CN108315290A - 一种高产白藜芦醇大肠杆菌工程菌的构建方法及其应用 - Google Patents
一种高产白藜芦醇大肠杆菌工程菌的构建方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高产白藜芦醇大肠杆菌工程菌及相关生产白藜芦醇大肠杆菌工程菌的构建方法和应用，所述高产白藜芦醇大肠杆菌工程菌株命名为BL21‑pETduet‑sts::4cl‑aae，该工程菌经过IPTG诱导表达相应目的蛋白后，在加入终浓度为1 mM 4‑香豆酸及1 mM丙二酸的条件下，发酵培养24 h，通过HPLC检测到白藜芦醇产量为80.8 mg/L，转化效率高，在利用生物合成进行白藜芦醇的工业化生产中有着巨大的实用价值。其他相关生产白藜芦醇大肠杆菌工程菌株分别为BL21‑pETduet‑sts‑4cl、BL21‑pETduet‑4cl::sts、BL21‑pETduet‑sts::4cl，在加入终浓度为1 mM 4‑香豆酸条件下，发酵培养24 h，白藜芦醇产量分别为12.0 mg/L，24.2 mg/L，61.1 mg/L，转化效率高，也有着巨大的实用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和发酵工程领域，涉及一种高水平表达合成白藜芦醇的相关酶蛋白并生产白藜芦醇的大肠杆菌工程菌的构建方法与应用。
背景技术
白藜芦醇是植物中的一种非黄酮多酚化合物，作为一种抗毒素广泛存在于葡萄、虎杖等植物中。研究表明其在药理活性和保健功能方面都对人体的健康有益，比如能够防治心血管疾病，延缓衰老，尤其在治疗肿瘤方面，白藜芦醇更是被喻为最有前途的抗癌药物之一。因此，白藜芦醇在药物、保健品和化妆品等领域应用广泛，有着巨大的市场价值及社会需求。
白藜芦醇在植物中的天然合成途径为：第一步，L-苯丙氨酸在苯丙氨酸裂解酶（PAL）（EC 4.3.1.5）的作用下裂解为反式肉桂酸。第二步，肉桂酸经过肉桂酸-4-羟化酶（C4H）（EC 1.14.13.11）羟基化形成4-香豆酸。第三步，4-香豆酸在4-香豆酸：CoA连接酶（4CL）（EC 6.2.1.12）的催化下合成4-香豆酰CoA。第四步，1分子的4-香豆酰CoA与3分子的丙二酰CoA在芪合酶（STS）（EC 2.3.1.95）的作用下生成白藜芦醇。
目前从植物中提取白藜芦醇是生产白藜芦醇的主要方式，然而在植物中其含量微少，资源短缺，而且制取工艺复杂，分离难度大，提取纯度低，无法满足市场需求。化学方法虽然能够成功实现白藜芦醇的从头合成，但其步骤复杂、合成困难，且价格不菲，成品率也不高。利用基因工程通过微生物进行的生物合成白藜芦醇不仅工艺简单，而且产量丰厚，同时也保护了植物资源。
例如现有技术CN106032525A公开了一种合成白藜芦醇的基因工程菌，该基因工程菌是在E.coli BW25113中敲除限制葡萄糖合成酪氨酸的基因tyrR和trpED，并其染色体重组有粘红酵母的酪氨酸脱氨酶基因tal、欧芹的4-香豆酸:辅酶A连接酶基因4cl和葡萄的芪合酶基因sts；该基因工程菌以葡萄糖为底物合成白藜芦醇。该技术方案主要存在的问题如下：
（1）天然合成白藜芦醇的第四步还需要3分子的丙二酰辅酶A才能生成白藜芦醇，该现有技术虽可以利用基础能源葡萄糖作为底物进行合成，但丙二酰辅酶A在大肠杆菌细胞内含量有限，将会成为大量生产白藜芦醇的限速步骤。
（2）多酶催化的反应体系中，反应过程空间位置的关系及反应的先后顺序将大大影响到最终产物的产率
不同来源的基因在大肠杆菌宿主细胞中的表达情况不同，可以进一步的优化能够带来更高表达强度及催化活性的基因来进行搭配。
发明内容
针对目前白藜芦醇生物合成产量不高及现有技术存在的问题，本发明提供了一种高产白藜芦醇大肠杆菌工程菌及相关生产白藜芦醇大肠杆菌工程菌的构建方法和应用，该方法通过其它的方式带来了一些新的提高白藜芦醇产量的思路，即可自成一体，成为高效生产白藜芦醇的菌株，可也作为已有技术生物合成白藜芦醇高效菌株构建的补充进一步的优化和增产。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种高产白藜芦醇的大肠杆菌工程菌株，所述工程菌为BL21-pETduet-sts-4cl，其基因序列为SEQ ID NO: 1，在工程菌E.coli BL21中能够进行STS酶蛋白和4CL酶蛋白的表达，以及高效转化底物4-香豆酸合成白藜芦醇。
其中，sts基因来源于葡萄，4cl和aae基因来源于拟南芥。具体地，sts为葡萄中的芪合酶基因，4cl为拟南芥中的4-香豆酰CoA合成酶基因，aae为拟南芥中的丙二酰CoA合成酶基因。
由于葡萄中尤其在葡萄皮中白藜芦醇含量较为丰富，因此，本发明选择了葡萄来源的sts基因。
拟南芥作为模式生物已被研究的比较透彻，遗传信息资料相对齐全，具有生长周期短，遗传操作简单等特点，很多基因作为外源基因在大肠杆菌宿主中可以正常表达，因此，本发明选择了拟南芥来源的4cl和aae基因。本发明大量实验发现，通过二者结合能够产生协同效果。
本发明的优选方案之一为所述的一种高产白藜芦醇的大肠杆菌工程菌株为BL21-pETduet-4cl::sts，其基因序列为SEQ ID NO: 2，在工程菌E.coli BL21中能够进行融合蛋白4CL::STS的表达，以及高效转化底物4-香豆酸合成白藜芦醇。
本发明通过大量实验研究发现，无论是在多酶的克隆中或是在代谢的通路上，分子复合物的形成在生物合成中能够提高代谢效率。出于代谢工程的考虑，可以把两个或多个基因连接起来使其表达后形成一个融合蛋白，这个策略中的融合蛋白具有其中各个基因所表达蛋白的活性，类似一个多酶复合体，大大提高了目的产物的产量。同时，融合蛋白的使用能够减少表达体系中的载体数量，简化了重组系统的代谢途径。
本发明的优选方案之一为所述的一种高产白藜芦醇的大肠杆菌工程菌株为BL21-pETduet-sts::4cl，其基因序列为SEQ ID NO: 3，在工程菌E.coli BL21中能够进行融合蛋白STS::4CL的表达，以及高效转化底物4-香豆酸合成白藜芦醇。
本发明通过大量实验研究偶然发现，调换基因sts和4cl的顺序后，形成的融合蛋白中STS蛋白的活性中心与4CL蛋白的活性中心在空间上更靠近，因此在反应的连续性上更容易实现快捷、高效，进而提高产率。
本发明的优选方案之一为所述的一种高产白藜芦醇的大肠杆菌工程菌株为BL21-pETduet-sts::4cl-aae，其基因序列为SEQ ID NO: 4，在工程菌E.coli BL21中能够进行融合蛋白STS::4CL和AAE的表达，以及高效转化底物4-香豆酸与丙二酸合成白藜芦醇。
更为重要的是，本发明在BL21-pETduet-sts::4cl基础上加上aae基因表达的原因和超出预期的效果如下：
合成白藜芦醇需要1分子的对香豆酰CoA和3分子的丙二酰CoA，而丙二酰CoA是细胞内脂肪酸合成途径的中间代谢物，一方面其在细胞中的积累量较少，另一方面丙二酰CoA的合成与分解受到细胞的代谢调控。作为白藜芦醇生物合成的底物，提高丙二酰CoA的含量，保证白藜芦醇合成中原料的充足对最终Res产量具有重要的作用。
本发明的另一目的在于提供了一种所述高产白藜芦醇工程菌的构建方法，步骤包括：
从葡萄中克隆出来sts基因、从拟南芥中克隆出来4cl基因和aae基因；
将sts和4cl分别构建到共表达载体pETduet-1的MCS1及MCS2中，获得重组质粒pETduet-sts-4cl，利用其转化大肠杆菌BL21，得到工程菌BL21-pETduet-sts-4cl，抗性为Amp；
将4cl和sts通过linker连接，组成融合片段4cl::sts（其中4cl在前，sts在后），构建到共表达载体pETduet-1的MCS1中，获得重组质粒pETduet-4cl::sts，利用其转化大肠杆菌BL21，得到工程菌BL21-pETduet-4cl::sts，抗性为Amp；
将sts和4cl通过linker连接，组成融合片段sts::4cl（其中sts在前，4cl在后），构建到共表达载体pETduet-1的MCS1中，获得重组质粒pETduet-sts::4cl，利用其转化大肠杆菌BL21，得到工程菌BL21-pETduet-sts::4cl，抗性为Amp；
将aae基因构建到重组质粒pETduet-sts::4cl的MCS2中，获得重组质粒pETduet-sts::4cl-aae，利用其转化大肠杆菌BL21，得到工程菌BL21-pETduet-sts::4cl-aae，抗性为Amp。
