CN103814135A

CN103814135A - 木质纤维素水解产物作为原料用于异丁醇发酵

Info

Publication number: CN103814135A
Application number: CN201280029221.0A
Authority: CN
Inventors: I.D.多布森; A.L.克鲁科伯格
Original assignee: Butamax Advanced Biofuels LLC
Current assignee: Butamax Advanced Biofuels LLC
Priority date: 2011-06-17
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2014-05-21
Also published as: WO2012173659A2; WO2012173659A3; CA2838519A1; ZA201308691B; JP2014522634A; BR112013032320A2; US20130035515A1; EP2721165A2

Abstract

本发明一般涉及工业微生物和从诸如木质纤维素水解产物的5碳糖源生产丁醇的领域。更具体地，本发明涉及使用产生木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶和微氧或厌氧条件以增加来自此类糖的丁醇产量以及通过原位产物回收方法回收所述丁醇。

Description

木质纤维素水解产物作为原料用于异丁醇发酵

以电子方式提交的序列表参考

与本申请一起提交的、以ASCII文本文件格式的电子方式提交的序列表内容(文件名：20120615_CL5194WOPCT_SeqList.txt，大小：1,164,854字节，并且创建日期为：2012年6月14日)全文以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明一般涉及工业微生物学和丁醇生产领域。更具体地，本发明涉及使用微生物将5碳糖(包括木质纤维素生物质水解产物中的5碳糖)转化成丁醇以及在混合糖存在下从发酵中回收丁醇的方法。

背景技术

丁醇是一种重要的工业化学品，具有多种用途，包括用作燃料添加剂，在塑料工业中用作化学原料，以及在食品和食用香料工业中用作食品级的提取剂。因此，高度需求丁醇以及高效环保的生产方法。

利用微生物发酵生产丁醇是一种这样的环保生产方法。许多原料可用于此类发酵产物。在这些当中有木质纤维素生物质的水解产物，包括玉米棒、玉米秸秆、柳枝稷、甘蔗渣和木材废料。然而，木质纤维素水解产物还含有抑制用于发酵的微生物的生长和代谢，具体地，抑制能够产生丁醇的微生物的生长和代谢的化合物。

本发明通过提供有效将5碳糖转化成丁醇的方法以及在混合糖存在下从发酵中回收丁醇的方法，满足了当前对于来自此类木质纤维素水解产物的改善丁醇产量的需求，所述5碳糖获自木质纤维素水解产物。

发明内容

本发明一般涉及从5碳糖和6碳糖的混合来源生产丁醇的方法和组合物，所述来源诸如木质纤维素水解产物，以及采用原位产物回收方法的来自所述糖的改善丁醇产量。更具体地，本发明涉及使用产生木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶和微氧或厌氧条件以增加丁醇产量。

在一些实施例中，生产丁醇的方法包括：(a)提供组合物，其包含(i)能够产生丁醇的微生物和(ii)能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合；(b)使所述组合物与包含混合糖的碳底物接触；以及(c)在限制氧气利用的条件下培养微生物，从而产生丁醇。

附图说明

从下文的具体实施方式、附图和附带的序列描述中可较充分地理解本发明的多个实施例，它们形成本专利申请的一部分。

图1：在玉米棒水解产物中的生长。按照生产商的指令(TPP，Trasadingen，Switzerland)使用PCV管通过细胞压积监测生长。显示了重复三次烧瓶的结果。使产异丁醇生物(PNY1504，虚线)生长于0.5倍的LCH中。使产乙醇生物(实线)生长于1倍LCH中。

图2：PNY1504的葡萄糖消耗以及异丁醇和甘油产量。测量结果超过148小时，并且采用HPLC(高效液相色谱)测定代谢物。

图3：CEN.PK113-7D的葡萄糖消耗以及乙醇和甘油产量。测量结果超过148小时，并且采用HPLC(高效液相色谱)测定代谢物。

图4：通过PNY1504的葡萄糖至异丁醇的发酵。显示了在抗霉素A存在(+AA；实线)或不存在(-AA；虚线)下葡萄糖消耗(Glc)、生长(生物质，通过细胞压积)、以及异丁醇产量(Iso)的特征图。

图5：木糖异构酶存在下PNY1504的木糖至异丁醇的发酵。显示了在抗霉素A存在(+AA；实线)或不存在(-AA；虚线)下木糖(Xyl)和木酮糖(Xls)浓度、生长(生物质，通过细胞压积)、以及异丁醇产量(Iso)的特征图。

图6：在发酵过程中木质纤维素水解产物中的葡萄糖和木糖转化成异丁醇的特征图。培养物经抗霉素A处理(实线)或未经处理(虚线)，并且补充了木糖异构酶(封闭符号)或未补充(开放符号)。

图7：在木质纤维素水解产物发酵过程中产生的异丁醇有效滴度。培养物经抗霉素A处理(实线)或未经处理(虚线)，并且补充了木糖异构酶(封闭符号)或未补充(开放符号)。

具体实施方式

除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本申请(包括其定义)为准。除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。为所有目的，所有的出版物、专利、以及本文提及的其它参考资料均全文以引用方式并入本文。

下文公开了合适的方法和材料，虽然在本发明的实施或试验过程中也可以使用与本文所公开的那些类似或等同的方法和材料。材料、方法和例子仅是例证性的并且不旨在进行限制。根据具体实施方式和权利要求，本发明的其他特点和优点将显而易见。

为了进一步明确本发明，提供下列术语、缩写和定义。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”，或其任何其他变型旨在是非排他的或可广泛解释的。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非另外特别说明，否则“或”是指包含性的或，而不是指排它性的或。例如，以下任何一个均表示满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。

同样，在本发明的元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在有关实例，即元件或组分出现的数量是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。

如本文所用，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施例，而是涵盖如本专利申请所公开的所有可能的实施例。

如本文所用，修饰成分或采用反应物的量使用的术语“约”是指数量的变化，其可以通过，例如在真实世界中用于制备浓缩物或使用溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；通过用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等而发生。术语“约”还包括由于产生自特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施例中，术语“约”指在报告数值10％范围内，优选地在报告数值5％范围内。

如本文所用的“生物质”是指包含可水解的多糖或碳水化合物的天然产物，其提供了可发酵糖，包括任何纤维素或木质纤维素材料，以及包含纤维素的材料，并任选地还包括半纤维素、木质素、淀粉、寡糖和/或单糖。生物质还可包含附加组分，诸如蛋白质和/或脂质。生物质能够来源于单一来源，或生物质可包括来源于一种以上来源的混合物。例如，生物质能够包括玉米棒和玉米秸秆的混合物，或草茎和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的例子包括但不限于：玉米粒、玉米棒、农作物残余物如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、黑麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、从谷物的研磨中获得的组分、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、城市垃圾、以及它们的混合物。

如本文所用，“丁醇”是特指或以单独或其混合物形式的丁醇异构体1-丁醇(1-BuOH)、2-丁醇(2-BuOH)和/或叔异丁醇(t-BuOH)。

如本文所用，“可发酵碳源”意为来自能被本文所公开的微生物代谢的生物质的碳底物。合适的可发酵碳源包括但不限于单糖，诸如葡萄糖或果糖以及阿拉伯糖；二糖，诸如麦芽糖、乳糖或蔗糖；低聚糖；多糖如淀粉或纤维素；一碳底物；以及它们的混合物。

如本文所用，“原料”意为包含可发酵碳源的产物。合适的原料包括但不限于黑麦、小麦、玉米、甘蔗、秸秆、柳枝稷、甘蔗渣、以及它们的混合物。

如本文所用，“发酵液体培养基”是指水、糖(可发酵碳源)、液化固体、微生物产生的醇、产物醇及发酵容器内具有的所有其它物质组分的混合物，其中产物醇通过在微生物存在的情况下使糖反应生成醇、水和二氧化碳(CO₂)而制得。有时，如本文所用，术语“发酵培养基”和“发酵混合物”可与“发酵液体培养基”同义使用。

术语“碳底物”是指来自能被本文所公开的微生物和细胞代谢的生物质的碳源。本文提供了非限制性的碳底物的例子，包括但不限于单糖、寡糖、多糖、乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、甘油、二氧化碳、甲醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、右旋糖、或它们的混合物。

如本文所用，术语“有效滴度”是指每升发酵培养基通过发酵产生的特定醇(例如丁醇)的总量。

如本文所用，术语“分离”与“回收”同义，是指从初始混合物中移除化合物以获得纯度或浓度比初始混合物中的化合物纯度或浓度更高的化合物。

如本文所用，术语“水相”是指通过使发酵液体培养基接触与水不混溶的有机提取剂而获得的两相混合物中的水相。在本文所述包括发酵提取的方法的一个实施例中，术语“发酵液体培养基”具体地指在双相发酵提取中的水相。

如本文所用，术语“有机相”是指通过使发酵液体培养基接触与水不混溶的有机提取剂而获得的两相混合物中的非水相。

术语“多核苷酸”旨在涵盖单个核酸以及多个核酸，并且是指核酸分子或构建体例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸能够包含全长cDNA序列的核苷酸序列，或其片段，包括非翻译的5′和3′端序列和编码序列。所述多核苷酸能够由任何多核糖核酸或多脱氧核糖核酸组成，其可为非改性的RNA或DNA，或改性的RNA或DNA。例如，多核苷酸能够由单链和双链DNA构成，其为单链和双链区域的混合物；单链和双链RNA，其为单链和双链区域的混合物；包含DNA和RNA的杂合分子，其可为单链或，更典型地双链或单链和双链区域的混合物。“多核苷酸”包含了化学地、酶学地、或代谢地改性的形式。

多核苷酸序列可意为“分离的”，其中它从天然的环境中移除出来。例如，出于本发明的目的分离了异源多核苷酸，其编码具有酶活性(例如将底物转化成木酮糖的能力)的多肽或多肽片段。分离的多核苷酸的另一个例子包括异源宿主细胞拥有的重组多核苷酸或溶液中的纯化的(部分地或基本上)多核苷酸。根据本发明分离的多核苷酸或核酸还包括此类人工合成生产的分子。DNA聚合物形式的分离的多核苷酸片段可以由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。

术语“基因”指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调节序列(5′非编码序列)和编码序列后的调节序列(3′非编码序列)。

如本文所用，术语“编码区”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”是指位于编码序列上游(5′非编码序列)、中间、或下游(3′非编码序列)并影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单个“多肽”以及多个“多肽”，并指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也被称为肽键)线性连接组成的分子。术语“多肽”是指任何两个或更多个氨基酸的链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“肽”、“二肽”、“三肽”、“寡肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”、或其它任何用于指由两个或更多个氨基酸组成的一条链或多条链的术语，都包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可用于取代或与这些术语中任一项互换使用。多肽可来源于天然生物源或由重组技术产生，但不一定是由指定的核酸序列翻译的。它可由任何方式生成，包括通过化学合成方式。

以“分离的”多肽或片段形式的变体和其衍生物拟为不在其自然环境下的多肽。不需要特别的纯化水平。例如，分离的多肽能够从它原生的或天然的环境中去除。为了本发明的目的，在宿主细胞中重组产生的多肽和表达的蛋白质被认为是分离的，即为天然的或重组的多肽，其已通过任何适合的技术被分离、分馏、或部分地或充分地纯化。

如本文所用，“天然的”是指多核苷酸、基因或多肽的形式与天然存在的一样，带有其自身的调节序列(如果存在调节序列)。

如本文所用，“内源性”是指多核苷酸、基因或多肽在其在生物体中或生物体的基因组中的天然位置的天然形式。“内源性多核苷酸”包括在其在生物体的基因组中的天然位置的天然多核苷酸。“内源性基因”包括在其在生物体的基因组中的天然位置的天然基因。“内源性多肽”包括在其在生物体中的天然位置的天然多肽。

如本文所用，“异源性”是指正常情况下不存在于宿主生物中，而是被导入宿主生物的多核苷酸、基因或多肽。“异源性多核苷酸”包括原生的编码区、或它们的一部分，即以不同于对应的原生多核苷酸的形式重新导入源生物体。“异源性基因”也包括原生的编码区、或它们的一部分，即以不同于对应的原生基因的形式重新导入源生物体。例如，异源性基因可包括被再引入至天然宿主的原生编码区，其为包括非天然的调控区的嵌合基因的一个部分。“异源性多肽”包括天然多肽，其以不同于对应的天然多肽的形式被重新导入源生物体。

如本文所用，术语“修饰”是指本文所公开的由所述多核苷酸编码的多肽活性改变导致的多核苷酸的变化，以及本文所公开的多肽活性改变导致的多肽的变化。此类改变能改通过本领域熟知的方法实现，包括但不限于缺失、突变(例如，自发诱变、随机诱变、由增变基因导致的诱变、或转座诱变)、取代、插入、改变细胞定位、改变多核苷酸或多肽的状态(例如，甲基化、磷酸化或泛素化)、移除辅因子、化学修饰、共价修饰、用UV或X-射线照射、同源重组、有丝分裂重组、启动子置换法、和/或它们的组合。通过将特定多核苷酸或多肽的序列与同源的多核苷酸或多肽(例如酵母或细菌的)的序列进行比较，并使高度同源区域(保守区域)或共有序列中进行的修饰的数量最大化，能够发现用以确定哪些核苷酸或氨基酸残基能够被修饰的指导。

