CN112342254A

CN112342254A - 一种发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法

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Publication number: CN112342254A
Application number: CN202110020967.6A
Authority: CN
Inventors: 李宜奎; 汪仁; 钱彬彬; 李洁; 李杨
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2021-01-08
Filing date: 2021-01-08
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2041-01-08
Also published as: CN112342254B

Abstract

本发明公开了一种发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法，属于氨基酸衍生物生产技术领域。本发明包括：利用含有由人工密码子优化得到的四氢甲基嘧啶羧酸生物合成基因组装而成的基因簇的大肠杆菌，进行发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸，包括活化培养、种子培养和发酵培养。通过控制发酵培养基中葡萄糖的浓度，显著提高了四氢甲基嘧啶羧酸的产量，使四氢甲基嘧啶羧酸的产量达到41.5 g/L。本发明所提供的四氢甲基嘧啶羧酸发酵生产方法，不需外源添加天冬氨酸等前体物质和抗生素及任何辅因子，不产生四氢甲基嘧啶羧酸结构类似物，具有低盐条件、过程简单、操控简便、生产成本低、产物得率高、分离方便等优点，具有极高的工业应用价值。

Description

一种发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法

技术领域

本发明涉及氨基酸衍生物生产技术领域，更具体地，本发明涉及一种发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法。

背景技术

四氢甲基嘧啶羧酸，是必需氨基酸天冬氨酸的衍生物，也是一种天然的环状氨基酸。四氢甲基嘧啶羧酸，还是一种天然的相容性溶质，可以作为渗透压调节因子，有利于细胞保持渗透平衡，使细胞适应盐环境。四氢甲基嘧啶羧酸，还是一种优秀的具有稳定作用的化合物，可以作为生物分子（如蛋白质、核酸等）的保护剂，稳定蛋白质分子，保持酶的活性，促进多肽链折叠成有活性的蛋白质，减轻冷冻、干旱、高温等恶劣条件对蛋白质的不利影响。四氢甲基嘧啶羧酸还可以稳定整个细胞，抵抗多种压力（如紫外线辐射、细胞毒素和纳米粒子所引起的炎症等）。

四氢甲基嘧啶羧酸的上述特性使工业界注意到，四氢甲基嘧啶羧酸可以作为一种保护性化合物用于提高人体的健康。四氢甲基嘧啶羧酸在多个行业领域具有重要的应用。（1）日化品领域：四氢甲基嘧啶羧酸是一种广泛应用于防晒和抗老化等护肤品的活性成分，这得益于其可以降低紫外线对皮肤的伤害，减少皮肤因紫外线照射而形成的晒斑，防止皮肤干燥，增强细胞修复能力，延缓皮肤老化等作用。（2）医药领域：四氢甲基嘧啶羧酸在临床上用于治疗皮肤过敏、皮肤炎、鼻窦炎、眼鼻干涩等；四氢甲基嘧啶羧酸还可以抗上皮细胞炎症（肺炎、结肠炎等），防止淀粉样蛋白的聚集（这使四氢甲基嘧啶羧酸可用于预防和治疗神经退行性疾病（阿尔兹海默氏症、帕金森氏症、亨廷顿氏症、朊病毒相关疾病等）），保护化疗过程中的健康细胞，保护免疫系统，护理口腔等。（3）农业领域：四氢甲基嘧啶羧酸可以用作提高植物抗逆性的生物制剂，这得益于其可以帮助植物抵抗冷冻、干旱、高温、高盐等不利条件。

四氢甲基嘧啶羧酸是一些嗜盐微生物的渗透压调节因子，其在嗜盐微生物中的生物合成受盐浓度和氮源浓度的调控。这归因于嗜盐微生物中四氢甲基嘧啶羧酸的生物合成基因在转录水平上受渗透压响应的σ³⁸启动子和氮源响应的σ⁵⁴启动子的共同调控。这使得嗜盐微生物发酵过程中存在（1）设备腐蚀严重、（2）不连续生产、（3）结构类似物—羟基四氢甲基嘧啶羧酸—的产生而导致的下游分离提取困难等在技术上难以避免的瓶颈。四氢甲基嘧啶羧酸虽然易于化学合成，但由于其前体物质（如二氨基丁酸等）的价格昂贵，致使其化学合成生产的成本非常高；而且，四氢甲基嘧啶羧酸化学合成过程中存在的（1）过程复杂、（2）立体专一性差、（3）成本高等技术问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效的四氢甲基嘧啶羧酸发酵生产工艺，旨在提高四氢甲基嘧啶羧酸的生产效率。

本发明是通过如下技术方案来实现的。

一种发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法：利用含有多核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示的四氢甲基嘧啶羧酸生物合成基因簇ect213的大肠杆菌发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸。

