CN107475282A

CN107475282A - 一种合成四氢嘧啶的三基因共表达载体及应用

Info

Publication number: CN107475282A
Application number: CN201710820910.8A
Authority: CN
Inventors: 鞠建松; 徐书景; 宋瑞甜; 王珊珊; 王青青; 孙韩聪; 赵宝华
Original assignee: Hebei Normal University
Current assignee: Hebei Normal University
Priority date: 2017-09-13
Filing date: 2017-09-13
Publication date: 2017-12-15

Abstract

本发明公开了一种高效合成四氢嘧啶的三基因共表达载体的构建及应用。根据同尾酶原理，将假坚强芽孢杆菌中编码L‑二氨基丁酸转氨酶(ectA)、L‑二氨基丁酸乙酰转移酶(ectB)和四氢嘧啶合成酶(ectC)基因依次插入到改造过的质粒pET‑22bNS上，构建三基因串联共表达载体pET‑22bNS‑EctA/B/C。所构建的三基因共表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导，以重组菌株全细胞催化反应3h后四氢嘧啶的最高产量为9.8mg/mL，合成效率为78.4mg/mL/d，高于同类研究的合成水平。本发明所构建的三基因共表达载体具有高效合成四氢嘧啶的能力，具有较好的应用价值。

Description

一种合成四氢嘧啶的三基因共表达载体及应用

技术领域

本发明涉及一种合成四氢嘧啶的三基因共表达载体的构建方法及应用，属于酶工程和化合物生物合成技术领域。

背景技术

四氢嘧啶类化合物是嗜盐以及耐盐菌胞内合成的一类能够抵御外界高盐胁迫的相容性溶质，四氢嘧啶类相容性溶质具有广泛的抗逆效果，能够稳定酶蛋白、DNA和细胞膜结构，帮助细胞抗冻、抗旱、抵抗高盐高渗辐射等各种逆境。目前，四氢嘧啶类化合物已被广泛应用于医药、美容、精细化工和生物制造等行业。传统的合成四氢嘧啶的方法主要是“细菌挤奶”，该方法是高盐环境下合成和积累四氢嘧啶，低盐环境释放四氢嘧啶，通过渗透压的冲击完成四氢嘧啶的合成和释放。虽然“细菌挤奶”法是目前生产四氢嘧啶最成功的方法，但是由于该方法的高盐环境导致了设备易腐蚀、细胞生长速率低及下游加工困难等问题。

目前，在基因水平和酶蛋白水平上都对四氢嘧啶合成途径有了较为深入的研究和认识，研究者在喜盐海球菌、伸长盐单胞菌、达坂喜盐芽孢杆菌等菌中发现了一条以天冬氨酸为前体的四氢嘧啶合成途径，其合成反应主要由3个基因(ectA、ectB、ectC)编码的酶蛋白参与，并且这3个基因串联构成一个单操纵子，即二氨基丁酸转氨酶(EctB)催化天冬氨酸半醛转化为L-2，4-二氨基丁酸，该产物随后被L-二氨基丁酸转氨酶(EctA)催化生成N-γ-乙酰基-2，4-二氨基丁酸，最后在四氢嘧啶合酶(EctC)的催化作用下N-γ-乙酰基二氨基丁酸环化生成反应终产物——四氢嘧啶。为了克服“细菌挤奶”法合成四氢嘧啶所面临的问题，当前普遍采用的方法是将嗜盐菌中合成四氢嘧啶的相关基因转入大肠杆菌等非嗜盐菌中重新构建四氢嘧啶合成途径。Galinski等将从喜盐海球菌中克隆获得的ectABC基因并成功表达于大肠杆菌(E.coli)中，不过研究发现利用该基因合成四氢嘧啶的产量仍然受外界盐浓度的调节。此外，研究还发现利用重组方法构建的工程菌株合成四氢嘧啶时其产量普遍较低。因此，开发一种高效的四氢嘧啶合成方法，对于四氢嘧啶的生产和应用有着重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种合成四氢嘧啶的三基因共表达载体。

本发明的目的还在于提供一种含合成四氢嘧啶的三基因共表达载体的工程菌的培养和应用方法。

本发明的目的是这样实现的。一种合成四氢嘧啶的三基因共表达载体，其核苷酸序列由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6共同构成。其中：