如本文所用，术语“变体”是指利用例如重组DNA技术(诸如诱变)产生的，通过氨基酸的插入、缺失、突变和取代而不同于本发明具体地列举的多肽的多肽。通过将特定多肽的序列与同源的多肽(例如酵母或细菌的)的序列进行比较，并使高度同源区域(保守区域)中进行的氨基酸序列改变的数量最小化，或通过用共有序列代替氨基酸，能够发现用以确定哪些氨基酸残基可以被替代、添加、或缺失而不会破坏所关注的活性的指导。

作为另外一种选择，编码这些相同或相似的多肽的重组多核苷酸变体可以被合成，或通过利用遗传密码中的“冗余”进行选择。各种密码子取代，如产生各种限制性位点的沉默变化，可引入以优化克隆到质粒表达载体或病毒表达载体。多核苷酸序列的突变可以反应在被添加至多肽，以改变所述多肽的任何部分的特性的其他肽的多肽或结构域之中。

氨基酸“取代”可为一个氨基酸替换为另一个具有相似结构和/或化学性质的氨基酸的结果，例如，保守的氨基酸替换，或可为一个氨基酸替换为另一个具有不同结构和/或化学性质的氨基酸的结果，例如，非保守的氨基酸替换。“保守的”氨基酸取代可以基于所涉及的残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两亲性性质方面的相似性实现。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；而带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。作为另外一种选择，“非保守的”氨基酸取代可以通过选择任何这些氨基酸在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两亲性性质方面的差异实现。“插入”或“缺失”可在重组蛋白质结构上或功能上耐受的变型范围之内。通过系统地利用重组DNA技术产生多肽分子中的氨基酸的插入、缺失、或取代，并检测所得重组变体的活性，可以以实验方法确定所允许的变型。

术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA转录的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整体源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至可包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的宿主细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。还应认识到因为在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接到调控序列。

如本文所用，术语“表达”是指源于本发明核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。

如本文所用，术语“过表达”是指在宿主细胞中核酸或蛋白水平的增加。因此，可通过增加宿主细胞中内源性的序列的转录或翻译水平、或在宿主细胞中导入异源的序列导致过表达。也可通过增加核酸或蛋白序列的稳定性导致过表达。

术语内源性蛋白诸如酶的“活性和/或表达减少”可意为或者所述蛋白比活性的降低(例如活性降低)，和/或细胞中蛋白浓度的减少(例如表达降低)，而内源性蛋白诸如酶的“活性和/或表达缺失”可意为或者所述酶没有比活性或比活性可以忽略不计(例如活性缺失)，和/或细胞中所述酶没有浓度或浓度可以忽略不计(例如表达缺失)。

如本文所用，术语“转化”是指将核酸片段转移至宿主生物体内，导致基因稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。

如本文所用，术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。这类元件可包括源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进入独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和编码器与适当的3′端非翻译序列一起导入细胞中。

如本文所用，术语“密码子简并性”是指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，期望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。

术语“密码子优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时，是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反应宿主生物体通常的密码子使用。此类优化包括将至少一个、或多于一个、或显著的数目的密码子替换为在那种生物体中使用频率更高的一个或多个同义密码子。密码子优化的编码区也可通过本领域的技术人员已知的多个方法进行设计，包括软件包如“synthetic genedesigner”(http：//phenotype.biosci.umbc.edu/codon/sgd/index.php)。

包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的偏向，允许编码该基因的序列中的变型。由于每一密码子由三个核苷酸组成，而组成DNA的核苷酸限于四种特异性碱基，存在64种可能的核苷酸组合，其中的61种编码氨基酸(其余三种密码子编码结束翻译的信号)。本文将显示哪些密码子编码哪些氨基酸的“遗传密码”重制为表1。因此，许多氨基酸被分配了多于一种的密码子。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由六种，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组成在宽范围内变化而不会改变由该DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。

表1：标准遗传密码

考虑到对于多种多样的动物、植物和微生物物种存在大量的基因序列，计算密码子使用的相对频率是可能的。密码子使用表是易得的，例如在http：//www.kazusa.or.jp/codon/(2008年3月20日访问)提供的“密码子使用数据库”，并且这些表格可以在许多方面进行调整。参见Nakamura，Y.，等人Nucl.Acids Res.28：292(2000)。从GenBank Release128.0[2002年2月15日]计算的酵母的密码子使用表被重制为下文的表2。该表使用mRNA命名，因此，该表使用存在于RNA中的尿嘧啶(U)，而不是存在于DNA中的胸腺嘧啶(T)。已经修改了该表以便计算每个氨基酸、而不是所有64个密码子的频率。

表2：酿酒酵母(Saccharomyees cerevisiae)基因的密码子使用表

通过利用该表或类似的表，本领域的普通技术人员能够将这些频率应用于任何给定的多肽序列，并产生密码子优化的编码所述多肽的编码区的核酸片段，但其使用针对给定的物种优化的密码子。

以优化的频率随机分配密码子来编码给定的多肽序列，能够通过计算每种氨基酸的密码子频率，然后随机地为给多肽序列分配密码子而人工地实现。此外，多种算法和计算机软件程序是本领域的普通技术人员容易获得的。例如，可从DNAstar，Inc.，Madison，WI获得的Lasergene软件包中的“EditSeq”功能，可从InforMax，Inc.，Bethesda，MD获得的VectorNTI套件中的“backtranslation”功能，以及可从Accelrys，Inc.，San Diego，CA获得的GCG-Wisconsin软件包中的“backtranslate”功能。此外，对编码区序列进行密码子优化的多种资源是可公开获得的，例如http：//www.entelechon.com/bioinformatics/backtranslation.php？lang＝eng(2008年4月15日访问)的“backtranslation”功能，和可在http：//bioinfo.pbi.nrc.ca：8090/EMBOSS/index.html(2002年7月9日访问)获得的“backtranseq”功能。构建基本的算法来基于给定的频率分配密码子也能够由本领域的普通技术人员用基本的数学函数实现。

密码子优化的编码区也可通过本领域的技术人员已知的多个方法进行设计，包括软件包诸如“synthetic gene designer”(http：//phenotype.biosci.umbc.edu/codon/sgd/index.php)。

当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，多核苷酸或核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交和洗涤条件为人们所熟知，示例参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold SpringHarbor，NY(1989)，尤其是在该文献第11章和表11.1(全文以引用方式并入本文)中进行了例示。温度和离子强度条件确定了杂交的“严格性”。可调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤确定严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6×SSC、0.5％SDS在室温下洗涤15分钟，然后用2×SSC、0.5％SDS在45℃下重复30分钟，再用0.2×SSC、0.5％SDS在50℃下重复洗涤两次，每次30分钟。更优选的一组严格性条件采用更高的温度，其中洗涤与上述洗涤相同，不同的是最后两次在0.2×SSC、0.5％SDS中洗涤30分钟时的温度被增加到60℃。另一组优选的高度严格性条件是最后两次洗涤在65℃下用0.1×SSC，0.1％SDS进行。例如，另一组严格性条件包括在0.1×SSC、0.1％SDS中在65℃下杂交并用2×SSC、0.1％SDS洗涤，随后用0.1×SSC、0.1％SDS洗涤。

杂交需要两种核酸含有互补序列，但取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适严格性取决于核酸的长度和互补的程度，所述长度和互补程度是本领域内所熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的公式(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个实施例中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸；更优选至少约20个核苷酸；最优选长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。

氨基酸或核苷酸序列的“主要部分”是指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定而鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST(Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))的算法通过计算机自动化的序列比对和鉴定进行的。一般来讲，为了推定鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有十个或更多邻接氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(例如如southern杂交)和基因分离(例如细菌菌落或噬菌斑的原位杂交)的方法中。此外，12-15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”包含的序列足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书教导了编码特定蛋白质的完整氨基酸和核苷酸序列。利用本文所公开的序列，技术人员现在可以利用本发明所公开序列的全部或基本部分，以用于本领域技术人员已知的目的。相应地，本发明包括如本文所提供的完全序列，以及那些上述序列的基本部分。

术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。

如本领域所熟知的，术语“百分比同一性”是两个或更多个多肽序列之间或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。本领域中“同一性”也意为多肽或多核苷酸序列之间的序列关联度，视情况而定，如由此类序列字符串的匹配来测定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于下列文献中所公开的那些：1.)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)OxfordUniversity：NY(1988)；2.)Biocomputmg：Informatics and GenomeProjects(Smith，D.W.编辑)Academic：NY(1993)；3.)ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humania：NJ(1994)；4.)Sequence Analysis in Molecular Biology(vonHeinie，G.编辑)Academic(1987)；以及5.)Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)Stockton：NY(1991)。

设定确定同一性的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和同一性百分比计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包(LASERGENE bioinformatics computing suite(DNASTAR Inc.，Madison，WI))中的MegAlign^TM程序进行。序列的多重比对使用“Clustal比对方法”进行，该方法涵盖若干个不同的算法，包括对应于称为Clustal V的比对方法的“Clustal V比对方法”(公开于Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Compm.Appl.BioSci.，8：189-191(1992))中，并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR inc.)中的MegAlign^TM程序中找到的比对方法。对于多重比对，默认值对应于GAP PENALTY＝10、以及GAP LENGTHPENALTY＝10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5、以及DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2、GAPPENALTY＝5、WINDOW＝4、以及DIAGONALS SAVED＝4。在使用ClustalV程序进行序列比对后，通过查看同一程序中的“序列距离”表格有可能获得“百分比同一性”。另外“Clustal W比对方法”是可用的并对应于标记为Clustal W的比对方法(描述见Higgins and Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.BioSci.8：189-191(1992)中)，并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlign^TMv6.1程序中找到的比对方法。用于多重比对的默认参数(GAP PENALTY＝10、GAP LENGTH PENALTY＝0.2、Delay Divergen Seqs(％)＝30、DNA Transition Weight＝0.5、Protein Weight Matrix＝Gonnet系列、以及DNA Weight Matrix＝IUB)。在使用Clustal W程序进行序列比对后，通过查看在同一程序中的“序列距离”表有可能获得“百分比同一性”。

本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其它物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。有用的一致性百分比例子包括但不限于：55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％、或从55％至100％的任何正数百分比在描述本发明时可以为有用的，诸如55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，最优选至少250个氨基酸的多肽。

术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：1.)GCG程序套件(Wisconsin Package Version9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Biol.，215：403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4.)Sequencher(Gene CodesCorporation，Ann Arbor，MI)；以及5.)所述FASTA程序结合了Smith-Waterman算法(W.R.Pearson，Comput.Methods GenomeRes.，[Proc.Int.Symp.](1994)，会议时间1992年，111-20。编辑：Suhai，Sandor，Plenum：New York，NY)。在本专利申请案的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，除非另外指明，否则分析结果将基于所参考程序的“默认值”。在此所用的“默认值”是指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文“Maniatis”)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in MolecularBiology，published by Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)。此处所用的附加的方法参见Methods in Enzymology，第194卷，Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology(Part A，2004，Christine Guthrie和Gerald R.Fink(编辑)，Elsevier Academic Press，SanDiego，CA)。

对本文所公开的宿主细胞的遗传操纵能够利用标准遗传技术和筛选进行，并且能够在任何适合遗传操纵的宿主细胞中完成(Methods in YeastGenetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)。

5碳糖源

木质纤维素生物质的水解产物对于生产生物燃料是有价值的原料，其提供了包括5碳糖和6碳糖。然而，这些水解产物可包含对于用于发酵5碳糖的微生物的生长和代谢有抑制作用的化合物。因此，能从木质纤维素水解产物制得的丁醇的量是受限制的，因为未经某些遗传修饰和未经某些加工以改善抑制活性，所述5碳糖是不容易利用的。然而，本文所述方法提供了通过使产丁醇微生物生长和代谢并发酵5碳糖，以增加从此类木质纤维素水解产物生产丁醇的量的各种方法。

生物质指任何纤维质的或木质纤维质的材料并包括包含纤维素的材料，并且任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖。生物质也可包含附加组分，诸如蛋白和/或脂质。生物质能够来源于单一来源，或生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质能够包括玉米棒和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的例子包括但不限于：玉米粒、玉米棒、作物残余物如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、从谷物的研磨中获得的组分、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、龙舌兰、以及它们的混合物。

可发酵的糖类可通过预处理和糖化过程来源于此类纤维素的或木质纤维素的生物质，如例如美国专利申请公布7,781,191中所述，该专利以引用方式并入本文。以举例的方式，相对高浓度的生物质可用相对于生物质干重低浓度的氨作预处理。在预处理后，可用糖化酶聚生体处理生物质以制备可发酵糖。因此，所述预处理可包括a)使生物质与含氨的水溶液接触以形成生物质-氨水混合物，其中所述氨的含量为至少足以保持生物质-氨水混合物的碱性pH的浓度，但是其中所述氨的含量相对于生物质的干重为小于约12重量％，此外其中所述生物质的干重具有高固体浓度，所述高固体浓度相对于生物质-氨水混合物的重量为至少约15重量％；以及b)使步骤(a)的产物与糖化酶聚生体在合适的条件下接触，以制备可发酵糖。

木质纤维素水解产物和其他5碳糖源可提供5碳糖并提供5碳糖与6碳糖或其它适于发酵的碳底物的组合。在一些实施例中，所述5碳糖为木糖。在一些实施例中，所述5碳糖为阿拉伯糖。在一些实施例中，所述5碳糖包括木糖和阿拉伯糖。5碳糖源也可包括其他碳底物，诸如单糖、多糖、单碳底物、双碳底物、和其他碳底物。从而可以预期在本发明中利用的碳源可涵盖除所述5碳糖外的任何碳数目的底物。