具体地，所述的方法包括以下步骤：

（1）活化培养：将所述的大肠杆菌接种至固体平板培养基上进行活化培养，得到活化菌；

（2）种子培养：将步骤（1）得到的活化菌接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子液；

所述的种子培养基包括：葡萄糖、酵母蛋白胨、酵母提取物、氯化钠；

（3）发酵培养：将步骤（2）得到的种子液，接种至发酵培养基中培养，期间进行诱导和补料，得到发酵液；

所述的发酵培养基包括：葡萄糖、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、氯化钾、七水硫酸镁、酵母蛋白胨、酵母提取物、微量元素母液；

所述的微量元素母液包括：七水硫酸亚铁、七水硫酸锌、五水硫酸铜、五水硫酸锰、十水硼酸钠、二水氯化钙、钼酸铵；

所述的补料培养基包括：葡萄糖、七水硫酸镁；

具体地，上述步骤（1）的操作包括：将所述的大肠杆菌接种至固体平板培养基上，于培养箱中37 ℃活化培养24 h，得到活化菌；

所述的固体平板培养基包括：酵母蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L、琼脂粉15 g/L，pH = 7.0 - 7.2。

具体地，上述步骤（2）的操作包括：取一环生长良好的活化菌，接种至含有种子培养基的摇瓶中进行培养，装液量为200 mL/1000 mL，种子培养的条件为37 ℃，200 rpm摇床培养24 h，得到种子液；

优选地，所述步骤（2）中的种子培养基包括：葡萄糖30 g/L、酵母蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L，pH = 7.0 - 7.2。

具体地，上述步骤（3）的操作包括：按照1-2%的接种量将上述步骤（2）得到的种子液，接种至发酵培养基中培养，当菌液在600 nm波长下吸光度为15-20时，加入乳糖结构类似物—异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（终浓度为0.1 mmol/L）作为诱导剂进行诱导，发酵期间加入补料培养基，得到含有四氢甲基嘧啶羧酸的发酵液；

优选地，所述步骤（3）中的发酵培养基包括：葡萄糖5-40 g/L、磷酸氢二铵5.0 g/L、磷酸二氢铵1.8 g/L、氯化钾4.5 g/L、七水硫酸镁2.5 g/L、酵母蛋白胨20 g/L、酵母提取物10g/L、微量元素母液1%（v/v），pH = 7.0 - 7.2；

优选地，所述微量元素母液包括：七水硫酸亚铁15 g/L，七水硫酸锌4 g/L，五水硫酸铜2 g/L，五水硫酸锰1 g/L，十水硼酸钠0.5 g/L，二水氯化钙5 g/L，钼酸铵0.5 g/L，pH =7.0 - 7.2；

优选地，所述步骤（3）中的补料培养基包括：葡萄糖800 g/L、七水硫酸镁19.72 g/L，pH= 7.0 - 7.2。

优选地，所述步骤（3）的发酵培养温度为36-38 ℃，搅拌转速为800 rpm。

优选地，所述步骤（3）的发酵培养通气量为1 vvm。

优选地，所述步骤（3）的发酵培养过程中通过自动流加浓氨水控制发酵液的pH =6.8 - 7.0。

与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：

1）本申请人通过在mRNA的密码子和空间结构等方面对四氢甲基嘧啶羧酸生物合成基因进行优化，并将之与基因表达盒排列而构建了四氢甲基嘧啶羧酸生物合成基因簇及表达构建物，经转化大肠杆菌宿主细胞，开发了一种不受盐浓度和氮源浓度调控的四氢甲基嘧啶羧酸生产菌株，以可再生碳水化合物葡萄糖为碳源发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸；

2）通过优化发酵培养的培养基、培养条件和过程控制，使所述的大肠杆菌在低盐浓度发酵培养基中，通过控制发酵培养基中葡萄糖的浓度，显著提高了四氢甲基嘧啶羧酸的产量，使四氢甲基嘧啶羧酸的产量达到41.5 g/L；

3）本发明所提供的四氢甲基嘧啶羧酸发酵生产方法的发酵液中的盐含量仅为1.38%（w/v），这不会造成发酵设备和提纯设备的盐腐蚀；

4）本发明所提供的四氢甲基嘧啶羧酸发酵生产方法的四氢甲基嘧啶羧酸发酵生产过程是连续的，这提高了四氢甲基嘧啶羧酸的生产强度；

5）本发明所提供的四氢甲基嘧啶羧酸发酵生产方法的发酵液中不存在四氢甲基嘧啶羧酸的结构类似物——羟基四氢甲基嘧啶羧酸；而且，四氢甲基嘧啶羧酸是被生产菌株分泌到细胞外的（即发酵液中），是发酵液的主要成分，这非常有利于四氢甲基嘧啶羧酸的提取、分离和纯化；

