CN113897402A - 白皮衫醇的生物催化合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白皮衫醇的生物催化合成方法。其以白藜芦醇为底物通过HpaBC酶体系合成，所述的HpaBC酶体系由能够表达HpaB和HpaC基因，生成HpaB和HpaC酶的重组菌提供。其可以从白藜芦醇简单高效地生产白皮衫醇。白藜芦醇底物可完全转化，转化率高，并且可适用于80mM高底物浓度下白藜芦醇到白皮衫醇的生物转化，大大提升了白皮衫醇的生物催化合成产量。
Description
技术领域
本发明涉及微生物与酶工程技术领域，尤其涉及一种白皮衫醇的生物催化合成方法。
背景技术
白皮杉醇(trans-Piceatannol)是一种在葡萄、大黄藓、大黄和甘蔗等中发现的多酚物质，该多酚被证明具有很多的生物活性，如抗氧化、清除自由基、提高免疫调节力、抗细胞增殖、抗炎、抗菌、防癌、抗癌、抗白血病、抑制蛋白酪氨酸激酶等。因此，随着研究开发的不断深入，白皮杉醇有望在保健品、化妆品和药品等领域获得广泛应用。
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Toshiki Furuya等人公开了一种全细胞生物催化合成白皮衫醇的方法Regioselective synthesis of piceatannol from resveratrol:catalysis by two-component flavin-depen dent monooxygenase HpaBC in whole cells,TetrahedronLetters,Volume 55,Issue 17,2014。其在10mM底物白藜芦醇浓度下，转化率62％，进一步提升底物浓度到20mM和30mM，白皮衫醇产量有提升，但转化率下降，文中进一步通过引入Tween80或TritonX-100后，转化率有所提升，但最高只能达到83％。对于工业应用而言，进一步提升反应转化率，并根据需要进一步提升底物浓度也是非常有必要的，为此，本发明旨在开发一种转化率高、能适用于高底物浓度的白皮衫醇的生物催化合成方法。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种白皮衫醇的生物催化合成方法，可以从白藜芦醇简单高效地生产白皮衫醇，其转化率高，合成效果优异。
本发明采用的技术方案如下：
提供一种生物催化合成白皮衫醇的方法，所述白皮衫醇的结构式为：
以白藜芦醇为底物通过HpaBC酶体系合成，所述的HpaBC酶体系由能够表达HpaB和HpaC基因，生成HpaB和HpaC酶的重组菌提供；其中，
按上述方案，所述HpaC酶基因序列如SEQ ID No.3所示。
按上述方案，HpaB酶基因序列如SEQ ID No.1所示。
按上述方案，所述重组菌是将下述表达载体转化到宿主细胞得到的，所述的表达载体为：pACYCDuet-HpaBC2(rbs)，其中：HpaBC2(rbs)的基因序列如SEQ ID No.4所示,第1564bp-1583bp为rbs序列，或为pETDuet-HpaB+pRSFDuet-HpaC2。
pACYCDuet-HpaBC2(rbs):表示HpaB与HpaC2用RBS连接后再构建在pACYCDuet质粒上。pETDuet-HpaB+pRSFDuet-HpaC2表示HpaB构建在pETDuet质粒上，HpaC2构建在pRSFDuet质粒上。pETDuet-HpaB+pRSFDuet-HpaC2构建重组菌为双质粒表达，通过将pETDuet-HpaB和pRSFDuet-HpaC2两个质粒同时转入一个感受态细胞中构建重组菌。
按上述方案，所述的合成方法为：将底物白藜芦醇溶解在2-羟丙基-β-环糊精中，加入重组菌发酵液,OD600范围10-30，生物合成白皮衫醇。
优选地，所述反应体系还包括磷酸盐缓冲液。
优选地，反应体系中底物终浓度为0.1～80mM；磷酸盐缓冲液为磷酸钾缓冲液或者磷酸钠缓冲液，浓度为0.1～0.2M，pH为7.0-7.5。
优选地，所述反应温度为20～35℃，反应震荡转速为150～300rpm，反应时间为0.5～25h。
提供生物催化合成白皮衫醇的表达载体，其为pACYCDuet-HpaBC2(rbs)，其中：HpaBC2(rbs)的基因序列如SEQ ID No.4所示，第1564bp-1583bp为rbs序列，或为pETDuet-HpaB+pRSFDuet-HpaC2，pETDuet-HpaB+pRSFDuet-HpaC2构建重组菌为双质粒表达，通过将pETDuet-HpaB和pRSFDuet-HpaC2两个质粒同时转入一个感受态细胞中构建重组菌。
pACYCDuet-HpaBC2(rbs)的构建可采用如下方法：首先将HpaB酶构建到pACYCDuet-1载体上，得到pACYCDuet-HpaB，然后再将HpaC2酶通过RBS连接到pACYCDuet-HpaB上的HpaB酶后面，得到pACYCDuet-HpaBC2。也可先获得HpaBC2(rbs)基因片段，然后将其连接到载体pACYCDuet-1上。
