CN111778167A - 高产桦木酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

高产桦木酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高产桦木酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。该菌株为菌株BA‑1和BA‑2中的至少一种；所述菌株BA‑1以酿酒酵母为出发菌株，敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因，过表达ERG8、ERG10、tHMG1、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1、UPC2‑1、SmFPPS、AtSQS1、AtSQE2、AtLUP、GDH2、GDH、CYP716A155和RoCPR1基因；将AtLUP、CYP716A155和RoCPR1基因整合到菌株BA‑1染色体GAL80位点可获得菌株BA‑2。本发明构建的菌株通过发酵培养，其桦木酸的产量可以达到1.5g/L。

Description

高产桦木酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程和代谢工程领域，特别涉及一株高产桦木酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
桦木酸(Betulinic acid)，又称白桦脂酸，是一种羽扇豆烷型五环三萜类化合物，最早发现于白桦树树皮中，桦木酸及其衍生化合物具有多种药理活性，如抗肿瘤活性、抗HIV活性、抗菌、抗炎和免疫调节等，特别是在抗黑色素瘤和艾滋病方面有显著的活性。早在20世纪90年代，研究表明桦木酸对黑色素瘤细胞具有极强的选择性细胞毒性(Pisha E,etal.Nature Medicine,1995,1(10):1046-1051)，近年来，随着对桦木酸药理活性更加深入的研究，发现桦木酸对尤文氏肉瘤、神经母细胞瘤和髓母细胞瘤等儿童常见细胞瘤均有抑制作用(Fulda S,et al.International Journal of Cancer,2015,82(3):435-441)。
桦木酸不仅可以选择性抑制肿瘤细胞的生长，而且对正常细胞无毒性或者毒性很小，相比于其它化疗药物，其副作用也更少，同时桦木酸在与其它抗肿瘤药物联合使用，会出现协同作用，增强抗肿瘤活性，如将桦木酸与长春新碱在小鼠黑色素瘤细胞B16F10模型中联合使用，可以产生协同的细胞毒性效应，使肿瘤细胞分裂停滞在不同周期，从而导致B16F10黑色素瘤细胞的凋亡(Sawada N,et al.Br J Cancer,2004,90(8):1672-1678)。
此外，研究表明，桦木酸可以通过抑制包膜介导的HIV-1病毒与正常细胞膜的融合，阻碍病毒对细胞膜的吸附与融合，阻止其形成成熟的HIV蛋白，从而降低HIV的感染性(Holzsmith S L,et al.Antimicrob Agents Chemother,2001,45(1):60-66)。近年来，通过对桦木酸C-3和C-28结构的修饰，发现在桦木酸C-3位羟基引入二甲基丁二酰基团，得到衍生物PA-457(Bevirimat)，该化合物通过阻断Gag蛋白，阻止外壳释放，抑制病毒的转移与扩散，从而抑制HIV病毒的复制(Li F,et al.PNAS,2003,100(23):13555-60)，相比于桦木酸具有更好的抗HIV活性，目前该化合物已经在I和II期临床阶段取得成功。对桦木酸C-28位进行结构修饰，通过五步反应合成桦木酸酰胺类衍生物RPR103611，该化合物作用机制与PA-457不同，其主要是通过抑制HIV-1跨膜蛋白gp41，干扰病毒与细胞膜的融合，从而阻止HIV病毒的入侵与感染，其抗HIV-1型病毒的IC50值为0.04～0.1μmol/L，是一种非常具有成药前景的HIV细胞膜融合抑制剂(Mayaux J F,et al.PNAS,1994,91(9):3564-3568)。
目前桦木酸的制备方法主要有两种，一种是通过天然植物直接提取分离，虽然随着提取方法的不断改进，提取效率不断提高，但由于天然植物中桦木酸的含量较低，因此产量仍然不高，且会消耗大量植物资源和有机试剂。而在白桦树树皮中，桦木醇的含量远远高于桦木酸的含量，因此另一种方法就是通过化学合成方法将桦木醇合成桦木酸，但其合成路线较长，反应条件苛刻，杂质较多，纯化困难，因此不适合于大规模工业化生产。
近年来，随着合成生物学的飞速发展，越来越多的药用活性成分通过这种绿色、高效的方法生产，如青蒿素、紫杉醇、丹参酮、灯盏乙素等都在合成生物学研究中取得了重大突破。目前桦木酸的生物合成途径已经明了，通过MVA途径产生的萜类前体化合物IPP和DMAPP可以在法呢烯焦磷酸合成酶催化下生成FPP(法呢烯焦磷酸)，FPP在角鲨烯合成酶催化下生成角鲨烯，继而在鲨烯环氧化酶催化下生成2,3-氧化鲨烯，进一步通过羽扇豆醇合成酶催化生成羽扇豆醇，最后通过细胞色素P450酶氧化生成桦木酸(图1表示桦木酸在酿酒酵母工程菌内的生物合成途径)。在之前的研究中已有生产桦木酸的酿酒酵母工程菌株的报道(Chen Z,Li J,Li C,et al.Bmc Biotechnology,2016,16(1):59)，但由于所选的细胞色素P450具有底物宽泛性，当以羽扇豆醇为底物时其氧化效率较低，同时由于对酿酒酵母MVA途径的优化还不够完善，因此桦木酸的产量仍然较低。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株高产桦木酸的酿酒酵母工程菌。
本发明的另一目的在于提供所述高产桦木酸的酿酒酵母工程菌的构建方法。
本发明的又一目的在于提供所述高产桦木酸的酿酒酵母工程菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一株高产桦木酸的酿酒酵母工程菌，为菌株BA-1和BA-2中的至少一种；
所述菌株BA-1以酿酒酵母为出发菌株，敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因，过表达ERG8、ERG10、tHMG1、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1、UPC2-1、SmFPPS、AtSQS1、AtSQE2、AtLUP、GDH2、GDH、CYP716A155和RoCPR1基因；其中，
tHMG1和UPC2-1基因整合到酿酒酵母染色体TY3位点；
IDI1和SmFPPS基因整合到酿酒酵母染色体TY4位点；
GDH2和GDH基因整合到酿酒酵母染色体TY1Cons1位点；
AtSQS1和AtSQE2基因整合到酿酒酵母染色体HIS3位点；
ERG8、ERG10、ERG12、ERG13和ERG19基因整合到酿酒酵母染色体Gal7位点；
AtLUP、CYP716A155和RoCPR1基因整合到酿酒酵母染色体NDT80位点；
所述菌株BA-2以菌株BA-1为出发菌株，将AtLUP、CYP716A155和RoCPR1基因整合到菌株BA-1染色体GAL80位点。
所述的酿酒酵母优选为酿酒酵母BY4741。
所述的敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因为运用CRISPR-Cas9基因敲除系统进行基因敲除，具体步骤如下：
(A)将LPP1、DPP1和GDH1基因的crRNA spacer核酸序列SEQ ID NO.4通过限制性内切酶BsaΙ连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT-1；将PEP4和PAH1基因的crRNA spacer核酸序列SEQ ID NO.5通过限制性内切酶BsaΙ连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT-2；
(B)将重组质粒pCRCT-1转化酿酒酵母，经过培养筛选，得到敲除LPP1、DPP1和GDH1基因的菌株；然后将重组质粒pCRCT-2转化敲除LPP1、DPP1和GDH1基因的菌株，再次培养筛选，得到敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因的菌株。
步骤(B)中所述的酿酒酵母优选为酿酒酵母BY4741。
步骤(B)中所述的培养的温度优选为30℃。
步骤(B)中所述的筛选为通过SD-URA缺陷培养基进行筛选；其中，所述SD-URA缺陷培养基的配方如下：YNB(YNB培养基)6.7g/L，尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体SD-URA缺陷培养基在制备时多添加20g/L的琼脂粉即可)；其中，
所述的尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100X)的配方如下：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，组氨酸0.12g，亮氨酸0.36g，赖氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，用ddH2O定容到57mL。
所述的ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1和GDH2基因可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6～12所示。
所述的tHMG1基因优选为从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
所述的UPC2-1基因为UPC2基因第888位的Gly突变为Asp得到UPC2-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的CYP716A155基因针对酵母菌经过密码子优化人工合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的SmFPPS基因为通过如下方法制备得到：提取丹参总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板，克隆得到SmFPPS基因；其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
所述的AtLUP、AtSQS1和AtSQE2基因为通过如下方法制备得到：提取拟南芥总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板，分别克隆得到AtLUP、AtSQS1和AtSQE2基因；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14～16所示。
所述的RoCPR1基因为通过如下方法制备得到：提取迷迭香总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板，克隆得到RoCPR1基因；其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
所述的GDH基因优选为从枯草芽孢杆菌基因组克隆得到，其核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示。
所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)基因敲除：将LPP1、DPP1和GDH1基因的crRNA spacer核酸序列SEQ ID NO.4通过限制性内切酶BsaΙ连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT-1；将PEP4和PAH1基因的crRNA spacer核酸序列SEQ ID NO.5通过限制性内切酶BsaΙ连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT-2；然后将重组质粒pCRCT-1转化酿酒酵母BY4741，经过培养筛选，得到敲除LPP1、DPP1和GDH1基因的菌株；再将重组质粒pCRCT-2转化敲除LPP1、DPP1和GDH1基因的菌株，再次培养筛选，得到敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因的菌株BY4741-1；
(2)构建以下13个模块：
(a)将PTDH2、ERG8和TPYX212顺序连接，得到模块PTDH2-ERG8-TPYX212，命名为模块1；
(b)将PPGK1、ERG10和TADH1顺序连接，得到模块PPGK1-ERG10-TADH1，命名为模块2；
(c)将PTDH3、ERG12和TTDH2顺序连接，得到模块PTDH3-ERG12-TTDH2，命名为模块3；
(d)将PTEF1、ERG13和TCYC1顺序连接，得到模块PTEF1-ERG13-TCYC1，命名为模块4；
(e)将PTPI1、ERG19和TFBA1顺序连接，得到模块PTPI1-ERG19-TFBA1，命名为模块5；
(f)将PTPI1、AtSQS1和TFBA1顺序连接，得到模块PTPI1-AtSQS1-TFBA1，命名为模块6；
(g)将PPGK1、AtSQE2和TADH1顺序连接，得到模块PPGK1-AtSQE2-TADH1，命名为模块7；
(h)将PTEF1、AtLUP和TCYC1顺序连接，得到模块PTEF1-AtLUP-TCYC1，命名为模块8；
(i)将PPGK1、CYP716A155和TADH1顺序连接，得到模块PPGK1-CYP716A155-TADH1，命名为模块9；
(j)将PTEF1、RoCPR1和TCYC1顺序连接，得到模块PTEF1-RoCPR1-TCYC1，命名为模块10；
(k)将tHMG1、PPGK1、PTEF1和UPC2-1顺序连接，得到模块tHMG1-PPGK1-PTEF1-UPC2-1，命名为模块11；
(l)将IDI1、PPGK1、PTEF1和SmFPPS顺序连接，得到模块IDI1-PPGK1-PTEF1-SmFPPS，命名为模块12；
(m)将GDH2、PTDH3、PTDH2和GDH顺序连接，得到模块GDH2-PTDH3-PTDH2-GDH，命名为模块13；
(3)构建菌株BY4741-7
(I)将步骤(k)中得到的模块11插入到载体pCfB2875的sfaΙ酶切位点，得到整合载体pCfB2875-1；然后用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合载体pCfB2875-1，得到DNA整合片段A1；再将DNA整合片段A1整合到步骤(1)中得到的菌株BY4741-1的染色体TY3位点，得到菌株BY4741-2；
(II)将步骤(l)中得到的模块12插入到载体pCfB2798的sfaΙ酶切位点，得到整合载体pCfB2798-1；然后用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合载体pCfB2798-1，得到DNA整合片段A2；再将DNA整合片段A2整合到步骤(I)中得到的菌株BY4741-2的染色体TY4位点，得到菌株BY4741-3；
(III)将步骤(m)中得到的模块13插入到载体pCfB2989met15的sfaΙ酶切位点，得到整合载体pCfB2989met15-1；然后用限制性核酸内切酶NotΙ酶切整合载体pCfB2989met15-1，得到DNA整合片段A3；再将DNA整合片段A3整合到步骤(II)中得到的菌株BY4741-3的染色体TY1Cons1位点，得到菌株BY4741-4；
(IV)将pSH65载体转化菌株BY4741-4，然后用含有zeocin(博来霉素)的YPD培养基进行筛选，得到菌株BY4741-5；
(V)将模块1、模块2、模块3、模块4、模块5和筛选标记MET15共同转化菌株BY4741-5，然后通过酵母缺陷型培养基SD-MET筛选培养，得到菌株BY4741-6；
(VI)将模块6、模块7和筛选标记KILEU2共同转化菌株BY4741-6，然后通过酵母缺陷型培养基SD-LEU筛选培养，得到菌株BY4741-7；
(4)构建菌株BA-1
将模块8、模块9、模块10和筛选标记HIS3共同转化菌株BY4741-7，然后通过酵母缺陷型培养基SD-HIS筛选培养，得到菌株BA-1，即为所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌；
(5)构建菌株BA-2
将模块8、模块9、模块10和筛选标记KIURA3共同转化菌株BA-1，然后通过酵母缺陷型培养基SD-URA筛选培养，得到菌株BA-2，即为所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌。
步骤(1)中所述的筛选为通过SD-URA缺陷培养基进行筛选；其中，所述SD-URA缺陷培养基的配方如下：YNB(YNB培养基)6.7g/L，尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体SD-URA缺陷培养基在制备时多添加20g/L的琼脂粉即可)；其中，
所述的尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100X)的配方如下：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，组氨酸0.12g，亮氨酸0.36g，赖氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，用ddH2O定容到57mL。
步骤(2)中所述的13个模块的构建通过重叠PCR的方法进行构建。
步骤(2)中所述的CYP716A155针对酵母菌经过密码子优化人工合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
步骤(2)中所述的UPC2-1为UPC2基因第888位的Gly突变为Asp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
步骤(2)中所述的tHMG1优选为从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
步骤(2)中所述的ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1和GDH2可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6～12所示。
步骤(2)中所述的SmFPPS为通过如下方法制备得到：提取丹参总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板，克隆得到SmFPPS基因；其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
步骤(2)中所述的AtLUP、AtSQS1和AtSQE2为通过如下方法制备得到：提取拟南芥总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板，分别克隆得到AtLUP、AtSQS1和AtSQE2基因；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14～16所示。
步骤(2)中所述的RoCPR1为通过如下方法制备得到：提取迷迭香总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板，克隆得到RoCPR1基因；其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
步骤(2)中所述的GDH优选为从枯草芽孢杆菌基因组克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
步骤(2)中所述的PPGK1、PTEF1、PTDH3、PTDH2、PTPI1为启动子序列，可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.19～23所示。
步骤(2)中所述的TADH1、TCYC1、TTDH2、TPYX212、TFBA1为终止子序列，可从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.24～28所示。
步骤(3)中所述的整合为采用酵母转化试剂盒进行整合；优选为用Frozen-EZYeast Transformation II KitTM试剂盒进行整合。
步骤(IV)中所述的YPD培养基中zeocin(博来霉素)的浓度为100μg/mL；其中，YPD平板的配方如下：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L(固体YPD培养基在配制时添加20g/L的琼脂粉即可)。
步骤(V)中所述的筛选标记MET15的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示。
步骤(V)中所述的酵母缺陷型培养基SD-MET的配方如下：YNB培养基6.7g/L，甲硫氨酸(MET)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体酵母缺陷型培养基SD-MET在配制时添加20g/L的琼脂粉即可)；其中，
所述的甲硫氨酸(MET)缺陷氨基酸(100X)的配方如下：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，组氨酸0.12g，亮氨酸0.36g，赖氨酸0.18g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，尿嘧啶0.12g，用ddH2O定容到57mL。
步骤(VI)所述的筛选标记KILEU2的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。
步骤(VI)中所述的酵母缺陷型培养基SD-LEU的配方如下：YNB培养基6.7g/L，亮氨酸(LEU)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体酵母缺陷型培养基SD-URA在配制时添加20g/L的琼脂粉即可)；其中，
所述的亮氨酸(LEU)缺陷氨基酸(100X)的配方如下：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，组氨酸0.12g，赖氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，尿嘧啶0.12g，用ddH2O定容到57mL。
步骤(4)所述的筛选标记HIS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示。
步骤(4)中所述的酵母缺陷型培养基SD-HIS的配方如下：YNB培养基6.7g/L，组氨酸(HIS)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体酵母缺陷型培养基SD-HIS在配制时添加20g/L的琼脂粉即可)；其中，
所述的组氨酸(HIS)缺陷氨基酸(100X)配方如下：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，亮氨酸0.36g，赖氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，尿嘧啶0.12g，用ddH2O定容到57mL。
步骤(5)所述的筛选标记KIURA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。
步骤(5)中所述的酵母缺陷型培养基SD-URA的配方如下：YNB培养基6.7g/L，URA(尿嘧啶)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L(固体酵母缺陷型培养基SD-URA在配制时添加20g/L的琼脂粉即可)；其中，
所述的尿嘧啶(URA)缺陷氨基酸(100X)的配方如下：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，组氨酸0.12g，亮氨酸0.36g，赖氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，用ddH2O定容到57mL。
步骤(IV)、(V)、(VI)、(4)和(5)中所述的培养的条件优选为：30℃培养3～6天。
步骤(V)中所述的模块1、模块2、模块3、模块4、模块5和筛选标记MET15共同转化菌株BY4741-5后，5个模块和筛选标记通过酵母体内同源重组连接成完整的一条DNA片段，并且由于两端(模块1和MET15)带有50bp特异性的同源臂，使得这个DNA片段可以整合到酵母染色体的HIS3位点；同理，步骤(VI)中所述的块6和模块7通过同源重组原理整合到菌株BY4741-5的染色体Gal7位点；步骤(4)中所述的模块8、模块9和模块10通过同源重组原理整合到菌株BY4741-7的染色体NDT80位点；步骤(5)中所述的模块8、模块9和模块10通过酵母体内同源重组整合到菌株BA-1的染色体Gal80位点。
所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌在制备羽扇豆醇、桦木醇和/或桦木酸中的应用。
一种桦木酸的制备方法，为将所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌经活化后接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到桦木酸；具体包括如下步骤：将所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌经活化后接种到发酵培养基中进行发酵培养，待溶氧值达到60％时补加补料培养基，使培养基内葡萄糖的含量维持在5g/L，得到桦木酸。
所述的活化为多级活化；其通过如下步骤实现：将所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌的单菌落接种到100mL摇瓶中，220～250rpm、30℃条件下培养10～24h；然后将培养得到的菌液接种到1L摇瓶中220～250rpm、30℃条件下培养36～48h。
所述的发酵培养基的组成如下：发酵培养基组成包括：(NH4)2SO4 15g/L，KH2PO48g/L，MgSO4 3g/L，ZnSO4·7H2O 0.72g/L，维他命溶液12mL/L，微量金属盐溶液10mL/L，25g/L葡萄糖；其中：
维他命溶液的组成包括：维生素H 0.05g/L，泛酸钙1g/L，烟酸1g/L，肌醇25g/L，盐酸硫胺素1g/L，盐酸吡哆醇1g/L和对氨基苯甲酸0.2g/L；
微量金属盐溶液组成如下：EDTA(乙二胺四乙酸)15g/L，ZnSO4·7H2O 10.2g/L，MnCl2·4H2O 0.5g/L，CuSO4 0.5g/L，CoCl2·6H2O 0.86g/L，Na2MoO4·2H2O 0.56g/L，CaCl2·2H2O 3.84g/L和FeSO4·7H2O 5.12g/L。
所述的补料培养基组成如下：微量金属盐溶液10mL/L，维他命溶液12mL/L，KH2PO49g/L，MgSO4 2.5g/L，K2SO4 3.5g/L，Na2SO4 0.28g/L，葡萄糖585g/L；其中：
微量金属盐溶液组成如下：EDTA(乙二胺四乙酸)15g/L，ZnSO4·7H2O 10.2g/L，MnCl2·4H2O 0.5g/L，CuSO4 0.5g/L，CoCl2·6H2O 0.86g/L，Na2MoO4·2H2O 0.56g/L，CaCl2·2H2O 3.84g/L和FeSO4·7H2O 5.12g/L；