6）该方法工艺简单易控制，成本低，不需外源添加天冬氨酸等前体物质和抗生素及任何辅因子，具有低盐条件、过程简单、操控简便、生产成本低、产物得率高、分离方便等优点，具有极高的工业应用价值。

附图说明

图1是本发明的发酵液的液相色谱分析图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：四氢甲基嘧啶羧酸生物合成基因的密码子优化及全基因合成

本发明根据来源于伸长盐单胞菌的二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶（EC 2.6.1.76）、L-2,4-二氨基丁酸转乙酰酶（EC 2.3.1.178）和四氢甲基嘧啶羧酸合酶（EC 4.2.1.108）的氨基酸序列（三种酶在蛋白数据库中的ID号分别为O52250、O52249和O52251），利用密码子的简并性对编码上述四氢甲基嘧啶羧酸生物合成酶的mRNA的密码子偏好性、GC含量、空间结构等进行设计并优化，委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行全基因合成，获得了核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示的编码二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的多核苷酸、核苷酸序列如SEQ ID NO : 2所示的编码L-2,4-二氨基丁酸转乙酰酶的多核苷酸、核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示的编码四氢甲基嘧啶羧酸合酶的多核苷酸。

实施例2：四氢甲基嘧啶羧酸生物合成基因簇的构建

（1）合成两条分别具有序列表中SEQ ID NO : 5和SEQ ID NO : 6所示核苷酸序列的引物。核苷酸序列如SEQ ID NO : 5和SEQ ID NO : 6所示的引物的5’-端分别设置了pUC57载体Sap I和Pfo I酶切位点两侧的25 bp多核苷酸。以核苷酸序列如SEQ ID NO : 2所示的多核苷酸为模板进行聚合酶链式反应（PCR）。DNA聚合酶选用南京诺唯赞生物科技有限公司的Phanta^® Super-Fidelity DNA聚合酶。PCR扩增程序为：95℃ 5min；94℃ 45s, 56℃ 45s，72℃ 2min，共30个循环；72℃ 10min，降至10℃。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、分离、切胶回收。利用One-step cloning试剂盒（购自南京诺唯赞生物科技有限公司）按照产品说明书将回收获得的DNA片段装配到经Sap I和Pfo I内切酶线性化的pUC57载体中。组装产物转化大肠杆菌（E. coli）DH5α感受态细胞（购自南京诺唯赞生物科技有限公司），并涂布于添加氨苄青霉素（终浓度为100 μg/mL）的LB平板上。单菌落经PCR验证获得阳性转化子。测序进一步确定表达载体pUC-ect2构建成功，并在Sap I和Pfo I酶切位点之间含有序列如SEQ ID NO : 2所示的多核苷酸。

（2）合成两条分别具有序列表中SEQ ID NO : 7和SEQ ID NO : 8所示核苷酸序列的引物。核苷酸序列如SEQ ID NO : 7和SEQ ID NO : 8所示的引物的5’-端分别设置了SphI和Spe I酶切位点及其保护碱基。以核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示的多核苷酸为模板进行PCR扩增。PCR扩增程序同本实施例中的（1）。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、分离、切胶回收后经SphI和Spe I双酶切，利用T4 DNA连接酶（购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa））连接同样经SphI和Spe I双酶切的pUC-ect2载体中（pUC-ect2载体中的SphI和Spe I酶切位点是通过引物SEQ ID NO : 6引入的）。连接产物转化大肠杆菌（E. coli）DH5α感受态细胞（购自南京诺唯赞生物科技有限公司），并涂布于添加氨苄青霉素（终浓度为100μg/mL）的LB平板上。单菌落经PCR验证获得阳性转化子。测序进一步确定表达载体pUC-ect21构建成功，并在SphI和Spe I酶切位点之间含有序列如SEQ ID NO : 1所示的多核苷酸。

（3）合成两条分别具有序列表中SEQ ID NO : 9和SEQ ID NO : 10所示核苷酸序列的引物。核苷酸序列如SEQ ID NO : 9和SEQ ID NO : 10所示的引物的5’-端分别设置了SpeI和Xho I酶切位点及其保护碱基。以核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示的多核苷酸为模板进行PCR扩增。PCR扩增程序同本实施例中的（1）。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、分离、切胶回收后经SpeI和Xho I双酶切，利用T4 DNA连接酶（购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa））连接同样经SpeI和Xho I双酶切的pUC-ect21载体中（pUC-ect21载体中的XhoI酶切位点是通过引物SEQ ID NO : 6引入的）。连接产物转化大肠杆菌（E. coli）DH5α感受态细胞（购自南京诺唯赞生物科技有限公司），并涂布于添加氨苄青霉素（终浓度为100 μg/mL）的LB平板上。单菌落经PCR验证获得阳性转化子。测序进一步确定表达载体pUC-ect213构建成功，并在Nde I和XhoI酶切位点之间含有多核苷酸序列如SEQ ID NO : 4所示的四氢甲基嘧啶羧酸生物合成基因簇（pUC-ect213载体中的NdeI酶切位点是通过引物SEQ ID NO: 5引入的）。