提供生物催化合成白皮衫醇的重组菌，其是将上述表达载体转化到宿主细胞得到的。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
HpaBC是一种双组分黄素依赖的单加氧酶,HpaBC家族的酶由黄素依赖性单加氧酶(HpaB)和NAD(P)H:黄素氧化还原酶(HpaC)组成，本发明以白藜芦醇为底物通过HpaBC酶体系，实现了白藜芦醇到白皮衫醇的生物转化，白藜芦醇转化率高，可实现白藜芦醇的完全转化；
通过酶基因的选择，以及进一步结合质粒构建方法，构建的质粒等优化构建的效果优异的表达HpaBC酶体系的的重组质粒和重组菌，大大提高了白藜芦醇到白皮衫醇的产量，可适用于高底物浓度下白藜芦醇到白皮衫醇的生物转化，提升了生物催化合成性能。
生物合成反应中优选使用2-羟丙基-β-环糊精，其与底物互溶性好，可进一步促进反应效果的提升，实现高底物浓度的白藜芦醇到白皮衫醇的生物转化。
反应过程绿色环保，转化率高，合成效果优异。
附图说明
图1为白皮杉醇的生物催化合成路线。
图2为构建的多种载体组合。
图3构建的不同的表达载体全细胞和上清物的蛋白表达情况，左侧为全细胞的蛋白表达情况，右侧为上清液中的蛋白表达情况。
图4不同组合HpaBC在30mM底物浓度反应6h时的HPLC反应情况。反应条件：30mMresveratrol(dissolved in Cyclodextrin)，1％tween 80，200mM pH 7.5 KP buffercontaining glycerol(10％v/v)，OD 20，30℃200rpm。
图5不同组合HpaBC在30mM底物浓度反应19h时的HPLC反应情况。反应条件：30mMresveratrol(dissolved in Cyclodextrin)，1％tween 80，200mM pH 7.5 KP buffercontaining glycerol(10％v/v)，OD 20，30℃200rpm。
图6为pACYCDuet-HpaBC2(rbs)在不同温度下的反应情况a)25。b)28℃。c)20℃。反应条件：30mM resveratrol(dissolved in Cyclodextrin)，1％tween 80，200mM pH 7.5KP buffer containing glycerol(10％v/v)，OD 20，30℃200rpm。
图7为pACYCDuet-HpaBC2(rbs)在不同OD下的反应情况a)OD 10。b)OD 32。30mMresveratrol(dissolved in Cyclodextrin)，1％tween 80，200mM pH 7.5 KP buffercontaining glycerol(10％v/v)，30℃200rpm。
图8为pACYCDuet-HpaBC2(rbs)在不同底物浓度(50，80mM下的反应情况)a)50mMresveratrol。b)80mM resveratrol(resveratrol dissolved in Cyclodextrin)，1％tween 80，200mM pH 7.5 KP buffer containing glycerol(10％v/v)，OD 20，30℃，200rpm。
图9为pACYCDuet-HpaBC2(rbs)在不同浓度IPTG诱导的反应效果a)pACYCDuet-HpaBC2-0.2mM IPTG。b)pACYCDuet-HpaBC2-0.4mM IPTG。c)pACYCDuet-HpaBC2-0.6mMIPTG。d)pACYCDuet-HpaBC2-0.8mM IPTG。30mM resveratrol(dissolved inCyclodextrin)，1％tween 80，200mM，pH 7.5 KP buffer containing glycerol(10％v/v)，OD 20，30℃200rpm。
具体实施方式
实施例1载体的构建
A.首先人工合成HpaB酶基因，序列如SEQ ID No.1所示，通过克隆位点：BamHIHindIII克隆到pETduet-1载体的第一个多克隆位点上，得到了pETduet-HpaB，然后人工合成HpaC酶基因，序列如SEQ ID No.2所示，通过克隆位点：NdeI XhoI进一步克隆到上述的pETduet-HpaB载体的第二个多克隆位点上，得到了pETduet-HpaBC(MCS)载体。
人工合成HpaC2酶基因，序列如SEQ ID No.3所示，通过克隆位点：NdeI XhoI克隆到pETduet载体上，得到了pETduet-HpaC2载体。
所述HpaB酶基因序列如SEQ ID No.1所示，HpaB酶来源自P.aeruginosa菌株；
HpaC酶基因序列如SEQ ID No.2所示，记作HpaC1，HpaC酶来源自P.aeruginosa菌株；
HpaC酶基因序列如SEQ ID No.3所示，记作HpaC2，HpaC酶来源自Salmonellaenterica菌株。
B.构建质粒pETDuet-HpaBC2(rbs)
