CN104321436A - 醇类的发酵生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及工业微生物和醇生产的领域。本发明还涉及能够经由工程化的途径生产发酵产物的微生物的开发，以及所述微生物的使用。用于生产丁醇的方法，其包括下列步骤：(a)提供产丁醇菌，(b)使所述产丁醇菌与一种或多种碳底物在其中丁醇以有效收率被生产的条件下接触；(c)收集所述产丁醇菌；(d)以至少约6g/L的浓度回收丁醇；(e)使(c)的所收集的产丁醇菌与一种或多种碳底物在其中丁醇以有效收率被生产的条件下接触，并且其中所述有效收率为(b)的有效收率的至少约90％；(f)重复步骤(c)-(e)；以及，任选地使(c)的所收集的产丁醇菌在至少约0.3％的丁醇的存在下暴露于pH小于或等于约2.0的条件下至少约1小时。本发明还涉及改善细胞活力和生产能力的方法以及用以提高发酵产物的收率的循环利用和酸洗涤的使用。

Description

醇类的发酵生产
本专利申请要求提交于2011年12月30日的美国临时申请61/581,877；提交于2012年5月9日的印度专利申请1423/DELNP/2012；以及提交于2012年8月9日的美国临时申请61/681,230的权益；其全部内容全部以引用方式并入本文。
序列表
连同本文提交的序列表(CL5196WOPCT_SequenceListing.txt)中提供的序列(以引用方式并入本文)，符合37C.F.R.§§1.821-1.825(“对含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/orAmino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules))，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization)(WIPO)ST.25标准(2009)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(α-β)以及行政指令(Administrative Instructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822所示的规定。
技术领域
本发明涉及工业微生物和醇生产的领域。本发明还涉及能够经由工程化的途径生产发酵产物的微生物的开发，以及所述微生物的使用。本发明还涉及改善细胞活力和生产能力的方法以及用以提高发酵产物的收率的循环利用和酸洗涤的使用。
背景技术
丁醇是一种重要的工业化学品，其可用作燃料添加剂、塑料工业中的化学原料以及食品和香料工业中的食品级提取剂。每年使用来源于石油化学品的原料通过化学合成生产100至120亿磅的丁醇。用于丁醇异构体(异丁醇)的化学合成的方法是已知的，诸如羰基合成、一氧化碳的催化氢化(Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第6版，2003，Wiley-VCH Verlag GmbH and Co.，Weinheim，Germany，第5卷，716-719页)和甲醇与正丙醇的格尔伯特缩合(Carlini等人，J.Molec.Catal.A.Chem.220：215-220，2004)。这些方法使用来源于石油化学品的起始材料。由植物来源的原材料生产异丁醇能够使化石燃料的使用最小化，并将代表本领域中的进步。此外，利用植物来源的材料或其他生物质源的化学品和燃料的生产将提供对石油化学品工艺的对生态环境友好的且可持续的替代方案。
异丁醇可以以生物方式作为酵母发酵的副产物产生。它是“杂醇油”的一种组分，所述杂醇油由这群真菌氨基酸的不完全代谢形成。异丁醇具体地讲由L-缬氨酸的分解代谢而产生。在L-缬氨酸的胺基作为氮源被利用后，所得的a-酮酸被酶脱羧并还原成异丁醇，这就是所谓的Ehrlich途径(Dickinson等人，J.Biol.Chem.273：25752-25756，1998)。
诸如基因工程和代谢工程的技术可被用于修饰微生物，以从植物来源的材料或其他的生物质源生产某些产物。例如，通过基因的插入诸如编码生物合成途径的基因的插入、基因的缺失、或对调控因子诸如启动子的修饰，可以修饰微生物。微生物还可以被工程化以改善细胞的生产能力和收率、消除生物合成途径的副产物、和/或用于菌株的改善。表达用于生产丁醇异构体(包括异丁醇)的工程化的生物合成途径的微生物的例子描述于美国专利7,851,188和7,993,889中。
然而，在发酵过程中暴露于醇类诸如乙醇和丁醇，可对细胞活力、细胞生产能力、和产物收率具有负面影响。这些醇类的积聚能够抑制细胞的生长并最终影响这些醇类的发酵生产。因此，在这些醇类的存在下，存在对表现出改善的细胞生长和生产的微生物的开发以及维持和/或改善细胞活力和细胞生产能力的方法的需求。