在一些实施例中，所述木质纤维素水解产物以特定浓度存在于用于发酵的组合物中。例如，在一些实施例中，所述木质纤维素水解产物以至少约5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L、160g/L、170g/L、180g/L、190g/L、或200g/L的浓度存在。在一些实施例中，所述木质纤维素水解产物以约5-500g/L、约5-400g/L、约5-300g/L、约5-200g/L、或约5-150g/L的浓度存在。在一些实施例中，所述木质纤维素水解产物以约25-500g/L、约25-400g/L、约25-300g/L、约25-200g/L、或约25-150g/L的浓度存在。在一些实施例中，所述木质纤维素水解产物以约50-500g/L、约50-400g/L、约50-300g/L、约50-200g/L、或约50-150g/L的浓度存在。

此外，在一些实施例中，所述木质纤维素水解产物以特定速率消耗。因此，在一些实施例中，假设6g/L细胞群像在玉米中以及对于秸秆20％的TS水平提供的C5消耗率为0.44g/L-h或比速率为0.07g C5/g细胞小时。

具体地，来自所述木质纤维素水解产物的5碳糖以特定速率消耗。

从5碳糖源制备木酮糖

可按照本文所述方法使用的微生物能经戊糖磷酸途径发酵木酮糖。然而，许多5碳糖源，此类木质纤维素水解产物，可包含非木酮糖的5碳糖，其不能被所述微生物直接发酵。因此，本文所述的方法提供了能够将其它5碳糖转化成D-木酮糖和/或D-木酮糖-5-P的酶。例如，能够将木糖或阿拉伯糖转化成木酮糖的酶是本领域技术人员已知的。以举例的方式：木糖异构酶能够将木糖转化成D-木酮糖；木糖还原酶和木糖醇脱氢酶能够将木糖转化成D-木酮糖；阿拉伯糖还原酶、阿拉伯糖醇脱氢酶、L-木酮糖还原酶以及木糖醇脱氢酶能够将阿拉伯糖转化成D-木酮糖；阿拉伯糖异构酶、核酮糖激酶和核酮糖-磷酸-5-差向异构酶能够将阿拉伯糖转化成D-木酮糖-5-P。此外，醛糖还原酶，其能够将糖醇转化成醛糖，可用于将阿拉伯糖和木糖转化成D-木酮糖-5-P。

能够将其它5碳糖转化成木酮糖的单个或多个酶能由外源提供或由发酵组合物中的重组微生物制备。

例如，产生木酮糖的酶可由本领域那些技术人员通过任何已知方法制得(包括天然产生、重组产生和化学合成)，并且包含所述产生木酮糖的酶的组合物可添加至丁醇生产微生物以发酵5碳糖。产生木酮糖的酶，诸如木糖异构酶可购自商业来源，例如，产自Novozyme的“Sweetzyme”。

另外，和/或作为另外一种选择，表达产生木酮糖和/或木酮糖-5-P的酶的细胞和/或微生物可添加至丁醇生产生物体以发酵5碳糖。所述细胞和/或微生物可为将5碳糖内源性地转化成木酮糖和/或木酮糖-5-P的细胞和/或微生物，或可为已经被工程化以重组产生木酮糖和/或木酮糖-5-P的酶的细胞和/或微生物。另外，和/或作为另外一种选择，所述丁醇生产微生物可被工程化以重组产生木酮糖和/或木酮糖-5-P的酶。另外，在本发明的所述宿主细胞中，提供了对L-阿拉伯糖的利用的、混有降低非特异性醛糖还原酶活性的遗传修饰的araA、araB和araD酶的表达，提供了对于戊糖磷酸途径(PPP)中L-阿拉伯糖的有效利用。参见例如美国专利7，354，755，该专利以引用方式并入本文。在如本文所述的宿主细胞中，导致非特异性醛糖还原酶活性降低的遗传修饰可与任何增加戊糖磷酸途径通量的修饰和/或与任何增加所述木酮糖激酶比活性的修饰混合。因此，本发明具体地包括了表达araA、arab和araD的宿主细胞，其包含降低了非特异性醛糖还原酶活性的附加的遗传修饰。表达araA、araB和araD的基因可来源于大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。当宿主细胞为酵母菌株，在某些实施例中所述酵母菌株包括至少一个阿拉伯糖转运蛋白基因，其选自GAL2、KmLAT1和PgLAT2。具有高亲和性的L-阿拉伯糖转运蛋白可分别来源于马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)(也被称为季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii))。马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)都被认为可有效利用L-阿拉伯糖，这使得它们成为克隆L-阿拉伯糖转运蛋白的来源。在某些实施例中所述酵母菌株还可过表达GAL2编码的半乳糖透性酶。也参见美国专利5,514,583，其以引用的方式并入本文。其它利用木糖的菌株包括CP4(pZB5)(美国专利5,514,583)、ATCC31821/pZB5(美国专利6,566,107)、8b(US20030162271；Mohagheghi等人，(2004)Biotechnol.Lett.25；321-325)，以及ZW658(ATTCC#PTA-7858)，这些菌株可被修饰用于从包括木糖和葡萄糖的混合糖产生丁醇。

因此，为了提高丁醇生产，微生物可被工程化以表达能够产生木酮糖和/或木酮糖-5-P的酶。在宿主细胞中，可通过导入异源性的核酸和/或蛋白序列或通过突变内源性的核酸和/或蛋白序列以增加产生木酮糖和/或木酮糖-5-P的酶的总体活性。当在宿主细胞中导入异源性的产生木酮糖和/或木酮糖-5-P的酶时，宿主细胞内的所述酶活性相对于没有异源性的核酸和/或蛋白序列时的酶活性是增加的。当在宿主细胞中突变内源性核酸或蛋白时，宿主细胞内的所述酶活性相对于没有突变的酶活性是增加的。在一些实施例中，相对于野生型酵母菌株，细胞中木酮糖和/或木酮糖-5-P产生的速率增加了。

在宿主菌株中，产生木酮糖和/或木酮糖-5-P的酶可单个地或组合地过表达。在一些实施例中，木糖异构酶是过表达的。在一些实施例中，木糖还原酶和木糖醇脱氢酶是过表达的。在一些实施例中，由阿拉伯糖产生木酮糖和/或木酮糖-5-P的酶是过表达的。在一些实施例中，木糖异构酶、木糖还原酶和木糖醇脱氢酶是过表达的。在一些实施例中，将木糖转化成木酮糖的酶和将阿拉伯糖转化成木酮糖和/或木酮糖-5-P的酶都是过表达的。

将产生木酮糖和/或木酮糖-5-P的酶导入重组宿主细胞可增加丁醇产量。在本文所述方法的一些实施例中，使用本领域为人们所熟知的重组DNA技术可将编码具有期望活性的蛋白的多核苷酸导入细胞。在一些实施例中，编码具有例如木糖异构酶、木糖还原酶、或木糖醇脱氢酶活性的蛋白的多核苷酸的导入导致异丁醇浓度增加和比异丁醇产量增加。

表达产生木酮糖的酶的微生物的制备方法是本领域已知的。例如，国际公布WO2009/109630，其据此全文引入以供参考，描述了表达木糖异构酶的戊糖发酵细胞的制备。本文所公开的可在宿主细胞中表达的产生木酮糖和/或木酮糖-5-P的酶基因和蛋白的附加的例子包括但不限于下面表3中的那些，在附表中提供了序列，以引用方式并入本文。在US20110318801A1中公开了木糖异构酶和此类多肽的来源生物的例子。木糖异构酶和来源生物的例子包括但不限于下面表4和5中的那些(例如SEQ ID NO：89-394)以及如SEQ ID NO：74、75、和395-399。

表3：产生木酮糖的酶。

整个GenBank记录以FASTA格式给出。在标题行末尾的括号中给出了所关注酶的编码区。

表4：木糖异构酶的编码区和蛋白的SEQ ID NO。给出的Uniprot登录号(AC)或NCBI GI号。

表5：木糖异构酶的蛋白SEQ ID NO。对于指定蛋白给出的Uniprot登录号(AC)。

SEQ ID NO：395是针对发酵单胞菌(Zymomonas)密码子优化的密苏里游动放线菌(Actinoplanes missourinesis)木糖异构酶的编码区。

SEQ ID NO：396是针对发酵单胞菌(Zymomonas)密码子优化的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)木糖异构酶的编码区。

SEQ ID NO：397是针对发酵单胞菌(Zymomonas)密码子优化的大肠杆菌(E.coli)木糖异构酶的编码区。

SEQ ID NO：398是经密码子优化的昏暗地嗜皮菌(Geodermatophilusobscurus)木糖异构酶编码区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：399是经密码子优化的耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)木糖异构酶编码区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：74是经密码子优化的Salinispora arenicola木糖异构酶编码区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：75是经密码子优化的Xylanimonas cellulosilytica木糖异构酶编码区的核苷酸序列。

本文可使用的多核苷酸和多肽的其他例子包括但不限于与表3、4或5的任何一个序列具有至少约70％至约75％、约75％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％的序列同一性的多核苷酸和/或多肽，其中此类多核苷酸或基因编码、或此类多肽具有酶活性。可用于所述异构化和发酵过程的多核苷酸和多肽的其它例子包括但不限于表3、4或5的任何一个序列的活性变体、片段或衍生物，其中此类多核苷酸或基因编码、或此类多肽具有酶活性。

在多个实施例中，使用本文所公开的和本领域可获得的序列在文献和技术人员所熟知的生物信息数据库中鉴定其它多核苷酸和/或多肽的序列。例如，通过用已知编码酶的多核苷酸或多肽序列对可公开获得的数据库的BLAST检索能够鉴定此类序列。在此类方法中，同一性能够基于Clustal W比对方法，采用GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝0.1、以及Gonnet250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数。

此外，本文所公开的或本领域已知的多核苷酸或多肽序列能够被用于鉴定天然的其它同源物。例如本文所公开的每一个核酸和其片段能够被用于分离编码同源蛋白质的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的例子包括但不限于：(1)核酸杂交方法；(2)DNA和RNA扩增方法，这可通过核酸扩增技术的多种用法来举例说明[如聚合酶链反应(PCR)，Mullis等人，美国专利4,683,202；连接酶链反应(LCR)，Tabor，等人，Proc.Acad.Sci.USA82：1074(1985)；或链置换扩增(SDA)，Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992)]；和(3)文库构建和互补筛选方法。

用于在重组宿主细胞，包括但不限于酵母细胞，中表达基因的方法是本领域已知的(参见例如，Methods in Enzymology，第194卷，Guide toYeast Genetics and Molecular and Cell Biology(Part A，2004，ChristineGuthrie和Gerald R.Fink(编辑)，Elsevier Academic Press，San Diego，CA)。以游离的质粒和整合的多核苷酸的方式表达基因的方法与目前所述的方法都是相容的。

在一些实施例中，待表达的酶的编码区可为针对靶宿主细胞优化过密码子的，如本领域的技术人员所熟知的。在包括但不限于酵母细胞的重组宿主细胞中的基因表达能够需要可操作地连接至所关注的编码区的启动子和转录终止子。许多启动子能够被用于构建基因的表达盒，包括但不限于下列的适合在酵母中使用的组成型启动子：FBA1、TDH3、ADH1和GPM1；和下列的适合在酵母中使用的诱导型启动子：GAL1、GAL10和CUP1。可在用于表达的嵌合基因构建体中使用的适宜转录终止子包括但不限于FBAlt、TDH3t、GPM1t、ERG10t、GAL1t、CYC1t和ADH1t。

重组多核苷酸通常使用编码序列作为转化用嵌合基因的一部分进行克隆表达，所述嵌合基因包括可操作地连接至编码序列的启动子和终止控制区。所述编码区可以来自用于转化的宿主细胞，并与编码所述蛋白的天然基因的非原生调控序列接合。作为另外一种选择，所述编码区可来源于另一个宿主细胞。

用于转化多种宿主细胞的载体是常见的并在文献中有描述。载体通常包含选择性标记和在目标宿主中允许自主复制或染色体整合的序列。此外，适合的载体可包含转录起始控制的启动子区域和转录终止控制区，编码区DNA片段可被插入至二者之间，以提供所插入的编码区的表达。这两种控制区均能够来源于与转化的宿主细胞同源的基因，但是应当理解，这种控制区也能够来源于对被选择作生产宿主的特定物种来说是非天然的基因。

在多个实施例中，适合的启动子、转录终止子和酶编码区能够被克隆至大肠杆菌-酵母穿梭载体中，并被转化至酵母细胞。此类载体允许菌株在大肠杆菌和酵母菌株中繁殖，并且可包含选择性标记和允许在所期望的宿主中的自主复制或染色体整合的序列。在酵母中通常使用的质粒包括但不限于穿梭载体pRS423、pRS424、pRS425和pRS426(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)，它们包含大肠杆菌复制起点(例如，pMB1)、酵母2μ-复制起点、以及用于营养选择的标记。这四种载体的选择标记物是HIS3(载体pRS423)、TRPl(载体pRS424)、LEU2(载体pRS425)和URA3(载体pRS426)。

