CN111733179A - 产油微生物耶氏解脂酵母合成白藜芦醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物合成领域，具体而言，涉及产油微生物耶氏解脂酵母合成白藜芦醇的方法及应用。本发明利用同源重组技术在耶氏解脂酵母Po1f中进行4‑香豆酸‑辅酶A连接酶（4‑CL来源于拟南芥）和二苯乙烯合成酶（STS来源于葡萄）的表达，重组菌株Polf‑At4CL‑VvSTS在添加对香豆酸的YPD培养基中白藜芦醇含量与对照菌Polf相比变化较大，在表达菌株4号中获得674μg/L的白藜芦醇含量。

Description

产油微生物耶氏解脂酵母合成白藜芦醇的方法
技术领域
本发明属于微生物合成领域，具体而言，涉及产油微生物耶氏解脂酵母合成白藜芦醇的方法及应用。本发明利用同源重组技术在耶氏解脂酵母Po1f中进行4-香豆酸-辅酶A连接酶（4-CL来源于拟南芥）和二苯乙烯合成酶（STS来源于葡萄）的表达，并添加外源对香豆酸进行发酵，从而构建能够产白藜芦醇的耶氏解脂酵母细胞工厂。
背景技术
白藜芦醇是一种非黄酮类多酚化合物，是许多植物受到刺激时产生的一种抗毒素,可在葡萄叶及葡萄皮中合成，是葡萄酒和葡萄汁中的生物活性成分。目前天然白藜芦醇的主要植物来源是虎杖（Polygonumcuspidatum）和葡萄（Vitis）。白藜芦醇是有益于人类健康的非黄酮类多酚化合物，天然植物中提取的白藜芦醇不能满足人们的需求，因此，科研工作者们一直致力于研究出快速、安全的化学、生物合成方法来生产白藜芦醇。
随着耶氏解脂酵母基因组信息的公布和遗传操作工具的完善，研究者们可以在分子生物学水平上对耶氏解脂酵母进行研究。白藜芦醇的合成需要三分子丙二酰辅酶A和一分子对香豆酸辅酶A。耶氏解脂酵母是产油酵母，富含乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A，能够提供白藜芦醇合成所需的前体物质丙二酰辅酶A。而白藜芦醇合成另外一个重要前体物质对香豆酸辅酶A则可以在耶氏解脂酵母中通过外源加入对香豆酸并在转入的4-香豆酸-辅酶A连接酶（4-CL来源于拟南芥）催化下合成。最后，在耶氏解脂酵母中三分子丙二酰辅酶A和一分子对香豆酸辅酶A在二苯乙烯合成酶（STS来源于葡萄）的作用下合成白藜芦醇。
发明内容
本发明提供了一种能够产生白藜芦醇的生物方法和产生白藜芦醇的耶氏解脂酵母菌株。
本发明的内容包括：将分别来源于拟南芥和葡萄的4-CL、STS基因克隆形成的重组表达载体pCRCyl-At4CL-VvSTS及表达4-CL、STS基因的重组耶氏解脂酵母菌株，还有产生白藜芦醇的方法。
本发明的重组酵母菌株是将4-CL、STS基因制备重组质粒，并导入耶氏解脂酵母形成。
本发明优选为：根据来源于拟南芥和葡萄的4-CL、STS基因，设计引物将其克隆到单拷贝质粒pCRCylm，形成重组质粒pCRCyl-At4CL-VvSTS。
具体地，将质粒pCRCyl-At4CL-VvSTS经限制性内切酶Not I酶切后回收转化耶氏解脂酵母Polf。经过同源重组后得到重组酵母菌株Polf-At4CL-VvSTS。
本发明的另一方面，重组菌株经培养后检测，酵母细胞能够在外源添加对香豆酸的条件下产生白藜芦醇，最高白藜芦醇含量(Polf-At4CL-VvSTS)为674 μg/L。
附图说明
图1重组质粒pCRCyl-At4CL-VvSTS。
图2 酶切质粒图。
图3耶氏解脂酵母重组菌株PCR
具体实施方式
实施例1：重组质粒pCRCyl-At4CL-VvSTS的构建。
来源于拟南芥和葡萄的4-CL、STS基因具有完整的基因组序列，这部分由公司代为合成，得到重组质粒pCRCyl-At4CL-VvSTS，如图1所示。
感受态细胞制备：从YL Po1f甘油管涂布与YPD（10 g/L酵母浸粉，20 g/L胰蛋白胨，20 g/L葡萄糖，15 g/L琼脂）平板，28℃静置培养9-10 h。培养时间结束后，最好的酵母细胞状态是新鲜酵母细胞生长层覆盖在培养基上，且没有变褶皱。将Po1f重悬于1 mL TE（10 mMTris-HCL，1 mM EDTA，pH7.5-8.0，高压灭菌，常温保存）溶液中（1.5 mL EP管中），10000 rpm离心1 min，弃上清。重悬细胞于600 μL醋酸锂溶液（0.1 M，pH=6.0）中，28℃静置水浴1 h，且勿晃动样品。1 h水浴后，3000 rpm离心2 min，弃上清。轻柔地重悬细胞于80-120 μL醋酸锂溶液（0.1 M，pH=6.0）中（可用于2-3次转化）。