本发明涉及此类方法的开发以及能够经由在该微生物中的工程化的途径生产发酵产物并且具有改善的细胞活力和细胞生产能力的微生物的开发。
发明内容
本发明涉及用于生产醇的方法，所述方法包括：(a)提供微生物，其中所述微生物产生醇；(b)使所述微生物与一种或多种碳源在其中醇被生产的条件下接触；(c)收集所述微生物；(d)回收所述醇；(e)使步骤(c)的所收集的微生物与一种或多种碳源在其中醇被生产的条件下接触；(f)重复步骤(c)-(e)；以及任选地，使步骤(c)的微生物暴露于低pH条件下。在一些实施例中，步骤(c)-(e)被重复至少10次、至少20次、至少30次、至少40次、至少50次、至少100次、或更多次。
本发明还涉及用于生产丁醇的方法，所述方法包括：(a)提供产丁醇菌；(b)使所述产丁醇菌与一种或多种碳源在其中丁醇以有效收率被生产的条件下接触；(c)收集所述产丁醇菌；(d)回收丁醇；(e)使步骤(c)的所收集的产丁醇菌与一种或多种碳源在其中丁醇以有效收率被生产的条件下接触，并且其中所述有效收率是步骤(b)的有效收率的至少约90％；(f)重复步骤(c)-(e)；以及任选地，使步骤(c)的所收集的产丁醇菌暴露于低pH条件下。在一些实施例中，步骤(c)的所收集的产丁醇菌在至少约0.3％的丁醇的存在下被暴露于小于或等于约2.0的pH的条件下至少约一小时。在一些实施例中，步骤(d)的丁醇以至少约6g/L的浓度被回收。在一些实施例中，丁醇在步骤(e)中以一定有效收率被生产，所述有效收率为步骤(b)中有效收率的至少约99％。在一些实施例中，步骤(c)-(e)被重复至少10次、至少20次、至少30次、至少40次、至少50次、至少100次、或更多次。
本发明还涉及用于改善细胞活力和生产能力的方法，包括(a)收集来自醇发酵的微生物；以及(b)使所述微生物与富含营养物质的培养基接触。本发明涉及用于改善细胞活力和生产能力的方法，所述方法包括(a)收集来自醇发酵的微生物；(b)使所述微生物暴露于低pH条件下；(c)收集所述微生物；以及(d)使所收集的微生物与富含营养物质的培养基接触。
本文所述的本发明的另一个方法是用于生产醇的方法，所述方法包括(a)提供微生物，其中所述微生物产生醇；(b)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；(c)收集所述微生物；(d)回收所述醇；(e)使步骤(c)的微生物与富含营养物质的培养基接触；(f)收集步骤(e)的微生物；(g)使步骤(f)的微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；以及(h)任选地重复步骤(c)-(g)。
本发明还涉及用于生产醇的方法，所述方法包括(a)提供微生物，其中所述微生物产生醇；(b)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；(c)收集所述微生物；(d)回收所述醇；(e)使步骤(c)的微生物暴露于低pH条件下；(f)收集来自步骤(e)的微生物；(g)使步骤(f)的微生物与富含营养物质的培养基接触；(h)收集步骤(g)的微生物；(i)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；以及(j)任选地重复步骤(c)-(i)。
在本文所述的工艺和方法的一些实施例中，使微生物与富含营养物质的培养基接触的步骤可在有氧条件下进行。在本文所述的工艺和方法的一些实施例中，pH小于或等于约2。在本文所述的工艺和方法的一些实施例中，pH条件可以是约2至约4。在一些实施例中，所述微生物可暴露于pH小于或等于约2.0的条件下至少约一小时。
在一些实施例中，通过本文所述的工艺和方法生产的醇是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、和己醇。在一些实施例中，所述丁醇可以是1-丁醇、2-丁醇、2-丁酮、异丁醇、或它们的混合物。
在一些实施例中，所述微生物可经受细胞循环利用。在一些实施例中，所述微生物可被循环利用至少5次。在一些实施例中，所述微生物可被循环利用至少10次。在一些实施例中，所述微生物可在循环利用步骤中被酸洗涤。在一些实施例中，所述微生物可在循环利用步骤之后被酸洗涤。
在本文所述的工艺和方法的一些实施例中，与碳底物接触的步骤可在提取剂的存在下进行。在一些实施例中，与碳底物接触的步骤可在厌氧条件下进行。在一些实施例中，与碳底物接触的步骤可在微氧条件下进行。在一些实施例中，接触的步骤可以是第一次接触。在一些实施例中，循环利用可在厌氧条件中进行。在一些实施例中，循环利用可在微氧条件中进行。