在多个实施例中，带有编码所述酶的嵌合基因的表达载体的构建，可在酵母中通过空位修复重组方法进行。缺口修复克隆方法利用了酵母中高效的同源重组系统。在多个实施例中，酵母载体DNA被消化(例如，在其多克隆位点)，以在其序列中产生“空位”。制备所关注的多种插入DNA，所述插入DNA在其5′和3′端均包含约21bp的序列，所述序列依次彼此重叠和与载体DNA的5′和3′端重叠。例如，为构建“基因X”的酵母表达载体，表达盒选择了酵母启动子和酵母终止子。所述启动子和终止子扩增自酵母基因组DNA，而基因X通过PCR扩增自其源生物，或者从包含基因X序列的克隆载体获得。至少21bp的重叠序列存在于在线性载体和启动子序列的5′之间、在启动子和基因X之间、基因X与终止子序列之间、和在终止子与线性载体3′端之间。然后，所述“有间隙的”载体和所述插入DNAs共转化到酵母菌株中并且接种到包含适宜化合物混合物的培养基上，将允许质粒上的营养选择标记互补。通过利用从选择的细胞制备的质粒DNA进行PCR作图，能够验证正确的插入组合的存在。然后，可将从酵母分离的质粒DNA(通常浓度较低)转入大肠杆菌菌株，例如TOP10，然后通过小量抽提和限制性作图进一步验证所述质粒构建体。最后所述构建体可通过DNA序列分析进行验证。

与缺口修复技术类似，向酵母基因组的整合也利用了酵母中的同源重组系统。在多个实施例中，利用高保真DNA聚合酶和引物，包含编码区加上控制元件(启动子和终止子)和营养缺陷型标记的盒被PCR扩增，其中所述引物与所述盒杂交，并且包含与期望插入发生的基因组座位的5′和3′区域同源的40-70碱基对的序列。然后将PCR产物转入酵母，并涂布于包含适当的化合物混合物的培养基上，所述混合物允许对所整合的营养缺陷型标记的选择。例如，为了将“基因X”整合至染色体位置“Y”中，从质粒DNA构建体PCR扩增启动子-编码区X-终止子构建体，并通过SOE PCR或普通的限制性消化和克隆将其与营养缺陷型标记(例如URA3)相连接。所述全长盒，包含启动子-编码区X-终止子-URA3区，是PCR扩增得到的，所用引物序列为包含40-70个碱基对、与酵母染色体Y位置的5′和3′区同源性。上述PCR产物被转入酵母，并在缺乏尿嘧啶的生长培养基上进行选择。转化体可通过克隆PCR或通过对染色体DNA的直接测序得到验证。

可使用本领域已知的方法确认本文所公开的重组宿主细胞中产生木酮糖的酶活性(例如，木糖异构酶、木酮糖激酶等)的存在。在非限制性例子中，可通过使用针对所述酶的引物的PCR筛选转化子。在另一个非限制性例子中，可在本文所公开的缺乏内源性酶活性的重组宿主细胞中检测酶活性。例如，具有酶活性的多肽能够将木糖或阿拉伯糖转化成木酮糖。在另一个非限制性例子中，可通过更直接的方法确认酶活性，诸如通过检测需要所述酶活性的途径中的下游产物，包括，例如，异丁醇产量。

通过代谢工程改造以增加木酮糖产量将在没有外源酶的情况下实现通过发酵产生异丁醇。因此，能通过添加外源酶、通过重组表达酶，或两者兼而有之能促进将5碳糖发酵为丁醇。随着木酮糖产量的增加，从5碳糖产生异丁醇的功效也被增加了。

在一些实施例中，将底物转化成木酮糖的酶的使用产生特定的木糖：木酮糖平衡。例如，在一些实施例中，所述平衡为约5木糖：1木酮糖。

在一些实施例中，所述酶存在的量足以将底物以至少约0.1g/小时、至少约0.25g/小时、至少约0.5g/小时、或至少约1g/小时的速率转化成木酮糖。

将底物转化成木酮糖的酶的使用使得丁醇产量增加。

在一些实施例中，此类酶的使用导致5碳糖消耗的增加。5碳糖消耗的速率可用本领域已知的任何方法测量。在某些实施例中，其中也消耗了6碳糖，5碳糖消耗的速率可为6碳糖消耗速率的至少约0.5％、0.75％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、或70％。

在一些实施例中，能够产生丁醇的微生物是遗传稳定的。在遗传稳定的微生物中染色体畸变和质粒丢失被最小化。在一些实施例中，当在工业相关的培养基中生长时，能够产生丁醇的微生物是遗传稳定的。在一些实施例中，当在矿物质培养基中生长时，能够产生丁醇的微生物是遗传稳定的。在一些实施例中，当在限定培养基中生长时，能够产生丁醇的微生物是遗传稳定的。在一些实施例中，经过长时间连续培养期后，能够产生丁醇的微生物是遗传稳定的。

异构化和发酵

丁醇生产微生物可在允许丁醇产生的任何条件下培养。具体地，已经观察到微生物在通气情况下生长，随后在没有呼吸作用下发酵增加了丁醇产量(厌氧或微氧发酵)。

可用本领域已知的任何方法测量呼吸作用。以举例的方式，可通过ATP产生、二氧化碳产生和/或氧气使用来检测呼吸作用。可用本领域已知的任何方法抑制呼吸作用。例如，可在发酵组合物中加入呼吸抑制剂。合适的呼吸抑制剂包括，以举例的方式，抗霉素A、氰化物、叠氮化物、寡霉素、和鱼藤酮。

所述抑制剂能以任何减少或限制呼吸作用的浓度存在。在一些实施例中，所述抑制剂以约0.1至约10μM的浓度存在。例如，所述抑制剂的浓度可为约0.1至约5μM、约0.1至约4μM、约0.1至约3lμm、约0.1至约2μM、约0.1至约1.5μM、或约0.1至约1μM。所述抑制剂的浓度也可为约0.5至约10μM、约0.5至约5μM、约0.5至约3μM、约0.5至约2μM、约0.5至约1.5μM、或约0.5至约1μM。所述抑制剂的浓度也可为约1μM。

所述抑制剂可以足以降低呼吸作用水平的浓度存在，所述降低的呼吸作用水平不超过在没有抑制剂的相同条件下呼吸作用水平的约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、或75％。

在一些实施例中，所述呼吸抑制剂为抗霉素A。在一些实施例中，抗霉素A以约0.1至约10μM的浓度存在。例如，抗霉素A的浓度可为约0.1至约5μM、约0.1至约4μM、约0.1至约3μM、约0.1至约2μM、约0.1至约1.5μM、或约0.1至约1μM。抗霉素A的浓度也可为约0.5至约10μM、约0.5至约5μM、约0.5至约3μM、约0.5至约2μM、约0.5至约1.5μM、或约0.5至约1μM。抗霉素A的浓度也可为约1μM。

抗霉素A可以足以降低呼吸作用水平的浓度存在，所述降低的呼吸作用水平不超过在没有抗霉素A的相同条件下呼吸作用水平的约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、或75％。

在一些实施例中，培养条件是使得在没有抑制剂的情况进行无呼吸作用的发酵。例如，细胞可在微氧或厌氧条件下在发酵罐中培养。

也可提供最大化丁醇产量的其它条件。

通常微生物在约20℃至约40℃的温度范围内生长。5碳糖转化成木酮糖(异构化)和发酵可在相同或不同温度下进行。例如，约40℃的温度可用于5碳糖转化成木酮糖，而约30℃的温度可用于木酮糖发酵为丁醇。此外，约30℃至约40℃、约31℃至约39℃、约32℃至约38℃、约32℃至约37℃、约33℃至约36℃、或约33℃至约35℃的温度可同时用于5碳糖转化成木酮糖和木酮糖发酵为丁醇。此外，约32℃至约36℃、约32℃至约35℃、约32℃至约34℃、约33℃至约36℃、约33℃至约35℃、或约33℃至约34℃的温度可同时用于5碳糖转化成木酮糖和木酮糖发酵为丁醇。此外，约32℃至约36℃、约33℃至约36℃、约34℃至约36℃、约33℃至约35℃、约33℃至约35℃、或约34℃至约35℃的温度可同时用于5碳糖转化成木酮糖和木酮糖发酵为丁醇。在一些实施例中，约33℃至约35℃的温度或约34℃的温度用于5碳糖转化成木酮糖和木酮糖发酵为丁醇。

对于所述微生物合适的pH值范围为约pH3.0至约pH9.0。5碳糖转化成木酮糖(异构化)和发酵可在相同或不同pH下进行。在一些实施例中，所述异构化在约pH5.0至约pH8.0、约pH5.0至约pH7.0、约pH6.0至约pH8.0、约pH6.0至约pH7.0、或约7.0的pH值下进行。在一些实施例中，所述发酵在约pH3.0至约pH7.0、约pH4.0至约pH6.0、约pH4.0至约pH5.0的pH值下进行。

在一些实施例中，异构化和发酵在约pH4.0至约pH8.0、约pH5.0至约pH7.0、或约pH6.0的pH值下进行。在一些实施例中，异构化和发酵在约pH5.0至约pH8.0、或约pH6.0至约pH8.0的pH值下进行。在一些实施例中，异构化和发酵在约pH4.0至约pH7.0、约pH4.0至约pH6.0的pH值下进行。在一些实施例中，异构化和发酵在约pH6.0的pH值下进行。

此外，发酵培养基还必须包含本领域技术人员已知的适于培养物生长并促进本文所述酶途径的合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂及其它组分。可用的培养基的非限制性例子包括酵母提取物-蛋白胨、限定矿物质培养基、酵母氮源基础(YNB)、合成完全培养基(SC)、M122C、MOPS、SOB、TSY、YMG、YPD、2XYT、LB、M17、或M9最小培养基。可使用的培养基的其他例子包括包含磷酸钾和/或磷酸钠的溶液。适用的培养基可补充有NADH或NADPH。本发明中的其他合适的生长培养基是普通的商品化制备的培养基，例如Luria Bertani(LB)肉汤、沙氏葡萄糖肉汤(SD)肉汤、酵母培养基(YM)肉汤、或包含酵母氮源基础、硫酸铵和右旋糖(作为碳/能源)的肉汤，或YPD培养基——蛋白胨、酵母提取物和右旋糖以大多数酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株生长的最适比例的共混物。其他确定的或合成的生长培养基也能够被使用，微生物学或发酵科学领域的技术人员将知道用于具体微生物生长的合适培养基。

在一些实施例中，所述发酵培养基不包含酵母提取物。

在一些实施例中，抗生素也包括在内。例如，使用外源的产生木酮糖的酶的方法可导入细菌污染。例如，可使用抗生素诸如青霉素(例如，青霉素G或青霉素V)、四环素、或先锋霉素(例如，先锋霉素C)、维吉尼亚霉素、和氯霉素。在一些实施例中，抗生素存在的量足以抑制细菌生长。在一些实施例中，抗生素存在的量不会影响酵母生长。在一些实施例中，抗生素以约5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50μg/L的浓度存在。

在一些实施例中，培养所述组合物至少约20小时、至少约30小时、至少约40小时、至少约50小时、至少约60小时、至少约70小时、至少约80小时、至少约90小时、至少约100小时、至少约120小时、至少约140小时、至少约160小时、至少约180小时、或至少约200小时。

采用分批、分批补料或连续过程，预期异丁醇或其它产物的生产可以实行，并且任何已知的发酵模式将是合适的。另外，预期细胞能够被固定在底物上作为完整细胞催化剂，并经受用于生产异丁醇的发酵条件。

异丁醇生产

本文描述了采用5碳糖生产丁醇的方法。在一些实施例中，所述丁醇为异丁醇。

例如，可从5碳糖产生丁醇，通过(a)提供包含能够产生丁醇的微生物和将底物转化成木酮糖的酶或酶组合的组合物；(b)使组合物与5-碳源接触；以及(c)在限制酵母呼吸作用的条件下培养酵母。

因此，也提供了从5碳糖产生丁醇的组合物。所述组合物包含(a)能够产生丁醇的酵母；(b)能够将5碳糖转化成木酮糖的酶或酶组合；(c)5碳糖源；和(d)发酵培养基。

在一些实施例中，丁醇或异丁醇是以特定产率或速率产生的。

因此，比异丁醇产量可为至少约0.10g/g/h(克异丁醇每克干重每小时)、至少约0.11g/g/h、至少约0.12g/g/h、至少约0.13g/g/h、至少约0.14g/g/h、至少约0.15g/g/h、至少约0.16g/g/h、至少约0.17g/g/h、至少约0.18g/g/h、至少约0.19g/g/h、至少约0.20g/g/h、至少约0.25g/g/h、至少约0.30g/g/h、至少约0.35g/g/h、至少约0.40g/g/h、至少约0.45g/g/h、至少约0.50g/g/h、至少约0.75g/g/hr、或至少约1.0g/g/hr。比异丁醇产量也可为约0.05g/g/h至约1.0g/g/h、约0.05g/g/h至约0.75g/g/h、或约0.05g/g/h至约0.50g/g/h。比异丁醇产量也可为约0.10g/g/h至约1.0g/g/h，约0.10g/g/h至约0.75g/g/h、或约0.10至约0.50g/g/h。比异丁醇产量也可为约0.15g/g/h至约1.0g/g/h、约0.15g/g/h至约0.75g/g/h、或约0.15至约0.5g/g/h。

在某些实施例中，生产提供了高于理论的约10％的产率、高于理论的约20％的产率、高于理论的约25％的产率、高于理论的约30％的产率、高于理论的约40％的产率、高于理论的约50％的产率、高于理论的约60％的产率、高于理论的约70％的产率、高于理论的约75％的产率、高于理论的约80％的产率、高于理论的约85％的产率、高于理论的约90％的产率、高于理论的约95％的产率、高于理论的约96％的产率、高于理论的约97％的产率、高于理论的约98％的产率、高于理论的约99％的产率、或约理论的100％的产率。