酶切质粒：将含有重组质粒的大肠杆菌接种到含100 mg/L卡那霉素的LB液体培养基（蛋白胨，10 g/L；酵母膏，5 g/L；NaCl，10 g/L）。经37℃培养过夜，提取质粒（参照植物快捷DNA提取试剂盒说明书进行）。将回收好的质粒用NotⅠ进行酶切，酶切后进行电泳检测，如图2所示。-20℃保存。
重组YL Po1f的构建：取40μL感受态细胞+5μL：2（或3）μL鲑鱼精DNA（加前煮沸5-10min）+3（或2）μL转化DNA片段，轻弹混匀于1.5 mL灭菌EP管中。28℃静置水浴15 min，切勿晃动样品。水浴后加入350μL 40%（w/v）PEG4000（2 g PEG4000溶解于0.1 M醋酸锂，可10%乙酸调节pH=6.0，定容至5 mL，滤菌；现用现配，或4℃保存1-2周）（0.1 M，pH=6.0）和16 μL 1 MDTT（154.25 mg DTT溶解于1 mL去离子水，滤菌，-20℃冻存）（终浓度40 mM），轻弹混匀，28℃静置水浴1 h，切勿晃动样品。水浴后，逐滴加入40 μL DMSO(终浓度接近10%)，39℃水浴热激10 min。热激后加入600μL醋酸锂（0.1 M，pH=6.0），轻轻涂布于5块选择性平板YNB-N5000（1.7 g/L YNB，10 g/L葡萄糖，5 g/L硫酸铵，20 g/L琼脂，pH 5.5-6.0），28℃静置培养。转化子将会在2-3天后出现。出现后的转化子，重复上述筛选步骤，能够稳定遗传，则说明得到稳定遗传的转化子。稳定遗传的转化子在YNB-N5000液体培养基，28℃培养3天，-80℃保存于30%甘油管中。最终获得了耶氏解脂酵母重组菌株Polf-At4CL-VvSTS。
和对照菌株YL Po1f。将摇瓶培养的剩余菌体用布氏漏斗真空抽滤分离得到，提取重组耶氏解脂酵母基因组DNA（参照植物快捷DNA提取试剂盒说明书进行），以此为模板，以Po1f-F和Po1f-R为引物，进行PCR验证。
Po1f-F：5’–CTTAAGCTTATGGCCTCCGTCGAGG–3’
Po1f-R：5’– AGTTGGTGACCATAGGGATAGAGTGGAGGAC–3’
反应体系及扩增条件，95℃预变性3min，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，循环数30，72℃补偿延伸10min。PCR验证结果如图3，耶氏解脂酵母重组菌株YL Polf-At4CL-VvSTS得到的片段为1034 bp，说明质粒已成功转化进入耶氏解脂酵母中。
白藜芦醇细胞工厂发酵生产：
（1）重组耶氏解脂酵母Polf-At4CL-VvSTS白藜芦醇产量的测定
待测样品的测定：在250 mL的摇瓶中利用YPD（蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L）培养基并添加对香豆酸16 mg/L进行培养对照菌株Po1f以及重组筛选菌株1，2，3，4，发酵条件为28℃，200 rpm，发酵84 h。取10 mL发酵菌液，加入10 mL乙酸乙酯进行萃取5h，4000 rpm离心10 min，将上层液分离到另一个离心管氮气吹干，并加入1 mL甲醇溶解，进行高效液相色谱检测。
采用高效液相色谱分析检测白藜芦醇含量，结果如表1，重组4号菌株白藜芦醇产 量最高可达674 μg/L。
菌株 对照 重组1 重组2 重组3 重组4
产量（μg/L） 0 624 508 548 674
表1发酵后各菌株白藜芦醇含量。
序列表
<110> 山东理工大学
<120> 产油微生物耶氏解脂酵母合成白藜芦醇的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1698
<212> DNA
<213> 拟南芥 (Arabidopsis thaliana)
<400> 1
tccggaatgg ctcctcaaga gcaagccgtg tcccaagtca tggagaagca gtccaataac 60
aacaactccg acgtgatctt cagatccaag ctccccgaca tctacattcc caaccacctc 120
tctctgcacg actacatttt ccagaacatc tctgagttcg ctaccaagcc ttgtctgatt 180