在一些实施例中，所述碳底物可选自低聚糖、多糖、单糖、以及它们的混合物。在一些实施例中，所述碳底物可选自果糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、淀粉、纤维素、原料、乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、甘油、玉米醪、甘蔗、生物质、C5糖例如木糖和阿拉伯糖、以及它们的混合物。
在一些实施例中，所述微生物可以是重组宿主细胞。在一些实施例中，所述微生物可以是产丁醇菌。在一些实施例中，所述微生物可以是产异丁醇菌。在一些实施例中，所述微生物可包含丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径可以是异丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(c)2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；(d)2-酮异戊酸至异丁醛；以及(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和/或醇脱氢酶活性。
在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径可以是异丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(c)2，3-二羟基异戊酸至a-酮异戊酸的转化；(d)a-酮异戊酸至异丁酰-CoA的转化；(e)异丁酰-CoA至异丁醛的转化；以及(f)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶活性；乙酰羟酸还原异构酶活性；乙酰羟酸脱水酶活性；支链酮酸脱氢酶活性；醛脱氢酶活性；和/或支链醇脱氢酶活性。
在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径可以是1-丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述1-丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：(a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA的转化；(b)乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酰-CoA的转化；(c)3-羟丁酰-CoA至丁烯酰-CoA的转化；(d)丁烯酰-CoA至丁酰-CoA的转化；(e)丁酰-CoA至丁醛的转化；以及(f)丁醛至1-丁醇。在一些实施例中，所述1-丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰-CoA乙酰转移酶活性；3-羟丁酰-CoA脱氢酶活性；巴豆酸酶活性；丁酰-CoA脱氢酶活性；丁醛脱氢酶活性、和/或丁醇脱氢酶活性。
在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径可以是2-丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述2-丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至a-乙酰乳酸的转化；(b)a-乙酰乳酸至乙偶姻的转化；(c)乙偶姻至3-氨基-2-丁醇；(d)3-氨基-2-丁醇至磷酸-3-氨基-2-丁醇；(e)磷酸-3-氨基-2-丁醇至2-丁酮；和(f)-丁酮至2-丁醇。在一些实施例中，所述2-丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶活性；乙酰乳酸脱羧酶活性；乙偶姻胺化酶活性；氨基丁醇激酶活性；磷酸氨基丁醇磷酸化酶活性；和/或丁醇脱氢酶活性。
在一些实施例中，所述2-丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至a-乙酰乳酸的转化；(b)a-乙酰乳酸至乙偶姻的转化；(c)乙偶姻至2，3-丁二醇的转化；(d)2，3-丁二醇至2-丁酮的转化；以及(e)2-丁酮至2-丁醇。在一些实施例中，所述2-丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶活性；乙酰乳酸脱羧酶活性；丁二醇脱氢酶活性；丁二醇脱水酶活性；和/或丁醇脱氢酶活性。
在一些实施例中，一种或多种底物至产物的转化可利用NADH或NADPH作为辅因子。在一些实施例中，NADH是辅因子。