维他命溶液的组成如下：维生素H 0.05g/L，泛酸钙1g/L，烟酸1g/L，肌醇25g/L，盐酸硫胺素1g/L，盐酸吡哆醇1g/L和对氨基苯甲酸0.2g/L。
所述的接种高产桦木酸的酿酒酵母工程菌的接种量为0.01％～20％(v/v)。
所述的发酵培养的条件为：发酵温度25～35℃，pH值3～7，溶氧值30％，搅拌速度300～1000rpm，通气量3～20L/min，发酵时间24～168h；优选为：发酵温度30℃，pH值5，溶氧值30％，搅拌速度300～1000rpm，通气量3～20L/min，发酵时间120～144h。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明通过优化MVA途径各步骤基因，调节NADPH代谢，敲除旁路基因，同时选择对羽扇豆醇具有高度特异性氧化功能的P450酶CYP716A155，成功构建了高产桦木酸的酿酒酵母工程菌株BA-1、BA-2，具体为通过过表达ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、tHMG1、IDI1、UPC2-1、SmFPPS、AtSQS1、AtSQE2、GDH2、GDH、AtLUP、CYP716A155和RoCPR1基因，敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因构建得到，利用酿酒酵母工程菌株BA-2通过五天发酵培养，其桦木酸的产量可以达到1.5g/L，远高于原植物中桦木酸的含量，因此可以有效的解决药源问题，从而节省植物资源，保护环境。
附图说明
图1是桦木酸在酵母内的生物合成途径图。
图2是BA-2菌株发酵产物和桦木酸标准品GC-MS总离子流图。
图3是桦木酸质谱图。
图4是BA-1菌株高密度发酵生产桦木酸及其前体羽扇豆醇、桦木醇产量图。
图5是BA-2菌株高密度发酵生产桦木酸及其前体羽扇豆醇、桦木醇产量图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
1、实施例中涉及的YPD培养基组成如下：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L。
2、实施例中涉及的酵母缺陷型培养基：SD-URA、SD-LEU、SD-HIS、SD-URA培养基的配方：YNB(YNB培养基)6.7g/L，缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L；其中，缺陷氨基酸(100X)配方如下：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，组氨酸(HIS)0.12g，亮氨酸(LEU)0.36g，赖氨酸0.18g，甲硫氨酸(MET)0.12g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，尿嘧啶(URA)0.12g，用ddH2O定容到57mL，根据需要不加对应氨基酸配置成缺陷氨基酸母液(100X)，即如SD-URA培养基，则对应不添加尿嘧啶(URA)即可。固体培养基在配制时添加20g/L的琼脂粉即可。上述原料均购买自Sigma-Aldrich。
实施例1酵母内源性基因、表达元件和枯草芽孢杆菌内GDH基因的克隆
1、酵母基因组的提取
(1)取酿酒酵母BY4741(ATCC)单菌落于5mL YPD培养基中培养16～24h，菌液在离心机中4000rpm离心5min收集菌体放入研钵中。
(2)加入液氮研磨2～3次，待液氮挥干，加入1mL DNAiso Reagent(宝日医生物技术有限公司)覆盖菌体。
(3)静置待融化后，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状，将裂解液转移至离心管中。
(4)将装有裂解液的离心管在4℃或室温离心10min，将上清转移到新的离心管内，加入1/2体积的无水乙醇，反复颠倒2min，室温4000rpm离心沉淀DNA，去上清。
(5)缓慢加入1mL 75％(v/v)的乙醇，混匀，12000rpm离心5min，去上清，挥干残留乙醇。加入50μL ddH2O溶解，作为PCR克隆模板。
2、PCR克隆酵母内源性基因和表达元件
PCR反应体系：phanta max高保真酶0.5μL，dNTP(10mM)0.4μL，2x Phanta Maxbuffer 10μL，上下游特异性引物各1μL(引物见表1)，ddH2O 6.1μl，模板1μL，总反应体系20μL。
PCR扩增反应条件为：第一阶段95℃3min；第二阶段，95℃30s，50-60℃30s，72℃1-2min，30循环；第三阶段，72℃5min。
以上述获得的酵母基因组为模板，按上述体系和条件，分别克隆如下9个基因、5个启动子和5个终止子：
ERG8(引物ERG8-F、ERG8-R)、ERG10(引物ERG10-F、ERG10-R)、tHMG1(引物tHMG1-F、tHMG1-R)、ERG12(引物ERG12-F、ERG12-R)、ERG13(引物ERG13-F、ERG13-R)、ERG19(引物ERG19-F、ERG19-R)、IDI1(引物IDI1-F、IDI1-R)、UPC2(引物UPC2-F、UPC2-R)和GDH2(引物GDH2-F、GDH2-R)基因；其中，ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1、GDH2基因序列分别如SEQ ID NO.6～12所示；
PPGK1(引物PPGK1-F、PPGK1-R)、PTEF1(引物PTEF1-F、PTEF1-R)、PTDH3(引物PTDH3-F、PTDH3-R)、PTDH2(引物PTDH2-F、PTDH2-R)和PTPI1(引物PTPI1-F、PTPI1-R)启动子，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.19～23所示；
TADH1(引物TADH1-F、TADH1-R)、TCYC1(引物TCYC1-F、TCYC1-R)、TTDH2(引物TTDH2-F、TTDH2-R)、TPYX212(引物TPYX212-F、TPYX212-R)和TFBA1(引物TFBA1-F、TFBA1-R)终止子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.24～28所示。
CYP716A155基因通过赛默飞世尔科技有限公司的GeneArtTM GeneOptimizerTM软件以酿酒酵母为宿主进行密码子优化，优化后的基因由苏州泓迅生物科技有限公司合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3、DNA片段胶回收
PCR反应结束后，向反应体系加入Loading Buffer，用1％的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪紫外照射下将DNA片段切下来，使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)胶回收，具体操作过程见产品说明书。
4、DNA片段连接pEASY-Blunt载体并测序
DNA片段连接平末端pEASY-Blunt载体(全式金生物技术有限公司)，转化DH5α菌株，具体操作见产品说明书。37℃培养14～16h后，挑选单菌落做菌落PCR。
PCR体系：M13通用引物-F(引物见表1；10μM)0.3μL，M13通用引物-R(引物见表1；10μM)0.3μL，Easy Taq聚合酶0.2μL，dNTPs(2.5mM)0.8μL，10x Easy Taq Buffer 1μL，DMSO(二甲基亚砜)1μL，ddH2O 6.4μL。用枪头沾取部分菌落于PCR体系中混匀。
PCR扩增，扩增条件为：第一阶段95℃5min；第二阶段，95℃30s，55℃30s，72℃1-3min，30循环；第三阶段，72℃7min。
反应结束后，向反应体系加入Loading Buffer，用1％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪确定阳性转化子，将该菌落送样测序。
5、UPC2定点突变得到UPC2-1
UPC2是酵母合成萜类化合物的一个关键的转录因子基因，将UPC2基因的第888位的甘氨酸(Glycine)突变为天门冬氨酸(Aspartate)能进一步提高萜类化合物的含量。UPC2定点突变得到的UPC2-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。其具体步骤如下：
(1)以pEASY-Blunt-UPC2质粒(pEASY-Blunt-UPC2质粒由UPC2基因构建到pEASY-Blunt载体上制备得到，参考实施例1中步骤4)为模板，稀释到1～10ng/μL为模板，扩增体系为：phanta max高保真酶0.5μL，dNTP 0.4μL，2x Phanta Max buffer 10μL，正向、反向引物各1μL(引物见表1：上游引物UPC2-1-F和下游引物UPC2-1-R)，ddH2O 6.1μL，模板1μL，总反应体系20μL。放入PCR仪中反应，反应条件为：第一阶段95℃3min；第二阶段，95℃30s，62℃30s，72℃2min，30循环；第三阶段，72℃5min。
(2)将反应产物用DpnΙ酶在37℃下反应1h。然后取1μL加入50μL大肠杆菌DH5α内，用手指轻轻弹匀，冰浴20～30min。再将感受态细胞放入42℃水浴锅中热击60s，立即将其置于冰浴中冷却2min。向感受态细胞中加入250μL NZY培养基(配方：Casein酪蛋白10g/L，氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L，无水硫酸镁1g/L，加去离子水定容至1L，pH值调至7.0，在121℃条件下灭菌20min。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉)，在37℃，220rpm的恒温振荡培养箱中抚育60min。将孵育好的感受态细胞在3000rpm条件下离心1min，去掉200μL上清液，重悬菌体，取全部菌液进行涂板，在超净台内将菌液吹干，放入37℃恒温生化培养箱中，倒置培养14～18h。
(3)通过菌落PCR挑选阳性转化子测序。
6、枯草芽孢杆菌中GDH基因的克隆
提取枯草芽孢杆菌基因组为模板克隆GDH基因(引物见表1：上游引物GDH-F和下游引物GDH-R)，方法参考实施例1中1、2、3和4，GDH基因的核苷酸序列SEQ ID NO.18所示。
实施例2植物源基因的克隆
1、RNA的提取
(1)用药勺取100mg样品(样品为拟南芥、迷迭香以及丹参，均可通过常规市售购买得到)加入到含有950μL Trizol和50μLβ-巯基乙醇的EP管中，涡旋15s，在12000rpm，4℃条件下离心10min。
(2)用移液枪吸取上清至含有200μL氯仿的EP管中，涡旋15s，在12000rpm，4℃条件下离心15min。
(3)用移液枪吸取上层清夜，转移至含有500μL异丙醇的EP管中，在室温条件下静置10min，在12000rpm，4℃条件下离心10min。
(4)离心完毕后，去掉上清液，在EP管中加入1mL现配的75％(v/v)乙醇溶液，用移液枪进行吹打，在7500rpm，4℃条件下离心5min，去掉上清，将EP管放在超净台中晾干3～5min。
(5)取30μL的RNase-Free H2O，加入到EP管中，用枪头吹打混匀，直至沉淀完全溶解。RNA样品用于下一步实验或保存于-80℃备用。
2、RNA反转录成cDNA，克隆目的基因
采用Hiscript II Reverse Transcriptase试剂盒(南京诺维赞生物科技有限公司)将RNA反转录成cDNA，具体操作见试剂盒说明书。
以丹参cDNA为模板克隆SmFPPS基因(引物见表1：SmFPPS-F和SmFPPS-R)，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13所示。
以拟南芥cDNA为模板克隆AtLUP(引物见表1：AtLUP-F和AtLUP-R)、AtSQS1(引物见表1：AtSQS1-F和AtSQS1-R)和AtSQE2基因(引物见表1：AtSQE2-F和AtSQE2-R)基因，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14～16所示。
以迷迭香cDNA为模板克隆RoCPR1基因(引物见表1：RoCPR1-F和RoCPR1-R)基因，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.17所示。
具体克隆方法可参考实施例1中2、3和4。
表1.本发明克隆基因和表达元件引物
Figure BDA0002018505940000091
Figure BDA0002018505940000101
实施例3、CRISPR-Cas9系统敲除酿酒酵母BY4741的LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因
1、crRNA spacer核酸序列的设计和载体的构建
(1)通过对基因序列分析，根据CRISPR/Cas9靶点设计原则，设计出靶位点序列，在PAM序列两端各取50bp碱基序列作为同源臂，左右两段同源臂之间相隔8bp碱基，且这8bp碱基需包括PAM序列。同源臂用于修复双链DNA断裂，并造成目标基因的移码突变，具体的crRNA spacer设计参考文献(Huimin Zhao et al,ACS Synth.Biol.2015,4,585-594)。其中，
LPP1、DPP1、GDH1基因的crRNA spacer核酸序列如SEQ ID NO.4所述；
PEP4和PAH1基因的crRNA spacer核酸序列如SEQ ID NO.5所述；
crRNA spacer序列由苏州泓迅生物科技有限公司合成。
(2)将上述2个crRNA spacer序列分别通过BsaΙ(New England Biolabs)限制性内切酶酶切连接到pCRCT载体(武汉淼灵生物科技有限公司)上，得到pCRCT-1载体和pCRCT-2载体。
2、pCRCT载体转化酿酒酵母敲除目的基因
(1)将上述连接了crRNA spacer核酸序列的pCRCT-1载体和pCRCT-2载体依次利用Zymo Research Frozen-EZ Yeast Transformation II KitTM酵母转化试剂盒(上海懋康生物科技有限公司)转化酿酒酵母BY4741，具体转化方法参照产品说明书。
(2)利用SD-URA缺陷平板(配方：YNB6.7g/L，URA(尿嘧啶)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉)进行筛选，平板在30℃条件下培养五天。
(3)挑选大的菌落通过菌落PCR挑选阳性转化子，取阳性转化子接于4mL SD-URA培养基中，在30℃、220rpm条件下摇床培养。
(4)培养两天后取100μL菌液接于新鲜SD-URA培养基中继续表达两天。
(5)将菌液稀释后涂于SD-URA缺陷平板上，挑选单菌落摇菌两天，离心收集菌沉淀后DNAiso Reagent基因组提取试剂盒提取基因组。
(6)通过PCR克隆出目的基因，胶回收纯化之后进行测序，验证目的基因已经产生移码突变。
(7)将已经敲除目的基因的菌株用YPD培养基传代培养十天丢失pCRCT载体，构建菌株BY4741-1。
实施例4、模块的构建
1、重叠PCR构建模块
所有片段的连接均采用重叠PCR，通过三轮PCR将目的DNA片段连接成模块。具体步骤如下：
(1)所有需要连接的片段经过第一轮PCR克隆互相之间加上40～50bp的重叠区域，重叠区域碱基退火温度在60～70℃之间，模板为连接有目的DNA片段的pEASY-Blunt载体。PCR体系为：phanta max高保真酶0.5μL，dNTP(10mM)0.4μL，2x Phanta Max buffer 10μL，上下游引物各1μL(见表2)，ddH2O6.9μL，模板0.2μL，总反应体系20μL。PCR反应条件为：第一阶段95℃3min，第二阶段，95℃30s，50-60℃30s，72℃1-4min，30循环，第三阶段，72℃5min。
(2)将需要重叠的DNA片段根据片段大小按照每100ng/1000bp加入第二轮PCR体系中，反应体系为：phanta max高保真酶0.5μL，dNTP(10mM)0.4μL，2x Phanta Max buffer 10μL，DNA片段1～9.1μL，加ddH2O补齐到20μL。其中，第二轮PCR反应条件为：第一阶段95℃3min；第二阶段，95℃30s，60-70℃30s，72℃1-4min，10循环；第三阶段，72℃5min。
(3)取第二轮PCR反应液作为第三轮PCR模板，第三轮PCR体系为：phanta max高保真酶0.5μL，dNTP(10mM)0.4μL，2x Phanta Max buffer 10μL，上下游引物各1μL(引物为连接成完整DNA片段上下游引物，见表2)，ddH2O 6.1μL，模板1μL，总反应体系20μL。其中，第三轮PCR反应条件为：第一阶段95℃3min，第二阶段，95℃30s，50-60℃30s，72℃1-4min，30循环，第三阶段，72℃5min。
(4)胶回收模块DNA片段,连接pEASY-Blunt载体(全式金生物技术有限公司)测序。
按上述步骤构建以下13个模块：
(a)将ERG8、PTDH2和TPYX212基因连接，构建模块PTDH2-ERG8-TPYX212，命名为模块1；其中，第一轮PCR克隆ERG8引物为1-ERG8-F、1-ERG8-R，克隆PTDH2引物为PTDH2-F、1-PTDH2-R，克隆TPYX212引物为1-TPYX212-F、TPYX212-R；第三轮PCR引物为PTDH2-F、TPYX212-R。
(b)将ERG10、PPGK1和TADH1基因连接，构建成模块PPGK1-ERG10-TADH1，命名为模块2；其中，第一轮PCR克隆ERG10的引物为2-ERG10-F、2-ERG10-R，克隆PPGK1的引物为PPGK1-F、2-PPGK1-R，克隆TADH1的引物为2-TADH1-F、TADH1-R；第三轮PCR引物为PPGK1-F、TADH1-R。
(c)将ERG12、PTDH3和TTDH2基因连接，构建模块PTDH3-ERG12-TTDH2，命名为模块3；其中，第一轮PCR克隆ERG12引物为3-ERG12-F、3-ERG12-R，克隆PTDH3引物为PTDH3-F、3-PTDH3-R，克隆TTDH2引物为3-TTDH2-F、TTDH2-R；第三轮PCR引物为PTDH3-F、TTDH2-R。
(d)将ERG13、PTEF1和TCYC1基因连接，构建模块PTEF1-ERG13-TCYC1，命名为模块4；其中，第一轮PCR克隆ERG13引物为4-ERG13-F、4-ERG13-R，克隆PTEF1引物为PTEF1-F、4-PTEF1-R，克隆TCYC1引物为4-TCYC1-F、TCYC1-R；第三轮PCR引物为PTEF1-F、TCYC1-R。
(e)将ERG19、PTPI1和TFBA1基因连接，构建模块PTPI1-ERG19-TFBA1，命名为模块5；其中，第一轮PCR克隆ERG19的引物为5-ERG19-F、5-ERG19-R，克隆PTPI1引物为PTPI1-F、5-PTPI1-R，克隆TFBA1的引物为5-TFBA1-F、TFBA1-R；第三轮PCR引物为PTPI1-F、TFBA1-R。
(f)将AtSQS1、PTPI1和TFBA1基因连接，构建模块PTPI1-AtSQS1-TFBA1，命名为模块6；其中，第一轮PCR克隆AtSQS1的引物为6-SQS1-F、6-SQS1-R，克隆PTPI1的引物为PTPI1-F、6-PTPI1-R，克隆TFBA1的引物为6-T-FBA1-F、TFBA1-R；第三轮PCR引物为PTPI1-F、TFBA1-R。
(g)将AtSQE2、PPGK1和TADH1基因连接，构建模块PPGK1-AtSQE2-TADH1，命名为模块7；其中，第一轮PCR克隆AtSQE2的引物为7-AtSQE2-F、7-AtSQE2-R，克隆PPGK1的引物为PPGK1-F、7-PPGK1-R，克隆TADH1的引物为7-TADH1-F、TADH1-R；第三轮PCR引物为PPGK1-F、TADH1-R。
(h)将AtLUP、PTEF1和TCYC1基因连接，构建模块PTEF1-AtLUP-TCYC1，命名为模块8；其中，第一轮PCR克隆AtLUP的引物为8-AtLUP-F、8-AtLUP-R，克隆PTEF1的引物为PTEF1-F、8-PTEF1-R，克隆TCYC1的引物为8-TCYC1-F、TCYC1-R；第三轮PCR引物为PTEF1、TCYC1-R。
(i)将CYP716A155、PPGK1和TADH1连接，构建模块PPGK1-CYP716A155-TADH1，命名为模块9；其中，第一轮PCR克隆CYP716A155的引物为9-CYP716A155-F、9-CYP716A155-R，克隆PPGK1的引物为PPGK1-F、9-PPGK1-R，克隆TADH1的引物为9-TADH1-F、TADH1-R；第三轮PCR引物为PPGK1-F、TADH1-R。
(j)将RoCPR1、PTEF1和TCYC1基因连接，构建模块PTEF1-RoCPR1-TCYC1，命名为模块10；其中，第一轮PCR克隆RoCPR1的引物为10-RoCPR1-F、10-RoCPR1-R，克隆PTEF1的引物为PTEF1-F、10-PTEF1-R，克隆TCYC1的引物为10-TCYC1-F、TCYC1-R；第三轮PCR引物为PTEF1、TCYC1-R。
(k)将tHMG1、PPGK1、PTEF1和UPC2-1基因连接，构建模块tHMG1-PPGK1-PTEF1-UPC2-1，命名为模块11；其中，第一轮PCR克隆tHMG1的引物为11-tHMG1-F、11-tHMG1-R，克隆PPGK1的引物为11-PPGK1-F、11-PPGK1-F，克隆PTEF1的引物为11-PTEF1-F、11-PTEF1-R，克隆UPC2-1的引物为11-UPC2-1-F、11-UPC2-1-R。第三轮的PCR引物为11-tHMG1-F、11-UPC2-1-R。
(l)将IDI1、SmFPPS、PPGK1和PTEF1基因连接，构建模块IDI1-PPGK1-PTEF1-SmFPPS，命名为模块12；其中，第一轮PCR克隆IDI1的引物为12-IDI1-F、12-IDI1-R，克隆SmFPPS的引物为12-SmFPPS-F，12-SmFPPS-R，克隆PPGK1的引物为12-PPGK1-F，11-PPGK1-R，克隆PTEF1的引物为11-PTEF1-F、12-PTEF1-R；第三轮PCR引物为12-IDI1-F，12-SmFPPS-R。
(m)将GDH2、GDH、PTDH3和PTDH2基因连接，构建模块GDH2-PTDH3-PTDH2-GDH，命名为模块13；其中，第一轮PCR克隆GDH2的引物为13-GDH2-F，13-GDH2-R，克隆GDH引物为13-GDH-F，13-GDH-R，克隆PTDH3引物为13-PTDH3-F，13-PTDH3-R，克隆PTDH2的引物为13-PTDH2-F，13-PTDH2-R；第三轮PCR的引物为13-GDH2-F，13-GDH-R。
2、整合载体pCfB2875-1、pCfB2798-1和pCfB2989met15-1的构建
(1)将pCfB2875载体(Addgene)用sfaΙ限制性内切酶线性化，酶切体系为：pCfB2875载体1μg，sfaΙ0.5μL，10x Fast Digest Green Buffer 2μL，加水补齐到20μL体系。37℃酶切1h，胶回收线性化载体。
(2)将上述tHMG1-PPGK1-PTEF1-UPC2-1模块从pEASY-Blunt-tHMG1-PPGK1-PTEF1-UPC2-1(即上述tHMG1-PPGK1-PTEF1-UPC2-1模块连接pEASY-Blunt载体获得)上用sfaΙ内切酶切下来，酶切体系如载体pCfB2875线性化酶切体系。
(3)将tHMG1-PPGK1-PTEF1-UPC2-1模块通过T4连接酶插入载体pCfB2875的sfaΙ酶切位点，连接体系为：线性化的pCfB2875 20～100ng，tHMG1-PPGK1-PTEF1-UPC2-1模块50～500ng，T4DNA Ligase 0.5μL，10x T4DNA Ligase Buffer 1μL，加水补齐到10μL体系。
(4)16℃连接1h，将连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃培养14～16h，通过菌落PCR筛选和提取质粒测序，获得连接好的载体pCfB2875-1。
(5)载体pCfB2798-1(含有模块IDI1-PPGK1-PTEF1-SmFPPS)和pCfB2989met15-1(含有GDH2-PTDH3-PTDH2-GDH)的构建方法如pCfB2875-1。
表2.构建模块引物
Figure BDA0002018505940000131
Figure BDA0002018505940000141
Figure BDA0002018505940000151
实施例5、模块整合酵母染色体构建工程酵母菌
1、BY4741-4菌株的构建
(1)用限制性内切酶NotΙ将包含TCYC1-tHMG1-PPGK1-PTEF1-UPC2-1-TADH1表达模块和筛选标记KIURA3的DNA整合片段从载体pCfB2875-1(实施例4步骤2构建)切下来，其酶切体系为：载体pCfB2875-1 5～10μg，NotΙ限制性内切酶1～2μL，10x Fast Digest GreenBuffer 5μL，加水补齐到50μL体系；37℃酶切2h，胶回收。
(2)取5μL(4～10μg)上述酶切下来的DNA整合片段用Frozen-EZ YeastTransformation II KitTM试剂盒转化酿酒酵母BY4741-1(即将该模块整合到酵母BY4741-1染色体TY3位点)，用SD-URA(配方：YNB6.7g/L，URA(尿嘧啶)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉)平板进行筛选，构建菌株BY4741-2。
(3)在菌株BY4741-2的基础上，通过NotΙ限制性核酸内切酶酶切载体pCfB2798-1可获得包含TCYC1-IDI1-PPGK1-PTEF1-SmFPPS-TADH1表达模块和筛选标记KILEU2的DNA整合片段。
(4)将TCYC1-IDI1-PPGK1-PTEF1-SmFPPS-TADH1表达模块整合到酵母(菌株BY4741-2)染色体TY4位点，整合方法如上所述，筛选平板为SD-LEU(配方：YNB 6.7g/L，LEU(亮氨酸)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉)，构建菌株BY4741-3。
(5)在菌株BY4741-3的基础上，通过NotΙ限制性核酸内切酶酶切载体pCfB2989met15-1获得包含TCYC1-GDH2-PTDH3-PTDH2-GDH-TADH1表达模块和筛选标记MET15的DNA整合片段。
(6)将TCYC1-GDH2-PTDH3-PTDH2-GDH-TADH1表达模块整合到酵母(菌株BY4741-3)染色体TY1Cons1位点，筛选平板为SD-MET(配方：YNB 6.7g/L，MET(甲硫氨酸)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉)。构建菌株BY4741-4。
2、筛选标记的敲除
(1)将pSH65载体(武汉淼灵生物科技有限公司)用Frozen-EZ YeastTransformation II KitTM试剂盒转化BY4741-4菌株，筛选平板为YPD+zeocin(100μg/mL)。