在某些实施例中，其中产生了异丁醇和乙醇，异丁醇的产生速率可为并且在产生乙醇的存在下异丁醇的速率将会降低。

微生物

按照本位所述的方法，可使用任何能够产生丁醇的微生物。例如，在一些实施例中，所述微生物为能够产生丁醇的酵母细胞。在一些实施例中，所述酵母细胞为选自下组的属的成员，其包括：糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、和毕赤酵母属(Pichia)。在另一方面，所述酵母细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

所述微生物可为基因改变以使其生产丁醇的。可被使用的用于生产异丁醇的生物合成途径包括那些在美国专利7,993,889中描述的，其以引用的方式并入本文。例如，所述能够产生丁醇的微生物可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(c)2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；(d)2-酮异戊酸至异丁醛；或(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述微生物可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(c)2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；(d)2-酮异戊酸至异丁醛；以及(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟基酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和/或醇脱氢酶活性。

所述能够产生丁醇的微生物可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(c)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；(d)α-酮异戊酸至缬氨酸；(e)缬氨酸至异丁胺；(f)异丁胺至异丁醛；(g)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述微生物可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(c)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；(d)α-酮异戊酸至缬氨酸；(e)缬氨酸至异丁胺；(f)异丁胺至异丁醛；(g)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶、酮醇酸还原异构酶、二羟基酸脱水酶、转氨酶、缬氨酸脱氢酶、缬氨酸脱羧酶、ω-转氨酶和/或支链醇脱氢酶活性。

所述能够产生丁醇的微生物可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(c)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；(d)α-酮异戊酸至异丁酰-CoA；(e)异丁酰-CoA至异丁醛；以及(f)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述微生物可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(c)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；(d)α-酮异戊酸至异丁酰-CoA；(e)异丁酰-CoA至异丁醛；以及(f)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸还原异构酶、乙酰羟酸脱水酶、支链酮酸脱氢酶、乙酰化的醛脱氢酶和/或支链醇脱氢酶活性。

所述能够产生丁醇的微生物可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丁酰-CoA至异丁酰-CoA；(b)异丁酰-CoA至异丁醛；以及(c)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丁酰-CoA至异丁酰-CoA；(b)异丁酰-CoA至异丁醛；以及(c)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有异丁酰-CoA变位酶、乙酰化的醛脱氢酶和/或支链醇脱氢酶活性，如在美国专利7,993,889的表1中的步骤k、e和g所述，其以引用方式并入本文。

用于生产可使用的1-丁醇的生物合成途径包括在美国申请公布2008/0182308中描述的那些，其以引用的方式并入本文。所述能够产生丁醇的微生物可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA；(b)乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酰-CoA；(c)3-羟丁酰-CoA至丁烯酰-CoA；(d)巴豆酰-CoA至丁酰-CoA；(e)丁酰-CoA至丁醛；以及(f)丁醛至1-丁醇。在一些实施例中，所述微生物可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA；(b)乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酰-CoA；(c)3-羟丁酰-CoA至丁烯酰-CoA；(d)丁烯酰-CoA至丁酰-CoA；(e)丁酰-CoA至丁醛；以及(f)丁醛至1-丁醇。在一些实施例中，所述微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰-CoA乙酰基转移酶、3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脱氢酶、丁醛脱氢酶和/或丁醇脱氢酶活性。

用于生产可使用的2-丁醇的生物合成途径包括在美国申请公布2007/0259410和美国申请公布2009/0155870中描述的那些，它们以引用的方式并入本文。所述能够产生丁醇的微生物可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丙酮酸至α-乙酰乳酸；(b)α-乙酰乳酸至乙偶姻；(c)乙偶姻至3-氨基-2-丁醇；(d)3-氨基-2-丁醇至3-氨基-2-丁醇磷酸；(e)3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮；以及(f)2-丁酮至2-丁醇。在一些实施例中，所述微生物可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丙酮酸至α-乙酰乳酸；(b)α-乙酰乳酸至乙偶姻；(c)乙偶姻至3-氨基-2-丁醇；(d)3-氨基-2-丁醇至3-氨基-2-丁醇磷酸；(e)3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮；以及(f)2-丁酮至2-丁醇。在一些实施例中，所述微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸脱羧酶、乙偶姻脱氨酶、氨基丁醇激酶、氨基丁醇磷酸磷酸酶和/或丁醇脱氢酶活性。

所述能够产生丁醇的微生物可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丙酮酸至α-乙酰乳酸；(b)α-乙酰乳酸至乙偶姻；(c)乙偶姻至2，3-丁二醇；(d)2，3-丁二醇至2-丁酮；以及(e)2-丁酮至2-丁醇。在一些实施例中，所述微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丙酮酸至α-乙酰乳酸；(b)α-乙酰乳酸至乙偶姻；(c)乙偶姻至2，3-丁二醇；(d)2，3-丁二醇至2-丁酮；以及(e)2-丁酮至2-丁醇。在一些实施例中，所述微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸脱羧酶、丁二醇脱氢酶、二醇脱水酶和/或丁醇脱氢酶活性。

可使用的生产2-丁酮的生物合成途径包括在美国专利申请公布2007/0259410和美国专利申请公布2009/0155870中描述的那些，其以引用的方式并入本文。所述能够产生丁醇的微生物可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丙酮酸至α-乙酰乳酸；(b)α-乙酰乳酸至乙偶姻；(c)乙偶姻至3-氨基-2-丁醇；(d)3-氨基-2-丁醇至3-氨基-2-丁醇磷酸；以及(e)3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮。在一些实施例中，所述微生物可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丙酮酸至α-乙酰乳酸；(b)α-乙酰乳酸至乙偶姻；(c)乙偶姻至3-氨基-2-丁醇；(d)3-氨基-2-丁醇至3-氨基-2-丁醇磷酸；以及(e)3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮。在一些实施例中，所述微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸脱羧酶、乙偶姻脱氨酶、氨基丁醇激酶、和/或氨基丁醇磷酸磷酸酶活性。

所述能够产生丁醇的微生物可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丙酮酸至α-乙酰乳酸；(b)α-乙酰乳酸至乙偶姻；(c)乙偶姻至2，3-丁二醇；以及(d)2，3-丁二醇至2-丁酮。在一些实施例中，所述微生物可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丙酮酸至α-乙酰乳酸；(b)α-乙酰乳酸至乙偶姻；(c)乙偶姻至2，3-丁二醇；以及(d)2，3-丁二醇至2-丁酮。在一些实施例中，所述微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸脱羧酶、丁二醇脱氢酶、和/或二醇脱水酶活性。

此外，在一些实施例中，所述微生物在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性多核苷酸中，包含至少一个缺失、突变和/或取代。所述具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽可为，以举例的方式，Pdc1、Pdc5、Pdc6、或它们的任何组合。在一些实施例中，所述微生物基本上不含具有丙酮酸脱羧酶活性的酶。在其中该酵母生产的宿主细胞是pdc-的具有降低葡萄糖抑制的基因修饰，其描述参见美国专利申请公开20110124060，其以引用方式并入本文。

应当理解，包含如本文所提供的丁醇生物合成途径的微生物可进一步包含一个或多个附加的修饰。美国专利申请公开20090305363(以引用的方式并入本文)公开了通过工程化酵母以增加丙酮酸至乙酰乳酸的转化，所述工程化酵母表达定位于胞质溶胶的乙酰乳酸合酶并且基本消除了丙酮酸脱羧酶的活性。在一些实施例中，所述宿主细胞包含降低甘油-3-磷酸脱氢酶的活性的修饰，和/或干扰至少一个基因，其编码具有丙酮酸脱羧酶或的多肽，或干扰至少一个基因，其编码一个控制丙酮酸脱羧酶基因表达的调控元件，如美国专利申请公开20090305363(以引用方式并入本文)所述，对宿主细胞的修改通过Entner-Doudoroff途径提供增加的碳流量或降低等价平衡，如美国专利申请公开20100120105(其以引用方式并入本文)所述。其它的修饰包括整合至少一种多核苷酸，其编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中一个步骤的多肽。其它的修饰包括编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的内源性多核苷酸中的至少一个缺失、突变、和/或替换。在多个实施例中，所述具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽为酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)的YMR226C或其同源物。附加的修饰包括编码具有醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的多肽的内源性多核苷酸中的缺失、突变、和/或替换。在多个实施例中，具有醛脱氢酶活性的多肽为来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)的ALD6或其同源物。在一些实施例中，微生物包含一处缺失或编码多肽的多核苷酸下调，所述多肽催化甘油醛-3-磷酸至甘油酯1，3-二磷酸。在一些实施例中，催化所述反应的酶为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

在一些实施例中，所述酵母菌株为PNY1504。PNY1504来源于CEN.PK113-7D(CBS8340；Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre，Netherlands)并包含下列基因的缺失：URA3、HIS3、PDC1、PDC5、PDC6、和GPD2。所述菌株是用质粒pYZ090(SEQID NO：1)和pLH468(SEQ ID NO：2)转化以生成菌株PNY1504(BP1083，NGCI-070)。在美国临时申请61/246844中描述了质粒pYZ090和pLH468，其据此全文引入以供参考。在一些实施例中，所述微生物包含编码一个或多个多肽的多核苷酸，所述多肽在戊糖磷酸途径中起作用。例如，所述多肽可为转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-磷酸3-差向异构酶和/或核糖-5-磷酸异构酶。示例性戊糖磷酸途径蛋白的序列存在与下表6中。

表6：戊糖磷酸途径酶类。

来自酵母菌属基因组数据库的基因组编码区序列记录以FASTA格式显示。

此外，所述微生物可包含编码多肽的多核苷酸的任何组合，所述多肽在戊糖磷酸途径中起作用。

在一些实施例中，本文所用的组合物包含能够产生丁醇的微生物和不能产生丁醇的微生物。木质纤维素水解产物能抑制生产丁醇的微生物的生长，并且可对于不生产丁醇的微生物的生长有更大程度的抑制作用。本文所述方法，使丁醇生产微生物的生长和产率最大化。

在一些实施例中，丁醇生产微生物以组合物形式(例如，发酵组合物)存在，其浓度至少与不能产生丁醇的微生物的浓度相等。此外，能够产生丁醇的微生物可以以高于不能产生丁醇的微生物浓度的浓度存在。能够产生丁醇的微生物可以以不能产生丁醇的微生物浓度的至少两倍的浓度存在。

用于从发酵培养基中分离异丁醇的方法

按照本文所述的方法，可从5碳糖获得丁醇，所用方法包括(a)提供组合物，其包含能够产生丁醇的微生物和能够将5碳糖转化成木酮糖的一个或多个酶；(b)使组合物与5-碳源接触；(c)在限制呼吸作用的条件下培养所述微生物；以及(d)从培养物纯化异丁醇。

本文所述方法可用以同本领域已知的方法相结合。可用以同本文所公开的方法相结合的方法公开在提交于2010年6月18日的美国临时申请61/356,290；以及提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,451；提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,436；提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,444；提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,429；提交于2010年9月2日的美国临时申请61/379,546；以及提交于2011年2月7日的美国临时申请61/440,034；其全部内容全部以引用方式并入本文。

对于丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵可采用本领域已知的方法从发酵液体培养基中分离生物生产的异丁醇(参见，例如，Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.，49：639-648(1998)，Groot等人，Process.Biochem.27：61-75(1992)，以及本文参考)。例如，能够通过离心、过滤、滗析等方法从发酵培养基中去除固体。然后，可使用诸如蒸馏、共沸蒸馏、液-液提取、吸附、汽提、膜蒸发、或全蒸发的方法从发酵液体培养基中分离异丁醇。

因为异丁醇与水形成低沸点的共沸混合物，蒸馏能被用于分离混合物直至其共沸组成。蒸馏能够与其他分离方法组合使用以分离共沸物。能够与蒸馏组合使用以分离并纯化丁醇的方法包括但不限于滗析、液-液提取、吸附和基于膜的技术。另外，可使用夹带剂(参见例如Doherty和Malone，Conceptual Design of Distillation Systems，McGraw Hill，New York，2001)采用共沸蒸馏来分离丁醇。

丁醇-水混合物形成非均相共沸物，从而能够组合使用蒸馏和滗析以分离并纯化异丁醇。在这种方法中，蒸馏包含异丁醇的发酵液使其接近共沸组成。然后冷凝共沸混合物，并且通过滗析从发酵培养基分离异丁醇。滗析后的含水相能够作为回流返回第一蒸馏塔。富含异丁醇的滗析有机相能够通过在第二蒸馏塔中蒸馏进一步被纯化。

也可组合使用液-液提取和蒸馏从发酵液体培养基中分离异丁醇。在这种方法中，使用液-液提取用合适溶剂从发酵液中提取异丁醇。然后蒸馏包含异丁醇的有机相以从溶剂中分离丁醇。

蒸馏结合吸附也可用于从发酵培养基中分离异丁醇。在这种方法中，蒸馏包含异丁醇的发酵液使其接近共沸组成，然后使用吸附剂移除剩余的水，所述吸附剂例如分子筛(Aden等人，Lignocellulosic Biomass to EthanolProcess Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysisand Enzymatic Hydrolusis for Corn Stover，Report NREL/TP-510-32438，National Renewable Energy Laboratory，June2002)。

此外，也可组合使用蒸馏和全蒸发以从发酵液体培养基中分离并纯化异丁醇。在该方法中，包含异丁醇的发酵液蒸馏至接近共沸组合物，然后通过亲水性膜以全蒸发除去剩余的水分(Guo等人，J.Membr.Sci.245，199-210(2004))。