通过该构建优选方法：选用pETduet共表达质粒操作简便，表达量大，容易诱导表达，表达稳定，重复性高，适合同时表达两个基因或复合体，该构建方法充分利用了pETduet载体适合基因共表达的优势，对整个基因表达体系合理的分配与布局，最大程度利用了该载体的优势。
本发明的另一目的在于提供所述的高产白藜芦醇的大肠杆菌工程菌株在生产白藜芦醇中的应用。在生产转化过程中效率高，在利用生物合成进行白藜芦醇的工业化生产中有着巨大的实用价值。
本发明相对于现有技术的有益效果包括：
1、STS蛋白和4CL蛋白融合成一个蛋白的过程中，因为酶的活性中心空间位置的关系，两个蛋白的融合排列顺序至关重要，大大影响其转化效率，融合蛋白STS::4CL比融合蛋白4CL::STS具有更高的转化效率。
2、本发明所述高产白藜芦醇大肠杆菌工程菌株命名为BL21-pETduet-sts::4cl-aae，该工程菌经过IPTG诱导表达相应目的蛋白后，在加入终浓度为1 mM 4-香豆酸及1 mM丙二酸的条件下，发酵培养24 h，通过HPLC检测到白藜芦醇产量为80.8 mg/L，转化效率高，在利用生物合成进行白藜芦醇的工业化生产中有着巨大的实用价值。
3、本发明构思下其他相关生产白藜芦醇大肠杆菌工程菌株分别为BL21-pETduet-sts-4cl、BL21-pETduet-4cl::sts、BL21-pETduet-sts::4cl，在加入终浓度为1 mM 4-香豆酸条件下，发酵培养24 h，白藜芦醇产量分别为12.0 mg/L，24.2 mg/L，61.1 mg/L，转化效率高，也有着巨大的实用价值。
附图说明
图 1：重组质粒pETduet-sts-4cl的构建示意图；
图 2：BL21-pETduet-sts-4cl的SDS-PAGE电泳图；
图 3：重组质粒pETduet-4cl::sts的构建示意图；
图 4：BL21-pETduet-4cl::sts的SDS-PAGE电泳图；
图 5：重组质粒pETduet-sts::4cl的构建示意图；
图 6：BL21-pETduet-sts::4cl的SDS-PAGE电泳图；
图 7：重组质粒pETduet-sts::4cl-aae的构建示意图；
图 8：BL21-pETduet-sts::4cl-aae的SDS-PAGE电泳图；
图 9：白藜芦醇标准品的HPLC标准曲线；
图 10：发酵菌液中白藜芦醇的HPLC图；
图 11：工程菌BL21-pETduet-sts-4cl、BL21-pETduet-4cl::sts、BL21-pETduet-sts::4cl、BL21-pETduet-sts::4cl-aae生产白藜芦醇能力的比较。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图，对本发明进行进一步说明，但本发明不局限于此。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，如《分子克隆实验指南》（Molecμlar Cloning:A Laboratory Manual, 2002）中所述的条件进行。
本发明的实施例中使用了以下菌株和质粒：
大肠杆菌（E.coli DH5α）：北京全式金生物科技有限公司。
大肠杆菌（E.coli BL21）：北京全式金生物科技有限公司。
pETduet-1质粒：共表达质粒，其上有MCS1和MCS2区，两个区中各自有多酶切位点适用于片段的插入，并且两个区有独立的T7启动子可以对该区的目的片段转录表达。
高产白藜芦醇大肠杆菌工程菌的构建
实施例1：工程菌BL21-pETduet-sts-4cl的构建及表达
1.1总RNA的提取及反转录
利用RNAplant Plus Reagent试剂盒（TIANGEN BIOTECH）对葡萄果皮及拟南芥的叶片组织进行总RNA的提取，接着对RNA样品用FastQuant RT Kit with gDNase（TIANGENBIOTECH）试剂盒进行反转录，制成cDNA，操作流程见试剂盒内说明书。
1.2基因sts和4cl的克隆
将拟南芥叶片组织制取的cDNA作为PCR反应的模版，根据NCBI上已知的4cl基因序列设计引物：F-pETduet-4cl-Nde I：GGAATTCCATATGGCGCCACAAGAA（划线部分为Nde I酶切位点）；R-pETduet-4cl-Xho I：CCCTCGAGTCACAATCCATTTGCTA（划线部分为Xho I酶切位点），进行PCR反应，克隆4cl。利用DNA纯化回收试剂盒（TIANGEN BIOTECH）对PCR产物进行切胶回收，具体操作方法参照试剂盒手册，1%琼脂糖凝胶电泳验证扩增结果。目的条带大小约为1.7 kb。
同理，将葡萄果皮制取的cDNA作为PCR反应的模版，根据NCBI上已知的sts基因序列设计引物：F-pETduet-sts-Nco I：CATGCCATGGCTTCAGTTGAGGAAT（划线部分为Nco I酶切位点）；R-pETduet-sts-Not I：ATTTGCGGCCGCTTAATTTGTAACTG（划线部分为Not I酶切位点），进行PCR反应，克隆sts，并对PCR产物进行切胶回收。目的条带大小约为1.2 kb。
1.3重组共表达质粒pETduet-sts-4cl的构建
4cl片段及载体pETduet同时进行Nde I/Xho I双酶切，然后在T4连接酶作用下进行连接并转化大肠杆菌DH5α，得到重组质粒pETduet-4cl。接着，构建好的质粒pETduet-4cl作为载体与sts片段进行Nco I/Not I双酶切，纯化回收后的产物连接并转化大肠杆DH5α，得到重组质粒pETduet-sts-4cl。将其转化大肠杆菌BL21得到工程菌BL21-pETduet-sts-4cl，其基因序列为SEQ ID NO: 1。构建过程见图1。
1.4工程菌BL21-pETduet-sts-4cl的表达研究
BL21-pETduet-sts-4cl在终浓度为1 mM IPTG的诱导下，25℃，140 r进行蛋白表达，5h后对表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳，见图2，结果表明BL21-pETduet-sts4cl不仅在43kDa左右有STS的蛋白条带，同时在67 kDa左右也有4CL的蛋白条带，证明重组质粒BL21-pETduet-sts-4cl成功实现了sts和4cl基因的共表达。
实施例2：工程菌BL21-pETduet-4cl::sts的构建及表达
2.1重组质粒pET28a-4cl的构建
以pETduet-sts-4cl为模板，设计引物：F-pET28a-4cl-Nco I：CATGCCATGGCGCCACAAGAACA（下划线部分为Nco I酶切位点）；R-pET28a-4cl-BamH I：CGCGGATCCCAATCCATTTGCTAGT（下划线部分为BamH I酶切位点），经过PCR扩增获得4cl片段，同时对4cl片段以及载体pET28a进行Nco I/BamH I双酶切，连接并转化大肠杆菌DH5α。得到重组质粒pET28a-4cl。
2.2重组融合表达质粒pET28a-4cl::sts的构建
以pETduet-sts-4cl为模板，引物设计为：F-pET28a-4cl::sts-BamH I：CGCGGATCC GGCATGGCTTCAGTT（下划线部分为BamH I酶切位点，斜体字为添加的甘氨酸序列）；R-pET28a-4cl::sts-Not I：ATTTGCGGCCGC TTAATTTGTAACTG（下划线部分为Not I酶切位点）。经PCR扩增回收后，sts与载体pET28a-4cl同时进行BamH I/Not I双酶切，连接并转化大肠杆菌DH5α。得到重组质粒pET28a-4cl::sts。
2.3重组融合表达质粒pET28a-4cl::sts的点突变
以重组质粒pET28a-4cl::sts为模板，设计引物：F-pET28a-4cl::sts点突变：TGGCATGGCTTCAGTTGAGGAATTTAG（下划线处碱基C被T替换）；R-pET28a-4cl::sts点突变：GATCCCAATCCATTTGCTAGTTTTGCC。经过PCR扩增纯化回收后，将DNA片段5’端磷酸化，首尾自连构建成新的质粒pET28a-4cl::sts点突变，将其转化大肠杆菌DH5α。得到重组质粒pET28a-4cl::sts点突变。
2.4融合表达质粒pETduet-4cl::sts的构建