(2)挑选单菌落用YPG(配方：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖2g/L，半乳糖18g/L)+zeocin(博来霉素；100μg/mL)表达四天，通过划板稀释挑选单菌落，提取基因组，通过PCR克隆出整合的DNA片段，通过测序找出三个筛选标记(KILEU2、KIURA3和MET15)均被敲除的菌株。用YPD传代培养十天丢失pSH65质粒，得到菌株BY4741-5。
3、酵母菌株BY4741-7的构建
(1)酵母体内多片段同源重组将模块1、模块2、模块3、模块4和模块5整合到BY4741-5菌株染色体HIS3位点，按照“模块1-模块2-模块3-模块4-模块5-MET15(MET15的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，由苏州泓迅生物科技有限公司合成)”的顺序，通过PCR给相邻模块和筛选标记MET15加上50bp重叠区域用于酵母体内同源重组连接，同时在模块1的5'端和MET15的3'端加上50bp同源臂用于整合HIS3位点(将这5个模块和筛选标记MET15一起转化到酿酒酵母内会发生体内同源重组连接成完整的一条DNA片段，并且由于两端的模块1和MET15带有50bp特异性的同源臂，使得这个DNA片段可以整合到酵母染色体的HIS3位点)。其中，克隆模块1的引物为HIS3-1-F、HIS3-1-R，克隆模块2的引物为PPGK1-F、HIS3-2-R，克隆模块3引物为PTDH3-F、HIS3-3-R，克隆模块4的引物为PTEF1-F、HIS3-4-R，克隆模块5的引物为PTPI1-F、HIS3-5-R，克隆MET15的引物为HIS3-MET15(KILEU2,HIS3,KIURA3)-F、HIS3-MET15-R。
(2)将6个片段用Frozen-EZ Yeast Transformation II KitTM试剂盒转化菌株BY4741-5，用SD-MET平板筛选，30℃培养3～6天。
(3)挑选单菌落用YPD培养基摇菌，提取基因组PCR克隆出整合片段(方法参考实施例2)，对整合片段进行测序，挑选阳性菌株，得到菌株BY4741-6。
(4)将模块6、模块7整合到BY4741-5菌株染色体Gal7位点上，所用筛选标记为KILEU2(KILEU2的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示，由苏州泓迅生物科技有限公司合成)，所用的筛选平板是SD-LEU，其中克隆模块6的引物为Gal7-6-F、Gal7-6-R，克隆模块7的引物为PPGK1-F、Gal7-7-R，克隆KILEU2的引物为HIS3-MET15(KILEU2,HIS3,KIURA3)-F、Gal7-KILEU2-R。方法参考实施例5步骤3，构建菌株BY4741-7。
4、可合成桦木酸酿酒酵母工程菌株BA-1的构建
将模块8、模块9、模块10整合到BY4741-7菌株染色体NDT80位点上，所用筛选标记HIS3(HIS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示，由苏州泓迅生物科技有限公司合成)，所用的筛选平板是SD-HIS(配方如下：YNB 6.7g/L，HIS(组氨酸)缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L。固体培养基的制备需要添加20g/L的琼脂粉)，其中克隆模块8的引物为NDT80-8-F、NDT80(GAL80)-8-R，克隆模块9的引物为PPGK1-F、NDT80(GAL80)-9-R，克隆模块10的引物为PTEF1-F、NDT80(GAL80)-10-R，克隆HIS3的引物为HIS3-MET15(KILEU2,HIS3,KIURA3)-F、NDT80-HIS3-R。克隆方法参考实施例5步骤3，构建菌株BA-1。
5、桦木酸高产酿酒酵母工程菌株BA-2的构建
利用KIURA3(KIURA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示，由苏州泓迅生物科技有限公司合成)筛选标记第二次将模块8、模块9、模块10整合到BA-1菌株染色体Gal80位点上，所用的筛选平板是SD-URA，其中克隆模块8的引物为GAL80-8-F、NDT80(GAL80)-8-R，克隆模块9的引物为PPGK1-F、NDT80(GAL80)-9-R，克隆模块10的引物为PTEF1-F、NDT80(GAL80)-10-R，克隆KIURA3的引物为HIS3-MET15(KILEU2,HIS3,KIURA3)-F、GAL80-KIURA3-R。方法参考实施例5步骤3(酵母菌株BY4741-7的构建)，构建菌株BA-2。
表3.模块整合酵母染色体引物
Figure BDA0002018505940000171
Figure BDA0002018505940000181
实施例6、发酵酵母菌株BA-1、BA-2生成桦木酸
1、BA-1、BA-2菌株发酵培养
(1)分别挑选BA-1、BA-2菌株的单菌落于装有15mL YPD培养基的100mL摇瓶中，在摇床中培养10～24h至OD值2～3，温度设置为30℃转速220～250rpm。
(2)将菌液分别接到三个分别含有100mL发酵培养基的1L摇瓶中。在220～250rpm，30℃条件下培养36～48h至OD600 8～10。
(3)将上述300mL菌液都接到包含3L的发酵培养基的5L的发酵罐中。温度控制在30℃，用氨水控制PH维持在5.0，溶氧值控制30％，转速在300～1000rpm，通气量3～20L/min。
(4)待溶氧值达到60％时启动补料系统进行补料(即加入补料培养基)，使培养基内葡萄糖的含量维持在5g/L。发酵培养168h，得到发酵液。
上述涉及的培养基的配方如下：
发酵培养基组成包括：(NH4)2SO4 15g/L，KH2PO4 8g/L，MgSO4 3g/L，ZnSO4·7H2O0.72g/L，维他命溶液12mL/L，微量金属盐溶液10mL/L，25g/L葡萄糖；
补料培养基组成包括：微量金属盐溶液10mL/L，维他命溶液12mL/L，KH2PO4 9g/L，MgSO4 2.5g/L，K2SO4 3.5g/L，Na2SO4 0.28g/L，葡萄糖585g/L；
其中：
维他命溶液的组成包括：维生素H 0.05g/L，泛酸钙1g/L，烟酸1g/L，肌醇25g/L，盐酸硫胺素1g/L，盐酸吡哆醇1g/L和对氨基苯甲酸0.2g/L。
微量金属盐溶液组成包括：EDTA(乙二胺四乙酸)15g/L，ZnSO4·7H2O 10.2g/L，MnCl2·4H2O 0.5g/L，CuSO4 0.5g/L，CoCl2·6H2O 0.86g/L，Na2MoO4·2H2O 0.56g/L，CaCl2·2H2O 3.84g/L和FeSO4·7H2O 5.12g/L。
2、产物的萃取与检测
取上述发酵培养24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h获得的发酵液分别加等体积的乙酸乙酯超声1h，静置24h，取有机层于干净的液相小瓶中，用氮吹仪吹干，加入100μL硅烷化试剂MSTFA，在80℃条件下进行衍生化，反应30min，进行GC-MS检测；其中，所用的仪器为安捷伦气质联用仪7890B-5977B。检测方法：进样体积1uL，溶剂延时18min，载气为氦气，流速为1mL/min。色谱柱：HP-5MS。色谱条件：80℃，1min，以20℃/min程序升温到300℃，保持15min。
通过产物分析可知，BA-1、BA-2菌株发酵培养后均可以获得桦木酸，其中，桦木酸在酵母内的生物合成途径如图1所示；BA-2菌株发酵产物和桦木酸标准品GC-MS总离子流图如图2所示；桦木酸质谱图如图3所示；BA-1菌株高密度发酵生产桦木酸及其前体化合物羽扇豆醇(lupeol)、桦木醇(betulin)产量如图4所示，酿酒酵母工程菌株BA-1通过六天发酵培养，其桦木酸(BA)的产量可以达到0.36g/L。BA-2菌株高密度发酵生产桦木酸及其前体羽扇豆醇(lupeol)、桦木醇(betulin)产量如图5所示，从图中可以看出，酿酒酵母工程菌株BA-2通过五天发酵培养，其桦木酸(BA)的产量可以达到1.5g/L。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 高产桦木酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用
<160> 167
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaatttt tctatgcatc tttgttgtgt ttgtttgttt ctttagtttt cttgtcattg 60
catttgttat tttacaagac taagacaggt tcattgcctc caggtaaaac tggttggcca 120
gttattggtg aatctttgga atttttatca acaggttgga agggtcatcc agaaaagttt 180
attttcgata gaatggctag atattcttca catgttttta gaactcattt gttaggtgaa 240
ccagctgcag ttttatgtgg ttctgctggt aataagttct tgttttcaaa cgaaaataag 300
ttagttcaag catggtggcc atcttcagtt gaaaagattt tcccaaacga taacgctgaa 360
acttcttcaa aggaagaatc tattaaaatg agaagaatgt tgccaacttt ctttaagcca 420
gaagcattgc atagatacgt tggtatcatg gatcatatcg ctagaagaca ttttgcagat 480
ggttgggatg gtaaaagaga agttgttgtt ttcccattgg ctaaaaatta cactttctgg 540
ttggcatgta gattgttttt atctgttgaa gatccatcac aagttgaaaa gttcgctgca 600
ccttttaatt tgttggcttc tggtttgatc tcaatcccaa tcgatttgcc aggtacacca 660
ttccataagg gtattaaagc ttctgcatac atcagaaagg aattggttgc tattattaag 720
caaagaaagg ctgatttggc agatggtact gcatctccaa cacaagatat cttgtctcac 780
atgttgttga catcaaacga agatggtaaa ttcatgcaag aatcagatat cgctaataag 840
atcttgggtt tgttgattgg tggtcatgat actgcttctt cagcatgtac attcgttgtt 900
aagtatttgg cagaattgcc acaagtttac gaaggtgttt acaaggaaca aatggaaatc 960
gctaagtcta aagctgctgg tgaattgttg aactgggaag atttgcaaaa gatgaagtac 1020
tcatggaatg ttgcatgtga agttttgaga ttagctccac cattgcaagg tgcttttaga 1080
gaagctttgg cagatttctc ttttaatggt ttttcaatcc caaagggttg gaagttgtac 1140
tggtctgcta attcaactca taaaaattct gaatttttcc cagaaccaga aaagttcgat 1200
ccatctagat tcgaaggttc aggtccagca ccatatacat ttgttccatt tggtggtggt 1260
ccaagaatgt gtcctggtaa agaatacgct agattggaaa tcttggtttt tatgcatcat 1320
ttggttaaga gattcaaatg ggaaaagatg atcccagatg aaaagattgt tgttgatcca 1380
atgccaattc cagctaatgg tttgccagtt agattatacc cacatacttc ttaa 1480
<210> 2
<211> 2742
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgagcgaag tcggtataca gaatcacaag aaagcggtga caaaacccag aagaagagaa 60
aaagtcatcg agctaattga agtggacggc aaaaaggtga gtacgacttc aaccggtaaa 120
cgtaaattcc ataacaaatc aaagaatggg tgcgataact gtaaaagaag aagagttaag 180
tgtgatgaag ggaagccagc ctgtaggaag tgcacaaata tgaagttgga atgtcagtat 240
acaccaatcc atttaaggaa aggtagagga gcaacagtag tgaagtatgt cacgagaaag 300
gcagacggta gcgtggagtc tgattcatcg gtagatttac ctcctacgat caagaaggag 360
cagacaccgt tcaatgatat ccaatcagcg gtaaaagctt caggctcatc caatgattcc 420
tttccatcaa gcgcctctac aactaagagt gagagcgagg aaaagtcatc ggcccctata 480
gaggacaaaa acaatatgac tcctctaagt atgggcctcc agggtaccat caataagaaa 540
gatatgatga ataacttttt ctctcaaaat ggcactattg gttttggttc tcctgaaaga 600
ttgaattcag gtatcgatgg cttactatta ccgccattgc cttctggaaa tatgggtgcg 660
ttccaacttc agcaacagca gcaagtgcag cagcaatctc aaccacagac ccaagcgcag 720
caagcaagtg gaactccaaa cgagagatat ggttcattcg atcttgcggg tagtcctgca 780
ttgcaatcca cgggaatgag cttatcaaat agtctaagcg ggatgttact atgtaacagg 840
attccttccg gccaaaacta cactcaacaa caattacaat atcaattaca ccagcagctg 900
caattgcaac agcatcagca agttcagctg cagcagtatc aacaattacg tcaggaacaa 960
caccaacaag ttcagcaaca acaacaggaa caactccagc aataccaaca acattttttg 1020
caacagcagc aacaagtact gcttcagcaa gagcaacaac ctaacgatga ggaaggtggc 1080
gttcaggaag aaaacagcaa aaaggtaaag gaagggcctt tacaatcaca aacaagcgaa 1140
actactttaa acagcgatgc tgctacatta caagctgatg cattatctca gttaagtaag 1200
atggggctaa gcctaaagtc gttaagtacc tttccaacag ctggtattgg tggtgtttcc 1260
tatgactttc aggaactgtt aggtattaag tttccaataa ataacggcaa ttcaagagct 1320
actaaggcca gcaacgcaga ggaagctttg gccaatatgc aagagcatca tgaacgtgca 1380
gctgcttctg taaaggagaa tgatggtcag ctctctgata cgaagagtcc agcgccatcg 1440
aataacgccc aagggggaag tgctagtatt atggaacctc aggcggctga tgcggtttcg 1500
acaatggcgc ctatatcaat gattgaaaga aacatgaaca gaaacagcaa catttctcca 1560
tcaacgccct ctgcagtgtt gaatgatagg caagagatgc aagattctat aagttctcta 1620
ggaaatctga caaaagcagc cttggagaac aacgaaccaa cgataagttt acaaacatca 1680
cagacagaga atgaagacga tgcatcgcgg caagacatga cctcaaaaat taataacgaa 1740
gctgaccgaa gttctgtttc tgctggtacc agtaacatcg ctaagctttt agatctttct 1800
accaaaggca atctgaacct gatagacatg aaactgtttc atcattattg cacaaaggtc 1860
tggcctacga ttacagcggc caaagtttct gggcctgaaa tatggaggga ctacataccg 1920
gagttagcat ttgactatcc atttttaatg cacgctttgt tggcattcag tgccacccat 1980
ctttcgagga ctgaaactgg actggagcaa tacgtttcat ctcaccgcct agacgctctg 2040
agattattaa gagaagctgt tttagaaata tctgagaata acaccgatgc gctagttgcc 2100
agcgccctga tactaatcat ggactcgtta gcaaatgcta gtggtaacgg cactgtagga 2160
aaccaaagtt tgaatagcat gtcaccaagc gcttggatct ttcatgtcaa aggtgctgca 2220
acaattttaa ccgctgtgtg gcctttgagt gaaagatcta aatttcataa cattatatct 2280
gttgatctta gcgatttagg cgatgtcatt aaccctgatg ttggaacaat tactgaattg 2340
gtatgttttg atgaaagtat tgccgatttg tatcctgtcg gcttagattc gccatatttg 2400
ataacactag cttatttaga taaattgcac cgtgaaaaaa accagggtga ttttattctg 2460
cgggtattta catttccagc attgctagac aagacattcc tggcattact gatgacaggt 2520
gatttaggtg caatgagaat tatgagatca tattataaac tacttcgagg atttgccaca 2580
gaggtcaagg ataaagtctg gtttctcgaa ggagtcacgc aggtgctgcc tcaagatgtt 2640
gacgaataca gtggaggtgg tgatatgcat atgatgctag atttcctcgg tggcggatta 2700
ccatcgatga caacaacaaa tttctctgat ttttcgttat ga 2832
<210> 3
<211> 1584
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggctgcag accaattggt gaaaactgaa gtcaccaaga agtcttttac tgctcctgta 60
caaaaggctt ctacaccagt tttaaccaat aaaacagtca tttctggatc gaaagtcaaa 120
agtttatcat ctgcgcaatc gagctcatca ggaccttcat catctagtga ggaagatgat 180
tcccgcgata ttgaaagctt ggataagaaa atacgtcctt tagaagaatt agaagcatta 240
ttaagtagtg gaaatacaaa acaattgaag aacaaagagg tcgctgcctt ggttattcac 300
ggtaagttac ctttgtacgc tttggagaaa aaattaggtg atactacgag agcggttgcg 360
gtacgtagga aggctctttc aattttggca gaagctcctg tattagcatc tgatcgttta 420
ccatataaaa attatgacta cgaccgcgta tttggcgctt gttgtgaaaa tgttataggt 480
tacatgcctt tgcccgttgg tgttataggc cccttggtta tcgatggtac atcttatcat 540
ataccaatgg caactacaga gggttgtttg gtagcttctg ccatgcgtgg ctgtaaggca 600
atcaatgctg gcggtggtgc aacaactgtt ttaactaagg atggtatgac aagaggccca 660
gtagtccgtt tcccaacttt gaaaagatct ggtgcctgta agatatggtt agactcagaa 720
gagggacaaa acgcaattaa aaaagctttt aactctacat caagatttgc acgtctgcaa 780
catattcaaa cttgtctagc aggagattta ctcttcatga gatttagaac aactactggt 840
gacgcaatgg gtatgaatat gatttctaaa ggtgtcgaat actcattaaa gcaaatggta 900
gaagagtatg gctgggaaga tatggaggtt gtctccgttt ctggtaacta ctgtaccgac 960
aaaaaaccag ctgccatcaa ctggatcgaa ggtcgtggta agagtgtcgt cgcagaagct 1020
actattcctg gtgatgttgt cagaaaagtg ttaaaaagtg atgtttccgc attggttgag 1080
ttgaacattg ctaagaattt ggttggatct gcaatggctg ggtctgttgg tggatttaac 1140
gcacatgcag ctaatttagt gacagctgtt ttcttggcat taggacaaga tcctgcacaa 1200
aatgttgaaa gttccaactg tataacattg atgaaagaag tggacggtga tttgagaatt 1260
tccgtatcca tgccatccat cgaagtaggt accatcggtg gtggtactgt tctagaacca 1320
caaggtgcca tgttggactt attaggtgta agaggcccgc atgctaccgc tcctggtacc 1380
aacgcacgtc aattagcaag aatagttgcc tgtgccgtct tggcaggtga attatcctta 1440
tgtgctgccc tagcagccgg ccatttggtt caaagtcata tgacccacaa caggaaacct 1500
gctgaaccaa caaaacctaa caatttggac gccactgata taaatcgttt gaaagatggg 1560
tccgtcacct gcattaaatc ctaa 1636
<210> 4
<211> 448
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccaaaacaat tggattggaa gactaagacc agattttcta gatcgttgcc aacctgttgc 60
cattggacac tttatttact gcaaaagatg tgtgtacgac taagaatgat cgttgccaac 120
ctgttgagtt ttagagctat gctgttttga atggtcccaa aactgatata ctggggtcat 180
caagactaaa ttcgatgttt tggcccctag gtaatctccg aatagaggaa taatatcgta 240
catagaccaa ttatcatgta ctggttttgg cccctaggta ccagttttag agctatgctg 300
ttttgaatgg tcccaaaaca gcagtttcaa agacggcaat agcttctgga gtggaaccca 360
tgttggaaca taaacttgac accttgagca accaaggcct tggcttcttc accgctgacg 420
gaacccatgt tggaaccttg ttttagag 462
<210> 5
<211> 444
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaaaacctc ggttcctcct tctaagatgg atgtttcagg tgattgaggg gggcttgctc 60
atcacgggcg acacaagcaa ttcgtcaggg acatcagtga cctggtcgat tgaggggggc 120
ttgatggttt tagagctatg ctgttttgaa tggtcccaaa accttcctga ttccattgca 180
tctaagccta aaactgatcc gcttgtggcc atgcgtacct ggaggagata aatcagtaag 240
gtgctcgtaa ggatttacga tcgatccgct tgtggccatt gtgttttaga gctatgctgt 300
tttgaatggt cccaaaacgg acaactcgtg tttataaatt ttagccttgt ggacttttgc 360
agcaacttct gaccaacaac aaggccaatg gcaataatgc tttcaagctg aacatgactt 420
ttgcagcaac ttggtgtttt agag 458
<210> 6
<211> 1356
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 6
atgtcagagt tgagagcctt cagtgcccca gggaaagcgt tactagctgg tggatattta 60
gttttagata caaaatatga agcatttgta gtcggattat cggcaagaat gcatgctgta 120
gcccatcctt acggttcatt gcaagggtct gataagtttg aagtgcgtgt gaaaagtaaa 180
caatttaaag atggggagtg gctgtaccat ataagtccta aaagtggctt cattcctgtt 240