实施例3：四氢甲基嘧啶羧酸生物合成基因簇表达载体的构建

合成两条分别具有序列表中SEQ ID NO : 11和SEQ ID NO : 12所示核苷酸序列的引物。核苷酸序列如SEQ ID NO : 11和SEQ ID NO : 12所示的引物的5’-端分别含有pUC-ect213载体NdeI酶切位点两侧的25 bp多核苷酸。以大肠杆菌BL21(DE)的基因组为模板进行PCR扩增，获得BL21(DE)的lacZ基因编码区上游750 bp多核苷酸（包括lac启动子）。PCR扩增程序同实施例2中的（1）。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、分离、切胶回收。利用One-step cloning试剂盒（购自南京诺唯赞生物科技有限公司）按照产品说明书将回收获得的DNA片段装配到经NdeI内切酶线性化的pUC-ect213载体中。组装产物转化大肠杆菌（E. coli）DH5α感受态细胞（购自南京诺唯赞生物科技有限公司），并涂布于添加氨苄青霉素（终浓度为100 μg/mL）的LB平板上。单菌落经PCR验证获得阳性转化子。测序进一步确定表达载体pPlac-ect213构建成功。

实施例4：重组大肠杆菌细胞的获得

将表达载体pPlac-ect213利用热击法（42℃，90s）转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌细胞BL21(DE3)/pPlac-ect213。

实施例5：四氢甲基嘧啶羧酸生物合成基因簇整合载体的构建

合成两条分别具有序列表中SEQ ID NO : 13和SEQ ID NO : 14所示核苷酸序列的引物。核苷酸序列如SEQ ID NO : 13和SEQ ID NO : 14所示的引物的5’-端分别含有pPlac-ect213载体XhoI酶切位点两侧的25 bp多核苷酸。以大肠杆菌BL21(DE)的基因组为模板进行PCR扩增，获得BL21(DE)的lacA基因编码区下游750 bp多核苷酸（包括lacA转录终止子）。PCR扩增程序同实施例2中的（1）。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、分离、切胶回收。利用One-step cloning试剂盒（购自南京诺唯赞生物科技有限公司）按照产品说明书将回收获得的DNA片段装配到经XhoI内切酶线性化的pPlac-ect213载体中。组装产物转化大肠杆菌（E. coli）DH5α感受态细胞（购自南京诺唯赞生物科技有限公司），并涂布于添加氨苄青霉素（终浓度为100 μg/mL）的LB平板上。单菌落经PCR验证获得阳性转化子。测序进一步确定整合载体pLacZup750-Plac-ect213-LacAdown750构建成功。

实施例6：工程大肠杆菌细胞的获得

合成两条分别具有序列表中SEQ ID NO : 15和SEQ ID NO : 16所示核苷酸序列的引物。以整合载体pLacZup750-Plac-ect213-LacAdown750为模板进行PCR扩增，获得LacZup750-Plac-ect213-LacAdown750整合片段。PCR扩增程序同实施例2中的（1）。经限制性内切酶Dpn I消化后，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测、分离、切胶回收。将回收获得的DNA片段环化并利用电转化仪转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于添加乳糖结构类似物—异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的LB平板。筛选白色单菌落，经PCR验证获得阳性转化子。测序进一步确定四氢甲基嘧啶羧酸生物合成基因簇ect213已经通过同源重组整合到宿主细胞的基因组中的lacZYA操纵子处，成功构建工程大肠杆菌细胞BL21(DE3 Δ(lacZYA)::ect213)。

实施例7、一种发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法

（1）活化培养：将重组大肠杆菌BL21(DE3)/pPlac-ect213接种至含氨苄青霉素（终浓度为100 μg/mL）的固体平板培养基上，培养箱中37 ℃活化培养24 h，得到活化菌；

固体平板培养基：酵母蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L、琼脂粉15 g/L，pH = 7.0 - 7.2。

（2）种子培养：取一环生长良好的活化菌，接种至含有种子培养基的摇瓶中进行培养，装液量为200 mL/1000 mL，种子培养的条件为37 ℃，200 rpm摇床培养24 h，得到种子液；