原位产物移除(ISPR)(也被称为提取发酵)可用于从生产其的发酵容器中移除丁醇(或其它发酵性醇)，从而使微生物高产率生产丁醇。本领域已描述的移除发酵性醇的一种ISPR方法为液-液提取。一般来讲，关于丁醇发酵例如所述包括微生物的发酵培养基，在丁醇浓度达到毒性水平之前与有机提取剂接触。所述有机提取剂和所述发酵培养基形成两相混合物。所述丁醇分配至有机提取剂相，降低了在包含微生物的水相中的浓度，从而限制了微生物在抑制性的丁醇中的暴露。

例如，可根据美国专利公布2009/0305370所述的方法进行类液-液提取，其公开内容全文并入本文。美国专利申请公布2009/0305370描述了生产丁醇和采用液-液提取从发酵液体培养基中回收丁醇的方法，所述方法包括以下步骤：使发酵液体培养基与水不混溶的提取剂接触，以形成包含水相和有机相的两相混合物。通常，所述提取剂可为选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的(以及它们的混合物)C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物。用于ISPR的所述提取剂可为非醇提取剂。所述ISPR提取剂可为外源性有机提取剂，如油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、十四醇、硬脂醇、1-十一醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、十一醛、月桂醛、20-甲基十一醛、以及它们的混合物。

在一些实施例中，所述醇可通过将在发酵液体培养基中的醇与有机酸(例如，脂肪酸)和能够将醇与有机酸酯化的催化剂(例如，脂肪酶)接触而酯化。在此类实施例中，所述有机酸可作为ISPR提取剂，其中分配了醇酯。所述有机酸可供给至发酵容器和/或来源于添加至发酵容器中提供可发酵碳的生物质。原料中存在的脂质可被催化水解为有机酸，并且相同的催化剂(例如，酶)可将有机酸和醇酯化。所述催化剂可在发酵前供给制原料中，或在供给原料前或与其同时供给到发酵容器中。当所述催化剂供给至发酵容器中时，可通过所述脂质水解为有机酸并且基本上同时发生有机酸与发酵容器中存在的丁醇酯化，从而获得醇酯。有机酸和/或非来源于原料的天然油脂也可添加至发酵容器中，其中所述天然油脂被水解为有机酸。任何未与所述醇酯化的有机酸均可作为ISPR提取剂的一部分。所述包含醇酯的提取剂可从发酵培养基中分离，并且所述醇可从提取剂中回收。所述提取剂可在发酵容器中循环利用。因此，在丁醇生产的案例中例如将丁醇转化成酯降低了发酵培养基中游离丁醇浓度，屏蔽了来自增加的丁醇浓度对于微生物的毒性效应。此外，未磨碎谷物可用做原料而不用分离其中的脂质，由于这些脂质可被催化水解为有机酸，从而降低ISPR提取剂中脂质积累速率。

原位产物移除可以成批模式或连续模式进行。在连续模式的原位产物移除中，产物从反应器中持续地移除。在分批模式的原位产物移除中，一定体积的有机提取剂加入至发酵容器中，并且在这个过程中不移除所述提取剂。对于原位产物移除，有机提取剂可在形成两相发酵培养基的发酵开始时接触发酵培养基。作为另外一种选择，有机提取剂可在微生物已达到期望的生长量后与发酵培养基接触，其中所述生长量的达到可通过测定培养物的光密度来确定。而且，所述有机提取剂可在发酵培养基中的产物醇水平到达预设水平时接触发酵培养基。在安装本发明的一些实施例的丁醇生产案例中，所述有机酸提取剂可在发酵培养基中的丁醇水平到达毒性水平之前接触发酵培养基，以便将丁醇与有机酸酯化为丁醇酯，从而降低丁醇在发酵容器中的浓度。然后在丁醇酯达到期望的有效滴度后，所述含酯的有机相可从发酵容器中移除(并于与组成水相的发酵液分离)。在一些实施例中，在发酵容器中的可利用发酵糖的发酵基本上完成后，所述含酯的有机相可与水相分离。

实例

本发明将在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，尽管这些实例说明了本发明的实施例，但仅是以例证的方式给出的。从上文的讨论和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本发明的特性，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能对本发明进行各种变化和修改以适应不同的用途和条件。

本文引用的所有文件，包括期刊文章或摘要、已发表的或对应于美国或外国专利申请的、公布的或外国专利的、或任何其他文件，每一份整体以引用方式并入本文，包括被引用文件中存在的所有数据、表格、图片和文字。

实例1

将木质纤维素水解产物中的可发酵碳转化成异丁醇

方法

木质纤维素水解产物(LCH)是由玉米粉制得的，所述玉米粉经稀氨水和热加工预处理，然后用商业纤维素酶和半纤维素酶制剂的混合物以酶促方法水解百分比为25％的预处理过的玉米粉固体，在pH5.3、48℃反应96小时，全部如美国专利公布2007/0031918A1中所述，其以引用方式并入本文。所得的水解产物中主要的糖和乙酸盐浓度为：75g/L葡萄糖，54g/L木糖，6g/L阿拉伯糖，以及5g/L乙酸盐。

使用了两种酵母菌株。第一种，CEN.PK113-7D为野生型产乙醇的菌株。Van Dijken等人，Enzyme Microb Technol26：706-714(2000)。第二种菌株，PNY1504为产异丁醇的菌株。用质粒pYZ090(alsS-L.lactis KARI)和pLH468(IlvD-hADH-KivDy)转化PNY1503(MATa ura3Δ：：loxP his3△pdc6Δpdc1△：：PPDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t pdc5Δ：：P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5t gpd2△：：1oxP)生成所述菌株。

合成完全-GE培养基包括无氨基酸的酵母氮源基础、dropout mix-His-Ura-Trp-Leu(1.4g/L，Sigma Y2001)加上色氨酸(20ng/L)和亮氨酸(60mg/L)(Sherman F，Methods in Enzymology350：3-41(2002))，以及3g/L葡萄糖加上3ml/L190标准乙醇(Sigma E7023)。液体培养基用0.1MMES-KOH缓冲至pH5.5。加入20g琼脂/L形成用于Petri培养皿的固体培养基。

从平板接种至含2ml的SC-GE培养基的试管，在30℃振荡孵育6小时。然后将这个预培养物接种至250ml烧瓶中的50ml SC-GE，在30℃、250rpm下孵育过夜。细胞通过离心回收，并转移至50ml烧瓶中的10ml生产培养基。培养物在30℃繁殖150小时，定期采样以通过HPLC分析残留糖份和生成的醇类。测试的生产培养基为LCH或与水1：1稀释的LCH。

在分析之前，发酵样本用Microfuge18Centrifuge(Beckman Coulter)设定在13,000rpm离心3-5分钟以通过Nanosep MF0.2微米离心式过滤器(Pall Life Sciences，Ann Arbor，MI)。用Waters Alliance HPLC系统用HPLC测量发酵液体培养基中的葡萄糖、木糖、乙酸、甘油、乙醇和异丁醇。所用的柱为具有BioRad Micro-Guard Cartridge Cation-H(#125-0129，Bio-Rad，Hercules，CA)的Transgenomic ION-300柱(#ICE-99-9850，Transgenomic，Inc.，Ohmaha，NE)。使用0.01N H₂SO₄作为溶剂，在75℃和0.4mL/min的流速下运行所述色谱柱。采用外标校准曲线，用折射率检测器测定原料糖和产物的浓度。

结果

所述产异丁醇菌，PNYl504，不能在1x的玉米棒水解产物上生长。如图1中所见，它在稀释的水解产物上以相当于野生型菌株在未稀释LCH上生长的速率生长，并且它达到了野生型菌株最终生物质浓度的大约2/3。图2显示了PNY1504的葡萄糖消耗和异丁醇产量的特征图。在24小时内葡萄糖从～40g/L被消耗降至残余浓度为～15g/L。在同一时期，以最终滴度3g/L产生异丁醇，所得产率为0.12g.g^-1。通过比较，在图3中，观察到产乙醇的菌株几乎完全消耗了葡萄糖，经过＞48小时的时间从～75g/L的初始浓度降至＜5g/L。它产生了大约28g/L乙醇，产率为～0.37g.g^-1。

实例2

在限定培养基中将5碳糖转化成4碳醇

方法

在如上所述的限定培养基SC-GE中预培养菌株PNY1504，不同的是将培养基缓冲至pH6。生成培养物使用相同的SC培养基，不同的是添加葡萄糖或木糖至终35g/L的浓度、添加青霉素G(Sigma P3032)至25μg/ml。

除非它是通过基因工程而实现的，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)不能发酵木糖，但它能发酵木酮糖。为了测试木糖是否可用于发酵异丁醇，用木糖异构酶(10g/L；Sigma G4166)将它原位转化成木酮糖，基本上如Lastick S.M.，等人，Applied Microbiology and Biotechnology30：574-579(1989)，Wang P.Y，等人，Biotechnology Letters2：273-278(1980)以及Chandrakant P&Bisaria VS，Appl Microbiol Biotechnol53：301-309(2000)中所述。

木酮糖可被酵母接受并通过戊糖磷酸途径代谢。已经表明，当在木糖上生长时酵母显示主要为代谢的呼吸作用模式，其导致高生物质产率和发酵产物的低产率。Souto-Maior AM等人，J Biotechnol.143：119-23(2009)。因此，为了增加向发酵产物的通量，用呼吸抑制剂抗霉素A(1μM；SigmaA8674)处理培养物。

结果

如图4所示，产异丁醇菌将葡萄糖发酵为异丁醇。在24小时内己糖被消耗了，与抗霉素A处理无关。经抗霉素A处理过的培养物取得了稍高的异丁醇滴度，～3.3g/L，大约0.08g.g^-1的产率。由于使用高起始生物质浓度来接种生成培养物，观察到了生长的低水平。

图5显示当提供木糖作为唯一碳源以及木糖异构酶时的发酵特征图。木糖转化成木酮糖以及它额后续利用率慢于葡萄糖的消耗。经过78小时，仅消耗了10g/L的木糖(间接地，作为木酮糖，由于木糖异构酶的存在与其处于平衡状态)。这个消耗特征图没有收到抗霉素A存在与否的显著影响。然而，已观察到呼吸抑制剂的确略微降低了生物质积累，并显著增加了异丁醇产量(分别用0.5和0.1g/L处理78小时)。在抗霉素A存在下，异丁醇产率为0.04g.g^-1，而药物不存在的产率为0.01g.g^-1。

实例3

将木质纤维素水解产物中的木糖转化成异丁醇

方法

这个实验使用木糖异构酶将木质纤维素水解产物(LCH)中存在的木糖转化成木酮糖，然后所述木酮糖可被产异丁醇酵母菌株用于发酵异丁醇。如上所述，PNY1504经预生长，转移至包含25mg/L青霉素G的0.5X LCH中培养。如图片说明所述加入木糖异构酶(10g/L)和/或抗霉素A(1μm)。在170小时过程中定期取出样本用于分析。

结果

图6显示了在发酵过程中葡萄糖、木糖和木酮糖的浓度。在48小时内消耗葡萄糖，在不存在木糖异构酶情况下加入抗霉素时除外。可以预知，木糖消耗和木酮糖的形成(未示出)需要添加木糖异构酶。

图7中显示了在发酵过程中的有效异丁醇滴度。在最初48小时全部四种培养物从己糖产生异丁醇，滴度范围大约为4-6g/L。随后，在来自原料的葡萄糖耗尽后的期间，用木糖异构酶和抗霉素A处理培养物100小时。所述浓度随后下降，推测是由于醇的蒸发。未添加木糖异构酶的培养物在整个实验中持续逐渐积累异丁醇，可能是由于在水解产物如乙酸的贫碳源逐渐同化。

实例3

异丁醇的回收

根据提交于2010年6月18日的美国临时申请61/356,290的方法，在前面实例中产生的异丁醇可通过原位产物回收方法进行回收。本文所述原位产物回收(ISPR)方法通过在发酵前和发酵过程中去除抑制剂提供了改善的丁醇生产。通过如果增加一种或多种糖的利用、降低的抑制剂特征图以及增加的醇产物的耐受性，采用ISPR技术，重组生物体对混合糖的利用可提供改善的丁醇生产。

实例4

酿酒酵母(Saccharomvces cerevistae)菌株BP1083(“NGCI-070”； PNY1504)

所述菌株BP1064来源于CEN.PK113-7D(CBS8340；Centraalbureauvoor Schimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre，Netherlands)并包含下列基因的缺失：URA3、HIS3、PDC1、PDC5、PDC6和GPD2。用质粒pYZ090(SEQ ID NO：1，如美国临时申请61/246,844所述)和pLH468(SEQ ID NO：2)转化BP1064以生成菌株NGCI-070(BP1083，PNY1504)。

缺失，即完全去除整个编码序列，通过与PCR片段同源性重组而创建，所述PCR片段包含靶基因的上游和下游同源性区以及用于选择转化子的G418抗性标记或URA3基因。其侧翼为的所述G418抗性标记，用Cre重组酶去除。通过同源重组移除所述URA3基因以创建无痕缺失，或如果侧翼为1oxP位点则用Cre重组酶移除。