tcgataggcg gatctaagaa ccctttcatt gaaaaagtta tcgctaacgt atttagctac 300
tttaaaccta acatggacga ctactgcaat agaaacttgt tcgttattga tattttctct 360
gatgatgcct accattctca ggaggatagc gttaccgaac atcgtggcaa cagaagattg 420
agttttcatt cgcacagaat tgaagaagtt cccaaaacag ggctgggctc ctcggcaggt 480
ttagtcacag ttttaactac agctttggcc tccttttttg tatcggacct ggaaaataat 540
gtagacaaat atagagaagt tattcataat ttagcacaag ttgctcattg tcaagctcag 600
ggtaaaattg gaagcgggtt tgatgtagcg gcggcagcat atggatctat cagatataga 660
agattcccac ccgcattaat ctctaatttg ccagatattg gaagtgctac ttacggcagt 720
aaactggcgc atttggttga tgaagaagac tggaatatta cgattaaaag taaccattta 780
ccttcgggat taactttatg gatgggcgat attaagaatg gttcagaaac agtaaaactg 840
gtccagaagg taaaaaattg gtatgattcg catatgccag aaagcttgaa aatatataca 900
gaactcgatc atgcaaattc tagatttatg gatggactat ctaaactaga tcgcttacac 960
gagactcatg acgattacag cgatcagata tttgagtctc ttgagaggaa tgactgtacc 1020
tgtcaaaagt atcctgaaat cacagaagtt agagatgcag ttgccacaat tagacgttcc 1080
tttagaaaaa taactaaaga atctggtgcc gatatcgaac ctcccgtaca aactagctta 1140
ttggatgatt gccagacctt aaaaggagtt cttacttgct taatacctgg tgctggtggt 1200
tatgacgcca ttgcagtgat tactaagcaa gatgttgatc ttagggctca aaccgctaat 1260
gacaaaagat tttctaaggt tcaatggctg gatgtaactc aggctgactg gggtgttagg 1320
aaagaaaaag atccggaaac ttatcttgat aaataa 1400
<210> 7
<211> 1197
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 7
atgtctcaga acgtttacat tgtatcgact gccagaaccc caattggttc attccagggt 60
tctctatcct ccaagacagc agtggaattg ggtgctgttg ctttaaaagg cgccttggct 120
aaggttccag aattggatgc atccaaggat tttgacgaaa ttatttttgg taacgttctt 180
tctgccaatt tgggccaagc tccggccaga caagttgctt tggctgccgg tttgagtaat 240
catatcgttg caagcacagt taacaaggtc tgtgcatccg ctatgaaggc aatcattttg 300
ggtgctcaat ccatcaaatg tggtaatgct gatgttgtcg tagctggtgg ttgtgaatct 360
atgactaacg caccatacta catgccagca gcccgtgcgg gtgccaaatt tggccaaact 420
gttcttgttg atggtgtcga aagagatggg ttgaacgatg cgtacgatgg tctagccatg 480
ggtgtacacg cagaaaagtg tgcccgtgat tgggatatta ctagagaaca acaagacaat 540
tttgccatcg aatcctacca aaaatctcaa aaatctcaaa aggaaggtaa attcgacaat 600
gaaattgtac ctgttaccat taagggattt agaggtaagc ctgatactca agtcacgaag 660
gacgaggaac ctgctagatt acacgttgaa aaattgagat ctgcaaggac tgttttccaa 720
aaagaaaacg gtactgttac tgccgctaac gcttctccaa tcaacgatgg tgctgcagcc 780
gtcatcttgg tttccgaaaa agttttgaag gaaaagaatt tgaagccttt ggctattatc 840
aaaggttggg gtgaggccgc tcatcaacca gctgatttta catgggctcc atctcttgca 900
gttccaaagg ctttgaaaca tgctggcatc gaagacatca attctgttga ttactttgaa 960
ttcaatgaag ccttttcggt tgtcggtttg gtgaacacta agattttgaa gctagaccca 1020
tctaaggtta atgtatatgg tggtgctgtt gctctaggtc acccattggg ttgttctggt 1080
gctagagtgg ttgttacact gctatccatc ttacagcaag aaggaggtaa gatcggtgtt 1140
gccgccattt gtaatggtgg tggtggtgct tcctctattg tcattgaaaa gatatga 1235
<210> 8
<211> 1332
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 8
atgtcattac cgttcttaac ttctgcaccg ggaaaggtta ttatttttgg tgaacactct 60
gctgtgtaca acaagcctgc cgtcgctgct agtgtgtctg cgttgagaac ctacctgcta 120
ataagcgagt catctgcacc agatactatt gaattggact tcccggacat tagctttaat 180
cataagtggt ccatcaatga tttcaatgcc atcaccgagg atcaagtaaa ctcccaaaaa 240
ttggccaagg ctcaacaagc caccgatggc ttgtctcagg aactcgttag tcttttggat 300
ccgttgttag ctcaactatc cgaatccttc cactaccatg cagcgttttg tttcctgtat 360
atgtttgttt gcctatgccc ccatgccaag aatattaagt tttctttaaa gtctacttta 420
cccatcggtg ctgggttggg ctcaagcgcc tctatttctg tatcactggc cttagctatg 480
gcctacttgg gggggttaat aggatctaat gacttggaaa agctgtcaga aaacgataag 540
catatagtga atcaatgggc cttcataggt gaaaagtgta ttcacggtac cccttcagga 600
atagataacg ctgtggccac ttatggtaat gccctgctat ttgaaaaaga ctcacataat 660
ggaacaataa acacaaacaa ttttaagttc ttagatgatt tcccagccat tccaatgatc 720
ctaacctata ctagaattcc aaggtctaca aaagatcttg ttgctcgcgt tcgtgtgttg 780
gtcaccgaga aatttcctga agttatgaag ccaattctag atgccatggg tgaatgtgcc 840
ctacaaggct tagagatcat gactaagtta agtaaatgta aaggcaccga tgacgaggct 900
gtagaaacta ataatgaact gtatgaacaa ctattggaat tgataagaat aaatcatgga 960
ctgcttgtct caatcggtgt ttctcatcct ggattagaac ttattaaaaa tctgagcgat 1020
gatttgagaa ttggctccac aaaacttacc ggtgctggtg gcggcggttg ctctttgact 1080
ttgttacgaa gagacattac tcaagagcaa attgacagct tcaaaaagaa attgcaagat 1140
gattttagtt acgagacatt tgaaacagac ttgggtggga ctggctgctg tttgttaagc 1200
gcaaaaaatt tgaataaaga tcttaaaatc aaatccctag tattccaatt atttgaaaat 1260
aaaactacca caaagcaaca aattgacgat ctattattgc caggaaacac gaatttacca 1320
tggacttcat aa 1376
<210> 9
<211> 1476
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 9
atgaaactct caactaaact ttgttggtgt ggtattaaag gaagacttag gccgcaaaag 60
caacaacaat tacacaatac aaacttgcaa atgactgaac taaaaaaaca aaagaccgct 120
gaacaaaaaa ccagacctca aaatgtcggt attaaaggta tccaaattta catcccaact 180
caatgtgtca accaatctga gctagagaaa tttgatggcg tttctcaagg taaatacaca 240
attggtctgg gccaaaccaa catgtctttt gtcaatgaca gagaagatat ctactcgatg 300
tccctaactg ttttgtctaa gttgatcaag agttacaaca tcgacaccaa caaaattggt 360
agattagaag tcggtactga aactctgatt gacaagtcca agtctgtcaa gtctgtcttg 420
atgcaattgt ttggtgaaaa cactgacgtc gaaggtattg acacgcttaa tgcctgttac 480
ggtggtacca acgcgttgtt caactctttg aactggattg aatctaacgc atgggatggt 540
agagacgcca ttgtagtttg cggtgatatt gccatctacg ataagggtgc cgcaagacca 600
accggtggtg ccggtactgt tgctatgtgg atcggtcctg atgctccaat tgtatttgac 660
tctgtaagag cttcttacat ggaacacgcc tacgattttt acaagccaga tttcaccagc 720
gaatatcctt acgtcgatgg tcatttttca ttaacttgtt acgtcaaggc tcttgatcaa 780
gtttacaaga gttattccaa gaaggctatt tctaaagggt tggttagcga tcccgctggt 840
tcggatgctt tgaacgtttt gaaatatttc gactacaacg ttttccatgt tccaacctgt 900
aaattggtca caaaatcata cggtagatta ctatataacg atttcagagc caatcctcaa 960
ttgttcccag aagttgacgc cgaattagct actcgcgatt atgacgaatc tttaaccgat 1020
aagaacattg aaaaaacttt tgttaatgtt gctaagccat tccacaaaga gagagttgcc 1080
caatctttga ttgttccaac aaacacaggt aacatgtaca ccgcatctgt ttatgccgcc 1140
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ttttcttacg gttccggttt agctgcatct ctatattctt gcaaaattgt tggtgacgtc 1260
caacatatta tcaaggaatt agatattact aacaaattag ccaagagaat caccgaaact 1320
ccaaaggatt acgaagctgc catcgaattg agagaaaatg cccatttgaa gaagaacttc 1380
aaacctcaag gttccattga gcatttgcaa agtggtgttt actacttgac caacatcgat 1440
gacaaattta gaagatctta cgatgttaaa aaataa 1524
<210> 10
<211> 1191
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 10
atgaccgttt acacagcatc cgttaccgca cccgtcaaca tcgcaaccct taagtattgg 60
gggaaaaggg acacgaagtt gaatctgccc accaattcgt ccatatcagt gactttatcg 120
caagatgacc tcagaacgtt gacctctgcg gctactgcac ctgagtttga acgcgacact 180
ttgtggttaa atggagaacc acacagcatc gacaatgaaa gaactcaaaa ttgtctgcgc 240
gacctacgcc aattaagaaa ggaaatggaa tcgaaggacg cctcattgcc cacattatct 300
caatggaaac tccacattgt ctccgaaaat aactttccta cagcagctgg tttagcttcc 360
tccgctgctg gctttgctgc attggtctct gcaattgcta agttatacca attaccacag 420
tcaacttcag aaatatctag aatagcaaga aaggggtctg gttcagcttg tagatcgttg 480
tttggcggat acgtggcctg ggaaatggga aaagctgaag atggtcatga ttccatggca 540
gtacaaatcg cagacagctc tgactggcct cagatgaaag cttgtgtcct agttgtcagc 600
gatattaaaa aggatgtgag ttccactcag ggtatgcaat tgaccgtggc aacctccgaa 660
ctatttaaag aaagaattga acatgtcgta ccaaagagat ttgaagtcat gcgtaaagcc 720
attgttgaaa aagatttcgc cacctttgca aaggaaacaa tgatggattc caactctttc 780
catgccacat gtttggactc tttccctcca atattctaca tgaatgacac ttccaagcgt 840
atcatcagtt ggtgccacac cattaatcag ttttacggag aaacaatcgt tgcatacacg 900
tttgatgcag gtccaaatgc tgtgttgtac tacttagctg aaaatgagtc gaaactcttt 960
gcatttatct ataaattgtt tggctctgtt cctggatggg acaagaaatt tactactgag 1020
cagcttgagg ctttcaacca tcaatttgaa tcatctaact ttactgcacg tgaattggat 1080
cttgagttgc aaaaggatgt tgccagagtg attttaactc aagtcggttc aggcccacaa 1140
gaaacaaacg aatctttgat tgacgcaaag actggtctac caaaggaata a 1229
<210> 11
<211> 867
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 11
atgactgccg acaacaatag tatgccccat ggtgcagtat ctagttacgc caaattagtg 60
caaaaccaaa cacctgaaga cattttggaa gagtttcctg aaattattcc attacaacaa 120
agacctaata cccgatctag tgagacgtca aatgacgaaa gcggagaaac atgtttttct 180
ggtcatgatg aggagcaaat taagttaatg aatgaaaatt gtattgtttt ggattgggac 240
gataatgcta ttggtgccgg taccaagaaa gtttgtcatt taatggaaaa tattgaaaag 300
ggtttactac atcgtgcatt ctccgtcttt attttcaatg aacaaggtga attactttta 360
caacaaagag ccactgaaaa aataactttc cctgatcttt ggactaacac atgctgctct 420
catccactat gtattgatga cgaattaggt ttgaagggta agctagacga taagattaag 480
ggcgctatta ctgcggcggt gagaaaacta gatcatgaat taggtattcc agaagatgaa 540
actaagacaa ggggtaagtt tcacttttta aacagaatcc attacatggc accaagcaat 600
gaaccatggg gtgaacatga aattgattac atcctatttt ataagatcaa cgctaaagaa 660
aacttgactg tcaacccaaa cgtcaatgaa gttagagact tcaaatgggt ttcaccaaat 720
gatttgaaaa ctatgtttgc tgacccaagt tacaagttta cgccttggtt taagattatt 780
tgcgagaatt acttattcaa ctggtgggag caattagatg acctttctga agtggaaaat 840
gacaggcaaa ttcatagaat gctataa 895
<210> 12
<211> 3279
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 12
atgctttttg ataacaaaaa tcgcggtgct ttaaactcac tgaacacacc agatattgct 60
tctttatcaa tatcatccat gtcggactat cacgtgtttg attttcccgg taaggacctg 120
cagagagagg aagtgataga tttgctagat cagcaagggt ttattcccga cgatttgatc 180
gaacaagaag tagattggtt ttataactca ttgggtattg acgatttgtt cttctcgaga 240
gaatctcccc aattaatctc gaatatcata cattctttgt atgcttcaaa gctagatttc 300
tttgcgaagt ccaaattcaa cggaattcag ccaaggctat tcagcattaa aaacaaaatt 360
ataactaatg ataatcatgc catctttatg gaatctaata ctggtgtcag cataagcgat 420
tctcagcaaa aaaactttaa atttgctagt gacgccgtcg gaaacgatac tttggagcat 480
ggtaaggata ccatcaaaaa aaataggatt gaaatggatg attcttgtcc accttatgaa 540
ttagattccg aaattgatga ccttttcctg gataacaagt ctcaaaaaaa ctgcagatta 600
gtttcttttt gggctccaga aagcgaatta aagctaactt ttgtttatga gagtgtttac 660
cctaatgatg atccagccgg cgtagatatt tcctctcagg atttgctgaa aggtgatatt 720
gaatcgatta gtgataagac catgtacaaa gtttcgtcga acgaaaataa aaaactatac 780
ggtctcttac ttaagttggt taaagaaaga gaaggtcctg tcattaagac tactcgctcc 840
gtagaaaata aggatgaaat taggttatta gtcgcttaca agcgattcac cactaagcgt 900
tattactctg ctttgaactc tttgttccac tattacaagt tgaaaccttc taagttctat 960
ttagagtcgt ttaatgttaa ggatgatgac atcattatct tttccgttta tttgaacgag 1020
aaccagcaat tggaagatgt tctacttcac gatgtggagg cagcattgaa acaggttgaa 1080
agagaagctt cattgctata cgctatccca aacaattctt tccatgaggt ttaccagaga 1140
cgtcaattct cgcccaaaga agctatatat gctcatattg gtgctatatt cattaaccat 1200
tttgttaatc gtttaggctc tgattatcaa aaccttttat ctcaaatcac cattaagcgt 1260
aatgatacta ctcttttgga gattgtagaa aacctaaaaa gaaagttaag aaatgaaacc 1320
ttaactcagc aaactattat caacatcatg tcgaagcatt acactataat ttccaagttg 1380
tataaaaatt ttgctcaaat tcactattat cataatagta ctaaagatat ggagaagaca 1440
ttatcttttc aaagactgga aaaagtggag ccttttaaga atgaccaaga gttcgaagct 1500
tacttgaata aattcattcc aaatgattca cctgatttgt tgatcctgaa aacactgaac 1560
atcttcaaca agtctatttt gaagacaaat ttctttatta caagaaaagt agcaatatca 1620
ttcagattag atccttccct ggtgatgaca aaattcgaat atccagagac accctatggt 1680
atattttttg tcgttggtaa tactttcaaa gggttccata tcaggttcag agatatcgca 1740
aggggcggta ttcgtatagt ctgttccagg aatcaggata tttatgattt gaattccaag 1800
aacgttattg atgagaacta tcaattggcc tctactcagc aacgtaaaaa taaggatatt 1860
ccagagggtg gctctaaagg tgtcatctta ttgaacccag gattggtaga acatgaccag 1920
acatttgtcg ccttttccca atatgtggat gcaatgattg acattctaat caacgatcca 1980
ttaaaggaaa actatgtcaa ccttttacca aaggaggaaa tattattttt tggcccagat 2040
gaaggaactg ctggtttcgt ggattgggca actaaccatg ctcgtgtgag gaactgccca 2100
tggtggaaat catttttgac tggaaaatcc ccatctttgg gtggtattcc ccatgacgaa 2160
tatggtatga cttctctggg tgttcgtgct tatgttaata aaatttacga aactttaaac 2220
ttgacaaatt ctactgttta caaattccaa actggtggtc cggatggtga tttgggatcc 2280
aatgaaattc ttttatcttc gccaaacgaa tgttatttgg caattctgga cggttcaggt 2340
gtcctgtgtg atcctaaagg tttagataaa gatgaattat gccgcttggc acatgaaagg 2400
aaaatgattt ccgatttcga cacttccaaa ttatcaaaca acggattttt tgtttctgtg 2460
gatgcaatgg atatcatgct accaaatggt acaattgtag ctaacggcac aaccttcaga 2520
aacacctttc atactcaaat tttcaaattt gtggatcatg tcgacatttt tgttccatgc 2580
ggtggtagac caaactcaat tactctaaat aatctacatt attttgttga cgaaaagact 2640
gggaaatgta aaattccata tattgtggag ggtgccaatc tatttataac gcaacctgct 2700
aaaaatgctt tggaggaaca tggctgtatt ctgttcaaag atgcttctgc aaacaaaggt 2760