将pETduet-4cl::sts点突变质粒进行Nco I/Not I双酶切，切胶回收4cl::sts片段，并对pETduet载体也进行Nco I/Not I双酶切，纯化回收后作为载体备用，将4cl::sts片段与pETduet连接并转化大肠杆菌DH5α，得到融合表达质粒pETduet-4cl::sts。将其转化大肠杆菌BL21得到工程菌BL21-pETduet-4cl::sts，其基因序列为SEQ ID NO: 2。构建过程见图3。
2.5工程菌BL21-pETduet-4cl::sts的表达研究
BL21-pETduet-4cl::sts在终浓度为1 mM IPTG的诱导下，25℃，140 r进行蛋白表达，5h后对表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳，见图4，结果表明BL21-pETduet-4cl::sts在110kDa左右有4CL::STS的融合蛋白条带，证明重组质粒BL21-pETduet-4cl::sts成功实现了4cl::sts融合基因的表达。
实施例3：工程菌BL21-pETduet-sts::4cl的构建及表达
3.1重组融合质粒pETduet-sts::4cl的构建
为了在sts和4cl中间插入linker，将已构建好的重组质粒pETduet-sts-4cl作为模板，设计引物：F-pETduet-sts::4cl自连-linker：GGATCTGGCATGGCGCCACAAGAACAA（下划线为linker）；R- pETduet-sts::4cl自连：ATTTGTAACTGTAGGAACGCTATGCAGCA。经过PCR扩增后形成的片段利用Blunting Kination Ligation KIT试剂盒（TaKaRa Biotechnology）进行5’端的磷酸化，首尾自连成为含有sts::4cl片段的自连质粒。
对pETduet-sts::4cl自连质粒进行Nco I/Not I双酶切，切胶回收sts::4cl片段，并对pETduet载体也进行Nco I/Not I双酶切，纯化回收后作为载体备用，将sts::4cl片段与pETduet连接并转化大肠杆菌DH5α，得到重组质粒pETduet-sts::4cl。将其转化大肠杆菌BL21得到工程菌BL21-pETduet-sts::4cl，其基因序列为SEQ ID NO: 3。构建过程见图5。
3.2工程菌BL21-pETduet-sts::4cl的表达研究
BL21-pETduet-sts::4cl在终浓度为1 mM IPTG的诱导下，25℃，140 r进行蛋白表达，5h后对表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳，见图6，结果表明BL21-pETduet-sts::4cl在110kDa左右有STS::4CL的融合蛋白条带，证明重组质粒BL21-pETduet-sts::4cl成功实现了sts::4cl融合基因的表达。
实施例4： 工程菌BL21-pETduet-sts::4cl-aae的构建及表达
4.1总RNA的提取及反转录
将拟南芥种子于终浓度为0.1 mM丙二酸的MS培养基中进行萌发培养，并对萌发幼苗进行总RNA的提取及反转录，获得cDNA，方法见1.1。
4.2基因aae的克隆
将2.1中制取的cDNA作为PCR反应的模版，根据NCBI上已知的aae基因序列设计引物：F-pETduet-aae-Mun I：CGCAATTGGATGGAAGTGTTTAAAGCAGCT（下划线为Mun I酶切位点）；R-pETduet-aae-Bln I：CGCCCTAGGTTATTCTTGATTTTCCAGAGA（下划线为Bln I酶切位点），进行PCR反应，克隆aae，其片段大小约为1.6 kb。
4.3重组质粒pETduet-sts::4cl-aae的构建
对aae基因片段和已构建的载体pETduet-sts::4cl进行Mun I/Bln I酶切，回收酶切后的产物，将aae片段与pETduet-sts::4cl连接并转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒pETduet-sts::4cl-aae，将其转化大肠杆菌BL21，获得高产白藜芦醇工程菌BL21-pETduet-sts::4cl-aae，其基因序列为SEQ ID NO: 4，抗性为Amp，具体构建示意图见图7。
4.4工程菌BL21-pETduet-sts::4cl-aae的表达研究
BL21-pETduet-sts::4cl-aae在终浓度为1 mM IPTG的诱导下，25℃，140 r进行蛋白表达，5 h后对表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳，见图8，结果表明BL21-pETduet-sts::4cl-aae不仅在110 kDa有STS::4CL的融合蛋白条带，同时在60 kDa也有AAE的蛋白条带，证明重组质粒BL21-pETduet-sts::4cl-aae成功实现了sts::4cl和aae基因的共表达。
实施例5：高产白藜芦醇大肠杆菌工程菌发酵生产白藜芦醇
5.1. 白藜芦醇HPLC标准曲线的绘制
将白藜芦醇标准品母液（100 mg/L）分别稀释为10 mg/L，25 mg/L，50 mg/L，100 mg/L，200 mg/L五个浓度梯度，并进行高效液相色谱分析，以白藜芦醇浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制白藜芦醇标准曲线，见图9。
5.2. 利用工程菌生产白藜芦醇的发酵方法
（1）将工程菌接入到含有AMP抗性的新鲜LB液体培养基中，37℃，200 r过夜培养作为种子，接菌量为1%；
（2）取适量种子4000 g离心10 min，去掉上清，收集菌体接入到M9培养基中，调节OD600=0.1，37℃，200 r进行培养；
（3）待OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为1 mM的IPTG，同时加入终浓度为1 mM的底物4-香豆酸（工程菌BL21-pETduet-sts::4cl-aae需再加1 mM的丙二酸），置于摇床中，30℃，250 r发酵培养24 h；
（4）取500 μL发酵液于干净离心管中，最大转数离心10 min，收集上清，加入50 μL盐酸（1 N），置于-20℃，过夜；
（5）室温溶解，加入500 μL乙酸乙酯充分振荡混匀，5000 g简短离心，如此操作萃取两次，并于旋转蒸发仪中干燥；
（6）500 μL甲醇（色谱纯）重悬沉淀制得白藜芦醇粗品，加入到上样瓶中进行HPLC检测；
（7）HPLC条件：DiamonsilTMODS C18色谱柱；流动相（乙腈:水）；流速（1.0 mL/min）；检测波长（306 nm）；进样量（20 μL）；室温；
（8）HPLC梯度洗脱条件：0.1-25 min（10%乙腈水→35%乙腈水）；25.01-30 min（80%乙腈水）；30.01-40 min（10%乙腈水）。
5.3. 发酵液中白藜芦醇的含量分析
工程菌发酵24 h，粗提后菌液的HPLC见图10，图中可见白藜芦醇标准品的出峰时间在第21 min，发酵样品的检测中可以看出，在21 min处有与白藜芦醇标准品相同的峰，因此可以认定为此峰即为白藜芦醇，将该处样品的峰面积代入到白藜芦醇标准曲线中计算出样品中的白藜芦醇含量。
将上述的高产白藜芦醇白藜芦醇大肠杆菌工程菌BL21-pETduet-sts-4cl、BL21-pETduet-4cl::sts、BL21-pETduet-sts::4cl、BL21-pETduet-sts::4cl-aae发酵后的白藜芦醇产量进行比较，结果见图11，由图可知，在24 h工程菌中的白藜芦醇产量达到最大，分别为12.0 mg/L，24.2 mg/L，61.1 mg/L，80.8 mg/L。BL21-pETduet-sts::4cl-aae为高产白藜芦醇大肠杆菌工程菌，白藜芦醇的产量最高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市启未生物科技有限公司
<120> 一种高产白藜芦醇大肠杆菌工程菌的构建方法及其应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8153
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> gene