在一些实施例中，所述微生物的丁醇途径可包含至少一种多肽，所述至少一种多肽选自具有下列酶学委员会编号的酶：EC 2.2.1.6、EC1.1.1.86、EC 4.2.1.9、EC 4.1.1.72、EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.265、EC 1.1.1.2、EC 1.2.4.4、EC 1.3.99.2、EC 1.2.1.57、EC 1.2.1.10、EC 2.6.1.66、EC2.6.1.42、EC 1.4.1.9、EC 1.4.1.8、EC 4.1.1.14、EC 2.6.1.18、EC 2.3.1.9、EC 2.3.1.16、EC 1.1.130、EC 1.1.1.35、EC 1.1.1.157、EC 1.1.1.36、EC4.2.1.17、EC 4.2.1.55、EC 1.3.1.44、EC 1.3.1.38、EC 5.4.99.13、EC4.1.1.5、EC 2.7.1.29、EC 1.1.1.76、EC 1.2.1.57、和EC 4.2.1.28。
在一些实施例中，所述微生物的工程化的丁醇途径可包含至少一种选自下列一组酶的多肽：乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸异构还原酶、乙酰羟酸脱水酶、支链a-酮酸脱羧酶、支链醇脱氢酶、酰化醛脱氢酶、支链酮酸脱氢酶、丁酰-CoA脱氢酶、丁醛脱氢酶、转氨酶、缬氨酸脱氢酶、缬氨酸脱羧酶、w-转氨酶、乙酰-CoA乙酰转移酶、3-羟丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脱氢酶、异丁酰-CoA变位酶、乙酰乳酸脱羧酶、乙偶姻胺化酶、丁醇脱氢酶、丁醛脱氢酶、乙偶姻激酶、磷酸乙偶姻胺化酶、磷酸氨基丁醇磷酸化酶、氨基丁醇激酶、丁二醇脱氢酶、和丁二醇脱水酶。
在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌可包含一种或多种改变了cAMP信号转导途径的一种或多种组分的表达和/或活性的修饰。在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌可包含一种或多种改变了一种或多种磷酸二酯酶的表达和/或活性的修饰。在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌可包含被降低的或被除去的磷酸二酯酶和/或磷酸二酯酶活性。在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌可包含编码具有磷酸二酯酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌可在编码具有磷酸二酯酶活性的多肽的内源性多核苷酸中包含插入、缺失、突变、和/或取代。在一些实施例中，具有磷酸二酯酶活性的多肽可对应于酶学委员会编号EC 3.1.4.17。在一些实施例中，具有磷酸二酯酶活性的多肽可以是PDE1。
在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌不表达丙酮酸脱羧酶或具有降低的所述丙酮酸脱羧酶的表达。在一些实施例中，所述表达的降低是编码丙酮酸脱羧酶的基因的插入、缺失、突变、和/或取代的结果。在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌可包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌可在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性多核苷酸中包含插入、缺失、突变、和/或取代。在一些实施例中，具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽可选自：PDC1、PDC5、PDC6、以及它们的组合。在一些实施例中，编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性多核苷酸可选自：PDC1、PDC5、PDC6、以及它们的组合。