步骤1、以pETDuet-HpaC2为模板，用如下所示的上下游引物进行PCR扩增,反应体系为：
表1
PCR反应程序为：(1)98℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55～60℃退火15sec，(4)72℃延伸20sec～2min(根据目的片段长度按10sec扩增1000bp计算)，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸5min，12℃保藏产物。核酸电泳检测是否得到目的条带，检测正确后用限制性核酸内切酶Dpn I消化PCR产物中剩余的模板，体系(50μL)为：5μLCutSmart Buffer，2μL Dpn I，43μL PCR产物。在37℃消化5h，之后80℃灭活15min。用OMEGA回收试剂盒进行胶回收。
步骤2、将载体pETduet-HpaB采用如下所示的引物和高保真的DNA聚合酶进行扩增得到线性化的载体。核酸电泳检测是否得到目的条带，检测正确后用Dpn I消化PCR产物中剩余的模板，体系(50μL)为：5μL CutSmart Buffer，2μL Dpn I，43μL PCR产物。在37℃消化5h，之后80℃灭活15min。用OMEGA回收试剂盒进行胶回收。
步骤3、将步骤1中所得的扩增产物和步骤2中所得的线性化的载体在T5外切酶的作用下形成15bp或者20bp的粘性末端最终连接在一起。具体方法为：在5μL反应体系中按照摩尔比3:1加入目的片段和线性化载体(控制线性化载体的量为30～50ng)，再加入T5外切酶和buffer 4.0，不够5μL用水补足。T5外切酶加入T5外切酶后计时5min，时间到后立即加入50μL感受态细胞(大肠杆菌DH5α)进行正常转化，然后接种在含有适当抗生素的LB琼脂平板上。挑取所得的转化体并进行测序或者酶切鉴定。经测序比对表明成功制备得到质粒petduet-HpaBC2(rbs)。
pETduet-HpaBC2(rbs)的构建所需引物：
反扩petduet-HpaB载体所需引物：
正向引物：GGAAATGGAAGCACCGGTTTAAAAGCTTGCGGCCGCATAATG，如SEQ ID No.5所示；
反向引物：GATATATctccttAGGTACCTTACTGACGAATACGATCCAGAAC，如SEQ ID No.6所示；
扩增基因HpaC2所需引物：
正向引物：GGTACCTaaggagATATATCATGCAGGTTGATGAACAGCG，如SEQ ID No.7所示；
反向引物：TTAAACCGGTGCTTCCATTTCC，如SEQ ID No.8所示；
将所得的扩增产物和线性化的载体与T5外切酶孵育完成后转化到大肠杆菌，然后接种在含有适当抗生素的LB琼脂平板上。挑取所得的转化体并进行测序或者酶切鉴定。经测序比对表明成功制备得到质粒pETDuet-1carrying HpaBC2(rbs)。
C.pRSFDuet-HpaC2的构建方法如上，构建所需的引物如下：
以pETDuet-HpaC2为模板，用如下所示的上下游引物进行PCR扩增，反应体系和反应程序同上。
将载体pRSFDuet-1采用如下所示的引物和高保真的DNA聚合酶进行扩增得到线性化的载体。反应体系参照表1，反应程序同上。
反扩pRSFDuet载体所需引物：
正向引物：aagcttGCGGCCGCATAATG，如SEQ ID No.9所示；
反向引物：cgaattcGGATCCTGGCTGTG，如SEQ ID No.10所示；
扩增基因HpaC2所需引物：
正向引物：ACAGCCAGGATCCgaattcgATGCAGGTTGATGAACAGCG，如SEQ ID No.11所示；
反向引物：CATTATGCGGCCGCaagcttTTAAACCGGTGCTTCCATTTCC，如SEQ ID No.12所示；
D.pACYCDuet-HpaBC2(rbs)的构建方法如上，构建所需的引物如下：
以pETDuet-HpaBC2(rbs)为模板，用如下所示的上下游引物进行PCR扩增，反应体系和反应程序同上。
将载体pACYCDuet-1采用如下所示的引物和高保真的DNA聚合酶进行扩增得到线性化的载体。反应体系参照表1，反应程序同上。
反扩pACYCDuet载体所需引物：
正向引物：AAATGGAAGCACCGGTTTAAaattcgagctcggcgcgcc，如SEQ ID No.13所示；
反向引物：CGAAAATCTTCCGGTTTCATcggatcctggctgtggtgatg，如SEQ ID No.14所示；
扩增基因HpaBC2所需引物：
正向引物：ATGAAACCGGAAGATTTTCGTGC，如SEQ ID No.15所示；
反向引物：TTAAACCGGTGCTTCCATTTCC，如SEQ ID No.8所示；
表达载体pACYCDuet-HpaBC2(rbs):表示HpaB与HpaC2用RBS连接后再构建在pACYCDuet质粒上。pACYCDuet质粒的抗性是氯霉素。