<223> BL21-pETduet-sts-4cl的质粒基因序列
<400> 1
ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag 60
gagatatacc atggcttcag ttgaggaatt tagaaacgct caacgtgcca agggtccggc 120
cactatccta gccattggca cagctactcc tgaccactgt gtctaccagt ctgattatgc 180
tgattactat ttcagggtca ctaagagcga gcacatgact gagttgaaga agaagttcaa 240
tcgcatatgt gacaaatcaa tgatcaagaa gcgttacatt cacttgaccg aagaaatgct 300
tgaggagcac ccaaacattg gtgcttatat ggctccatct cttaacatac gccaagagat 360
tatcactgct gaggtaccta gacttggtag ggatgcagca ttgaaggctc ttaaagagtg 420
gggccaacca aagtccaaga tcacccatct tgtattttgt acaacctccg gtgtagaaat 480
gcccggtgcg gattacaaac tcgctaatct cttaggtctt gaaacatcgg ttagaagggt 540
gatgttgtac catcaagggt gctatgcagg tggaactgtc cttcgaactg ctaaggatct 600
tgcagaaaat aatgcaggag cacgagttct tgtggtgtgc tctgagatca ctgttgttac 660
attccgtggc ccttccgaag atgctttgga ctctttagtt ggccaagccc tttttggtga 720
tgggtcttca gctgtgattg ttggatcaga tccagatgtc tcgattgaac gaccactctt 780
ccaacttgtt tcagcagccc aaacatttat tcctaattca gcaggagcca ttgccggaaa 840
cttacgtgag gtggggctca cctttcattt gtggcccaat gtgcctactt tgatttctga 900
gaacatagag aaatgcttga cccaggcttt tgacccactt ggtattagcg attggaactc 960
gttattttgg attgctcacc caggtggccc tgcaattctc gatgcagttg aagcaaaact 1020
caatttagag aaaaagaaac tcgaagcaac taggcatgtg ttaagtgagt acggtaacat 1080
gtcaagtgca tgtgtgttgt ttattctgga tgagatgaga aagaaatcct tgaaggggga 1140
aaaggctacc acaggtgaag gattggattg gggagtatta tttggttttg ggccgggctt 1200
gaccatcgaa actgttgtgc tgcatagcgt tcctacagtt acaaattaag cggccgcata 1260
atgcttaagt cgaacagaaa gtaatcgtat tgtacacggc cgcataatcg aaattaatac 1320
gactcactat aggggaattg tgagcggata acaattcccc atcttagtat attagttaag 1380
tataagaagg agatatacat atggcgccac aagaacaagc agtttctcag gtgatggaga 1440
aacagagcaa caacaacaac agtgacgtca ttttccgatc aaagttaccg gatatttaca 1500
tcccgaacca cctatctctc cacgactaca tcttccaaaa catctccgaa ttcgccacta 1560
agccttgcct aatcaacgga ccaaccggcc acgtgtacac ttactccgac gtccacgtca 1620
tctcccgcca aatcgccgcc aattttcaca aactcggcgt taaccaaaac gacgtcgtca 1680
tgctcctcct cccaaactgt cccgaattcg tcctctcttt cctcgccgcc tccttccgcg 1740
gcgcaaccgc caccgccgca aaccctttct tcactccggc ggagatagct aaacaagcca 1800
aagcctccaa caccaaactc ataatcaccg aagctcgtta cgtcgacaaa atcaaaccac 1860
ttcaaaacga cgacggagta gtcatcgtct gcatcgacga caacgaatcc gtgccaatcc 1920
ctgaaggctg cctccgcttc accgagttga ctcagtcgac aaccgaggca tcagaagtca 1980
tcgactcggt ggagatttca ccggacgacg tggtggcact accttactcc tctggcacga 2040
cgggattacc aaaaggagtg atgctgactc acaagggact agtcacgagc gttgctcagc 2100
aagtcgacgg cgagaacccg aatctttatt tccacagcga tgacgtcata ctctgtgttt 2160
tgcccatgtt tcatatctac gctttgaact cgatcatgtt gtgtggtctt agagttggtg 2220
cggcgattct gataatgccg aagtttgaga tcaatctgct attggagctg atccagaggt 2280
gtaaagtgac ggtggctccg atggttccgc cgattgtgtt ggccattgcg aagtcttcgg 2340
agacggagaa gtatgatttg agctcgataa gagtggtgaa atctggtgct gctcctcttg 2400
gtaaagaact tgaagatgcc gttaatgcca agtttcctaa tgccaaactc ggtcagggat 2460
acggaatgac ggaagcaggt ccagtgctag caatgtcgtt aggttttgca aaggaacctt 2520
ttccggttaa gtcaggagct tgtggtactg ttgtaagaaa tgctgagatg aaaatagttg 2580
atccagacac cggagattct ctttcgagga atcaacccgg tgagatttgt attcgtggtc 2640
accagatcat gaaaggttac ctcaacaatc cggcagctac agcagagacc attgataaag 2700
acggttggct tcatactgga gatattggat tgatcgatga cgatgacgag cttttcatcg 2760
ttgatcgatt gaaagaactt atcaagtata aaggttttca ggtagctccg gctgagctag 2820
aggctttgct catcggtcat cctgacatta ctgatgttgc tgttgtcgca atgaaagaag 2880
aagcagctgg tgaagttcct gttgcatttg tggtgaaatc gaaggattcg gagttatcag 2940
aagatgatgt gaagcaattc gtgtcgaaac aggttgtgtt ttacaagaga atcaacaaag 3000
tgttcttcac tgaatccatt cctaaagctc catcagggaa gatattgagg aaagatctga 3060