所述无痕的缺失步骤是改编自Akada等人(Yeast23：399-405，2006)。一般来讲，每个无痕缺失的PCR盒是通过重叠PCR组合四个片段A-B-U-C得到的。所述PCR盒包含可选的/反可选的标记，URA3(片段U)，其包含原生CEN.PK113-7D URA3基因，连同启动子(URA3基因上游250bp)和终止子(URA3基因下游150bp)。片段A和C每个长500bp，它们对应于紧接靶基因(片段A)上游的500bp和靶基因3′的500bp(片段C)。片段A和C用于通过同源重组将盒整合到染色体中。片段B(500bp长)对应于紧接靶基因下游的500bp并用于通过同源性重组，从染色体上切除URA3标记和片段C，在盒整合到染色体时生成作为对应片段B的直接重复序列使用PCR产物ABUC盒，首先将URA3标记整合进基因组，然后通过同源重组从基因组中切除。初始整合删除了除3′的500bp之外的基因。在切除时，也删除了所述基因3′的500bp区域。对于使用这个方法的基因整合，将要整合的基因包含在PCR盒的片段A和B之间。

URA3缺失

为删除内源URA3编码区，ura3：：loxP-kanMX-loxP盒通过PCR扩增自pLA54模板DNA(SEQ ID NO：3)。pLA54包含乳酸克鲁维酵母TEF1启动子和kanMX标记，并且侧翼序列为loxP位点，允许Cre重组酶参与重组并移除标记。使用

DNA聚合酶(New England BioLabs Inc，Ipswich，MA)和引物BK505与BK506(SEQ ID NO：4和5)进行PCR。所述每个引物的URA3部分来源于URA3启动子上游5′区，和编码区下游3′区，使得loxP-kanMX-loxP标记的整合导致URA3编码区的替换。使用标准的遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)将所述PCR产物转化到CEN.PK113-7D中，并且于30℃在包含G418(100μg/mL)的YPD上对转化子进行选择。通过PCR对转化子进行了筛选以验证正确的整合，所用引物为LA468和LA492(SEQ ID NO：6和7)并命名为CEN.PK113-7D△ura3：：kanMX。

HIS3缺失

用于无痕HIS3缺失的PCR盒的四个片段的扩增使用

HighFidelity PCR Master Mix(New England BioLabs Inc，Ipswich，MA)并以CEN.PK113-7D基因组DNA为模板，用

Yeast/Bact kit(Qiagen，Valencia，CA)制备。HIS3片段A使用以下引物进行扩增：引物oBP452(SEQ ID NO：14)，和引物oBP453(SEQ ID NO：15)，其包含与HIS3片段B的5′端同源的5′尾。HIS3片段B使用以下引物进行扩增：引物oBP454(SEQ ID NO：16)，其包含与HIS3片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP455(SEQ ID NO：17)，其包含与HIS3片段U的5′端同源的5′尾。HIS3片段U使用以下引物进行扩增：引物oBP456(SEQ ID NO：18)，其包含与HIS3片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP457(SEQ IDNO：19)，其包含与HIS3片段C的5′端同源的5′尾。HIS3片段C使用以下引物进行扩增：引物oBP458(SEQ ID NO：20)，其包含与HIS3片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP459(SEQ ID NO：21)。PCR产物用PCRPurification kit(Qiagen，Valencia，CA)纯化。HIS3片段AB通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段A和HIS3片段B并用引物oBP452(SEQ ID NO：14)和oBP455(SEQ ID NO：17)扩增。HIS3片段UC通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段U和HIS3片段C并用引物oBP456(SEQ ID NO：18)和oBP459(SEQ ID NO：21)扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction kit(Qiagen，Valencia，CA)纯化。HIS3ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段AB和HIS3片段UC并用引物oBP452(SEQ ID NO：14)和oBP459(SEQ ID NO：21)扩增。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen，Valencia，CA)纯化。

制备CEN.PK113-7D△ura3：：kanMX的感受态细胞，并用HIS3ABUCPCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II^TM试剂盒(ZymoResearch Corporation，Irvine，CA)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶并补充了2％的葡萄糖的合成完全培养基上。具有his3敲除的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP460(SEQ ID NO：22)和oBP461(SEQ ID NO：23)，所用的基因组DNA用

Yeast/Bact.kit(Qiagen，Valencia，CA)制备。正确的转化子选择为菌株CEN.PK113-7D△ura3：：kanMX△his3：：URA3。

从△ura3位点移除KanMX标记以及从△his3位点移除URA3标记

所述KanMX标记通过用pRS423：：PGAL1-cre(SEQ ID NO：66，如美国临时申请61/290,639中所述)转化CEN.PK113-7D△ura3：：kanMX△his3：：URA3而去除，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II^TMkit(ZymoResearch Corporation，Irvine，CA)并在30℃下涂布在缺乏组氨酸和尿嘧啶、添加了2％的葡萄糖的合成完全培养基上。转化子于30℃在补充了1％的半乳糖的YP上生长～6小时以诱导Cre重组酶和KanMX标记的切除，并在30℃接种到YPD(2％葡萄糖)平板上以复苏。分离物过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸(5-FOA，0.1％)的合成完全培养基上以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。抗5-氟-乳清酸的分离物生长和接种到YPD中以去除pRS423：：PGAL1-cre质粒。检测分离物中KanMX标记和URA3标记的丢失，并通过在YPD+G418平板、缺乏尿嘧啶的合成完全培养基平板、和缺乏组氨酸的合成完全培养基平板的生长检测，检测pRS423：：PGAL1-cre质粒的丢失。对G418敏感并为尿嘧啶和组氨酸营养缺陷性的正确的分离物被选为菌株CEN.PK113-7D△ura3：：loxP△his3并命名为BP857。所述删除和标记移除通过PCR和测序确认，所用引物对于△ura3为引物oBP450(SEQ ID NO：24)和oBP451(SEQ ID NO：25)并且对于△his3为引物oBP460(SEQ ID NO：22)和oBP461(SEQ ID NO：23)，所用的基因组DNA用

Yeast/Bact.kit(Qiagen，Valencia，CA)制备。

PDC6缺失

用于无痕PDC6缺失的PCR盒的四个片段的扩增使用

Yeast/Bact.kit(Qiagen，Valencia，CA)制备。PDC6片段A使用以下引物进行扩增：引物oBP440(SEQ ID NO：26)，和引物oBP441(SEQ ID NO：27)，其包含与PDC6片段B的5′端同源的5′尾。PDC6片段B使用以下引物进行扩增：引物oBP442(SEQ ID NO：28)，其包含与PDC6片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP443(SEQ ID NO：29)，其包含与PDC6片段U的5′端同源的5′尾。PDC6片段U使用以下引物进行扩增：引物oBP444(SEQ ID NO：30)，其包含与PDC6片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP445(SEQ IDNO：31)，其包含与PDC6片段C的5′端同源的5′尾。PDC6片段C使用以下引物进行扩增：引物oBP446(SEQ ID NO：32)，其包含与PDC6片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP447(SEQ ID NO：33)。PCR产物用PCRPurification kit(Qiagen，Valencia，CA)纯化。PDC6片段AB通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段A和PDC6片段B并用引物oBP440(SEQID NO：26)和oBP443(SEQ ID NO：29)扩增。PDC6片段UC通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段U和PDC6片段C并用引物oBP444(SEQID NO：30)和oBP447(SEQ ID NO：33)扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction kit(Qiagen，Valencia，CA)纯化。所述PDC6ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段AB和PDC6片段UC并用引物oBP440(SEQ ID NO：26)和oBP447(SEQ ID NO：33)扩增。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen，Valencia，CA)纯化。

制备CEN.PK113-7D△ura3：：loxP△his3的感受态细胞，并用PDC6ABUC PCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II^TM试剂盒(ZymoResearch Corporation，Irvine，CA)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶并补充了2％的葡萄糖的合成完全培养基上。带有pdc6敲除的转化子通过PCR进行筛选，所用引物为oBP448(SEQ ID NO：34)和oBP449(SEQ IDNO：35)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.kit(Qiagen，Valencia，CA)制备。正确的转化子被选为菌株CEN.PK113-7D△ura3：：loxP△his3△pdc6：：URA3。

CEN.PK113-7D△ura3：：loxP△his3△pdc6：：URA3分离物过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。所述缺失和标记移除通过PCR和测序确认，所用引物为oBP448(SEQ ID NO：34)和oBP449(SEQ ID NO：35)，所用的基因组DNA用

Yeast/Bact.kit(Qiagen，Valencia，CA)制备。来自分离物的PDC6基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，所用PDC6的编码区的特异性引物为oBP554(SEQ ID NO：36)和oBP555(SEQ ID NO：37)。正确的分离物被选为菌株CEN.PK113-7D△ura3：：loxP△his3△pdc6并被命名为BP891。

PDC1缺失ilvDSm整合

所述PDC1基因被删除并被ilvD替换，其编码区来自变异链球菌(Streptococcus mutans)ATCC No.700610。所述A片段接着来自变异链球菌(Streptococcus mutans)的i1vD编码区，对于用于PDC1缺失-ilvDSm整合的PCR盒，使用Phusion High Fidelity PCR Master Mix(New EnglandBioLabs Inc，Ipswich，MA)进行扩增并用NYLA83基因组DNA作为模板，所述基因组DNA用

Yeast/Bact.kit(Qiagen，Valencia，CA)制备。NYLA83是美国专利申请公布2009/0305363(该专利全文以引用方式并入本文)中描述的携带着PDC1缺失-ilvDSm整合的菌株(构建描述于美国专利申请公布2011/0124060中，该专利全文以引用方式并入本文)。PDC1片段A-ilvDSm(SEQ ID NO：69)使用以下引物进行扩增：引物oBP513(SEQ ID NO：38)，和引物oBP515(SEQ ID NO：39)，其包含与PDC1片段B的5′端同源的5′尾。用于PDC1缺失-ilvDSm整合的PCR盒的B、U和C片段用High Fidelity PCR Master Mix(NewEngland BioLabs Inc，Ipswich，MA)和作为模板的CEN.PK113-7D基因组DNA进行扩增，用

Yeast/Bact.kit(Qiagen，Valencia，CA)制备。PDC1片段B使用以下引物进行扩增：引物oBP516(SEQ IDNO：40)，其包含与PDC1片段A-ilvDSm的3′端同源的5′尾，和引物oBP517(SEQ ID NO：41)，其包含与PDC1片段U的5′端同源的5′尾。PDC1片段U使用以下引物进行扩增：引物oBP518(SEQ ID NO：42)，其包含与PDC1片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP519(SEQ ID NO：43)，其包含与PDC1片段C的5′端同源的5′尾。PDC1片段C扩增使用以下引物进行扩增：引物oBP520(SEQ ID NO：44)，其包含与PDC1片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP521(SEQ ID NO：45)。PCR产物用PCRPurification kit(Qiagen，Valencia，CA)纯化。PDC1片段A-ilvDSm-B通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段A-ilvDSm和PDC1片段B并用引物oBP513(SEQ ID NO：38)和oBP517(SEQ ID NO：41)扩增。PDC1片段UC通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段U和PDC1片段C并用引物oBP518(SEQ ID NO：42)和oBP521(SEQ ID NO：45)扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction kit(Qiagen，valencia，CA)纯化。所述PDC1A-ilvDSm-BUC盒(SEQ ID NO：70)通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段A-ilvDSm-B和PDC1片段UC并用引物oBP513(SEQ ID NO：38)和oBP521(SEQ ID NQ：45)扩增。PCR产物用PCRPurification kit(Qiagen，Valencia，CA)纯化。

制备CEN.PK113-7D△ura3：：loxP△his3△pdc6的感受态细胞，并用PDC1A-ilvDSn-BUC PCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transfomation II^TM试剂盒(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶并补充了2％的葡萄糖的合成完全培养基上。具有PDC1敲除-ilvDSm整合的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP511(SEQ IDNO：46)和oBP512(SEQ ID NO：47)，所用的基因组DNA用

Yeast/Bact.kit(Qiagen，Valencia，CA)制备。来自分离物的PDC1基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，使用PDC1编码区特异性的引物oBP550(SEQ ID NO：48)和oBP551(SEQ ID NO：49)。正确的转化子被选为菌株CEN.PK113-7D△ura3：：loxP△his3△pdc6△pdc1：：ilvDSm-URA3。

CEN.PK113-7D△ura3：：loxP△his3△pdc6△pdcl：：ilvDSm-URA3过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。所述PDC1的缺失、ilvDSm的整合以及标记的移除通过PCR和测序来确认，所用引物为oBP511(SEQID NO：46)和oBP512(SEQ ID NO：47)，所用的基因组DNA用

Yeast/Bact.kit(Qiagen，Valencia，CA)制备。正确的分离物被选为菌株CEN.PK113-7D△ura3：：loxP△his3△pdc6△pdc1：：ilvDSm并命名为BP907。

PDC5缺失sadB整合

所述PDC5基因被删除并被sadB编码区替换，所述编码区来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)。对于PDC5缺失-sadB整合的PCR盒的一个片段首先克隆到质粒pUC19-URA3MCS中。

pUC19-URA3MCS是基于pUC19的并包含处于多克隆位点(MCS)内的URA3基因，其来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。pUC19包含pMB1复制子和编码β-内酰胺酶的基因，该基因负责在大肠杆菌(Escherichia coli)中的复制与选择。除URA3的编码序列外，该基因的上游至下游序列都被包括用于在酵母中表达URA3。所述载体能用于克隆的目的，并且能用做酵母整合载体。

所述DNA涵盖了URA3编码区，连同URA3编码区上游250bp和下游150bp，所述序列来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，CEN.PK113-7D基因组DNA的扩增使用引物oBP438(SEQ ID NO：12)，其包含BamHI、AscI、PmeI和FseI，和oBP439(SEQ ID NO：13)，其包含XbaI、PacI和NotI限制性位点。基因组DNA用