pETDuet-HpaB+pRSFDuet-HpaC2表示HpaB构建在pETDuet质粒上，HpaC2构建在pRSFDuet质粒上，然后将两个质粒同时转入一个感受态细胞中。其中pETDuet质粒的抗性是氨苄青霉素,pRSFDuet质粒的抗性是卡那霉素。
pETDuet-HpaBC(MCS)表示HpaB与HpaC分别构建在pETDuet质粒的两个多克隆位点上。
实施例2重组菌的构建
以上述表达载体构建重组菌
重组菌的构建：
以pACYCDuet-HpaBC2质粒构建重组菌为例说明：
将重组质粒pACYCDuet-HpaBC2转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并在含有氯霉素(50ug/ml)的LB固体培养基培养，可以得到重组细胞E.coli pACYCDuet-HpaBC2。
其他表达如载体pETduet-HpaBC(MCS)质粒构建重组菌的方法参考如上。
质粒(pRSFduet-HpaC2)与pETDuet-HpaB共同转入感受态细胞即可得到pETDuet-HpaB+pRSFDuet-HpaC2重组菌；
各重组菌的蛋白的表达情况：
将构建好的大肠杆菌重组菌接种于3mL含有相应抗性基因的LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)中在37℃，220rpm下培养大约6h，取1mL转接到50mL含有相应抗性的TB培养基(蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油0.4％，KH2PO4 2.31g/L，K2HPO412.54g/L)中，37℃，220rpm下培养到OD600约为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，25℃诱导12h。诱导结束后的菌体在10℃，4000rpm离心10min以收集菌体，菌体收集后用pH7.5 100mM磷酸钾缓冲液清洗菌体用作后续反应的催化剂，评价菌体的蛋白表达情况，其中：由表达载体pETDuet-HpaB+pRSFDuet-HpaC2构建的重组菌和重组质粒pACYCDuet-HpaBC2构建的重组菌菌体的蛋白表达情况优异，具体蛋白表达情况如图3所示。
实施例3白藜芦醇到白皮衫醇的生物转化
用上述构建好的重组菌进行发酵，获得菌液，再进行反应。在反应瓶中加入相应浓度的菌液，OD600为10-32，底物白藜芦醇溶解在2-羟丙基-β-环糊精中，加入1％的吐温80，使用200mM的磷酸盐缓冲液，其中溶解10％(v/v)的甘油。30℃，200rpm开始反应。在相应的时间取样，取50μL样品，加入950μL乙腈，震荡，离心，取上清过膜，HPLC分析。
结果表明在20mM和30mM底物浓度下，pETDuet-HpaB+pRSFDuet-HpaC2，pACYCDuet-HpaBC2(rbs)具有优异的效果，其中pACYCDuet-HpaBC2(rbs)的效果最好，如图4所示：在6h时得到了最多的产物，并且最终将底物完全转化，如图5所示。
不同温度：20℃，25℃，28℃的生物合成效果如图6所示。
不同OD值的生物合成效果如图7所示。
进一步提升底物浓度，在50mM，80mM底物浓度下均有非常高的转化率，如图8所示。
不同诱导所需IPTG的浓度的合成效果，结果显示0.2mM就有较好效果，如图9所示。
使用pACYCDuet-HpaBC2(rbs)重组菌，底物浓度至80mM，底物白藜芦醇溶解在2-羟丙基-β-环糊精中，摩尔比1:7，1％tween 80，200mM pH 7.5 KP buffer(磷酸钾缓冲液)含有10％体积比的甘油，OD值20，30℃200rpm生物合成白皮衫醇，结果显示，底物白藜芦醇可完全转化为白皮衫醇，转化率近100％。
HPLC分析检测白藜芦醇和白皮衫醇的方法，C18柱，分析方法如下：流动相A为含有0.5％乙酸的水，流动相B为纯乙腈，流动相A和B的比例为70:30，流速为1mL/min。
上述方案仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
说明书核苷酸和氨基酸序列表
＜110＞ 河北维达康生物科技有限公司
＜120＞ 白皮衫醇的生物催化合成方法
＜160＞ ３
＜210＞ 1
＜211＞ 1563bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
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＜212＞ DNA
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＜400＞ 1
ggaaatggaa gcaccggttt aaaagcttgc ggccgcataa tg 42
＜210＞ 6
＜211＞ 44 bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
gatatatctc cttaggtacc ttactgacga atacgatcca gaac 44