gggcaaaact agcaaatgga ttgtgactcg agtctggtaa agaaaccgct gctgcgaaat 3120
ttgaacgcca gcacatggac tcgtctacta gcgcagctta attaacctag gctgctgcca 3180
ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt 3240
tgctgaaagg aggaactata tccggattgg cgaatgggac gcgccctgta gcggcgcatt 3300
aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc 3360
gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca 3420
agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc 3480
caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt 3540
tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac 3600
aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc 3660
ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt 3720
aacgtttaca atttctggcg gcacgatggc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 3780
atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 3840
tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt 3900
tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca 3960
tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca 4020
gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc 4080
tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt 4140
ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg 4200
gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc 4260
aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg 4320
ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga 4380
tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga 4440
ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta 4500
aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg 4560
ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact 4620
ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata 4680
agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatcatg attgaagcat 4740
ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 4800
aataggtcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 4860
tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 4920
aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 4980
tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 5040
agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 5100
taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 5160
caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 5220
agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 5280
aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 5340
gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 5400
tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 5460
gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 5520
ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 5580
ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 5640
aggaagcgga agagcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 5700
accgcatata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagta 5760
tacactccgc tatcgctacg tgactgggtc atggctgcgc cccgacaccc gccaacaccc 5820
gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc 5880
gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgaggcag 5940
ctgcggtaaa gctcatcagc gtggtcgtga agcgattcac agatgtctgc ctgttcatcc 6000
gcgtccagct cgttgagttt ctccagaagc gttaatgtct ggcttctgat aaagcgggcc 6060
atgttaaggg cggttttttc ctgtttggtc actgatgcct ccgtgtaagg gggatttctg 6120
ttcatggggg taatgatacc gatgaaacga gagaggatgc tcacgatacg ggttactgat 6180
gatgaacatg cccggttact ggaacgttgt gagggtaaac aactggcggt atggatgcgg 6240
cgggaccaga gaaaaatcac tcagggtcaa tgccagcgct tcgttaatac agatgtaggt 6300
gttccacagg gtagccagca gcatcctgcg atgcagatcc ggaacataat ggtgcagggc 6360
gctgacttcc gcgtttccag actttacgaa acacggaaac cgaagaccat tcatgttgtt 6420
gctcaggtcg cagacgtttt gcagcagcag tcgcttcacg ttcgctcgcg tatcggtgat 6480
