CN104099258A

CN104099258A - 一种乙醇积累减少的酿酒酵母基因工程菌及其应用

Info

Publication number: CN104099258A
Application number: CN201410340560.1A
Authority: CN
Inventors: 徐国强; 吴满珍; 蒋伶活
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-07-16
Filing date: 2014-07-16
Publication date: 2014-10-15

Abstract

本发明公开了一种乙醇积累减少的酿酒酵母基因工程菌及其应用，属于遗传工程和发酵工程领域。本发明在敲除PDC1的基础上敲除ADH1基因，获得pdc1adh1双缺失株，通过测定酶活，缺失PDC1后，丙酮酸脱羧酶的酶活下降了57.1％，进一步缺失ADH1基因后，乙醇脱氢酶的酶活下降了38.2％。经培养基优化后，pdc1adh1双缺失株较对照菌株，乙醇产量下降了57.3％。本发明可以有效减少碳流的损失，为构建工程酵母高效生产C₄二元羧酸创造了条件，具有很好的工业应用价值和前景。

Description

一种乙醇积累减少的酿酒酵母基因工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种乙醇积累减少的酿酒酵母基因工程菌及其应用，属于遗传工程和发酵工程领域。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为一种真核模式微生物，因具有：遗传信息丰富，代谢改造操作方便；营养需求简单，分离提取工艺成本低廉；在低pH条件下(甚至pH<3.0)生长良好；能够耐受高浓度的底物；被FDA认证为GRAS(General Regarded As Safe)微生物，发酵产品具有安全性等优点而成为发酵生产羧酸(乳酸、丙酮酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等)的潜在最适微生物。然而，酿酒酵母在高浓度糖及通风的条件分批发酵产生大量的乙醇，对于以羧酸为目标产物来说，乙醇的大量积累使得碳流大量的损失，成为代谢工程改造酿酒酵母生产羧酸面临的一大难题。

作为糖酵解的末端产物，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶复合体(Pyruvate dehydrogenase complex,Pdh)的作用下，丙酮酸经脱氢转化为乙酰辅酶A，进而参与TCA循环。酿酒酵母的旁路代谢(Pyruvate dehydrogenase bypass,PDH bypass)也具有重要的生理作用，包括：(1)促进NAD⁺的再生，维持胞内氧化还原平衡；(2)合成胞质乙酰辅酶A，为合成细胞组成成分和氨基酸代谢提供前体物质；(3)产生乙醇。因此，乙醇的产生导致了碳代谢流及NADH辅因子的损失，从而严重影响了酿酒酵母对羧酸的积累效率。任何以羧酸为目标产物的酿酒酵母发酵工艺，都将面临同样一个问题：如何减少通往乙醇的碳代谢流，从而减少碳流的损失？本发明通过基因工程手段构建了一株乙醇产量大幅下降的酿酒酵母工程菌，对于利用酿酒酵母生产羧酸具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种乙醇积累减少的酿酒酵母基因工程菌，以减少酿酒酵母生产羧酸过程中乙醇的积累，为代谢工程改造酿酒酵母高效生产羧酸打下基础。

所述工程菌是以酿酒酵母为出发菌株，敲除乙醇途径中的关键酶基因丙酮酸脱羧酶基因PDC1和乙醇脱氢酶基因ADH1。

所述丙酮酸脱羧酶基因PDC1的核苷酸序列如NCBI Gene ID:850733所示。所述乙醇脱氢酶基因ADH1的核苷酸序列如NCBI Gene ID:854068所示。

所述工程菌优选酿酒酵母CEN.PK2-1C为出发菌株，购自EUROSCARF(http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/data/cen.html)；其基因型为：MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3,112；his3Δ1；MAL2-8^C；SUC2。敲除丙酮酸脱羧酶基因PDC1和乙醇脱氢酶基因ADH1；所述丙酮酸脱羧酶基因PDC1的核苷酸序列如NCBI Gene ID:850733所示。所述乙醇脱氢酶基因ADH1的核苷酸序列如NCBI Gene ID:854068所示。

本发明要解决的第二个技术问题是提供构建所述酿酒酵母工程菌的的方法，以pUG27质粒为模板通过PCR方法扩增得到敲除盒PDC1(1692bp)和ADH1(1544bp)，转化酿酒酵母，敲除乙醇途径中的关键酶基因丙酮酸脱羧酶基因PDC1和乙醇脱氢酶基因ADH1，筛选验证得到阳性转化菌株。

所述酿酒酵母优选酿酒酵母CEN.PK2-1C。

所述丙酮酸脱羧酶基因PDC1的核苷酸序列如NCBI中Gene ID：850733所示。

乙醇脱氢酶基因ADH1的核苷酸序列如NCBI中Gene ID：854068所示。

所述pUG27质粒的构建方法参见“Guldener U,HeckS,Fielder T,et al.A new efficient genedisruption cassette for repeated use in budding yeast.Nucleic Acids Res,1996,24(13):2519-2524”和“Guoqiang Xu,Qiang Hua,et al.Regulation of thiamine synthesis in Saccharomyces cerevisiaefor improved pyruvate production.Yeast,2012,29:209-217”。