aacggcccta ccggccacgt gtacacttac tccgacgtcc acgtcatctc ccgacagatt 240
gccgctaact ttcacaagct cggcgtgaat cagaacgacg tcgtgatgct gctgctgccc 300
aactgccccg agtttgtcct ctcttttctg gccgcctctt tcagaggcgc cactgctact 360
gccgctaacc cctttttcac ccccgccgag attgccaaac aagccaaggc ctccaacact 420
aagctgatca tcaccgaggc cagatacgtc gataagatca agcccctcca gaatgacgac 480
ggtgtggtga tcgtctgcat tgacgacaac gagtctgtgc ccattcccga gggttgtctg 540
agatttaccg agctgaccca gtctaccacc gaggcctccg aagtcatcga ctctgtggag 600
atctcccccg atgacgtcgt ggctctcccc tactcttccg gcaccactgg tctccctaag 660
ggcgtcatgc tgacccacaa gggtctcgtg acctctgtcg cccagcaagt cgacggtgag 720
aaccccaatc tgtacttcca ctccgacgac gtgattctgt gcgtgctgcc catgttccat 780
atctatgccc tcaactccat catgctgtgc ggtctgcgag tcggcgctgc tatcctcatc 840
atgcccaagt tcgagatcaa tctgctgctg gagctcattc agcgatgcaa agtgaccgtc 900
gcccccatgg tcccccctat tgtgctggct atcgccaaat cctctgagac cgagaagtac 960
gacctctcct ccattcgagt cgtcaaatcc ggcgctgctc ctctgggtaa ggaactggag 1020
gacgccgtca acgccaagtt ccccaacgcc aaactcggcc aaggctacgg tatgactgag 1080
gctggtcccg tgctggccat gtctctcggc ttcgctaagg agcccttccc cgtcaagtcc 1140
ggcgcttgcg gcaccgtcgt ccgaaacgct gagatgaaga ttgtggaccc cgataccggt 1200
gactccctct cccgaaacca acccggcgag atctgcattc gaggccatca gatcatgaag 1260
ggctatctga acaaccccgc cgccaccgcc gagactatcg acaaggacgg ctggctgcac 1320
accggtgaca tcggcctcat tgacgacgat gacgaactgt tcatcgtgga tcgactcaag 1380
gagctgatca agtacaaggg cttccaagtc gctcccgccg aactcgaggc tctgctgatc 1440
ggccaccccg acatcaccga tgtcgccgtg gtcgccatga aggaagaggc cgctggtgaa 1500
gtgcccgtgg ccttcgtcgt caagtctaaa gactccgagc tgtccgagga cgacgtcaag 1560
cagttcgtgt ccaagcaagt cgtgttctac aagcgaatca ataaggtgtt cttcaccgaa 1620
tctatcccta aggccccctc tggcaagatt ctgcgaaagg atctgcgagc caagctggcc 1680
aacggtctgt aaggtacc 1698
<210> 2
<211> 1191
<212> DNA
<213> 葡萄(Vitis)
<400> 2