tcattctgct aaccagtaag gcaaccccgc cagcctagcc gggtcctcaa cgacaggagc 6540
acgatcatgc tagtcatgcc ccgcgcccac cggaaggagc tgactgggtt gaaggctctc 6600
aagggcatcg gtcgagatcc cggtgcctaa tgagtgagct aacttacatt aattgcgttg 6660
cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 6720
caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgccagg gtggtttttc ttttcaccag 6780
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gtccacgctg gtttgcccca gcaggcgaaa atcctgtttg atggtggtta acggcgggat 6900
ataacatgag ctgtcttcgg tatcgtcgta tcccactacc gagatgtccg caccaacgcg 6960
cagcccggac tcggtaatgg cgcgcattgc gcccagcgcc atctgatcgt tggcaaccag 7020
catcgcagtg ggaacgatgc cctcattcag catttgcatg gtttgttgaa aaccggacat 7080
ggcactccag tcgccttccc gttccgctat cggctgaatt tgattgcgag tgagatattt 7140
atgccagcca gccagacgca gacgcgccga gacagaactt aatgggcccg ctaacagcgc 7200
gatttgctgg tgacccaatg cgaccagatg ctccacgccc agtcgcgtac cgtcttcatg 7260
ggagaaaata atactgttga tgggtgtctg gtcagagaca tcaagaaata acgccggaac 7320
attagtgcag gcagcttcca cagcaatggc atcctggtca tccagcggat agttaatgat 7380
cagcccactg acgcgttgcg cgagaagatt gtgcaccgcc gctttacagg cttcgacgcc 7440
gcttcgttct accatcgaca ccaccacgct ggcacccagt tgatcggcgc gagatttaat 7500
cgccgcgaca atttgcgacg gcgcgtgcag ggccagactg gaggtggcaa cgccaatcag 7560
caacgactgt ttgcccgcca gttgttgtgc cacgcggttg ggaatgtaat tcagctccgc 7620
catcgccgct tccacttttt cccgcgtttt cgcagaaacg tggctggcct ggttcaccac 7680
gcgggaaacg gtctgataag agacaccggc atactctgcg acatcgtata acgttactgg 7740
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gctagcaatg tcgttaggtt ttgcaaagga accttttccg gttaagtcag gagcttgtgg 2400
tactgttgta agaaatgctg agatgaaaat agttgatcca gacaccggag attctctttc 2460
gaggaatcaa cccggtgaga tttgtattcg tggtcaccag atcatgaaag gttacctcaa 2520
caatccggca gctacagcag agaccattga taaagacggt tggcttcata ctggagatat 2580
tggattgatc gatgacgatg acgagctttt catcgttgat cgattgaaag aacttatcaa 2640
gtataaaggt tttcaggtag ctccggctga gctagaggct ttgctcatcg gtcatcctga 2700
cattactgat gttgctgttg tcgcaatgaa agaagaagca gctggtgaag ttcctgttgc 2760
atttgtggtg aaatcgaagg attcggagtt atcagaagat gatgtgaagc aattcgtgtc 2820
gaaacaggtt gtgttttaca agagaatcaa caaagtgttc ttcactgaat ccattcctaa 2880
agctccatca gggaagatat tgaggaaaga tctgagggca aaactagcaa atggattggc 2940
ggccgcataa tgcttaagtc gaacagaaag taatcgtatt gtacacggcc gcataatcga 3000
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccca tcttagtata 3060
ttagttaagt ataagaagga gatatacata tggcagatct caattggatg gaagtgttta 3120
aagcagcttt ttcagaagcg tctaattctt gtgataggat tgcgattaaa gccgatggaa 3180
agagttactc ttatggccag ctaacatcgt ctgctttgag gatatctaaa ttgttcttaa 3240
aagatgatac gacaaatgga ggtcaagaaa ctaagaagta tgaagggttt ggtagtctaa 3300
aaggagctag aatcggaatt gtggcaaaac cttcagctga gtttgttgca ggagtcctgg 3360
ggacatggtt tagcggtggt gtagcggttc cacttgcact cagctatcct gaggctgaac 3420
tcttacatgt catgaatgat tcggatatat ctctgttatt gagcacagag gaccatagtg 3480
aaactatgaa aaccatcgca gcaaagagtg gtgctcgatt tcatcttatt cctcctgttg 3540
ttaactcaac ttcggaaact gttgcttgca atcagtttca ggatgacagt tttgaagcag 3600
aaggaaagtt tctagatgat ccagcattga tcgtctacac tagtggtaca actggtaagc 3660
caaaaggagt tgttcatact cacaacagca tcaattccca ggttagaatg ctcactgaag 3720
cttgggagta cacatctgct gatcattttc tccactgcct cccactacat catgttcatg 3780
ggcttttcaa cgctttattt gctcctcttt acgcacggtc tttggtggag tttttgccca 3840
aatttagtgt tagtggaatc tggcgtagat ggcgtgaatc atatccggtg aatgatgaaa 3900
aaaccaacga ctccataact gtatttactg gagttccaac catgtacact cggttgatac 3960
aaggttatga agcaatggat aaagagatgc aggactcgag cgcttttgct gcacggaagc 4020
ttcgcctaat gatgtctggc tcctctgctc tccctcgacc tgtcatgcat caatgggaaa 4080
gtatcacagg tcatcgtctt ttggaaagat atggcatgac tgagtttgta atggcaatgt 4140