ggtgtcacat cttcatcaat ggaagtgttg gcctcactag cgcttaacga taacgacttc 2820
gtgcacaaat ttattggaga tgttagtggt gagaggtctg cgttgtacaa gtcgtacgtt 2880
gtagaagtgc agtcaagaat tcagaaaaat gctgaattag agtttggtca gttatggaat 2940
ttgaatcaac taaatggaac ccacatttca gaaatttcaa accaattgtc cttcactata 3000
aacaaattga acgacgatct agttgcttct caagagttgt ggctcaatga tctaaaatta 3060
agaaactacc tattgttgga taaaataatt ccaaaaattc tgattgatgt tgctgggcct 3120
cagtccgtat tggaaaacat tccagagagc tatttgaaag ttcttctgtc gagttactta 3180
tcaagcactt ttgtttacca gaacggtatc gatgttaaca ttggaaaatt cttggaattt 3240
attggtgggt taaaaagaga agcggaggca agtgcttga 3387
<210> 13
<211> 1050
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atggcgaatc tgaacggaga gtcggcggat ctgagggcga cgtttctggg ggtttattcg 60
gtgcttaaat ctgagctctt gaacgaccct gctttcgagt ggactgatgg ttctcgtcaa 120
tgggtcgagc gtatgctgga ctataatgta cctggaggga aattaaaccg aggcctgtca 180
gtcattgata gctacaagtt actaaaagga ggaaaagatc taactgatga tgaagtgttt 240
ctagctagtg ctcttggctg gtgtgttgaa tggctccagg catattttct tgtacttgat 300
gatattatgg ataattctca cacacgacgt ggtcagccat gctggtttag agtccccaag 360
gttggtatga ttgccataaa tgatggaatc attctccgga accatatccc cagaattctt 420
aagaagcact tcagaacaaa gccttactat gttgatctgc tggatttgtt caatgaggtg 480
gaatttcaaa ctgcttctgg acagatgata gatttaatta ccactattga aggagaaaaa 540
gatttatcaa aatactcatt gcctcttcat cgccgcattg ttcagtacaa gacggcctac 600
tactcatttt acctcccagt tgcttgtgcg ttgctcatgg cgggtgagga cctggagaaa 660
catccaacag tgaaggatgt gcttattaat atgggaatat actttcaagt acaggatgac 720
tatttagatt gctttggtga gcctgaaaag attgggaaga ttggaacaga tattgaagat 780
ttcaaatgtt cttggctggt tgtaaaggcc ctggagcttt gtaacgaaga acagaagaaa 840
actcttttcg agcactatgg aaaggaagat ccagctgatg ttgcaaaaat caaagtcctc 900
tataatgaga ttaatctaca aggtgtgttt gctgagtttg agagcaagag ctacgagaaa 960
ctaaatagct cgattgaagc tcatcccagc aaatctgtgc aagcagtgct caagtctttc 1020
ttgggcaaga tatacaagag gcagaaataa 1084
<210> 14
<211> 2274
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 14
atgtggaagt tgaagatagg aaagggaaat ggagaagatc cgcatttatt cagcagcaat 60
aacttcgtcg gacgtcaaac atggaagttt gatcacaaag ccggctcacc ggaggaacga 120
gctgccgtcg aagaagctcg ccggggtttc ttggataacc gttttcgtgt taaaggttgc 180
agtgatctat tgtggcgaat gcaattttta agagagaaga aattcgaaca aggcatacca 240
caactaaaag ctactaacat agaagaaata acgtatgaaa caacgacaaa tgcattacga 300
agaggcgttc gttacttcac ggctttgcaa gcctctgacg gccattggcc gggagaaatc 360
accggtccgc ttttcttcct tcctcctctc atattttgtt tgtacattac cggacatctg 420
gaggaagtat tcgatgctga acatcgcaaa gagatgctaa gacatatcta ttgtcaccag 480
aacgaagatg gtggatgggg attacacatc gaaagcaaga gtgttatgtt ctgcaccgtg 540
ttgaattaca tatgtttacg tatgcttgga gaaaatcctg aacaagacgc atgcaaacga 600
gctagacaat ggattcttga ccgtggtgga gtgatcttta ttccttcttg ggggaaattt 660
tggctctcga tacttggagt ctatgattgg tctggaacta atccgacgcc accagaactc 720
ttgatgctgc cttcttttct tccaatacat ccagggaaaa ttttgtgtta tagccggatg 780
gttagtatac ctatgtcgta tctatatggg aagaggtttg ttggtccaat tacacctctt 840
attttactct tgcgcgaaga actttacttg gaaccttatg aagaaatcaa ttggaaaaaa 900
agtcgacgtc tatatgcaaa agaagacatg tattatgctc atcctttggt tcaagatttg 960
ttatctgaca ctcttcaaaa ctttgtggag cctttactta cacgttggcc attgaacaag 1020
cttgtgaggg aaaaagctct tcagcttact atgaaacaca tacactatga agacgaaaat 1080
agccattaca taaccattgg atgtgttgaa aaggtactgt gcatgctagc ttgttgggtt 1140
gaaaatccga atggagatta tttcaagaag catctggcta gaattccaga ttatatgtgg 1200
gtcgctgaag atggaatgaa aatgcagagc tttggatgtc aactgtggga taccggattt 1260
gctattcaag ctttgcttgc aagtaatctc cctgatgaaa ctgatgatgc actaaagaga 1320
ggacataatt acataaaggc atctcaggtt agagaaaacc cttcaggtga ttttaggagc 1380
atgtaccgcc acatttcgaa aggagcatgg acattttctg atcgagatca tggatggcaa 1440
gtttcagatt gtacagctga agctttaaag tgttgcctgc tgctttccat gatgtcagct 1500
gatatcggcg gccagaaaat agatgatgaa caattatatg actctgttaa cctcttgctg 1560
tctttacaga gcggaaatgg aggtgtcaat gcgtgggagc catcccgtgc atataaatgg 1620
ttggaactgc tcaatcctac agaattcatg gctaatacca tggtcgagcg ggagtttgtg 1680
gaatgcacct catctgttat acaagcactt gatctattta gaaaattgta tccagatcac 1740
aggaagaaag agatcaacag gtccatcgaa aaagctgtgc aatttataca agacaatcaa 1800
acaccagacg gttcatggta cggaaattgg ggtgtttgct tcatttacgc tacttggttt 1860
gctcttggag gcctagcagc agctggtgaa acttacaacg attgtttagc tatgcgcaat 1920
ggtgtccact ttttgctcac gacacaaaga gatgatggag gttggggtga aagctattta 1980
tcatgctccg aacagagata tataccatca gaaggagaaa gatcaaacct tgtgcaaaca 2040
tcatgggcta tgatggctct aattcatacg ggacaggctg agagagattt gactcctctt 2100
catcgtgctg ccaaacttat catcaattca caacttgaaa acggcgattt tcctcaacag 2160
gaaatagtag gagcgttcat gaatacatgc atgctacact atgctacata cagaaacacc 2220
ttcccattat gggcactcgc agaataccga aaagttgtgt ttatcgttaa ttaa 2348
<210> 15
<211> 1233
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 15
atggggagct tggggacgat gctgagatat ccggatgaca tatatccgct cctgaagatg 60
aaacgagcga ttgagaaagc ggagaagcag atccctcctg agccacactg gggtttctgc 120
tattcgatgc tccacaaggt ttctcgaagc ttttctctcg ttattcagca actcaacacc 180
gagctccgta acgccgtgtg tgtgttctac ttggttctcc gagctcttga tactgttgag 240
gatgatacta gcataccaac tgatgaaaag gttcccatcc tgatagcttt tcaccggcac 300
atatacgata ctgattggca ttattcatgt ggtacgaagg agtacaagat tctaatggac 360
caatttcacc atgtttctgc agcttttttg gaacttgaaa aagggtatca agaggctatc 420
gaggaaatta ctagaagaat gggtgcaggg atggccaagt ttatctgcca agaggtagaa 480
actgttgatg actacgatga atactgccac tatgttgctg ggcttgttgg tttaggtttg 540
tcgaaactct tcctcgctgc aggatcagag gttttgacac cagattggga ggcgatttcc 600
aattcaatgg gtttatttct gcagaaaaca aacattatca gagattatct tgaggacatt 660
aatgagatac caaaatcccg catgttttgg cctcgcgaga tttggggcaa atatgctgac 720
aagcttgagg atttaaaata cgaggagaac acaaacaaat ccgtacagtg cttaaatgaa 780
atggttacca atgcgttgat gcatattgaa gattgcctga aatacatggt ttccttgcgt 840
gatccttcca tatttcggtt ctgtgccatc cctcagatca tggcgattgg aacacttgca 900
ttatgctata acaatgaaca agtattcaga ggcgttgtga aactgaggcg aggtcttact 960
gctaaagtca ttgatcgtac aaagacaatg gctgatgtct atggtgcttt ctatgatttt 1020
tcctgcatgc tgaagacaaa ggttgacaag aacgatccaa atgccagtaa gacactaaac 1080
cgacttgaag ccgttcagaa actctgcaga gacgctggag ttcttcaaaa cagaaaatct 1140
tatgttaatg acaaaggaca accaaacagt gtctttatta taatggttgt gattctactg 1200
gccatagtct ttgcatatct cagagcaaac tga 1273
<210> 16
<211> 1758
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 16
atgaaaccat tcgtaatcag gaaccttcca agatttcaat caactcttag atcttcgctt 60
ctctacacaa atcatcgccc ctcttctcga ttctctctct ctactcgtcg attcaccacc 120
ggagccacct acattcgccg atggaaagca acggcggcgc agacactcaa actctccgcc 180
gtgaactcca cggtgatgat gaaaccggcg aagattgcgt tggatcaatt tatagcttct 240
ctatttacgt ttctgcttct ctacattttg cgtcggagta gtaataagaa taagaagaat 300
cgtggactcg tcgtttccca aaacgatacc gtatccaaaa atcttgaaac ggaggttgat 360
tctggcactg atgtgatcat cgtcggagct ggtgtcgccg gttccgctct tgctcatact 420
ctcggcaagg aaggaagaag agtgcacgtt atagaaagag atttttctga gcaagacaga 480
atcgttggtg aattgcttca acctggtggt tatttgaagt taatagaact tggacttgaa 540
gattgtgtga agaagattga tgctcaacga gttcttggtt atgttctctt taaagatggg 600
aagcatacta aacttgctta ccccttggaa acgtttgatt cggatgtagc cgggagaagt 660
ttccataatg ggagatttgt acagagaatg cgagaaaaag cccttactct ttcaaatgta 720
cgattggaac aaggaacggt tacgtcgttg cttgaagaac acgggacaat taaaggggtt 780
cgatacagaa caaaagaggg caatgagttt agatcatttg ctcctctcac aattgtatgt 840
gatggttgtt tctccaactt gcgtcgctct ctttgcaaac ctaaggtgga tgtgccatct 900
acttttgtgg gtcttgtctt ggagaactgt gaacttccat ttgcaaatca cgggcacgtt 960
gttctcggtg acccatcacc catcttaatg tatcccatca gcagttctga agtccgttgc 1020
ttagtagatg taccgggtca aaaacttcct cccattgcaa atggtgaaat ggcaaagtat 1080
ctgaaaacac gggttgcgcc tcaagtacca accaaggtcc gtgaagcatt catcaccgct 1140
gttgagaaag gtaatatcag aaccatgcca aaccgaagca tgccagctga tccgattcct 1200
actcctggag ctcttcttct tggtgatgca ttcaacatga gacatccttt aaccggtggt 1260
gggatgaccg ttgcattggc ggatatagtt gtactccgtg atcttctaag gccaattcgc 1320
aaccttaatg acaaagaagc tttgtctaag tatattgaat ccttttacac actacgaaaa 1380
cctgtagctt ccaccattaa tacattggcg gatgcgttgt ataaggtctt tttagcatct 1440
tcagatgaag caagaacgga aatgcgtgaa gcttgcttcg actatcttag ccttggaggt 1500
gttttctcat ctggtccagt tgcattgctc tctggtttaa accctcgtcc tctgagttta 1560
gttctccact tctttgctgt ggcgatctac gctgtttgtc gtttaatgct accatttcct 1620
tcgattgaga gcttttggct tggagctagg ataatctcga gtgcttcaag catcatcttt 1680
ccaataatta aagcagaggg agttagacaa atgttcttcc ctcgtacaat ccctgccata 1740
taccgtgctc ctccttaa 1816
<210> 17
<211> 2118
<212> DNA
<213> 迷迭香(Rosmarinus officinalis)
<400> 17
atggaaccct cgtcgccgaa gctctcgccg ctcgatttca tagcggcgat cttaaagggc 60
gatattgagg gggcggcgcc gcggggtgtg gcggcgatgt tgatggagaa cagagacctc 120
gcgatggtgc tcactacatc cgtcgcgttg ctcataggct gcgtcgttgt gctagcgtgg 180
cggcgcaccg ccggatcggc ggggaagaag cagctacagc cgcccaagct ggtggtgccg 240
aaggcggcgg tggagccgga ggaggcggag gatgacaaca ccaaggtttc cgtcttcttc 300
ggcacacaga ctggtacagc tgaaggtttc gcaaaggcat ttgctgagga agctaaagct 360
agatatccac aggccaagtt taaagtaatt gacttagatg attatgctgc cgatgatgat 420
gagtacgagg ataagttgaa gaaggagagt ttagcattct tcttcctggc ctcatatgga 480
gatggtgagc ctacagacaa tgctgcaagg ttctacaaat ggtttactga gggaaaagat 540
agggaggaat ggcttaagaa tcttcagtac gctatattcg gtcttgggaa cagacaatac 600
gagcatttca acaagattgc gatagtggta gatgacctta tcaccgagca aggaggaaag 660
aagcttgttc cagtaggctt gggagatgat gaccaatgca ttgaagatga ctttactgca 720
tggcgtgaat tattgtggcc tgagttggat aaattgctcc gcaacgagga cgatgcaacg 780
gttgctactc catacactgc tgcggtgttg cagtatcgtg ttgtgctcca tgaccaaaca 840
gatggattga ttacagagaa tggttcacca aatggtcgtg ccaatggtaa cactgtatat 900
gatgctcaac atccctgcag ggcaaatgtt tctgtaaaga gagagctgca cactcctgaa 960
tcagatcgtt cttgcactca tttggaattt gacatagctg gcacaggact tgtgtatgaa 1020
acgggggacc atgttggtgt ctattgtgag aatttgctca agaatgtgga ggaagcggaa 1080
aagttactaa atctgtcccc gcaaacatac ttttcagttc atactgataa cgaggatggc 1140
actccactca gtggaagctc tttgccacct ccattccccc cttgcacttt gcggacagca 1200
ctaactaaat acgcagatct tatgagtatg cccaaaaagt ctgtgctagt tgcattagcg 1260
gaatatgctt ctgaccaaag tgaagctgat cgactcagat atcttgcatc ccccgatgga 1320
aaggaggaat atgcacagta tgtagttgca agtcagagaa gcctactgga gatcatggcc 1380
gagttcccgt ccgccaagcc ttctctaggt gttttctttg cagctgttgc tcctcggctc 1440
cagcccagat tttattctat ctcatcctcc ccgaaaatcg caccaaccag agttcatgtg 1500
acttgtgctc tggtttatga caaaacacca acaggacgaa tccacaaggg tatatgctct 1560
acatggataa agaatgctgt gcctttggag gaaagtagcg attgcagttg ggcaccaatt 1620
tttattagaa gctctaactt caaactccct actgatccta aagtaccggt aataatggtc 1680
ggccctggta ctggcttggc tccatttagg ggtttccttc aggaaaggtt agctctaaag 1740
gaatctggag ctgaacttgg tcctgccatt ttattttttg gttgtaggaa ccgtaaaatg 1800
gattttattt atgaagatga gttgaatggc tttgtcaaag ctggagcaat ttccgagctc 1860
atagttgctt tctcacgtga gggacctgcg aaggaatacg tgcaacacaa gatgtctcaa 1920
agggcttcgg acgtctggaa aatgatctcc gatggaggtt atgtctacgt ctgtggtgat 1980
gccaagggaa tggcgcgtga tgtacaccga actctccaca caatcgcaca aaaacagggt 2040
tgtctgagca gctccgaagc cgaaggcatg gtcaagaatc tgcaaacgac aggaagatat 2100
ttgcgcgatg tatggtga 2188
<210> 18
<211> 786
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 18
atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga 60
aaggcgatgg ccattcgctt cggcaaggag caggcaaaag tggttatcaa ctattatagt 120
aataaacaag atccgaacga ggtaaaagaa gaggtcatca aggcgggcgg tgaagctgtt 180
gtcgtccaag gagatgtcac gaaagaggaa gatgtaaaaa atatcgtgca aacggcaatt 240
aaggagttcg gcacactcga tattatgatt aataatgccg gtcttgaaaa tcctgtgcca 300
tctcacgaaa tgccgctcaa ggattgggat aaagtcatcg gcacgaactt aacgggtgcc 360
tttttaggaa gccgtgaagc gattaaatat ttcgtagaaa acgatatcaa gggaaatgtc 420
attaacatgt ccagtgtgca cgaagtgatt ccttggccat tatttgtcca ctatgcggca 480
agtaaaggcg ggatgaagct gatgacagaa acattagcgt tggaatacgc gccgaagggc 540
attcgcgtca ataatattgg gccaggtgcg atcaacacga cgatcaataa ggagaaattt 600
gctgaccctg aacagagagc tgatgtagaa agcatgattc caatgggata tatcggcgaa 660
ccggaggaga tcgccgcagt agcagcctgg cttgcttcga aggaagccag ctacgtcaca 720
ggcatcacgt tattcgcgga cggcggtatg acacaatatc cttcattcca ggcaggccgc 780
ggttaa 812
<210> 19
<211> 984
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 19
ggaagtacct tcaaagaatg gggtcttatc ttgttttgca agtaccactg agcaggataa 60
taatagaaat gataatatac tatagtagag ataacgtcga tgacttccca tactgtaatt 120
gcttttagtt gtgtattttt agtgtgcaag tttctgtaaa tcgattaatt tttttttctt 180