＜210＞ 7
＜211＞ 40 bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
ggtacctaag gagatatatc atgcaggttg atgaacagcg 40
＜210＞ 8
＜211＞ 22 bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
ttaaaccggt gcttccattt cc 22
＜210＞ 9
＜211＞ 20 bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
aagcttgcgg ccgcataatg 20
＜210＞ 10
＜211＞ 21bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
cgaattcgga tcctggctgt g 21
＜210＞ 11
＜211＞ 40bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
acagccagga tccgaattcg atgcaggttg atgaacagcg 40
＜210＞ 12
＜211＞ 42bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
cattatgcgg ccgcaagctt ttaaaccggt gcttccattt cc 42
＜210＞ 13
＜211＞ 39bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
aaatggaagc accggtttaa aattcgagct cggcgcgcc 39
＜210＞ 14
＜211＞ 41bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
cgaaaatctt ccggtttcat cggatcctgg ctgtggtgat g 41
＜210＞ 15
＜211＞ 23bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
atgaaaccgg aagattttcg tgc 23
Claims (9)
1.一种生物催化合成白皮衫醇的方法，其特征在于：所述白皮衫醇的结构式为：
以白藜芦醇为底物通过HpaBC酶体系合成，所述的HpaBC酶体系由能够表达HpaB和HpaC基因，生成HpaB和HpaC酶的重组菌提供，所述HpaC酶基因序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1或权2所述的方法，其特征在于：HpaB酶基因序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组菌是将下述表达载体转化到宿主细胞得到的，所述的表达载体为：pACYCDuet-HpaBC2(rbs)，其中：HpaBC2(rbs)的基因序列如SEQ ID No.4所示,第1564bp-1583bp为rbs序列，或为pETDuet-HpaB+pRSFDuet-HpaC2，pETDuet-HpaB+pRSFDuet-HpaC2构建重组菌为双质粒表达，通过将pETDuet-HpaB和pRSFDuet-HpaC2两个质粒同时转入一个感受态细胞中构建重组菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将底物白藜芦醇溶解在2-羟丙基-β-环糊精中，加入重组菌发酵液，OD600范围10-30，生物合成白皮衫醇。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应体系还包括磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：反应体系中底物终浓度为0.1～80mM；磷酸盐缓冲液为磷酸钾缓冲液或者磷酸钠缓冲液，浓度为0.1～0.2M，pH为7.0-7.5。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应温度为20～35℃，反应震荡转速为150～300rpm，反应时间为0.5～25h。
8.生物催化合成白皮衫醇的表达载体，其特征在于：其为pACYCDuet-HpaBC2(rbs)，其中：HpaBC2(rbs)的基因序列如SEQ ID No.4所示，第1564bp-1583bp为rbs序列，或为pETDuet-HpaB+pRSFDuet-HpaC2，pETDuet-HpaB+pRSFDuet-HpaC2构建重组菌为双质粒表达，通过将pETDuet-HpaB和pRSFDuet-HpaC2两个质粒同时转入一个感受态细胞中构建重组菌。
9.生物催化合成白皮衫醇的重组菌，其是将权9所述的表达载体转化到宿主细胞得到的。
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