caaacccctt acggggtgca cgaaatgcag gtactgtcgg caaaccgctt cctggtgtgg 4200
aggctaaaat aaaagaagat gaaaatgacg caaatggagt gggtgagata tgtgttaaaa 4260
gcccatcttt gttcaaggag tactggaatc ttccagaggt gactaaagaa tcatttacgg 4320
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ttctaggacg taatagcgct gacattatga aggttggagg atacaagtta tctgccttag 4440
aaatcgaatc aacccttctc gagcacccta ctgttgcaga atgttgcgtg ttggggttaa 4500
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agagaagaga ggatgagtca aaacctgtaa taaccttaga agaactgtgc ggttgggcta 4620
aagacaagct tgctccttac aagctaccaa caagattgct gatatgggag agcttgcctc 4680
gcaacgccat gggaaaggtg aacaaaaaag agctaaagaa atctctggaa aatcaagaat 4740
aacctaggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg cctctaaacg 4800
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ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca 4920
cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc 4980
gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct 5040
ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg 5100
ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc 5160
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attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg 5280
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tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag 5460
cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga 5520
tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac 5580
cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc 5640
ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta 5700
gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac 5760
gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat 5820
gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa 5880
gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg 5940
tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag 6000
aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc 6060
cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct 6120
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cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg 6240
ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc 6300
aatcatgatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 6360
atttagaaaa ataaacaaat aggtcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 6420
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 6480
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 6540
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 6600
tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 6660
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 6720
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 6780
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 6840
acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 6900
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 6960
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 7020
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 7080
ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 7140
taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 7200
cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 7260
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gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc 7380
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acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 7500
cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga 7560
tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc 7620
ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg 7680
tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa tgataccgat gaaacgagag aggatgctca 7740
cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac 7800
tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg 7860
ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga 7920
acataatggt gcagggcgct gacttccgcg tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga 7980
agaccattca tgttgttgct caggtcgcag acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc 8040
gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac cagtaaggca accccgccag cctagccggg 8100
tcctcaacga caggagcacg atcatgctag tcatgccccg cgcccaccgg aaggagctga 8160
ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc gagatcccgg tgcctaatga gtgagctaac 8220
ttacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc 8280
tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgccagggtg 8340
gtttttcttt tcaccagtga gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc ctggccctga 8400
gagagttgca gcaagcggtc cacgctggtt tgccccagca ggcgaaaatc ctgtttgatg 8460
gtggttaacg gcgggatata acatgagctg tcttcggtat cgtcgtatcc cactaccgag 8520
atgtccgcac caacgcgcag cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc cagcgccatc 8580
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cgcgtaccgt cttcatggga gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc agagacatca 8880
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tcggcgcgag atttaatcgc cgcgacaatt tgcgacggcg cgtgcagggc cagactggag 9120
gtggcaacgc caatcagcaa cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac gcggttggga 9180
atgtaattca gctccgccat cgccgcttcc actttttccc gcgttttcgc agaaacgtgg 9240
ctggcctggt tcaccacgcg ggaaacggtc tgataagaga caccggcata ctctgcgaca 9300
tcgtataacg ttactggttt cacattcacc accctgaatt gactctcttc cgggcgctat 9360
catgccatac cgcgaaaggt tttgcgccat tcgatggtgt ccgggatctc gacgctctcc 9420
cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc cagtagtagg ttgaggccgt tgagcaccgc 9480
cgccgcaagg aatggtgcat gcaaggagat ggcgcccaac agtcccccgg ccacggggcc 9540
tgccaccata cccacgccga aacaagcgct catgagcccg aagtggcgag cccgatcttc 9600
cccatcggtg atgtcggcga tataggcgcc agcaaccgca cctgtggcgc cggtgatgcc 9660
ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcga gatcgatctc gatcccgcga aattaatacg 9720
actcactata 9730
Claims (7)
1.一种高产白藜芦醇的大肠杆菌工程菌株，其特征在于：所述工程菌为BL21-pETduet-sts-4cl，其基因序列为SEQ ID NO: 1，在工程菌E.coli BL21中能够进行STS酶蛋白和4CL酶蛋白的表达，以及高效转化底物4-香豆酸合成白藜芦醇。
2.根据权利要求1所述的一种高产白藜芦醇的大肠杆菌工程菌株，其特征在于：所述工程菌为BL21-pETduet-4cl::sts，其基因序列为SEQ ID NO: 2，在工程菌E.coli BL21中能够进行融合蛋白4CL::STS的表达，以及高效转化底物4-香豆酸合成白藜芦醇。
3. 根据权利要求1所述的一种高产白藜芦醇的大肠杆菌工程菌株，其特征在于： 所述工程菌为BL21-pETduet-sts::4cl，其基因序列为SEQ ID NO: 3，在工程菌E.coli BL21中能够进行融合蛋白STS::4CL的表达，以及高效转化底物4-香豆酸合成白藜芦醇。
4. 根据权利要求1所述的一种高产白藜芦醇的大肠杆菌工程菌株，其特征在于：所述工程菌为BL21-pETduet-sts::4cl-aae，其基因序列为SEQ ID NO: 4，在工程菌E.coliBL21中能够进行融合蛋白STS::4CL和AAE蛋白的表达，以及高效转化底物4-香豆酸与丙二酸合成白藜芦醇。
5.根据权利要求4所述的一种高产白藜芦醇的大肠杆菌工程菌株，其特征在于：sts为葡萄中的芪合酶基因，4cl为拟南芥中的4-香豆酰CoA合成酶基因，aae为拟南芥中的丙二酰CoA合成酶基因。
6.一种根据权利要求1-5任一项所述高产白藜芦醇工程菌的构建方法，步骤包括：
从葡萄中克隆出来sts基因、从拟南芥中克隆出来4cl基因和aae基因；
将sts和4cl分别构建到共表达载体pETduet-1的MCS1及MCS2中，获得重组质粒pETduet-sts-4cl，利用其转化大肠杆菌BL21，得到工程菌BL21-pETduet-sts-4cl，抗性为Amp；
将4cl和sts通过linker连接，组成融合片段4cl::sts（其中4cl在前，sts在后），构建到共表达载体pETduet-1的MCS1中，获得重组质粒pETduet-4cl::sts，利用其转化大肠杆菌BL21，得到工程菌BL21-pETduet-4cl::sts，抗性为Amp；
将sts和4cl通过linker连接，组成融合片段sts::4cl（其中sts在前，4cl在后），构建到共表达载体pETduet-1的MCS1中，获得重组质粒pETduet-sts::4cl，利用其转化大肠杆菌BL21，得到工程菌BL21-pETduet-sts::4cl，抗性为Amp；
将aae基因构建到重组质粒pETduet-sts::4cl的MCS2中，获得重组质粒pETduet-sts::4cl-aae，利用其转化大肠杆菌BL21，得到工程菌BL21-pETduet-sts::4cl-aae，抗性为Amp。
7.根据权利要求1-5任一项所述的高产白藜芦醇的大肠杆菌工程菌株在生产白藜芦醇中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180724 |
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