种子培养基：葡萄糖30 g/L、酵母蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L，pH= 7.0 - 7.2。

（3）发酵培养：按照1%的接种量将种子液接种至发酵培养基中培养，当菌液在600nm波长下吸光度为15-20时，加入乳糖结构类似物—异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（终浓度为0.1 mmol/L）进行诱导，发酵期间加入补料培养基，发酵时间为40 h得到发酵液；

发酵培养基：葡萄糖30 g/L、磷酸氢二铵5.0 g/L、磷酸二氢铵1.8 g/L、氯化钾4.5 g/L、七水硫酸镁2.5 g/L、酵母蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L、微量元素母液1%（v/v），pH= 7.0 - 7.2；

微量元素母液：七水硫酸亚铁15 g/L，七水硫酸锌4 g/L，五水硫酸铜2 g/L，五水硫酸锰1 g/L，十水硼酸钠0.5 g/L，二水氯化钙5 g/L，钼酸铵0.5 g/L，pH = 7.0 - 7.2；

补料培养基：葡萄糖800 g/L、七水硫酸镁19.72 g/L，pH = 7.0 - 7.2。

发酵培养温度为36-38 ℃，搅拌转速为800 rpm，通气量为1 vvm。

发酵培养过程中通过自动流加浓氨水控制发酵液的pH = 6.8 - 7.0。

（4）定量分析：取发酵液1 mL，室温下，12000 rpm离心5 min。取上清用0.22 μm孔径滤膜过滤，滤液进行一定倍数的稀释后，上样高效液相色谱仪（HPLC）进行定量分析。

HPLC分析条件为：采用高效液相色谱仪LC-20A（岛津，日本），色谱柱InertSustainC 18（5 μm，4.6 mm × 250 mm），柱温35℃，二极管阵列检测器，波长210 nm，进样量10 μL，流动相为2.0%（v/v）乙腈，流速1.0 mL/min。

发酵结果如图1所示，结果表明：（1）本发明所提供的四氢甲基嘧啶羧酸发酵生产方法的发酵液中不存在四氢甲基嘧啶羧酸的结构类似物——羟基四氢甲基嘧啶羧酸；（2）四氢甲基嘧啶羧酸是发酵液的主要成分；（3）重组细胞大肠杆菌可以将其发酵产生的四氢甲基嘧啶羧酸分泌到细胞外（即发酵液中）。这有利于四氢甲基嘧啶羧酸的提取、分离和纯化。

实施例8、一种发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法

与实施例7的区别仅在于，步骤（3）发酵培养的发酵培养基中葡萄糖为40 g/L。

实施例9、一种发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法

与实施例7的区别仅在于，步骤（3）发酵培养的发酵培养基中葡萄糖为50 g/L。

实施例10、一种发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法

与实施例7的区别仅在于，步骤（3）发酵培养的发酵培养基中葡萄糖为20 g/L。

实施例11、一种发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法

与实施例7的区别仅在于，步骤（3）发酵培养的发酵培养基中葡萄糖为10 g/L。

实施例12、一种发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法

与实施例7的区别仅在于，步骤（3）发酵培养的发酵培养基中葡萄糖为5 g/L。

实施例13、一种发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法

与实施例7的区别仅在于，步骤（3）发酵培养的发酵培养基中葡萄糖为0 g/L。

对实施例7-13的检测结果进行比较，见表1。

表1实施例7-13检测结果

	葡萄糖含量（g/L）	四氢甲基嘧啶羧酸的产量（g/L）
			实施例7	30	31.46
实施例8	40	30.65
			实施例9	50	27.94
实施例10	20	35.99
			实施例11	10	37.85
实施例12	5	41.49
			实施例13	0	11.25

表1中的实验数据显示，使用本发明所提供的方法生产四氢甲基嘧啶羧酸，发酵液中四氢甲基嘧啶羧酸的产量最高达到41.5 g/L。比较实施例7-13可看出，发酵培养基中葡萄糖浓度能够影响四氢甲基嘧啶羧酸的产量。

实施例14、一种发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法

与实施例12的区别仅在于，步骤（1）所活化的菌株为工程大肠杆菌BL21(DE3 Δ(lacZYA)::ect213)和整个生产过程不添加任何抗生素。

分析结果显示：发酵液中四氢甲基嘧啶羧酸的产量为33.7 g/L。

实施例15、一种发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法

与实施例14的区别仅在于，步骤（3）发酵培养的发酵培养基中葡萄糖为40 g/L。

分析结果显示：发酵液中四氢甲基嘧啶羧酸的产量为21.3 g/L。

综上，本发明所提供的方法，利用含有多核苷酸序列如SEQ ID NO : 4所示的四氢甲基嘧啶羧酸生物合成基因簇ect213的大肠杆菌，通过控制发酵培养基中可再生碳源——葡萄糖的浓度，在低盐条件下，不需外源添加天冬氨酸等前体物质和抗生素及任何辅因子，连续生产四氢甲基嘧啶羧酸，显著提高了四氢甲基嘧啶羧酸的产量（提高2.7倍）。