tcctcttttt attaacctta atttttattt tagattcctg acttcaactc aagacgcaca 240
gatattataa catctgcata ataggcattt gcaagaatta ctcgtgagta aggaaagagt 300
gaggaactat cgcatacctg catttaaaga tgccgatttg ggcgcgaatc ctttattttg 360
gcttcaccct catactatta tcagggccag aaaaaggaag tgtttccctc cttcttgaat 420
tgatgttacc ctcataaagc acgtggcctc ttatcgagaa agaaattacc gtcgctcgtg 480
atttgtttgc aaaaagaaca aaactgaaaa aacccagaca cgctcgactt cctgtcttcc 540
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 600
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 660
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 720
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 780
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 840
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 900
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 960
ctttttacaa caaatataaa acaa 1016
<210> 20
<211> 419
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 20
cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccagat tttctcggac 60
tccgcgcatc gccgtaccac ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat ttcccctctt 120
tcttcctcta gggtgtcgtt aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa aaaagagacc 180
gcctcgtttc tttttcttcg tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg tttctttttc 240
ttgaaaattt ttttttttga tttttttctc tttcgatgac ctcccattga tatttaagtt 300
aataaacggt cttcaatttc tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta ttacaacttt 360
ttttacttct tgctcattag aaagaaagca tagcaatcta atctaagttt taattacaa 431
<210> 21
<211> 676
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 21
tcgagtttat cattatcaat actgccattt caaagaatac gtaaataatt aatagtagtg 60
attttcctaa ctttatttag tcaaaaaatt agccttttaa ttctgctgta acccgtacat 120
gcccaaaata gggggcgggt tacacagaat atataacatc gtaggtgtct gggtgaacag 180
tttattcctg gcatccacta aatataatgg agcccgcttt ttaagctggc atccagaaaa 240
aaaaagaatc ccagcaccaa aatattgttt tcttcaccaa ccatcagttc ataggtccat 300
tctcttagcg caactacaga gaacaggggc acaaacaggc aaaaaacggg cacaacctca 360
atggagtgat gcaacctgcc tggagtaaat gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt 420
atctatctca ttttcttaca ccttctatta ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct 480
gaaaaaaaag gttgaaacca gttccctgaa attattcccc tacttgacta ataagtatat 540
aaagacggta ggtattgatt gtaattctgt aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta 600
cttttatagt tagtcttttt tttagtttta aaacaccaag aacttagttt cgaataaaca 660
cacataaaca aacaaa 698
<210> 22
<211> 874
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 22
cttatcttga cgggtattct gagcatctta ctcagtttca agatctttta atgtccaaaa 60
acatttgagc cgatctaaat acttctgtgt tttcattaat ttataaattg tactctttta 120
agacatggaa agtaccaaca tcggttgaaa cagtttttca tttacttatg gtttattggt 180
ttttccagtg aatgattatt tgtcgttacc ctttcgtaaa agttcaaaca cgtttttaag 240
tattgtttag ttgctctttc gacatatatg attatccctg cgcggctaaa gttaaggatg 300
caaaaaacat aagacaactg aagttaattt acgtcaatta agttttccag ggtaatgatg 360
ttttgggctt ccactaattc aataagtatg tcatgaaata cgttgtgaag agcatccaga 420
aataatgaaa agaaacaacg aaactgggtc ggcctgttgt ttcttttctt taccacgtga 480
tctgcggcat ttacaggaag tcgcgcgttt tgcgcagttg ttgcaacgca gctacggcta 540
acaaagccta gtggaactcg actgatgtgt tagggcctaa aactggtggt gacagctgaa 600
gtgaactatt caatccaatc atgtcatggc tgtcacaaag accttgcgga ccgcacgtac 660
gaacacatac gtatgctaat atgtgttttg atagtaccca gtgatcgcag acctgcaatt 720
tttttgtagg tttggaagaa tatataaagg ttgcactcat tcaagatagt ttttttcttg 780
tgtgtctatt cattttatta ttgtttgttt aaatgttaaa aaaaccaaga acttagtttc 840
aaattaaatt catcacacaa acaaacaaaa caaa 902
<210> 23
<211> 926
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 23
tcttcaagaa ttggggatct acgtatggtc attcttcttc agattccctc atggagaagt 60
gcggcagatg tatatgacag agtcgccagt ttccaagaga ctttattcag gcacttccat 120
gataggcaag agagaagacc cagagatgtt gttgtcctag ttacacatgg tatttattcc 180
agagtattcc tgatgaaatg gtttagatgg acatacgaag agtttgaatc gtttaccaat 240
gttcctaacg ggagcgtaat ggtgatggaa ctggacgaat ccatcaatag atacgtcctg 300
aggaccgtgc tacccaaatg gactgattgt gagggagacc taactacata gtgtttaaag 360
attacggata tttaacttac ttagaataat gccatttttt tgagttataa taatcctacg 420
ttagtgtgag cgggatttaa actgtgagga cctcaataca ttcagacact tctgacggta 480
tcaccctact tattcccttc gagattatat ctaggaaccc atcaggttgg tggaagatta 540
cccgttctaa gacttttcag cttcctctat tgatgttaca ctcggacacc ccttttctgg 600
catccagttt ttaatcttca gtggcatgtg agattctccg aaattaatta aagcaatcac 660
acaattctct cggataccac ctcggttgaa actgacaggt ggtttgttac gcatgctaat 720
gcaaaggagc ctatatacct ttggctcggc tgctgtaaca gggaatataa agggcagcat 780
aatttaggag tttagtgaac ttgcaacatt tactattttc ccttcttacg taaatatttt 840
tctttttaat tctaaatcaa tctttttcaa ttttttgttt gtattctttt cttgcttaaa 900
tctataacta caaaaaacac atacag 956
<210> 24
<211> 165
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 24
cgaatttctt atgatttatg atttttatta ttaaataagt tataaaaaaa ataagtgtat 60
acaaatttta aagtgactct taggttttaa aacgaaaatt cttattcttg agtaactctt 120
tcctgtaggt caggttgctt tctcaggtat agcatgaggt cgctc 169
<210> 25
<211> 190
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 25
atccgctcta accgaaaagg aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt 60
ttttatagtt atgttagtat taagaacgtt atttatattt caaatttttc ttttttttct 120
gtacagacgc gtgtacgcat gtaacattat actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg 180
acgctcgaag 196
<210> 26
<211> 400
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 26
atttaactcc ttaagttact ttaatgattt agtttttatt attaataatt catgctcatg 60
acatctcata tacacgttta taaaacttaa atagattgaa aatgtattaa agattcctca 120
gggattcgat ttttttggaa gtttttgttt ttttttcctt gagatgctgt agtatttggg 180
aacaattata caatcgaaag atatatgctt acattcgacc gttttagccg tgatcattat 240
cctatagtaa cataacctga agcataactg acactactat catcaatact tgtcacatga 300
gaactctgtg aataattagg ccactgaaat ttgatgcctg aaggaccggc atcacggatt 360
ttcgataaag cacttagtat cacactaatt ggcttttcgc 412
<210> 27
<211> 569
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 27
tagggcccac aagcttacgc gtcgacccgg gtatccgtat gatgtgcctg actacgcatg 60
atatctcgag ctcagctagc taactgaata aggaacaatg aacgtttttc ctttctcttg 120
ttcctagtat taatgactga ccgatacatc cctttttttt tttgtctttg tctagctcca 180
gcttttgttc cctttagtga gggttaattc aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt 240
gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc 300
agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 360
aatggcgaat ggcgcgacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt 420
acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc 480
ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct 540
ttagggttcc gatttagtgg tttacggca 587
<210> 28
<211> 400
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 28
gttaattcaa attaattgat atagtttttt aatgagtatt gaatctgttt agaaataatg 60
gaatattatt tttatttatt tatttatatt attggtcggc tcttttcttc tgaaggtcaa 120
tgacaaaatg atatgaagga aataatgatt tctaaaattt tacaacgtaa gatattttta 180
caaaagccta gctcatcttt tgtcatgcac tattttactc acgcttgaaa ttaacggcca 240
gtccactgcg gagtcatttc aaagtcatcc taatcgatct atcgtttttg atagctcatt 300
ttggagttcg cgattgtctt ctgttattca caactgtttt aatttttatt tcattctgga 360
actcttcgag ttctttgtaa agtctttcat agtagcttac 412
<210> 29
<211> 2077
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttattaggtc tagagatccc aatacaacag 60
atcacgtgat cttttgtaag atgaagttga agtgagtgtt gcaccgtgcc aatgcaggtg 120
gctattagat taaatatgtg atttgttcta ttaagtttcc tgtataatta tggtttttgg 180
ccagcgaaaa cagtttcaaa agattgctgg aagtctgcaa taatgtcatc aataaattcg 240
ataccaacag agacacgaat taagtccttg gtaacaccag atgccaactt ttctttgtca 300
tttaattgtt tgtgggtagt gaagtatgga gcaatgacta aggtcttggc atcaccaaca 360
ttggccaagt tagaggcaag ctttaaattg tcaacaactt gagcaccaga aagtttgaat 420
gggtcagttt ccttgtcggc atttggtaag tcttttacac cgaaagataa gacaccaccg 480
aaaccgttag atagatactt cttagcattt tcatgatgag aatgagatgc taaaccaggg 540
tatgaaaccc aagatacgta tggggattgt tctaaccatt tggctaactt caatgcattt 600
tcaccgtgtc tttcagctct caaagataat gtttcaacac cttgtagtag caagaaagag 660
gcaaatgggt tcatcaatgg acccaaatct cttaatagtt cagttctaac atgaacgatg 720
tatgccaagt taccgtaggc ttcattgtag atagtaccgt gatatccttc ggcaggttga 780
gagaattgag ggaacttttc tgggtagtcc ttccatggga acttaccaga gtcaacaata 840
ataccaccga tagtagtacc atgaccacca atccatttgg tagcagaatg tgttacaata 900
tcagcaccgt atttaattgg ctgacagaag taaccaccgg caccaaatgt gttgtcaacg 960
acaactggaa taccgtgttt gtgagcaatt gcaacaattt tttcaaaatc cggaacattg 1020
tactttggat taccaatggt ttccaaataa acagccttgg ttctttcatc aaagaccttt 1080
tcgaattctt ctggattgtc accttcaaca aatctagcct cgataccaaa tcttttgaac 1140
gagattttga actggttata agtaccaccg tataagtaag aagtggaaac gatgttgtca 1200
ccagtgtgtg ccaaaccttg gatggcaagg gtttgagcgg cttgaccgga ggaaacagcc 1260
aaagcagcag caccaccttc taaagcagca attctttctt ccaaaacatt actggttggg 1320
ttttggaaac gggaatagac gtaacctgga acttctagac caaacaattg cgaaccatgc 1380
ttagagtttt cgaaaacata agaagtggtg gcgtaaattg gtacagctct ggatctgtga 1440
gcattgtcac cagggttctc ttggccggcg tgtagttgaa cagtatcgaa atgagatggc 1500
atggtgcaac taattgacgg gagtgtattg acgctggcgt actggctttc acaaaatggc 1560
ccaatcacaa ccacatctta gatagttgaa atgactttag ataacatcaa ttgagatgag 1620
cttaatcatg tcaaagctaa aagtgtcacc atgaacgaca attcttaagc aaatcacgtg 1680
atatagatcc acgaataacc accatttgat gctcgaggca agtaatgtgt gtaaaaaaat 1740
gcgttaccac catccaatgc agaccgatct tctacccaga atcacatata tttatgtacc 1800
gagtaccttt tttctatctt ccaattgctt ctcccatatg attgtctccg taagctcgaa 1860
atttctaagt tggattttaa tcttcacgca ggatgacagt tcgatgagct tctgaggagt 1920
gtttagaaca taatcagttt atccatggtc tatctcttct tgtcgctttt tctcctcgat 1980
agaacctaaa taaaacgagc tctcgagaac ccttaatata acttcgtata atgtatgcta 2040
tacgaagtta ttgcaggtct catctggaat ataattc 2145
<210> 30
<211> 2352
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatattaag ggttctcgag agctcgctgt 60
gaagatccca gcaaaggctt acaaagtgtt atctcttttg agacttgttg agttgaacac 120
tggtgttttc atcaaactta ccaaggacgt gtacccattg ttgaaacttg tatcaccata 180
tattgttatc ggacaacctt cacttgcatc tatccgttct ttaatccaaa agagatctag 240
aataatgtgg caaaggccag aagataaaga accaaaagag ataatcttga atgacaacaa 300
tatcgttgaa gagaaattag gtgatgaagg tgtcatttgt atcgaggata tcatccatga 360
gatttcgacg ttgggcgaaa atttctcgaa atgtactttc ttcctattac cattcaaatt 420
gaacagagaa gtcagtggat tcggtgccat ctcccgtttg aataaactga aaatgcgcga 480
acaaaacaag gagactcgtc aaatttcaaa cgctgccacg gctccagtta tccaagtaga 540
tatcgactca atgatttcca agttgaattg attaactata aaaggaaaat atctgtacaa 600
tagacatcgg gctcccattg gccctaccca catatgtaga aatacattac tctattcact 660
actgcattta gttatgttta acatttgata tagcagacta ccgccaggca caatatattc 720
cccttccctc ttgccattcg ctgtacttgt ggtggattcc aattcagcgc agtcacgtgc 780
tagtaatcac cgcatttttt tcttttcctt tcaggctaaa accggttccg ggcctgatcc 840
ctgcactcat tttctaacgg aaaaccttca gaagcataac tacccattcc agtttagagt 900
catgacaggt tcaacatcag atgcttcata tacttttata tattgaatta tataaatata 960
tctatgtact ctaagtaagt acatctgctt taacgcattc ctacatttgc ttcgatttat 1020
ttttattgtt gatacctatt tgaagaagta aaaagtatcc cacactacac agattatacc 1080
atgtctaaga atatcgttgt cctaccgggt gatcacgtcg gtaaagaagt tactgacgaa 1140
gctattaagg tcttgaatgc cattgctgaa gtccgtccag aaattaagtt caatttccaa 1200
catcacttga tcgggggtgc tgccatcgat gccactggca ctcctttacc agatgaagct 1260
ctagaagcct ctaagaaagc cgatgctgtc ttactaggtg ctgttggtgg tccaaaatgg 1320
ggtacgggcg cagttagacc agaacaaggt ctattgaaga tcagaaagga attgggtcta 1380
tacgccaact taagaccatg taactttgct tctgattctt tactagatct ttctcctttg 1440
aagcctgaat atgcaaaggg taccgatttc gtcgtcgtta gagaattggt tggtggtatc 1500
tactttggtg aaagaaaaga agatgaaggt gacggagttg cttgggactc tgagaaatac 1560
agtgttcctg aagttcaaag aattacaaga atggctgctt tcttggcatt gcaacaaaac 1620
ccaccattac caatctggtc acttgacaag gctaacgtgc ttgcctcttc cagattgtgg 1680
agaaagactg ttgaagaaac catcaagact gagttcccac aattaactgt tcagcaccaa 1740
ttgatcgact ctgctgctat gattttggtt aaatcaccaa ctaagctaaa cggtgttgtt 1800
attaccaaca acatgtttgg tgatattatc tccgatgaag cctctgttat tccaggttct 1860
ttgggtttat taccttctgc atctctagct tccctacctg acactaacaa ggcattcggt 1920
ttgtacgaac catgtcatgg ttctgcccca gatttaccag caaacaaggt taacccaatt 1980
gctaccatct tatctgcagc tatgatgttg aagttatcct tggatttggt tgaagaaggt 2040
agggctcttg aagaagctgt tagaaatgtc ttggatgcag gtgtcagaac cggtgacctt 2100