(1)SEQ ID No.1所示序列为改造后表达载体pET-22bNS的表达区域的核苷酸序列，其中T7启动子和终止子附近分别含有限制内切酶NheI(GCTAGC)和SpeI(ACTAGT)的识别位点；

(2)SEQ ID No.2所示序列为编码基因ectA的核苷酸序列；

(3)SEQ ID No.4所示序列为编码基因ectB的核苷酸序列；

(4)SEQ ID No.6所示序列为编码基因ectC的核苷酸序列。

本发明还提供三个编码基因ectA、ectB和ectC的氨基酸序列，如SEQ ID No.3、SEQID No.5和SEQ ID No.7所示。

本发明还提供含有上述三基因的共表达载体及宿主细胞。

本发明还提供含有上述三基因共表达载体的工程菌。

本发明还提供上述三基因共表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)根据商业载体pET-22b(+)中T7启动子和终止子待突变区域的核苷酸序列，设计定点突变引物，改造获得限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；所述突变引物为：

Nhe-F01：5′-GAGATCTCGATGCTAGCAAATTAATACGACTC-3′；

Spe-F01：5′-AGGAGGAACTAGTTCCGGATTGGC-3′；

Spe-R01：5′-GCCAATCCGGAACTAGTTCCTCCT-3′；

(2)以商业载体pET-22b(+)为模板，使用上述设计的引物进行PCR扩增，将含有限制内切酶NheI和SpeI识别位点的扩增产物替换商业载体的表达区域，构建能够容纳多个基因共同表达的载体pET-22bNS；

(3)根据NCBI数据库中公开的来自假坚强芽孢杆菌OF4的L-二氨基丁酸转氨酶、L-二氨基丁酸乙酰转移酶和四氢嘧啶合成酶的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对；所述引物对为：

EctA-F01:5′-GCATATGTGGGAATTAGTTAATC-3′

EctA-R01:5′-CCTCGAGCCTTAATGGTCCAATTC-3′

EctB-F01:5′-GCATATGAAACAAACTGATATG-3′

EctB-R01:5′-AGAGCTCGTTAGCAACAGGCTCAG-3′

EctC-F01:5′-GCATATGAAAGTAGTAGCTCT-3′

EctC-R01:5′-ACTCGAGTTCGTCATCAACTACTG-3′

(4)以假坚强芽孢杆菌OF4基因组DNA为模板，使用上述设计的引物进行PCR扩增，将扩增产物逐一连入改造后的载体pET-22bNS中，构建三基因共表达载体；

(5)将上述三基因共表达载体转化可表达目的基因的工程菌中，随工程菌的复制表达L-二氨基丁酸转氨酶、L-二氨基丁酸乙酰转移酶和四氢嘧啶合成酶蛋白。

制备方法的优选条件：步骤(2)中所述表达载体为pET系列中的任意一种；

步骤(5)中所述工程菌为大肠杆菌BL21系列中的任意一种。

本发明进一步提供上述三基因共表达载体的应用，具体是将三基因共表达载体用于生物法生产四氢嘧啶。

具体地，本发明是从假坚强芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)OF4中获得L-二氨基丁酸转氨酶(GenBank:ADC50208.1)、L-二氨基丁酸乙酰转移酶(GenBank:ADC50207.1)和四氢嘧啶合成酶(GenBank:ADC50206.1)基因，通过PCR扩增获得目的基因，并将基因片段与质粒pET-22bNS连接，构建重组表达质粒pET-22bNS-EctA、pET-22bNS-EctB和pET-22bNS-EctC；利用NheI和SpeI互为同尾酶的原理，通过限制内切酶BglII和SpeI双酶切获取带有启动子、核糖体结合位点、终止子等表达调控元件的目的基因片段，逐一与经BglII和NheI双酶切处理的相应表达载体相连接，最终构建三基因共表达载体pET-22bNS-EctA/B/C；该重组质粒转化大肠杆菌感受态，构建三基因共表达的基因工程菌BL21(DE3)/pET-22bNS-EctA/B/C；经37℃和1.0mM IPTG诱导后，以重组菌体全细胞催化反应3h后四氢嘧啶的最高产量为9.8mg/mL，其合成效率为78.4mg/mL/d。

本发明取得以下有益效果：本发明通过同尾酶的原理构建三基因共表达载体，并使每个基因带有独立的启动子、核糖体结合位点和终止子等表达调控元件，通过转化获得含有三基因共表达载体的基因工程菌，其生产四氢嘧啶的合成效率高于同类研究。