本发明所提供的四氢甲基嘧啶羧酸发酵生产方法的发酵液中不存在四氢甲基嘧啶羧酸的结构类似物——羟基四氢甲基嘧啶羧酸；而且，四氢甲基嘧啶羧酸是被生产菌株分泌到细胞外的（即发酵液中），是发酵液的主要成分，这有利于简化下游提取分离纯化的工艺，降低提纯成本；加之，工艺简单易控制，产物得率高，生产成本低，使本发明具有极高的工业应用价值。

序列表

<110> 江苏省中国科学院植物研究所

<120> 一种发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法

<130> 100

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1266

<212> DNA

<213> 编码二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的多核苷酸(Artificial)

<400> 1

atgcagaccc agatcctgga acgtatggaa tctgatgttc gtacctatag ccgttctttc 60

ccggttgttt tcaccaaagc acgtaacgcg cgcctgaccg atgaagaagg ccgtgaatac 120

attgatttcc tggcgggcgc gggtaccctg aactacggcc acaacaaccc gcatctgaaa 180

caggcgctgc tggattacat cgattctgat ggtatcgttc acggtctgga tttctggacc 240

gcggcgaaac gtgattacct ggaaaccctg gaagaagtta tcctgaaacc gcgtggtctg 300

gattacaaag ttcacctgcc gggcccgacc ggcaccaacg cggttgaagc tgctatccgt 360

ctggcgcgtg ttgcgaaagg tcgtcataac attgttagct tcaccaacgg tttccacggc 420

gttaccatgg gcgctctggc gaccaccggc aaccgtaaat tccgtgaagc taccggcggt 480

gttccgaccc aggctgcgtc tttcatgccg ttcgatggtt acctgggcag cagcaccgac 540

accctggact acttcgaaaa actgctgggt gacaaaagcg gcggcctgga tgttccggca 600

gcggttatcg ttgaaaccgt gcagggtgaa ggcggtatca acgttgctgg tctggaatgg 660

ctgaaacgcc tggaatccat ttgccgtgct aacgatatcc tgctgattat tgatgacatc 720

caggcgggtt gcggtcgtac cggtaaattc ttctctttcg aacacgctgg tatcaccccg 780

gacatcgtta ccaacagcaa aagcctgagc ggttacggcc tgccgttcgc tcacgttctg 840

atgcgtccgg aactggataa atggaaaccg ggccagtaca acggcacctt ccgtggtttc 900

aacctggcgt tcgctaccgc ggcagcggcg atgcgtaaat attggtctga tgataccttc 960

gaacgtgatg ttcagcgtaa agcgcgtatc gtggaagaac gtttcggcaa aatcgcggct 1020

tggctgtctg aaaacggcat cgaagcatct gaacgtggcc gcggcctgat gcgcggcatc 1080

gatgtgggct ctggcgatat cgctgacaaa atcacccacc aggcattcga aaacggcctg 1140

atcatcgaaa ccagcggcca ggatggtgaa gttgttaaat gcctgtgccc gctgaccatc 1200

ccggatgaag atctggttga aggtctggat atcctggaaa ccagcaccaa acaggcgttc 1260

agctaa 1266

<210> 2

<211> 579

<212> DNA

<213> 编码L-2,4-二氨基丁酸转乙酰酶的多核苷酸(Artificial)

<400> 2

atgaacgcga ccaccgaacc gttcaccccg agcgcggatc tggcgaaacc gtctgttgcg 60

gatgcggttg ttggccacga agcgagcccg ctgttcatcc gtaaaccgag cccggatgat 120

ggctggggta tctacgaact ggttaaaagc tgcccgccgc tggatgttaa cagcgcgtac 180

gcgtacctgc tgctggcgac ccagttccgt gattcttgcg cggttgcgac caacgaagaa 240

ggcgaaatcg ttggcttcgt tagcggctac gttaaaagca acgcgccgga tacctacttc 300

ctgtggcagg ttgcggttgg cgaaaaagct cgtggcaccg gtctggcgcg tcgtctggtt 360

gaagcggtta tgacccgtcc ggaaatggcg gaagttcacc acctggaaac caccatcacc 420

ccggataacc aggcgagctg gggcctgttc cgtcgtctgg cggatcgttg gcaggcgccg 480

ctgaacagcc gtgaatactt cagcaccgat cagctgggcg gtgaacacga tccggaaaac 540

ctggttcgta tcggcccgtt ccagaccgat cagatctaa 579

<210> 3

<211> 414

<212> DNA

<213> 编码四氢甲基嘧啶羧酸合酶的多核苷酸(Artificial)