ggtggttcta actctaccac tgaggttggc gatgctatcg ccaaggctgt caaggaaatc 2160
ttggcttaat tatacaggaa acttaataga acaaatcaca tatttaatct aatagccacc 2220
tgcattggca cggtgcaaca ctcacttcaa cttcatctta caaaagatca cgtgatctgt 2280
tgtattggga tctctagacc taataacttc gtatagcata cattatacga agttatatta 2340
agggttgtcg ac 2430
<210> 31
<211> 1348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatcttaac tatgcggcat cagagcagat 60
tgtactgaga gtgcaccata aattcccgtt ttaagagctt ggtgagcgct aggagtcact 120
gccaggtatc gtttgaacac ggcattagtc agggaagtca taacacagtc ctttcccgca 180
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ggcattatca cataatgaat tatacattat ataaagtaat gtgatttctt cgaagaatat 360
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cgaccatcac accactgaag actgcgggat tgctctcggt caagctttta aagaggccct 720
actggcgcgt ggagtaaaaa ggtttggatc aggatttgcg cctttggatg aggcactttc 780
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ggctagcaga attaccctcc acgttgattg tctgcgaggc aagaatgatc atcaccgtag 960
tgagagtgcg ttcaaggctc ttgcggttgc cataagagaa gccacctcgc ccaatggtac 1020
caacgatgtt ccctccacca aaggtgttct tatgtagtga caccgattat ttaaagctgc 1080
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gatctatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaataact 1320
tcgtataatg tatgctatac gaagttat 1392
<210> 32
<211> 1536
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatattaag ggttctcgag agctcgtttt 60
atttaggttc tatcgaggag aaaaagcgac aagaagagat agaccatgga taaactgatt 120
atgttctaaa cactcctcag aagctcatcg aactgtcatc ctgcgtgaag attaaaatcc 180
aacttagaaa tttcgagctt acggagacaa tcatatggga gaagcaattg gaagatagaa 240
aaaaggtact cggtacataa atatatgtga ttctgggtag aagatcggtc tgcattggat 300
ggtggtaacg cattttttta cacacattac ttgcctcgag catcaaatgg tggttattcg 360
tggatctata tcacgtgatt tgcttaagaa ttgtcgttca tggtgacact tttagctttg 420
acatgattaa gctcatctca attgatgtta tctaaagtca tttcaactat ctaagatgtg 480
gttgtgattg ggccattttg tgaaagccag tacgccagcg tcaatacact cccgtcaatt 540
agttgcacca tgtccacaaa atcatatacc agtagagctg agactcatgc aagtccggtt 600
gcatcgaaac ttttacgttt aatggatgaa aagaaaacca atttgtgtgc ttctcttgac 660
gttcgttcga ctgatgagct attgaaactt gttgaaacgt tgggtccata catttgcctt 720
ttgaaaacac acgttgatat cttggatgat ttcagttatg agggtactgt cgttccattg 780
aaagcattgg cagagaaata caagttcttg atatttgagg acagaaaatt cgccgatatc 840
ggtaacacag tcaaattaca atatacatcg ggcgtttacc gtatcgcaga atggtctgat 900
atcaccaacg cccacggggt tactggtgct ggtattgttg ctggcttgaa acaaggtgcg 960
caagaggtca ccaaagaacc aaggggatta ttgatgcttg ctgaattatc ttccaagggt 1020
tctctagcac acggtgaata tactaagggt accgttgata ttgcaaagag tgataaagat 1080
ttcgttattg ggttcattgc tcagaacgat atgggaggaa gagaagaagg gtttgattgg 1140
ctaatcatga ccccaggtgt aggtttagac gacaaaggcg atgcattggg tcagcagtac 1200
agaaccgtcg acgaagttgt aagtggtgga tcagatatca tcattgttgg cagaggactt 1260
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gcgtaccaaa agagaatcag cgctccccat taattataca ggaaacttaa tagaacaaat 1380
cacatattta atctaatagc cacctgcatt ggcacggtgc aacactcact tcaacttcat 1440
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catacattat acgaagttat attaagggtt gtcgac 1586
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
atgtcagagt tgagagcctt cag 23
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ttatttatca agataagttt ccgg 24
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
atgtctcaga acgtttacat tgtatc 26
<210> 36
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tcatatcttt tcaatgacaa tagagg 26
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
atgtcattac cgttcttaac ttctg 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ttatgaagtc catggtaaat tcgtg 25
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
atgaaactct caactaaact ttgttg 26
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ttatttttta acatcgtaag atcttc 26
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
atgaccgttt acacagcatc c 21
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ttattccttt ggtagaccag tctttg 26
<210> 43
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
atggctgcag accaattggt gaaaac 26
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ttaggattta atgcaggtga cgg 23
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgactgccg acaacaatag tatgc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ttatagcatt ctatgaattt gcctgtc 27
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcataacgaa aaatcagaga aatttg 26
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
atgctttttg ataacaaaaa tcgcg 25
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
tcaagcactt gcctccgctt ctc 23
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<212> DNA
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<400> 51
atgtggaagt tgaagatagg aaag 24
<210> 52
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ttaattaacg ataaacacaa cttttc 26
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
atggggagct tggggacgat gc 22
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tcagtttgct ctgagatatg caaag 25
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
atgaaaccat tcgtaatcag gaacc 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ttaaggagga gcacggtata tgg 23
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<211> 22
<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 23
<212> DNA
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tcgagtttat cattatcaat actgc 25
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ctgtatgtgt tttttgtagt tatagatt 28
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atccgctcta accgaaaagg aagg 24
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<211> 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttcgagcgt cccaaaacct tctc 24
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<212> DNA
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<400> 77
atttaactcc ttaagttact ttaatg 26
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<211> 24
<212> DNA
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<400> 78
gcgaaaagcc aattagtgtg atac 24
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<212> DNA
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<400> 79
tagggcccac aagcttacgc g 21
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<211> 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
gtaagctact atgaaagact ttacaaag 28
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<400> 83
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<211> 38
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tctagcatca tatgcatatc accacctcca ctgtattc 38
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<211> 50
<212> DNA
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gcactgaagg ctctcaactc tgacattttg ttttgtttgt ttgtgtgatg 50
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<211> 50
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
catcacacaa acaaacaaaa caaaatgtca gagttgagag ccttcagtgc 50
<210> 89
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
tcgacgcgta agcttgtggg ccctattatt tatcaagata agtttccgga 50
<210> 90
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
tccggaaact tatcttgata aataataggg cccacaagct tacgcgtcga 50
<210> 91
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
atacaatgta aacgttctga gacatttgtt ttatatttgt tgtaaaaagt 50
<210> 92
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
actttttaca acaaatataa aacaaatgtc tcagaacgtt tacattgtat 50
<210> 93
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
aaaatcataa atcataagaa attcgtcata tcttttcaat gacaatagag 50
<210> 94
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
ctctattgtc attgaaaaga tatgacgaat ttcttatgat ttatgatttt 50
<210> 95
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
cagaagttaa gaacggtaat gacattttgt ttgtttatgt gtgtttattc 50
<210> 96
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
gaataaacac acataaacaa acaaaatgtc attaccgttc ttaacttctg 50
<210> 97
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
attaaagtaa cttaaggagt taaatttatg aagtccatgg taaattcgtg 50
<210> 98
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
cacgaattta ccatggactt cataaattta actccttaag ttactttaat 50
<210> 99
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
caacaaagtt tagttgagag tttcatttgt aattaaaact tagattagat tgc 53
<210> 100
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
gcaatctaat ctaagtttta attacaaatg aaactctcaa ctaaactttg ttg 53
<210> 101
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
ctccttcctt ttcggttaga gcggatttat tttttaacat cgtaagatct tc 52
<210> 102
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
gaagatctta cgatgttaaa aaataaatcc gctctaaccg aaaaggaagg ag 52
<210> 103
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
aacggatgct gtgtaaacgg tcatctgtat gtgttttttg tagttatag 49
<210> 104
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
ctataactac aaaaaacaca tacagatgac cgtttacaca gcatccgtt 49
<210> 105
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
actatatcaa ttaatttgaa ttaacttatt cctttggtag accagtcttt g 51
<210> 106
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
caaagactgg tctaccaaag gaataagtta attcaaatta attgatatag t 51
<210> 107
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
ctcagcatcg tccccaagct ccccatctgt atgtgttttt tgtagttata g 51
<210> 108
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
ctataactac aaaaaacaca tacagatggg gagcttgggg acgatgctga g 51
<210> 109
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
actatatcaa ttaatttgaa ttaactcagt ttgctctgag atatgcaaag 50
<210> 110
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
ctttgcatat ctcagagcaa actgagttaa ttcaaattaa ttgatatagt 50
<210> 111
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
ggaaggttcc tgattacgaa tggtttcatt tgttttatat ttgttgtaaa aagtag 56
<210> 112
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
ctacttttta caacaaatat aaaacaaatg aaaccattcg taatcaggaa ccttcc 56
<210> 113
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
ataaaaatca taaatcataa gaaattcgtt aaggaggagc acggtatatg gca 53
<210> 114
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
tgccatatac cgtgctcctc cttaacgaat ttcttatgat ttatgatttt tat 53
<210> 115
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
ccctttccta tcttcaactt ccacatttgt aattaaaact tagattagat tgc 53
<210> 116
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
gcaatctaat ctaagtttta attacaaatg tggaagttga agataggaaa ggg 53
<210> 117
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
ctccttcctt ttcggttaga gcggatttaa ttaacgataa acacaacttt tcg 53
<210> 118
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
cgaaaagttg tgtttatcgt taattaaatc cgctctaacc gaaaaggaag gag 53
<210> 119
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
cacaacaaag atgcatagaa aaattccatt tgttttatat ttgttgtaaa aagtag 56
<210> 120
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
ctacttttta caacaaatat aaaacaaatg gaatttttct atgcatcttt gttgtg 56
<210> 121
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
taataaaaat cataaatcat aagaaattcg ttaagaagta tgtgggtata atctaac 57
<210> 122
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
gttagattat acccacatac ttcttaacga atttcttatg atttatgatt tttatta 57
<210> 123
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
gagcttcggc gacgagggtt ccatttgtaa ttaaaactta gattagattg c 51
<210> 124
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
gcaatctaat ctaagtttta attacaaatg gaaccctcgt cgccgaagct c 51
<210> 125
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
ctccttcctt ttcggttaga gcggattcac catacatcgc gcaaatatc 49
<210> 126
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
gatatttgcg cgatgtatgg tgaatccgct ctaaccgaaa aggaaggag 49
<210> 127
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
cgatcgctta ggatttaatg caggtgacg 29
<210> 128
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
actttttaca acaaatataa aacaaatgga ccaattggtg aaaactgaag 50
<210> 129
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
cttcagtttt caccaattgg tccatttgtt ttatatttgt tgtaaaaagt 50
<210> 130
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
tagaaacatt ttgaagctat ggtgtgtggg aagtaccttc aaagaatggg g 51
<210> 131
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
ccccattctt tgaaggtact tcccacacac catagcttca aaatgtttct a 51