附图说明

图1为质粒pMD-22bNS双酶切电泳图谱。

图1中M：2000bp DNA marker；1：质粒pMD-22bNS的双酶切产物。

图2为质粒pMD-EctA双酶切电泳图谱。

图2中M：2000bp DNA marker；1：质粒pMD-EctA的双酶切产物。

图3为质粒pMD-EctB双酶切电泳图谱。

图3中M：1.0kb DNA marker；1：质粒pMD-EctB的双酶切产物。

图4为质粒pMD-EctC双酶切电泳图谱。

图4中M：2000bp DNA marker；1：质粒pMD-EctC的双酶切产物。

图5为三基因共表达载体中基因串联示意图。

图6为三基因共表达载体双酶切电泳图谱。

图6中M：1.0kb DNA marker；1：质粒pET-22bNS-EctA/B/C的双酶切产物。

图7为生物合成四氢嘧啶含量和HPLC检测图；

其中：图7A为四氢嘧啶的HPLC检测图；图7B为反应液中四氢嘧啶的含量图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明。需要说明，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1构建三个基因共表达载体

(1)改造载体pET-22b(+)

(a)引物设计：根据商业载体pET-22b(+)中T7启动子和终止子附近待突变区域的核苷酸序列，设计PCR扩增反应引物：

Nhe-F01：5′-GAGATCTCGATGCTAGCAAATTAATACGACTC-3′；

Spe-F01：5′-AGGAGGAACTAGTTCCGGATTGGC-3′；

Spe-R01：5′-GCCAATCCGGAACTAGTTCCTCCT-3′；

(b)增加SpeI识别位点：采用定点突变技术(Site-Directed Mutagenesis)，以质粒pET-22b(+)为模板，以Spe-F01和Spe-R01为引物对进行定点突变PCR，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性35sec，55℃退火1min，72℃延伸7min，循环16次；72℃充分延伸10min。

PCR产物经DpnI消化，转化至大肠杆菌E.coli DH5α，挑取单一菌落培养后提取质粒同时送样测序验证，获得含有SpeI识别位点的突变质粒pET-22bS。

(c)增加NheI识别位点：以质粒pET-22bS为模板，以Nhe-F01和Spe-R01为引物对进行PCR扩增反应，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性35sec，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环22次；72℃延伸10min，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测、分离，将通过胶回收获得目的DNA与载体pMD18-T连接，转入大肠杆菌E.coli DH5α，挑取菌落培养后送样测序验证；

将测序正确的质粒pMD-22bNS经BglII和SpeI双酶切(图1)，酶切产物(约390bp的DNA片段)经胶回收后，与经同样双酶切处理的线性质粒pET-22bS混匀，以T4连接酶16℃过夜连接，连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α，筛选获得含有NheI和SpeI识别位点的质粒pET-22bNS。

(2)获得目的基因

依据假坚强芽孢杆菌OF4已知的L-二氨基丁酸转氨酶(EctA,GenBank:ADC50208.1)、L-二氨基丁酸乙酰转移酶(EctB,GenBank:ADC50207.1)和四氢嘧啶合成酶(EctC,GenBank:ADC50206.1)基因序列设计PCR引物，以B.pseudofirmus基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得对应的特异DNA片段。各基因扩增引物及PCR条件分别为：

EctA-F01:5′-GCATATGTGGGAATTAGTTAATC-3′(下划线为NdeI的识别位点)

EctA-R01:5′-CCTCGAGCCTTAATGGTCCAATTC-3′(下划线为XhoI的识别位点)

EctB-F01:5′-GCATATGAAACAAACTGATATG-3′(下划线为NdeI的识别位点)

EctB-R01:5′-AGAGCTCGTTAGCAACAGGCTCAG-3′(下划线为SacI的识别位点)

EctC-F01:5′-GCATATGAAAGTAGTAGCTCT-3′(下划线为NdeI的识别位点)

EctC-R01:5′-ACTCGAGTTCGTCATCAACTACTG-3′(下划线为XhoI的识别位点)

95℃预变性5min；95℃变性45sec，53℃退火1min，72℃延伸90sec，循环25次；72℃延伸10min。扩增得到的DNA片段经琼脂糖凝胶回收后，分别与载体pMD18-T连接，并将连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α，经蓝白斑筛选，挑选白色克隆提取质粒送样测序。序列比对发现测序基因与Genbank公布的序列完全一致。