<400> 3

atgatcgttc gtaacctgga agaagcgcgt cagaccgatc gtctggttac cgcggaaaac 60

ggcaactggg atagcacccg tctgagcctg gcggaagatg gcggcaactg cagcttccac 120

atcacccgta tcttcgaagg caccgaaacc cacatccact acaaacacca cttcgaagcg 180

gtttactgca tcgaaggcga aggtgaagtt gaaaccctgg cggatggcaa aatctggccg 240

atcaaaccgg gcgatatcta catcctggat cagcacgatg aacacctgct gcgtgcgagc 300

aaaaccatgc acctggcgtg cgttttcact ccgggcctga ccggcaacga agttcaccgt 360

gaagatggca gctacgcgcc ggcggatgaa gcggatgatc agaaaccgct gtaa 414

<210> 4

<211> 2294

<212> DNA

<213> 四氢甲基嘧啶羧酸生物合成基因簇ect213(Artificial)

<400> 4

catatgaacg cgaccaccga accgttcacc ccgagcgcgg atctggcgaa accgtctgtt 60

gcggatgcgg ttgttggcca cgaagcgagc ccgctgttca tccgtaaacc gagcccggat 120

gatggctggg gtatctacga actggttaaa agctgcccgc cgctggatgt taacagcgcg 180

tacgcgtacc tgctgctggc gacccagttc cgtgattctt gcgcggttgc gaccaacgaa 240

gaaggcgaaa tcgttggctt cgttagcggc tacgttaaaa gcaacgcgcc ggatacctac 300

ttcctgtggc aggttgcggt tggcgaaaaa gctcgtggca ccggtctggc gcgtcgtctg 360

gttgaagcgg ttatgacccg tccggaaatg gcggaagttc accacctgga aaccaccatc 420

accccggata accaggcgag ctggggcctg ttccgtcgtc tggcggatcg ttggcaggcg 480

ccgctgaaca gccgtgaata cttcagcacc gatcagctgg gcggtgaaca cgatccggaa 540

aacctggttc gtatcggccc gttccagacc gatcagatct aagcatgcga gatacatgca 600

gacccagatc ctggaacgta tggaatctga tgttcgtacc tatagccgtt ctttcccggt 660

tgttttcacc aaagcacgta acgcgcgcct gaccgatgaa gaaggccgtg aatacattga 720

tttcctggcg ggcgcgggta ccctgaacta cggccacaac aacccgcatc tgaaacaggc 780

gctgctggat tacatcgatt ctgatggtat cgttcacggt ctggatttct ggaccgcggc 840

gaaacgtgat tacctggaaa ccctggaaga agttatcctg aaaccgcgtg gtctggatta 900

caaagttcac ctgccgggcc cgaccggcac caacgcggtt gaagctgcta tccgtctggc 960

gcgtgttgcg aaaggtcgtc ataacattgt tagcttcacc aacggtttcc acggcgttac 1020

catgggcgct ctggcgacca ccggcaaccg taaattccgt gaagctaccg gcggtgttcc 1080

gacccaggct gcgtctttca tgccgttcga tggttacctg ggcagcagca ccgacaccct 1140

ggactacttc gaaaaactgc tgggtgacaa aagcggcggc ctggatgttc cggcagcggt 1200

tatcgttgaa accgtgcagg gtgaaggcgg tatcaacgtt gctggtctgg aatggctgaa 1260

acgcctggaa tccatttgcc gtgctaacga tatcctgctg attattgatg acatccaggc 1320

gggttgcggt cgtaccggta aattcttctc tttcgaacac gctggtatca ccccggacat 1380

cgttaccaac agcaaaagcc tgagcggtta cggcctgccg ttcgctcacg ttctgatgcg 1440

tccggaactg gataaatgga aaccgggcca gtacaacggc accttccgtg gtttcaacct 1500

ggcgttcgct accgcggcag cggcgatgcg taaatattgg tctgatgata ccttcgaacg 1560

tgatgttcag cgtaaagcgc gtatcgtgga agaacgtttc ggcaaaatcg cggcttggct 1620

gtctgaaaac ggcatcgaag catctgaacg tggccgcggc ctgatgcgcg gcatcgatgt 1680

gggctctggc gatatcgctg acaaaatcac ccaccaggca ttcgaaaacg gcctgatcat 1740

cgaaaccagc ggccaggatg gtgaagttgt taaatgcctg tgcccgctga ccatcccgga 1800

tgaagatctg gttgaaggtc tggatatcct ggaaaccagc accaaacagg cgttcagcta 1860

aactagtgag atacatgatc gttcgtaacc tggaagaagc gcgtcagacc gatcgtctgg 1920

ttaccgcgga aaacggcaac tgggatagca cccgtctgag cctggcggaa gatggcggca 1980

actgcagctt ccacatcacc cgtatcttcg aaggcaccga aacccacatc cactacaaac 2040

accacttcga agcggtttac tgcatcgaag gcgaaggtga agttgaaacc ctggcggatg 2100

gcaaaatctg gccgatcaaa ccgggcgata tctacatcct ggatcagcac gatgaacacc 2160

tgctgcgtgc gagcaaaacc atgcacctgg cgtgcgtttt cactccgggc ctgaccggca 2220