在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌不表达3-磷酸甘油醛脱氢酶或具有降低的所述3-磷酸甘油醛脱氢酶的表达。在一些实施例中，所述表达的降低是编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因的插入、缺失、突变、和/或取代的结果。在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌不表达BDH1或具有降低的所述BDH1的表达。在一些实施例中，所述表达的降低是编码BDH1的基因的插入、缺失、突变、和/或取代的结果。在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌不表达编码乙酰乳酸还原酶的基因或具有降低的所述编码乙酰乳酸还原酶的基因的表达。在一些实施例中，所述表达的降低是编码YMR226c的基因的插入、缺失、突变、和/或取代的结果。
在一些实施例中，所述微生物或产丁醇菌可以是酵母细胞。在一些实施例中，所述酵母细胞可以是选自下列的酵母属的成员：酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、和毕赤酵母属(Pichia)。在一些实施例中，所述微生物可以是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
本发明还涉及包含如本文所述的微生物或产丁醇菌的组合物。在一些实施例中，所述组合物还包含富含营养物质的培养基。在一些实施例中，所述组合物可具有小于或等于约2的pH。在一些实施例中，所述组合物可具有约2至约4的pH。
附图说明
图1示出了菌株PNY860的四分平板。孢子活力如下：4+：0-，n＝15；3+：1-，n＝2；2+：2-，n＝1；1+：3-，n＝0；0+：4-，n＝0.活力和菌落大小是一定程度上可变的，但没有微菌落。
图2示出了来自对4个菌落的接合型分析的PCR产物的琼脂糖凝胶，这些菌落来自是PNY860的孢子子代的2个四分体。泳道1是PNY860。泳道2是PNY860-1A。泳道3是PNY860-1B。泳道4是PNY860-1C。泳道5是PNY860-1D。泳道6是PNY860-2A。泳道7是PNY860-2B。泳道8是PNY860-2C。泳道9是PNY860-2D。
图3示出了不同的异丁醇生物合成途径。标记为“a”、“b”、“c”、“d”、“e”、“f”、“g”、“h”、“I”、“j”、和“k”的步骤代表下述的底物至产物的转化。例如，“a”可被乙酰乳酸合酶催化；“b”可被，例如，乙酰羟酸还原异构酶催化；“c”可被，例如，乙酰羟酸脱水酶催化；“d”可被，例如，支链酮酸脱羧酶催化；“e″可被，例如，支链醇脱氢酶催化；“f”可被，例如，支链酮酸脱氢酶催化；“g”可被，例如，乙酰化醛脱氢酶催化；“h”可被，例如，转氨酶或缬氨酸脱氢酶催化；“i”可被，例如，缬氨酸脱羧酶催化；“j”可被，例如，w转氨酶催化；以及“k”可被，例如，异丁酰-CoA变位酶催化。
图4示出了1-丁醇生物合成途径。标记为“a”、“b”、“c”、“d”、“e”、和“f”的步骤代表下述的底物至产物的转化。例如，“a”可被乙酰-CoA乙酰基转移酶催化；“b”可被，例如，3-羟丁酰-CoA脱氢酶催化；“c”可被，例如，巴豆酸酶催化；“d”可被，例如，丁酰-CoA脱氢酶催化；“e”可被，例如，丁醛脱氢酶催化；以及“f”可被，例如，丁醇脱氢酶催化。
图5示出了2-丁醇和2-丁酮生物合成途径。
具体实施方式
本发明涉及生产发酵产物的微生物，以及在有利的经济的工艺条件下以高的速率和滴度生产诸如丁醇的发酵产物的优化。
在醇类的发酵生产过程中，微生物可能经受多种胁迫条件，包括，例如，醇的毒性、氧化胁迫、渗透胁迫、以及pH、温度、和营养物质可用性的波动。这些胁迫条件的影响可导致细胞生长的抑制和降低的细胞活力，这能够最终导致发酵生产能力和产物收率的降低。通过调整微生物的代谢过程适应这些胁迫条件的能力，对于维持有效的醇类生产是有利的。例如，当暴露于特定胁迫剂时，通过修饰某些代谢过程，诸如生长、信号转导、转录、和/或翻译后活性，微生物可响应这些胁迫条件。
在酵母中，3′-5′-环腺苷单磷酸(cAMP)信号转导途径是细胞的生长和增殖、对营养物质可用性的响应、细胞周期进行、代谢和形态发生、细胞防御、和胁迫响应的关键调节子。在正常条件下，诸如葡萄糖的激动剂经由G蛋白偶联的受体途径激活腺苷酸环化酶，导致提高的cAMP水平，这继而激活蛋白激酶A(PKA)(即，cAMP结合PKA的调节亚基)，并最终导致由例如Msn2p/Msn4p和Yap1p介导的胁迫响应的抑制。在胁迫条件下，cAMP的水平经由Ras/cAMP途径被下调，而cAMP的这些较低的水平导致对胁迫响应的抑制的释放。因此，控制cAMP水平在酵母中对于细胞的胁迫耐受性是重要的。
Ras/cAMP途径参与多种胁迫响应，并因此是酵母中胁迫抗性的主要决定子。例如，Ras/cAMP途径参与细胞对渗透胁迫、高渗胁迫、和冻融的响应的调控(Park，等人Biochem.Biophys.Res.Comm.327：311-319，2005)。