所述PCR使用的引物为：

PDC1-F(5′-3′)：GGCTCTTTCACTCTCCTTGCAATCAGATTTGGGTTTGTTCCCTTTCAGCTGAAGCTTCGTACGC

PDC1-R(5′-3′)：：TTATTGCTTAGCGTTGGTAGCAGCAGTCAACTTAGCTTGTTCAACGCATAGGCCACTAGTGGATCTG

ADH1-F(5′-3′)：CCCTTTCTTCCTTGTTTCTTTTTCTGCACAATATTTCAAGCTATACCAAGCATACAATCAACTATCTCATATACACAGCTGAAGCTTCGTACGC

ADH1-R(5′-3′)：TTATTTAGAAGTGTCAACAACGTATCTACCAACGATTTGACCCTTTTCCATCTTTTCGTAAATTTCTGGCAAGGTAG-GCATAGGCCACTAGTGGATCTG

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种应用所述酿酒酵母发酵生产羧酸的方法，能减少酿酒酵母副产物乙醇积累。

所述羧酸包括乳酸、丙酮酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等。

所述方法优选以下步骤：将30℃、220rpm下培养24h的基因工程菌种子以5％的接种量转入发酵培养基于30℃、220rpm条件下培养60h。

种子培养基为YPD培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。

发酵培养基：无氨基酵母氮源1.7g/L、(NH₄)₂SO₄5g/L、葡萄糖20g/L，添加碳酸钙5g/L。

采用酿酒酵母CEN.PK2-1C为出发菌株时，发酵培养基中还需添加亮氨酸100mg/L、色氨酸20mg/L、组氨酸20mg/L、尿嘧啶20mg/L。

本发明通过一种简单的方法构建了一株酿酒酵母基因工程菌，该菌能够大量减少副产物乙醇的产生，使其浓度从5.86±0.21g/L降低到2.50±0.18g/L，较改造前下降了57.3％。该菌可用于进一步构建羧酸高产菌株，对改善酿酒酵母在有机酸工业化生产中的应用和羧酸的工业化生产水平有重要意义和价值。

附图说明

图1PDC1敲除盒，大小为1692bp。

图2ADH1敲除盒，大小为1544bp。

图3丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的酶活。(a)丙酮酸脱羧酶的活性；(b)乙醇脱氢酶的活性。

图4pdc1缺失株、pdc1adh1双缺失株和野生型菌株的发酵特性比较。■代表野生型菌株BY4743，●代表pdc1缺失株，▲代表pdc1adh1双缺失株。(a)菌体生长，在波长为600nm条件下测定吸光值；(b)残糖浓度，用HPLC检测；(c)乙醇浓度，用HPLC检测。

具体实施方式

高效液相色谱测定乙醇、残糖含量的方法：发酵液中乙醇和残糖含量的测定采用高效液相色谱仪(HPLC)检测。发酵液经处理且上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，利用RID(示差折光检测器)进行检测，液相色谱方法如下：色谱柱：BIO-RAD有机酸柱；柱温：35℃；流动相：0.0275％(v/v)稀硫酸，经0.22μm滤膜过滤并除气；流速：0.6mL/min；检测时间：25min；进样量：20μL。

生物量的测定方法(Bio-Rid核酸仪)：用0.1M HCl稀释适当的倍数，设定波长为600nm，取200μL测定其吸光值。

乙醇的测定方法(HPLC法)：高效液相色谱仪为美国Waters公司产品，型号为1515，色谱柱为Aminex HPX-87H column(Bio-Rad)。乙醇用RID检测器。

种子培养基组成：葡萄糖2％，酵母提取物1％，蛋白胨2％，去离子水定容，pH自然，高压灭菌(115℃，20min)。

发酵培养基组成：无氨基酵母氮源3.4g/L,硫酸铵5g/L,葡萄糖40g/L，按要求分别添加亮氨酸100mg/L、色氨酸20mg/L、组氨酸20mg/L、尿嘧啶20mg/L。添加碳酸钙5g/L，装液量为40mL/250mL。

实施例1 低产乙醇酿酒酵母工程菌的构建

在野生型基础上敲除了丙酮酸脱羧酶基因PDC1和乙醇脱氢酶基因ADH1。

1、菌株和质粒

酿酒酵母(S.cerevisiae)CEN.PK2-1C购自欧洲EUROSCARF(http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/data/cen.html)，其基因型为MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3,112；his3Δ1；MAL2-8^C；SUC2。敲除盒模板pUG27质粒(包含HIS3标记基因)、Cre表达质粒pSH47(用来标记回收)的构建方法参见文献“Guldener U,Heck S,FielderT,et al.A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast[J].Nucleic AcidsRes,1996,24(13):2519-2524”和“Guoqiang Xu,Qiang Hua,et al.Regulation of thiaminesynthesis in Saccharomyces cerevisiae for improved pyruvate production.Yeast,2012,29:209-217”。