(3)构建三基因共表达载体

质粒pMB18-EctA、pMB18-EctB和pMB18-EctC经NdeI、XhoI或SacI双酶切，获得大小分别为430bp(图2)、1280bp(图3)和390bp(图4)的DNA片段。酶切产物经胶回收后，与经同样双酶切处理的线性质粒pET-22bNS混匀，用T4连接酶16℃过夜连接，连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α，通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得表达载体pET-22bNS-EctA、pET-22bNS-EctB和pET-22bNS-EctC；

将表达载体pET-22bNS-EctB经限制内切酶BglII和SpeI双酶切处理，酶切产物经胶回收获得约1.7kb的DNA片段，将该DNA与经限制内切酶BglII和NheI双酶切处理的质粒pET-22bNS-EctA相连接，随后连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α，并通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得双基因共表达载体pET-22bNS-EctA/B；

将表达载体pET-22bNS-EctC经限制内切酶BglII和SpeI双酶切处理，酶切产物经胶回收获得约0.8kb的DNA片段，将该DNA与经限制内切酶BglII和NheI双酶切处理的双基因共表达载体pET-22bNS-EctA/B相连接，随后连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α，通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得三基因串联共表达载体pET-22bNS-EctA/B/C(图5)，其中每个基因都带有独立的启动子、核糖体结合位点和终止子等表达调控元件；经限制内切酶BglII和SpeI双酶切处理得到一个大小约为2900bp的DNA片段(图6)，说明三基因共表达载体构建成功。

实施例2生物合成四氢嘧啶

(1)三基因共同表达

将三基因共表达载体pET-22bNS-EctA/B/C转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑选转化子于37℃含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中过夜培养；次日将培养液以1:100比例接种于100mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液，于37℃180rpm下振荡培养至OD600为0.5～0.6时，加入终浓度为1.0mM的IPTG于28℃诱导15h，8000rmp离心收集菌体，用0.8％的NaCl溶液洗菌体；

(2)全细胞催化合成四氢嘧啶

称取1g菌体重悬于20mL反应液(50mM PBS缓冲液，pH 7.5；150mM L-Asparticacid，100mM Glycerol)中，于40℃200rmp振荡培养3h后离心去除菌体，采用HPLC检测上清中四氢嘧啶的含量(图7A)。结果显示，该反应所合成的四氢嘧啶含量为9.8mg/mL(图7B)，转化率为78.4mg/mL/d，高于同类研究的合成水平。

虽然，以上已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北师范大学

<120> 一种合成四氢嘧啶的三基因共表达载体及应用

<130> 2017

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 397

<212> DNA

<213> 质粒pET-22bNS表达区域

<400> 1

agatctcgat gctagcaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggttaacaa 60

ttcccctcta gaactaattt tgtttaactt taagaaggag atatacatat gaaatacctg 120

ctgccgaccg ctgctgctgg tctgctgctc ctcgctgccc agccggcgat ggccatggat 180

atcggaatta attcggatcc gaattcgagc tccgtcgaca agcttgcggc cgcactcgag 240

caccaccacc accaccactg agatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg 300

gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg 360

aggggttttt tgctgaaagg aggaactagt tccggat 397

<210> 2

<211> 432

<212> DNA

<213> 假坚强芽孢杆菌（Bacillus pseudofirmus）

<400> 2

atgtgggaat tagttaatca ttctacattg gatcaaaatt ctgcttacaa gtacattatg 60

atgtgcgaat tttttgcaga aacatgtgtc gttgcaaaag atgaagatcg tgtcgttggc 120

ttcatcaccg cttttatccc tcccacaaaa ccagatgtcg tttttgtgtg gcaaattgga 180

gtggatgcct cacagcgagg acggggcctt gcctctcaaa tgctaaacga attagtaaaa 240

agagaaggtt gtaaggacgt tcaatatgta gaggctacag tcaccccatc caacaaagcg 300

tcacaatcct tgttcaaaag gttagcacgt gatcacaaca cagagtgtga agtcctagag 360

tgttttcctg aagaattatt ccctggagat aaccatgaaa aagagttaac ttttcgaatt 420

ggaccattaa gg 432

<210> 3

<211> 144

<212> PRT

<213> 假坚强芽孢杆菌（Bacillus pseudofirmus）

<400> 3

Met Trp Glu Leu Val Asn His Ser Thr Leu Asp Gln Asn Ser Ala Tyr

1 5 10 15

Lys Tyr Ile Met Met Cys Glu Phe Phe Ala Glu Thr Cys Val Val Ala

20 25 30

Lys Asp Glu Asp Arg Val Val Gly Phe Ile Thr Ala Phe Ile Pro Pro

35 40 45

Thr Lys Pro Asp Val Val Phe Val Trp Gln Ile Gly Val Asp Ala Ser

50 55 60

Gln Arg Gly Arg Gly Leu Ala Ser Gln Met Leu Asn Glu Leu Val Lys

65 70 75 80

Arg Glu Gly Cys Lys Asp Val Gln Tyr Val Glu Ala Thr Val Thr Pro

85 90 95

Ser Asn Lys Ala Ser Gln Ser Leu Phe Lys Arg Leu Ala Arg Asp His

100 105 110

Asn Thr Glu Cys Glu Val Leu Glu Cys Phe Pro Glu Glu Leu Phe Pro

115 120 125

Gly Asp Asn His Glu Lys Glu Leu Thr Phe Arg Ile Gly Pro Leu Arg

130 135 140

<210> 4

<211> 1281

<212> DNA

<213> 假坚强芽孢杆菌（Bacillus pseudofirmus）

<400> 4

atgaaacaaa ctgatatgaa tatattcgct caattagaat ctgaggtaag aagttattgc 60

cgtagttttc caacggtctt cactaaagca aaagggtaca aaatgtggga tgaatctgga 120

aaggaatatt tagatttctt ctctggtgcc ggcgccctta attacggaca caatgaagac 180

agcatgaaag aaaagctggt taattatatt atgagtgacg gtattaccca ctctcttgat 240

atggctacac agccgaaagc tgaattcctt gagacattca atgaagtcat attaaaacca 300

cgcaatttag agtacaaagt catgttccca ggaccgactg gtacgaatac agttgagggt 360

gccctaaagc ttgctcgtaa ggtaacgggc cgcacagata ttattagttt cactaacggt 420

ttccacggca tgacgattgg ttcactttcc gtaactggta acgcctttaa acgtaaaggt 480

gcaggaatac cattacaaaa tgtagtaaca atgccatacg acagctttgt aaacgaaggc 540

ctcgacactc tggagtatct cgaacgcttc ctagaggatg gcggcagtgg agttgacatt 600

cctgctgcga tgattctcga gacagtccaa ggtgaaggcg gtattaatgc tgcaagtttc 660

gagtggttac aacgaatcga agcgatttgt aagcgttggg gcattttact cattgtcgac 720

gatgttcaag ctggtgtcgg ccgtacaggt acgttcttca gttttgagaa agcaggaatt 780

aaaccagata tcgtatgtat gtctaaatca atcggcggtt atggtctacc tcttgctatc 840

actcttattc gtccagactt agacatctgg gcaccaggtg aacataatgg taccttccgc 900

ggaaacaatc atgcattcgt aactgcaact gcagcattag agttctggaa agaccctgaa 960

tttgaacaaa acattcaaaa acgttctgag cttatttact cgttcttaga aagtattgta 1020

gagaaatacc ctgaagtgaa aggtgaagta cgcggacgcg gctatatggt cggtattgga 1080

tctgaagtgg aagggttgtc tgaaaaaatt gctgcggaag catttaatcg cggtttaatt 1140