cAMP的水平受其通过腺苷酸环化酶活性的合成和其通过被环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)水解的降解的调控。两种磷酸二酯酶，PDE1和PDE2，已在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中被鉴定(Nikawa，等人Mol.Cell.Biol.7(10)：3629-3636，1987)。PDE1是低亲和力的cAMP磷酸二酯酶，而PDE2是高亲和力的cAMP磷酸二酯酶。PDE1已被显示通过水解cAMP(这导致PKA的抑制)而在激动剂诱导的cAMP信号作用(例如，瞬时的，适应条件)的下调中起作用。PDE1活性是受PKA介导的磷酸化调控的，即，PDE1被PKA磷酸化导致提高的磷酸二酯酶活性(Ma，等人Mol.Biol.Cell 10：91-104，1999)。因此，通过PDE1的破坏对cAMP水平和PKA活性的调节可为控制酵母中的胁迫耐受性的有效方法。
随着对可持续的生物燃料作为替代性能源的重新关注和对开发有效的和对环境友好的生产方法的期望，使用发酵工艺生产醇是替代当前的合成工艺的可行选项。然而，一些以特定收率生产醇(例如，乙醇、丁醇)的微生物还具有低的醇毒性阈值。因此，用于醇的商业生产的发酵工艺的开发受到醇的毒性的限制。如上文所述，醇的毒性能够在微生物中产生胁迫响应，导致，例如，细胞生长的抑制和细胞活力的降低。
本发明涉及具有改善的细胞活力和/或提高的醇的耐受性的微生物。在一些实施例中，通过使cAMP信号转导途径的一种或多种组分的表达和/或活性改变的一种或多种修饰，微生物可被工程化，以表现出改善的细胞活力和/或提高的醇的耐受性。在一些实施例中，cAMP信号转导途径的一种或多种组分可以是磷酸二酯酶。在一些实施例中，所述磷酸二酯酶可以是PDE1。
在一些实施例中，使表达和/或活性改变的一种或多种修饰可以是编码cAMP信号传导途径的一种或多种组分的一种或多种内源性基因的表达的消除或降低。在一些实施例中，使表达和/或活性改变的修饰可以是编码磷酸二酯酶的内源性基因的表达的消除或降低。在一些实施例中，使表达和/或活性改变的修饰可以是编码PDE1的内源性基因的表达的消除或降低。
在一些实施例中，微生物可包含一种或多种改变了cAMP信号转导途径的一种或多种组分的表达和/或活性的修饰。在一些实施例中，微生物可包含一种或多种改变了一种或多种磷酸二酯酶的表达和/或活性的修饰。在一些实施例中，微生物可包含一种或多种改变了PDE1的表达和/或活性的修饰。
在一些实施例中，微生物可包含使编码cAMP信号传导途径的一种或多种组分的一种或多种内源性基因的表达消除或降低的一种或多种修饰。在一些实施例中，微生物可包含使编码磷酸二酯酶的内源性基因的表达消除或降低的一种或多种修饰。在一些实施例中，微生物可包含使编码PDE1的内源性基因的表达消除或降低的一种或多种修饰。在一些实施例中，微生物可包含消除或降低磷酸二酯酶的活性的一种或多种修饰。在一些实施例中，微生物可包含消除或降低PDE1的活性的一种或多种修饰。
在一些实施例中，微生物可包含一种或多种改变了cAMP信号转导途径的一种或多种组分和丁醇生物合成途径的表达和/或活性的修饰。在一些实施例中，微生物可包含一种或多种改变了一种或多种磷酸二酯酶和丁醇生物合成途径的表达和/或活性的修饰。在一些实施例中，微生物可包含一种或多种改变了PDE1和丁醇生物合成途径的表达和/或活性的修饰。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径可以是1-丁醇生物合成途径、2-丁醇生物合成途径、2-丁酮生物合成途径、或异丁醇生物合成途径。
在一些实施例中，微生物可包含使编码cAMP信号传导途径和丁醇生物合成途径的一种或多种组分的一种或多种内源性基因的表达消除或降低的一种或多种修饰。在一些实施例中，微生物可包含一种或多种使编码磷酸二酯酶和丁醇生物合成途径的内源性基因的表达消除或降低的修饰。在一些实施例中，微生物可包含一种或多种使编码PDE1和丁醇生物合成途径的内源性基因的表达消除或降低的修饰。在一些实施例中，微生物可包含一种或多种使磷酸二酯酶和丁醇生物合成途径的活性消除或降低的修饰。在一些实施例中，微生物可包含一种或多种使PDE1和丁醇生物合成途径的活性消除或降低的修饰。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径可以是1-丁醇生物合成途径、2-丁醇生物合成途径、2-丁酮生物合成途径、或异丁醇生物合成途径。
本发明涉及包含本文所提供的微生物的组合物。例如，在一些实施例中，组合物可包含包含了一种或多种改变了cAMP信号转导途径的一种或多种组分的表达和/或活性的修饰的微生物。在一些实施例中，组合物可包含包含了一种或多种改变了一种或多种磷酸二酯酶的表达和/或活性的修饰的微生物。在一些实施例中，组合物可包含包含了一种或多种改变了PDE1的表达和/或活性的修饰的微生物。