Yeast/Bact.kit(Qiagen，Valencia，CA)制备。在使用BamHI和XbaI消化后，所述PCR产物和pUC19(SEQ ID NO：72)用T4DNA连接酶连接生成载体pUC19-URA3MCS。所述载体通过PCR和测序确认，所用引物为oBP264(SEQ ID NO：10)和oBP265(SEQ ID NO：11)。

所述sadB编码序列和PDC5片段B克隆到pUC19-URA3MCS生成PDC5A-sadB-BUC PCR盒的sadB-BU部分。所述sadB编码序列扩增以pLH468-sadB(SEQ ID NO：67)作为模板，所用引物为oBP530(SEQ IDNO：50)，其包含AscI限制性位点，和引物oBP531(SEQ ID NO：51)，其包含与PDC5片段B的5′端同源的5′尾。PDC5片段B使用以下引物进行扩增：引物oBP532(SEQ ID NO：52)，其包含与sadB的3′端同源的5′尾，和引物oBP533(SEQ ID NO：53)，其包含PmeI限制性位点。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen，Valencia，CA)纯化。sadB-PDC5片段B通过重叠PCR生成，通过混合sadB片段U和PDC5片段B并用引物oBP530(SEQ ID NO：50)和oBP533(SEQ ID NO：53)扩增。在用合适的酶消化后，所得PCR产物经AscI和PmeI消化用T4DNA连接酶连接到pUC19-URA3MCS对应的位点上。所得质粒用作模板以扩增sadB-片段B-片段U，所用引物为oBP536(SEQ ID NO：54)和oBP546(SEQ ID NO：55)，其包含与PDC5片段C的5′端同源的5′尾。PDC5片段C使用以下引物进行扩增：引物oBP547(SEQ ID NO：56)，其包含与PDC5sadB-片段B-片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP539(SEQ ID NO：57)。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen，Valencia，CA)纯化。PDC5sadB-片段B-片段U-片段C通过重叠PCR生成，通过混合PDC5sadB-片段B-片段U和PDC5片段C并用引物oBP536(SEQ ID NO：54)和oBP539(SEQ ID NO：57)扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction kit(Qiagen，Valencia，CA)纯化。PDC5A-sadB-BUC盒(SEQ ID NO：71)通过扩增PDC5sadB-片段B-片段U-片段C生成，所用引物为oBP542(SEQ ID NO：58)，其包含与原生PDC5编码序列上游50个核苷酸同源的5′尾，和oBP539(SEQ ID NO：57)。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen，Valencia，CA)纯化。

制备CEN.PK113-7D△ura3：：loxP△his3△pdc6△pdcl：：ilvDSm的感受态细胞，并用PDC5A-sadB-BUC PCR盒转化，使用Frozen-EZ YeastTransformation II^TM试剂盒(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶补充了1％的乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上。具有pdc5敲除sadB整合的转化子通过PCR进行筛选，所用引物为oBP540(SEQ ID NO：59)和oBP541(SEQ ID NO：60)，所用的基因组DNA用

Yeast/Bact.kit(Qiagen，Valencia，CA)制备。来自分离物的PDC5基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，使用PDC5编码区特异性的引物oBP552(SEQ ID NO：61)和oBP553(SEQ ID NO：62)。正确的转化子被选为菌株CEN.PK113-7D△ura3：：loxP△his3△pdc6△pdcl：：ilvDSm△pdc5：：sadB-URA3。

CEN.PK113-7D△ura3：：loxP△his3△pdc6△pdc1：：ilvDSm△pdc5：：sadB-URA3过夜生长在YPD(0.1％乙醇)中并在30℃接种到补充了乙醇(无葡萄糖)并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上以选择失去了URA3标记的分离物。所述PDC5缺失、sadB整合以及标记去除是通过PCR确认的，所用引物为oBP540(SEQ ID NO：59)和oBP541(SEQ ID NO：60)，所用的基因组DNA用

Yeast/Bact.kit(Qiagen，Valencia，CA)制备。所述正确的分离物被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSmΔpdc5：：sadB并命名为BP913。

GPD2缺失

为删除内源的GPD2编码区，gpd2：：loxP-URA3-loxP盒(SEQ ID NO：73)进行PCR扩增，使用loxP-URA3-loxP(SEQ ID NO：68)作为模板DNA。loxP-URA3-loxP包含(ATCC No.77107)URA3标记，其侧翼序列为loxP重组酶位点。使用

DNA聚合酶(New England BioLabsInc，Ipswich，MA)和引物LA512与LA513(SEQ ID NO：8和9)。所述每个引物的GPD2部分来源于GPD2编码区上游5′区和编码区下游3′区，使得loxP-URA3-loxP标记的整合导致GPD2编码区的替换。所述PCR产物转化到BP913并且转化子在缺乏尿嘧啶的辅以1％乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上筛选。筛选的转化子的正确整合通过PCR来验证，所用引物为oBP582和AA270(SEQ ID NO：63和64)。

所述URA3标记的循环是通过转化pRS423：：PGAL1-cre(SEQ ID NO：66)转化并在30℃涂板在缺乏组氨酸的补充了1％乙醇的合成完全培养基上实现的。将转化子划线接种至补充了1％的乙醇并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，并且在30℃孵育以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。抗5-氟-乳清酸的分离物生长在YPE(1％乙醇)上以移除pRS423：：PGAL1-cre质粒。所述缺失和标记移除通过PCR确认，所用引物为oBP582(SEQ ID NO：63)和oBP591(SEQ ID NO：65)。正确的分离物被选为菌株CEN.PK113-7D△ura3：：loxP△his3△pdc6△pdc1：：ilvDSm△pdc5：：sadB△gpd2：：loxP并命名为PNY1503(BP1064)。

用质粒pYZ090(SEQ ID NO：1)和pLH468(SEQ ID NO：2)转化BP1064以形成菌株NGCI-070(BP1083；PNY1504)。

Claims

1.生产丁醇的方法，包括：

(a)提供组合物，所述组合物包含(i)能够产生丁醇的微生物和(ii)能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合；

(b)使所述组合物与包含混合糖的碳底物接触；以及

(c)在限制氧气利用的条件下培养所述微生物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述丁醇是异丁醇。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述微生物是酵母。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合是由所述组合物中的微生物重组表达的。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合是由所述能够产生丁醇的微生物重组表达的。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合不是由所述能够产生丁醇的微生物产生的。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合不是由所述组合物中的微生物产生的。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合选自：(i)木糖异构酶；(ii)木糖还原酶；(iii)木糖醇脱氢酶；(iv)阿拉伯糖异构酶；(v)核酮糖激酶；(vi)核酮糖-磷酸-5-差向异构酶；(vii)阿拉伯糖还原酶；(viii)阿拉伯糖醇脱氢酶；(ix)木酮糖还原酶；(x)木酮糖激酶；(xi)醛糖还原酶；以及(xii)它们的组合。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述木糖异构酶具有酶学委员会编号EC5.3.1.5。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述木糖还原酶具有酶学委员会编号EC1.1.1.9或EC1.1.1.10。

11.根据权利要求8所述的方法，其中所述阿拉伯糖异构酶具有酶学委员会编号EC5.3.1.4。

12.根据权利要求8所述的方法，其中所述核酮糖激酶具有酶学委员会编号EC2.7.1.16。

13.根据权利要求8所述的方法，其中所述核酮糖-磷酸-5-差向异构酶具有酶学委员会编号EC5.1.3.4。

14.根据权利要求8所述的方法，其中所述阿拉伯糖醇脱氢酶具有酶学委员会编号EC1.1.1.12。

15.根据权利要求8所述的方法，其中所述木酮糖激酶具有酶学委员会编号EC2.7.1.17。

16.根据权利要求8所述的方法，其中所述醛糖还原酶具有酶学委员会编号EC1.1.1.21。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述5碳糖源是木糖源。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述5碳糖源是阿拉伯糖源。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中5碳糖被转化成丁醇。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述5碳糖源也是6碳糖源。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，还包括使所述组合物与6碳糖源接触。

22.根据权利要求21所述的方法，其中5碳和6碳糖以至少约1.5g/gdcw/h的速率累积消耗。

23.根据权利要求21-22中任一项所述的方法，其中5碳糖和6碳糖被转化成丁醇。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中可发酵碳以至少约2g/gdcw/h的速率累积消耗。

25.根据权利要求21-24中任一项所述的方法，其中5碳糖和6碳糖被消耗，并且5碳糖消耗的速率是6碳糖消耗的速率的至少约1％。

26.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述5碳糖源是木质纤维素生物质。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述木质纤维素生物质选自柳枝稷、废纸、来自造纸的淤渣、玉米粒、玉米棒、玉米壳、玉米秸秆、木材废料、草、小麦、小麦秸秆、干草、大麦、大麦秸秆、稻秆、甘蔗渣、高粱、大豆、从谷物的加工中获得的组分、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。

28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述木质纤维素生物质用氨预处理。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述5碳糖源以至少约20g/L的浓度存在。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述5碳糖源以至少约50g/L的浓度存在。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述5碳糖源以至少约75g/L的浓度存在。

32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述能够产生丁醇的微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(c)2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；(d)2-酮异戊酸至异丁醛；以及(e)异丁醛至异丁醇。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述能够产生丁醇的微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟基酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶和醇脱氢酶活性。

34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述能够产生丁醇的微生物在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性多核苷酸中包含至少一个缺失、突变和/或替换。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自Pdc1、Pdc5、Pdc6、以及它们的组合。

36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述能够产生丁醇的微生物基本上不含具有丙酮酸脱羧酶活性的酶。

37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述能够产生丁醇的微生物是PNY1504。

38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述培养在发酵罐中进行。

39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中向所述组合物添加呼吸抑制剂。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述抑制剂是抗霉素A。

41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述组合物和/或所述5碳糖源还包含不能产生丁醇的微生物，并且所述能够产生丁醇的微生物以至少等于1g/l的浓度存在。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述能够产生丁醇的微生物以超过不能产生丁醇的微生物浓度的浓度存在。

43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中比丁醇产量为至少约0.4g/g/h。

44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，还包括使所述组合物与合适的提取剂接触，从而可回收丁醇。

45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，还包括从所述培养物中纯化丁醇。

46.根据权利要求45所述的方法，其中从所述培养物中纯化丁醇包括在油醇中提取。

47.丁醇组合物，其通过权利要求1-46中任一项的方法获得。

48.异丁醇组合物，其通过权利要求2-47中任一项的方法获得。

49.用于生产丁醇的组合物，包含：

(a)能够产生丁醇的微生物；

(b)能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合；

(c)5碳糖源；和

(d)发酵培养基。

50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述丁醇是异丁醇。

51.根据权利要求49或权利要求50所述的组合物，其中所述微生物是酵母。

52.根据权利要求49-51中任一项所述的组合物，其中所述5碳糖源也是6碳糖源。

53.根据权利要求49-52中任一项所述的组合物，还包含6碳糖源。

54.根据权利要求49-53中任一项所述的组合物，其中所述5碳糖源以至少约20g/L的浓度存在。

55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述5碳糖源以至少约50g/L的浓度存在。

56.根据权利要求55所述的组合物，其中所述5碳糖源以至少约75g/L的浓度存在。

57.根据权利要求49-56中任一项所述的组合物，其中所述能够产生丁醇的微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(c)2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；(d)2-酮异戊酸至异丁醛；以及(e)异丁醛至异丁醇。

58.根据权利要求57所述的组合物，其中所述能够产生丁醇的微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟基酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶和醇脱氢酶活性。

59.根据权利要求49-58中任一项所述的组合物，其中所述能够产生丁醇的微生物在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性多核苷酸中包含至少一个缺失、突变和/或替换。

60.根据权利要求59所述的组合物，其中所述具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自Pdc1、Pdc5、Pdc6、以及它们的组合。

61.根据权利要求49-60中任一项所述的组合物，其中所述能够产生丁醇的微生物是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

62.根据权利要求49-61中任一项所述的组合物，还包含呼吸抑制剂。

63.根据权利要求49-62中任一项所述的组合物，还包含并不产生丁醇的微生物。

64.根据权利要求63所述的组合物，其中所述能够产生丁醇的微生物以与所述并不产生丁醇的微生物浓度至少相等的浓度存在。

65.根据权利要求49-64中任一项所述的组合物，其中所述组合物能够产生丁醇和乙醇。

66.根据权利要求49-65中任一项所述的组合物，其中所述组合物能够产生至少约0.4g/g％理论产率的丁醇。

67.丁醇组合物，其通过在限制氧气利用的条件下培养权利要求49-67中任一项的组合物获得。

68.异丁醇组合物，其通过在限制氧气利用的条件下培养权利要求49-67中任一项的组合物获得。

69.使丁醇生产微生物在木质纤维素材料中生长的方法，包括：

(a)提供包含木质纤维素材料的组合物；

(b)使所述组合物与(i)能够产生丁醇的微生物和(ii)能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合接触；以及

(c)将所述组合物维持在限制氧气利用的条件下。

70.根据权利要求69所述的方法，其中所述能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合是由所述能够产生丁醇的微生物重组表达的。

71.丁醇组合物，其通过权利要求70的方法获得。

72.异丁醇组合物，其通过权利要求70的方法获得。

73.抑制并不产生丁醇的微生物在包含木质纤维素材料的组合物中生长的方法，包括：

(a)提供包含木质纤维素材料的组合物；

(c)将所述组合物维持在限制氧气利用的条件下。

74.根据权利要求73所述的方法，其中所述能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合是由所述能够产生丁醇的微生物重组表达的。

75.丁醇组合物，其通过权利要求73或74的方法获得。

76.异丁醇组合物，其通过权利要求73或74的方法获得。