aagcttatgg cctccgtcga ggagtttcga aacgcccaga gagctaaggg ccccgccact 60
attctggcca tcggtactgc tacccccgac cactgtgtgt accagtccga ctacgctgac 120
tactacttcc gagtcaccaa gtccgaacac atgaccgagc tgaagaagaa gtttaaccga 180
atttgtgata agtctatgat caagaagcga tacatccatc tgaccgagga gatgctggag 240
gagcatccca acatcggcgc ctacatggcc ccctctctga atatccgaca agagatcatc 300
accgccgagg tgcccaaact cggcaaggag gccgccctca aggctctgaa ggagtggggc 360
cagcctaagt ccaagatcac ccatctggtc ttctgcacca cctccggtgt cgagatgccc 420
ggtgccgact ataagctggc caatctgctg ggtctggaga cctctgtccg acgagtgatg 480
ctgtaccacc aaggctgtta cgccggtggc accgtgctcc gaaccgctaa ggatctggcc 540
gagaacaacg ccggtgctcg agtgctggtg gtgtgttccg agatcaccgt cgtgaccttc 600
cgaggccctt ccgaggatgc cctcgactct ctcgtcggcc aagccctctt cggcgatggt 660
tctgccgctg tgattgtggg ttccgacccc gacgtctcta tcgagcgacc tctgttccag 720
ctcgtgtccg ccgctcagac tttcatccct aactccgccg gcgctattgc cggtaacctc 780
cgagaggtcg gtctgacctt tcacctctgg cccaacgtcc ccactctgat ctccgagaac 840
gtcgagaagt gtctgactca agccttcgac cccctcggta tctccgactg gaactctctg 900
ttctggattg ctcaccccgg tggccccgcc attctcgatg ctgtggaggc caagctgaat 960
ctggacaaga agaagctgga ggccacccga cacgtcctct ccgagtacgg caatatgtcc 1020
tccgcttgcg tgctgttcat tctggacgag atgcgaaaga agtcccacaa gggcgagaag 1080
gccaccactg gcgagggtct ggactggggt gtcctcttcg gcttcggtcc cggcctcacc 1140
atcgagactg tcgtcctcca ctctatccct atggtcacca actaacctag g 1191

Claims (3)

1.一种产白藜芦醇的耶氏解脂酵母细胞工厂的构建技术，其特征是，将4-香豆酸-辅酶A连接酶（4-CL来源于拟南芥）和二苯乙烯合成酶（STS来源于葡萄）通过同源重组的方法转入耶氏解脂酵母Po1f，再添加外源添加对香豆酸的发酵工艺下获得含量达674 μg/L的重组耶氏解脂酵母Polf-At4CL2-VvSTS3菌株。
2.根据权利要求1所述的重组菌株Polf-At4CL2-VvSTS3的制备方法，其特征是，4-香豆酸-辅酶A连接酶（4-CL来源于拟南芥）和二苯乙烯合成酶（STS来源于葡萄），其核苷酸序列如YL ID NO: 1，YL ID NO: 2所示，将两个基因连接至整合型质粒pCRCylm上，然后将该重组质粒通过醋酸锂转化法转化到耶氏解脂酵母Polf的感受态细胞中，挑选阳性克隆进行发酵培养。
3.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征是在YPD培养基中添加对香豆酸，并在28℃，200 rpm的发酵参数下培养重组酵母细胞。
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