atggaaacat ccggaccaaa agatgaggta ttcaagctct tcccaccatt aattattgat 1200

gatgcaggtc ttgaggctgg ctttgaaatc attgaagcaa gtgttaaaac agctcttgaa 1260

gcagctgagc ctgttgctaa c 1281

<210> 5

<211> 427

<212> PRT

<213> 假坚强芽孢杆菌（Bacillus pseudofirmus）

<400> 5

Met Lys Gln Thr Asp Met Asn Ile Phe Ala Gln Leu Glu Ser Glu Val

1 5 10 15

Arg Ser Tyr Cys Arg Ser Phe Pro Thr Val Phe Thr Lys Ala Lys Gly

20 25 30

Tyr Lys Met Trp Asp Glu Ser Gly Lys Glu Tyr Leu Asp Phe Phe Ser

35 40 45

Gly Ala Gly Ala Leu Asn Tyr Gly His Asn Glu Asp Ser Met Lys Glu

50 55 60

Lys Leu Val Asn Tyr Ile Met Ser Asp Gly Ile Thr His Ser Leu Asp

65 70 75 80

Met Ala Thr Gln Pro Lys Ala Glu Phe Leu Glu Thr Phe Asn Glu Val

85 90 95

Ile Leu Lys Pro Arg Asn Leu Glu Tyr Lys Val Met Phe Pro Gly Pro

100 105 110

Thr Gly Thr Asn Thr Val Glu Gly Ala Leu Lys Leu Ala Arg Lys Val

115 120 125

Thr Gly Arg Thr Asp Ile Ile Ser Phe Thr Asn Gly Phe His Gly Met

130 135 140

Thr Ile Gly Ser Leu Ser Val Thr Gly Asn Ala Phe Lys Arg Lys Gly

145 150 155 160

Ala Gly Ile Pro Leu Gln Asn Val Val Thr Met Pro Tyr Asp Ser Phe

165 170 175

Val Asn Glu Gly Leu Asp Thr Leu Glu Tyr Leu Glu Arg Phe Leu Glu

180 185 190

Asp Gly Gly Ser Gly Val Asp Ile Pro Ala Ala Met Ile Leu Glu Thr

195 200 205

Val Gln Gly Glu Gly Gly Ile Asn Ala Ala Ser Phe Glu Trp Leu Gln

210 215 220

Arg Ile Glu Ala Ile Cys Lys Arg Trp Gly Ile Leu Leu Ile Val Asp

225 230 235 240

Asp Val Gln Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Phe Phe Ser Phe Glu

245 250 255

Lys Ala Gly Ile Lys Pro Asp Ile Val Cys Met Ser Lys Ser Ile Gly

260 265 270

Gly Tyr Gly Leu Pro Leu Ala Ile Thr Leu Ile Arg Pro Asp Leu Asp

275 280 285

Ile Trp Ala Pro Gly Glu His Asn Gly Thr Phe Arg Gly Asn Asn His

290 295 300

Ala Phe Val Thr Ala Thr Ala Ala Leu Glu Phe Trp Lys Asp Pro Glu

305 310 315 320

Phe Glu Gln Asn Ile Gln Lys Arg Ser Glu Leu Ile Tyr Ser Phe Leu

325 330 335

Glu Ser Ile Val Glu Lys Tyr Pro Glu Val Lys Gly Glu Val Arg Gly

340 345 350

Arg Gly Tyr Met Val Gly Ile Gly Ser Glu Val Glu Gly Leu Ser Glu

355 360 365

Lys Ile Ala Ala Glu Ala Phe Asn Arg Gly Leu Ile Met Glu Thr Ser

370 375 380

Gly Pro Lys Asp Glu Val Phe Lys Leu Phe Pro Pro Leu Ile Ile Asp

385 390 395 400

Asp Ala Gly Leu Glu Ala Gly Phe Glu Ile Ile Glu Ala Ser Val Lys

405 410 415

Thr Ala Leu Glu Ala Ala Glu Pro Val Ala Asn

420 425

<210> 6

<211> 387

<212> DNA

<213> 假坚强芽孢杆菌（Bacillus pseudofirmus）

<400> 6

atgaaagtag tagctcttaa agacattatc ggatcagatc aagaagtaaa aggtgaaaac 60

tggacgagcc gccgtctgct tttaaagaaa gatggcatgg ggtattctgt ccatgatacg 120

gttattaaag caggtacaga aactcatatt tggtatcaaa accacctaga agcggtttac 180

tgcattgaag gtgaaggaga agtagaaacg cttaaagata ataaagtttg gccgatcaaa 240

aaagacgaga tatatgcgtt agatgaaaat gatgagcacc ttcttcgtgc aaagacagat 300

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ggtgtatatc cagtagttga tgacgaa 387