acgaagttca ccgtgaagat ggcagctacg cgccggcgga tgaagcggat gatcagaaac 2280

cgctgtaact cgag 2294

<210> 5

<211> 64

<212> DNA

<213> primer 5(Artificial)

<400> 5

agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagccata tgaacgcgac caccgaaccg 60

ttca 64

<210> 6

<211> 75

<212> DNA

<213> primer 6(Artificial)

<400> 6

ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gactcgagac tagtgcatgc ttagatctga 60

tcggtctgga acggg 75

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> primer 7(Artificial)

<400> 7

taagcatgcg agatacatgc agacccagat cctggaacgt a 41

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> primer 8(Artificial)

<400> 8

ctagactagt ttagctgaac gcctgtttgg tgctg 35

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> primer 9(Artificial)

<400> 9

taaactagtg agatacatga tcgttcgtaa cctggaagaa g 41

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> primer 10(Artificial)

<400> 10

ccgctcgagt tacagcggtt tctgatcatc cgct 34

<210> 11

<211> 68

<212> DNA

<213> primer 11(Artificial)

<400> 11

agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcccag acacccatca acagtattat 60

tttctccc 68

<210> 12

<211> 66

<212> DNA

<213> primer 12(Artificial)

<400> 12

ggggtgaacg gttcggtggt cgcgttcata tgagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 60

gctcac 66

<210> 13

<211> 52

<212> DNA

<213> primer 13(Artificial)

<400> 13

agcggatgat cagaaaccgc tgtaataata accgggcagg ccatgtctgc cc 52

<210> 14

<211> 65

<212> DNA

<213> primer 14(Artificial)

<400> 14

ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gactcgaggg aaacgccaat aacatacagt 60

gacaa 65

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> primer 15(Artificial)

<400> 15

ccagacaccc atcaacagta ttattttctc cc 32

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> primer 16(Artificial)

<400> 16

ggaaacgcca ataacataca gtgacaa 27

Claims

1.一种发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法，其特征在于：利用含有多核苷酸序列如SEQID NO : 4所示的四氢甲基嘧啶羧酸生物合成基因簇ect213的大肠杆菌发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸。

2.根据权利要求1所述发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

（1）将所述的大肠杆菌接种至固体平板培养基上，得到活化菌；

（2）将上述步骤（1）得到的活化菌接种至种子培养基中进行种子培养，得到种子液；所述的种子培养基包括：葡萄糖、酵母蛋白胨、酵母提取物、氯化钠；

（3）将上述步骤（2）得到的种子液，接种至发酵培养基中培养，期间加入诱导剂和补料培养基，得到含有四氢甲基嘧啶羧酸的发酵液；所述的发酵培养基包括：葡萄糖、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、氯化钾、七水硫酸镁、酵母蛋白胨、酵母提取物、微量元素母液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的种子培养基包括：30 g/L葡萄糖、10 g/L酵母蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L氯化钠，pH = 7.0 - 7.2。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中的发酵培养基包括：5-40g/L葡萄糖、5.0 g/L磷酸氢二铵、1.8 g/L磷酸二氢铵、4.5 g/L氯化钾、2.5 g/L七水硫酸镁、20 g/L酵母蛋白胨、10 g/L酵母提取物、1%（v/v）微量元素母液，pH = 7.0 - 7.2。

5.根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中的微量元素母液包括：15 g/L七水硫酸亚铁、4 g/L七水硫酸锌、2 g/L五水硫酸铜、1 g/L五水硫酸锰、0.5 g/L十水硼酸钠、5 g/L二水氯化钙、0.5 g/L钼酸铵，pH = 7.0 - 7.2。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）的培养温度为36-38 ℃，搅拌转速为800 rpm。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）发酵培养过程中通气量为1vvm。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）发酵培养过程中通过自动流加浓氨水控制发酵液的pH = 6.8 - 7.0。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。

10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中的补料培养基包括：葡萄糖、七水硫酸镁。