2、基因的敲除

以pUG27质粒为模板通过PCR方法扩增得到敲除盒PDC1和ADH1。以质粒pUG27为模版，通过PCR扩增，获得部分序列与待敲除基因PDC1编码区上下游同源的DNA片段，其核酸电泳图如图1泳道1所示。以质粒pUG27为模版，通过PCR扩增，获得部分序列与待敲除基因ADH1编码区上下游同源的DNA片段，其核酸电泳图如图2泳道1所示。所用到的引物序列如表1：

表1.PDC1和ADH1基因敲除所用到的引物

3、转化

用LiAc方法将PDC1敲除盒转化酿酒酵母CEN.PK2-1C，涂布SD-HIS平板，得到的阳性转化子提基因组进行PCR验证，正确的转化子保菌，即为pdc1单基因缺失株。以pdc1单基因缺失株为背景菌株用同样的方法转化ADH1敲除盒，验证正确的即为pdc1adh1双基因缺失株。通过改造代谢途径，得到可减少乙醇积累的酿酒酵母工程菌。

实施例2 发酵法研究乙醇的产量

将30℃、220rpm下培养24h的基因工程菌种子以起始OD₆₀₀＝0.2的接种量转入发酵培养基于30℃、220rpm条件下培养96h，每隔一定的时间段取样测OD，同时取样1mL离心保存用来测乙醇产量。

细胞生物量的测定方法：

取一定量的菌悬液置于1.5mL EP中，加适量的0.1M的稀盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙并同时稀释到合适倍数，涡旋混匀，用Bio-Rid核酸仪，于600nm处比色测OD值。

乙醇含量的测定方法(HPLC法)：

将每个时间点的发酵液12000rpm离心2min，取上清500μL，用三氯乙酸等倍处理，于4℃放置3h以上，沉降蛋白。然后用0.22μm的亲水膜过滤后，得到的样品进行HPLC分析。标样处理：0.1-0.5μg/L五个浓度梯度。

发酵进行到48h时，丙酮酸脱羧酶的酶活达到最高值，PDC1敲除后，其活性下降了57.1％；发酵进行到48h时，乙醇脱氢酶的活性达到了最高值，PDC1和ADH1同时敲除后，其活性下降了38.2％。

对照菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C在36h时积累乙醇达5.86±0.21g/L，PDC1和ADH1同时敲除后，乙醇产量下降到2.50±0.18g/L，较改造前下降了57.3％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种乙醇积累减少的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，将酿酒酵母乙醇途径中的关键酶基因丙酮酸脱羧酶基因PDC1和乙醇脱氢酶基因ADH1敲除后得到。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，以酿酒酵母CEN.PK2-1C为出发菌株。

3.根据权利要求1或2所述的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述丙酮酸脱羧酶基因PDC1的核苷酸序列如Gene ID:850733所示，乙醇脱氢酶基因ADH1的核苷酸序列如Gene ID:854068所示。

4.一种构建权利要求1所述酿酒酵母基因工程菌的方法，其特征在于，敲除乙醇途径中的关键酶基因丙酮酸脱羧酶基因PDC1和乙醇脱氢酶基因ADH1。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，以酿酒酵母CEN.PK2-1C为出发菌株，以pUG27质粒为模板通过PCR方法扩增得到敲除盒PDC1和敲除盒ADH1，转化酿酒酵母，敲除乙醇途径中的关键酶基因丙酮酸脱羧酶基因PDC1和乙醇脱氢酶基因ADH1，筛选验证得到敲除了两基因的菌株。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述丙酮酸脱羧酶基因PDC1的核苷酸序列如Gene ID:850733所示，乙醇脱氢酶基因ADH1的核苷酸序列如Gene ID:854068所示。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR使用的引物为：

PDC1-F(5′-3′)：GGCTCTTTCACTCTCCTTGCAATCAGATTTGGGTTTGTTCCCTTTCAGCTGAAGCTTCGTACGC；

PDC1-R(5′-3′)：：TTATTGCTTAGCGTTGGTAGCAGCAGTCAACTTAGCTTGTTCAACGCATAGGCCACTAGTGGATCTG；

ADH1-F(5′-3′)：CCCTTTCTTCCTTGTTTCTTTTTCTGCACAATATTTCAAGCTATACCAAGCATACAATCAACTATCTCATATACACAGCTGAAGCTTCGTACGC；

ADH1-R(5′-3′)：TTATTTAGAAGTGTCAACAACGTATCTACCAACGATTTGACCCTTTTCCATCTTTTCGTAAATTTCTGGCAAGGTAG-GCATAGGCCACTAGTGGATCTG。

8.权利要求1或2所述酿酒酵母基因工程菌在发酵生产羧酸中的应用。

9.权利要求1或2所述酿酒酵母基因工程菌在构建羧酸高产菌株中的应用。