<210> 7

<211> 129

<212> PRT

<213> 假坚强芽孢杆菌（Bacillus pseudofirmus）

<400> 7

Met Lys Val Val Ala Leu Lys Asp Ile Ile Gly Ser Asp Gln Glu Val

1 5 10 15

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20 25 30

Met Gly Tyr Ser Val His Asp Thr Val Ile Lys Ala Gly Thr Glu Thr

35 40 45

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50 55 60

Glu Gly Glu Val Glu Thr Leu Lys Asp Asn Lys Val Trp Pro Ile Lys

65 70 75 80

Lys Asp Glu Ile Tyr Ala Leu Asp Glu Asn Asp Glu His Leu Leu Arg

85 90 95

Ala Lys Thr Asp Met Arg Met Val Cys Val Phe Asn Pro Pro Ile Thr

100 105 110

Gly Lys Glu Thr His Asp Glu Asn Gly Val Tyr Pro Val Val Asp Asp

115 120 125

Glu

Claims

1.一种合成四氢嘧啶的三基因共表达载体，其特征在于其核苷酸序列由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6共同构成，其中：

(1)SEQ ID No.1所示为改造后表达载体pET-22bNS的表达区域的核苷酸序列，其中T7启动子和终止子附近分别含有限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；

(2)SEQ ID No.2所示为L-二氨基丁酸转氨酶基因的核苷酸序列；

(3)SEQ ID No.4所示为L-二氨基丁酸乙酰转移酶基因的核苷酸序列；

(4)SEQ ID No.6所示为四氢嘧啶合成酶基因的核苷酸序列，其中第252位的碱基C突变为A。

2.一种编码如权利要求1所述三个酶蛋白ectA、ectB和ectC的基因，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7所示，其中SEQ ID No.7中第84位的异亮氨酸(I)为同义突变(ATC→ATA)。

3.一种含权利要求1所述三基因共表达载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)根据质粒pET-22b(+)中T7启动子和终止子待突变区域核苷酸序列信息，设计突变引物，通过PCR突变技术引入限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；

所述引物为：

Nhe-F01:5′-GAGATCTCGATGCTAGCAAATTAATACGACTC-3′；

Spe-F01：5′-AGGAGGAACTAGTTCCGGATTGGC-3′；

Spe-R01:5′-GCCAATCCGGAACTAGTTCCTCCT-3′；

(2)以质粒pET-22b(+)为PCR模板，使用上述设计的引物，利用PCR突变技术将T7启动子和终止子待突变区域分别突变获得限制内切酶NheI和SpeI的识别位点，改造获得质粒pET-22bNS；

(3)根据NCBI数据库中公开的来自假坚强芽孢杆菌OF4的L-二氨基丁酸转氨酶、L-二氨基丁酸乙酰转移酶和四氢嘧啶合成酶的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对，通过PCR扩增获得目的DNA；

所述各基因扩增引物为：

EctA-F01:5′-GCATATGTGGGAATTAGTTAATC-3′

EctA-R01:5′-CCTCGAGCCTTAATGGTCCAATTC-3′

EctB-F01:5′-GCATATGAAACAAACTGATATG-3′

EctB-R01:5′-AGAGCTCGTTAGCAACAGGCTCAG-3′

EctC-F01:5′-GCATATGAAAGTAGTAGCTCT-3′

EctC-R01:5′-ACTCGAGTTCGTCATCAACTACTG-3′

(4)以来自假坚强芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)OF4的基因组DNA为模板，使用上述设计的引物，利用PCR技术扩增获得目的DNA片段，通过限制内切酶将目的DNA与经相同酶切处理的质粒pET-22bNS连接，构建表达载体pET-22bNS-EctA、pET-22bNS-EctB和pET-22bNS-EctC；

(5)利用NheI和SpeI互为同尾酶的原理，通过限制内切酶BglII和NheI或SpeI逐一双酶切处理上述3个表达载体，最终构建三基因共表达载体pET-22bNS-EctA/B/C。

4.含有权利要求1所述三基因共表达载体的工程菌的培养和应用方法，其特征在于：

(1)将共表达载体pET-22bNS-EctA-EctB-EctC通过化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)中，37℃于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基过夜培养，即得工程菌；

(2)挑取单菌落，37℃于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养至OD₆₀₀达0.5～0.6时，加入终浓度为1.0mM的IPTG，于28℃诱导15h，离心收集菌体作为转化反应的酶源；

(3)称取1g湿菌体，重悬于20mL含150mM天冬氨酸钠、100mM甘油的磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.5)中，在40℃下200rpm振荡反应3h，四氢嘧啶的产量为9.8mg/mL，合成效率为78.4mg/mL/d。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(2)中表达载体为pET系列中的任意一种。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的工程菌为大肠杆菌BL21系列中的任意一种。