<210> 132
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
cttgtgattc tgtataccga cttcgctcat ttgtaattaa aacttagatt agattgc 57
<210> 133
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
gcaatctaat ctaagtttta attacaaatg agcgaagtcg gtatacagaa tcacaag 57
<210> 134
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
gcgatcgctc ataacgaaaa atcagagaaa tttg 34
<210> 135
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
gcgatcgctt atagcattct atgaatttgc ctg 33
<210> 136
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
ctacttttta caacaaatat aaaacaaatg actgccgaca acaatagtat gc 52
<210> 137
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
gcatactatt gttgtcggca gtcatttgtt ttatatttgt tgtaaaaagt ag 52
<210> 138
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
ccgactctcc gttcagattc gccatttgta attaaaactt agattagatt gc 52
<210> 139
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
gcaatctaat ctaagtttta attacaaatg gcgaatctga acggagagtc gg 52
<210> 140
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
gcgatcgctt atttctgcct cttgtatatc ttgc 34
<210> 141
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
gcgatcgctc aagcacttgc ctccgcttct c 31
<210> 142
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
cgaataaaca cacataaaca aacaaaatgc tttttgataa caaaaatcgc g 51
<210> 143
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
cgcgattttt gttatcaaaa agcattttgt ttgtttatgt gtgtttattc g 51
<210> 144
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
tgctcagaat acccgtcaag ataagtcgag tttatcatta tcaatactgc 50
<210> 145
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
gcagtattga taatgataaa ctcgacttat cttgacgggt attctgagca 50
<210> 146
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
acttttcctt ttaaatccgg atacattttg ttttgtttgt ttgtgtgatg a 51
<210> 147
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
tcatcacaca aacaaacaaa acaaaatgta tccggattta aaaggaaaag t 51
<210> 148
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
gcgatcgctt aaccgcggcc tgcctggaat g 31
<210> 149
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
cagaacaggc cacacaatcg caagtgatta acgtccacac aggtataggg cttatcttga 60
cgggtattct gagcatct 80
<210> 150
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
cagtggtact tgcaaaacaa gataagaccc cattctttga aggtacttcc tgccgtaaac 60
cactaaatcg gaac 76
<210> 151
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
aattatttac gtattctttg aaatggcagt attgataatg ataaactcga gagcgacctc 60
atgctatacc tgag 76
<210> 152
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
tctggaagag taaaaaagga gtagaaacat tttgaagcta tggtgtgtgc gcgaaaagcc 60
aattagtgtg atac 76
<210> 153
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
gagggaatct gaagaagaat gaccatacgt agatccccaa ttcttgaaga cttcgagcgt 60
cccaaaacct tc 74
<210> 154
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatattaag ggttgtcgac gtaagctact 60
atgaaagact ttacaaag 80
<210> 155
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
gtcgacaacc cttaatataa cttcg 25
<210> 156
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
ccttgaacgc actctcacta cggtgatgat cattcttgcc tcgcagacaa ataacttcgt 60
atagcataca ttatacg 79
<210> 157
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
catatgtttt agccccaatc ataatctaac cattccacaa atgaaacaat tcttcaagaa 60
ttggggatct acg 75
<210> 158
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
cagtggtact tgcaaaacaa gataagaccc cattctttga aggtacttcc gtaagctact 60
atgaaagact ttacaaag 80
<210> 159
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatattaag ggttgtcgac gagcgacctc 60
atgctatacc tgaga 77
<210> 160
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
attcattctc cactacgact cttgacttct ctcttgattc taatttgacg ataacttcgt 60
atagcataca ttatacg 79
<210> 161
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
gttttgatct tctcgttgaa gactcttcag tagaaagcag attaagagtg gcacacacca 60
tagcttcaaa atg 75
<210> 162
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
ggaagtacct tcaaagaatg gggtcttatc ttgttttgca agtaccactg cttcgagcgt 60
cccaaaacct tc 74
<210> 163
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
tctggaagag taaaaaagga gtagaaacat tttgaagcta tggtgtgtgc gagcgacctc 60
atgctatacc tg 74
<210> 164
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatattaag ggttgtcgac cttcgagcgt 60
cccaaaacct tctc 76
<210> 165
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
ctccatattc ttcataatta acgtggtctc tgtgcaaata aaaagtggaa ataacttcgt 60
atagcataca ttatacg 79
<210> 166
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 166
aaaattgagt aatgccactg cttttcccac tttagagtca tttgcatcat gcacacacca 60
tagcttcaaa atgtttc 79
<210> 167
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 167
cattggctag cgggaagtcg tttgctctag ttccactgta gtaaaggacc ataacttcgt 60
atagcataca ttatacg 79

Claims (10)

1.一株高产桦木酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于：为菌株BA-1和BA-2中的至少一种；
所述菌株BA-1以酿酒酵母为出发菌株，敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因，过表达ERG8、ERG10、tHMG1、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1、UPC2-1、SmFPPS、AtSQS1、AtSQE2、AtLUP、GDH2、GDH、CYP716A155和RoCPR1基因；其中，
tHMG1和UPC2-1基因整合到酿酒酵母染色体TY3位点；
IDI1和SmFPPS基因整合到酿酒酵母染色体TY4位点；
GDH2和GDH基因整合到酿酒酵母染色体TY1Cons1位点；
AtSQS1和AtSQE2基因整合到酿酒酵母染色体HIS3位点；
ERG8、ERG10、ERG12、ERG13和ERG19基因整合到酿酒酵母染色体Gal7位点；
AtLUP、CYP716A155和RoCPR1基因整合到酿酒酵母染色体NDT80位点；
所述菌株BA-2以菌株BA-1为出发菌株，将AtLUP、CYP716A155和RoCPR1基因整合到菌株BA-1染色体GAL80位点；
所述的UPC2-1基因为UPC2基因第888位的Gly突变为Asp。
2.根据权利要求1所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于：
所述的CYP716A155基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的UPC2-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的tHMG1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1和GDH2基因的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.6～12所示；
所述的SmFPPS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
所述的AtLUP、AtSQS1和AtSQE2基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14～16所示；
所述的RoCPR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
所述的GDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
3.根据权利要求1所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述的敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因为运用CRISPR-Cas9基因敲除系统进行基因敲除，具体步骤如下：
(A)将LPP1、DPP1和GDH1基因的crRNA spacer核酸序列SEQ ID NO.4、通过限制性内切酶Bsa Ι连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT-1；将PEP4和PAH1基因的crRNA spacer核酸序列SEQ ID NO.5通过限制性内切酶Bsa Ι连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT-2；
(B)将重组质粒pCRCT-1转化酿酒酵母，经过培养筛选，得到敲除LPP1、DPP1和GDH1基因的菌株；然后将重组质粒pCRCT-2转化敲除LPP1、DPP1和GDH1基因的菌株，再次培养筛选，得到敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因的菌株。
4.根据权利要求3所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于，
步骤(B)中所述的酿酒酵母为酿酒酵母BY4741；
步骤(B)中所述的筛选为通过SD-URA缺陷培养基进行筛选；其中，所述SD-URA缺陷培养基的配方如下：YNB培养基6.7g/L，尿嘧啶缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L；其中，
所述的尿嘧啶缺陷氨基酸(100X)的配方如下：腺嘌呤硫酸盐0.25g，精氨酸0.12g，天冬氨酸0.6g，谷氨酸0.6g，组氨酸0.12g，亮氨酸0.36g，赖氨酸0.18g，甲硫氨酸0.12g，苯丙氨酸0.3g，丝氨酸2.25g，苏氨酸1.2g，色氨酸0.24g，酪氨酸0.18g，缬氨酸0.9g，用ddH2O定容到57mL。
5.权利要求1～4任一项所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)基因敲除：将LPP1、DPP1和GDH1基因的crRNA spacer核酸序列SEQ ID NO.4通过限制性内切酶Bsa Ι连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT-1；将PEP4和PAH1基因的crRNAspacer核酸序列SEQ ID NO.5通过限制性内切酶Bsa Ι连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT-2；然后将重组质粒pCRCT-1转化酿酒酵母BY4741，经过培养筛选，得到敲除LPP1、DPP1和GDH1基因的菌株；再将重组质粒pCRCT-2转化敲除LPP1、DPP1和GDH1基因的菌株，再次培养筛选，得到敲除LPP1、DPP1、GDH1、PEP4和PAH1基因的菌株BY4741-1；
(2)构建以下13个模块：
(a)将PTDH2、ERG8和TPYX212顺序连接，得到模块PTDH2-ERG8-TPYX212，命名为模块1；
(b)将PPGK1、ERG10和TADH1顺序连接，得到模块PPGK1-ERG10-TADH1，命名为模块2；
(c)将PTDH3、ERG12和TTDH2顺序连接，得到模块PTDH3-ERG12-TTDH2，命名为模块3；
(d)将PTEF1、ERG13和TCYC1顺序连接，得到模块PTEF1-ERG13-TCYC1，命名为模块4；
(e)将PTPI1、ERG19和TFBA1顺序连接，得到模块PTPI1-ERG19-TFBA1，命名为模块5；
(f)将PTPI1、AtSQS1和TFBA1顺序连接，得到模块PTPI1-AtSQS1-TFBA1，命名为模块6；
(g)将PPGK1、AtSQE2和TADH1顺序连接，得到模块PPGK1-AtSQE2-TADH1，命名为模块7；
(h)将PTEF1、AtLUP和TCYC1顺序连接，得到模块PTEF1-AtLUP-TCYC1，命名为模块8；
(i)将PPGK1、CYP716A155和TADH1顺序连接，得到模块PPGK1-CYP716A155-TADH1，命名为模块9；
(j)将PTEF1、RoCPR1和TCYC1顺序连接，得到模块PTEF1-RoCPR1-TCYC1，命名为模块10；
(k)将tHMG1、PPGK1、PTEF1和UPC2-1顺序连接，得到模块tHMG1-PPGK1-PTEF1-UPC2-1，命名为模块11；
(l)将IDI1、PPGK1、PTEF1和SmFPPS顺序连接，得到模块IDI1-PPGK1-PTEF1-SmFPPS，命名为模块12；
(m)将GDH2、PTDH3、PTDH2和GDH顺序连接，得到模块GDH2-PTDH3-PTDH2-GDH，命名为模块13；
(3)构建菌株BY4741-7
(I)将步骤(k)中得到的模块11插入到载体pCfB2875的sfa Ι酶切位点，得到整合载体pCfB2875-1；然后用限制性核酸内切酶Not Ι酶切整合载体pCfB2875-1，得到DNA整合片段A1；再将DNA整合片段A1整合到步骤(1)中得到的菌株BY4741-1的染色体TY3位点，得到菌株BY4741-2；
(II)将步骤(l)中得到的模块12插入到载体pCfB2798的sfa Ι酶切位点，得到整合载体pCfB2798-1；然后用限制性核酸内切酶Not Ι酶切整合载体pCfB2798-1，得到DNA整合片段A2；再将DNA整合片段A2整合到步骤(I)中得到的菌株BY4741-2的染色体TY4位点，得到菌株BY4741-3；
(III)将步骤(m)中得到的模块13插入到载体pCfB2989met15的sfa Ι酶切位点，得到整合载体pCfB2989met15-1；然后用限制性核酸内切酶Not Ι酶切整合载体pCfB2989met15-1，得到DNA整合片段A3；再将DNA整合片段A3整合到步骤(II)中得到的菌株BY4741-3的染色体TY1Cons1位点，得到菌株BY4741-4；
(IV)将pSH65载体转化菌株BY4741-4，然后用含有zeocin的YPD培养基进行筛选，得到菌株BY4741-5；
(V)将模块1、模块2、模块3、模块4、模块5和筛选标记MET15共同转化菌株BY4741-5，然后通过酵母缺陷型培养基SD-MET筛选培养，得到菌株BY4741-6；
(VI)将模块6、模块7和筛选标记KILEU2共同转化菌株BY4741-6，然后通过酵母缺陷型培养基SD-LEU筛选培养，得到菌株BY4741-7；
(4)构建菌株BA-1
将模块8、模块9、模块10和筛选标记HIS3共同转化菌株BY4741-7，然后通过酵母缺陷型培养基SD-HIS筛选培养，得到菌株BA-1，即为所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌；
(5)构建菌株BA-2
将模块8、模块9、模块10和筛选标记KIURA3共同转化菌株BA-1，然后通过酵母缺陷型培养基SD-URA筛选培养，得到菌株BA-2，即为所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌；
步骤(2)中所述的UPC2-1基因为UPC2基因第888位的Gly突变为Asp。
6.根据权利要求5所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的CYP716A155的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤(2)中所述的UPC2-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
步骤(2)中所述的tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
步骤(2)中所述的ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1和GDH2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6～12所示；
步骤(2)中所述的SmFPPS的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
步骤(2)中所述的AtLUP、AtSQS1和AtSQE2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14～16所示；
步骤(2)中所述的RoCPR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
步骤(2)中所述的GDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
步骤(2)中所述的PPGK1、PTEF1、PTDH3、PTDH2、PTPI1为启动子序列，其核苷酸序列分别如SEQID NO.19～23所示；
步骤(2)中所述的TADH1、TCYC1、TTDH2、TPYX212、TFBA1为终止子序列，其核苷酸序列分别如SEQID NO.24～28所示；
步骤(V)中所述的筛选标记MET15的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；
步骤(VI)所述的筛选标记KILEU2的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；
步骤(4)所述的筛选标记HIS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；
步骤(5)所述的筛选标记KIURA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。
7.根据权利要求5所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的13个模块的构建通过重叠PCR的方法进行构建；
步骤(3)中所述的整合为采用酵母转化试剂盒进行整合；
步骤(IV)中所述的YPD培养基中zeocin的浓度为100μg/mL；其中，YPD平板的配方如下：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L；
步骤(V)中所述的酵母缺陷型培养基SD-MET的配方如下：YNB培养基6.7g/L，甲硫氨酸缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L；
步骤(VI)中所述的酵母缺陷型培养基SD-LEU的配方如下：YNB培养基6.7g/L，亮氨酸缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L；
步骤(4)中所述的酵母缺陷型培养基SD-HIS的配方如下：YNB培养基6.7g/L，组氨酸缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L；
步骤(5)中所述的酵母缺陷型培养基SD-URA的配方如下：YNB培养基6.7g/L，尿嘧啶缺陷氨基酸(100X)10mL/L，葡萄糖20g/L。
8.权利要求1～4任一项所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌在制备羽扇豆醇、桦木醇和/或桦木酸中的应用。
9.一种桦木酸的制备方法，其特征在于：为将权利要求1～4任一项所述的高产桦木酸的酿酒酵母工程菌经活化后接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到桦木酸。
10.根据权利要求9所述的桦木酸的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：将高产桦木酸的酿酒酵母工程菌经活化后接种到发酵培养基中进行发酵培养，待溶氧值达到60％时补加补料培养基，使培养基内葡萄糖的含量维持在5g/L，得到桦木酸；
所述的发酵培养基的组成如下：发酵培养基组成包括：(NH4)2SO4 15g/L，KH2PO4 8g/L，MgSO4 3g/L，ZnSO4·7H2O 0.72g/L，维他命溶液12mL/L，微量金属盐溶液10mL/L，25g/L葡萄糖；其中：
维他命溶液的组成包括：维生素H0.05g/L，泛酸钙1g/L，烟酸1g/L，肌醇25g/L，盐酸硫胺素1g/L，盐酸吡哆醇1g/L和对氨基苯甲酸0.2g/L；
微量金属盐溶液组成如下：EDTA 15g/L，ZnSO4·7H2O 10.2g/L，MnCl2·4H2O 0.5g/L，CuSO4 0.5g/L，CoCl2·6H2O 0.86g/L，Na2MoO4·2H2O 0.56g/L，CaCl2·2H2O 3.84g/L和FeSO4·7H2O 5.12g/L；
所述的补料培养基组成如下：微量金属盐溶液10mL/L，维他命溶液12mL/L，KH2PO4 9g/L，MgSO42.5g/L，K2SO4 3.5g/L，Na2SO4 0.28g/L，葡萄糖585g/L；其中：
微量金属盐溶液组成如下：EDTA 15g/L，ZnSO4·7H2O 10.2g/L，MnCl2·4H2O 0.5g/L，CuSO4 0.5g/L，CoCl2·6H2O 0.86g/L，Na2MoO4·2H2O 0.56g/L，CaCl2·2H2O 3.84g/L和FeSO4·7H2O 5.12g/L；
维他命溶液的组成如下：维生素H0.05g/L，泛酸钙1g/L，烟酸1g/L，肌醇25g/L，盐酸硫胺素1g/L，盐酸吡哆醇1g/L和对氨基苯甲酸0.2g/L；
所述的发酵培养的条件为：发酵温度25～35℃，pH值3～7，溶氧值30％，搅拌速度300～1000rpm，通气量3～20L/min，发酵时间24～168h。
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