在一些实施例中，组合物可包含包含了一种或多种改变了cAMP信号转导途径的一种或多种组分和丁醇生物合成途径的表达和/或活性的修饰的微生物。在一些实施例中，组合物可包含包含了一种或多种改变了一种或多种磷酸二酯酶和丁醇生物合成途径的表达和/或活性的修饰的微生物。在一些实施例中，组合物可包含包含了一种或多种改变了PDE1和丁醇生物合成途径的表达和/或活性的修饰的微生物。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径可以是1-丁醇生物合成途径、2-丁醇生物合成途径、2-丁酮生物合成途径、或异丁醇生物合成途径。
在一些实施例中，所述微生物表现出与亲本细胞相比提高的醇类生产。在一些实施例中，醇类的生产可通过测量被确定，例如测量：液体培养基滴度(每升液体培养基生产的醇类克数)、醇类收率(每克消耗的底物生产的醇类克数)、体积生产能力(每升每小时生产的醇类克数)、特异性生产能力(每克重组细胞生物质每小时生产的醇类克数)、或它们的组合。
本发明还涉及在醇类的发酵中改善和/或维持微生物的细胞生长和细胞活力的方法。在一些实施例中，所述方法包括获得微生物(例如，亲本细胞)并引入使cAMP信号转导途径的一种或多种组分的表达和/或活性改变的修饰。在一些实施例中，所述方法包括获得微生物并引入使编码cAMP信号传导途径的一种或多种组分的一种或多种内源性基因的表达消除或降低的一种或多种修饰。在一些实施例中，所述方法包括获得微生物并引入使编码磷酸二酯酶的一种或多种内源性基因的表达消除或降低的一种或多种修饰。在一些实施例中，所述方法包括获得微生物并引入使编PDE1的内源性基因的表达消除或降低的一种或多种修饰。在一些实施例中，所述方法包括获得微生物并引入使磷酸二酯酶的活性消除或降低的一种或多种修饰。在一些实施例中，所述方法包括获得微生物并引入使PDE1的活性消除或降低的一种或多种修饰。
本发明还涉及通过发酵方法生产醇的方法。在一些实施例中，所述方法包括在其中醇被生产的条件下培养本文所提供的微生物并回收醇类。在一些实施例中，所述醇可以是丁醇。在一些实施例中，所述醇可以是1-丁醇、2-丁醇、2-丁酮、异丁醇、或叔丁醇。
在发酵过程中，微生物污染可以是一个问题。例如，细菌可经由原料被引入发酵过程。由于细菌易于比酵母更快地分裂，这能够导致显著水平的微生物污染。此外，可采用细胞的循环利用以改善发酵工艺的效率。例如，通过将酵母重新引入发酵容器(或发酵罐)中，发酵容器内的酵母浓度被持续维持在高水平，而没有使糖类离开所期望的发酵产物的生产而显著地转向细胞的生长。细胞的循环利用可被用于提高体积转化率。通过从收获的发酵液持续地分离酵母(诸如通过离心)，然后将酵母再循环至发酵罐，能够实现可发酵的糖类至丁醇的体积转化率的提高。然而，由于如此重复地再循环利用酵母，非期望的微生物诸如细菌，也可与酵母一起被再循环。这些微生物污染物能够竞争营养物质，而营养物质的耗竭可抑制酵母细胞的生长。此外，微生物污染物能够抑制酵母的代谢。例如，微生物可产生对细胞活力具有负面影响的代谢物，并可导致发酵产物收率的降低。
对发酵工艺中微生物污染的控制可通过对细胞悬浮液的酸洗涤进行。酸处理的一个目的是消灭不能承受低pH条件的污染性微生物，而基本不降低细胞活力或发酵能力。然而，pH条件的改变能够在微生物中产生胁迫响应，导致细胞生长的抑制和细胞活力的降低。本发明涉及在低pH条件的存在下具有改善的细胞活力的微生物，以及通过发酵工艺生产醇的方法，其中所述方法包括循环利用所述微生物和对微生物悬浮液进行酸洗涤的步骤。例如，所述方法可包括(a)提供微生物，(b)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；(c)收集所述微生物；(d)回收所述醇；(e)使所收集的微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；以及(f)使所述微生物暴露于低pH条件下。在一些实施例中，步骤(c)-(e)可被重复。
经受酸处理和/或细胞循环利用的微生物可能具有细胞活力和生产能力的损失。为了维持微生物的细胞活力和生产能力，可通过添加富含营养物质的培养基并在富含营养物质的培养基中温育微生物一段时间，使所述微生物恢复活力。在恢复活力阶段之后，可通过例如离心收集微生物，并重悬在新鲜的生产培养基中，用于继续发酵。
本发明还涉及使微生物恢复活力以用于醇类发酵的方法。在恢复活力之后，微生物可被再循环至发酵过程中。在一些实施例中，所述方法包括(a)提供微生物，(b)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；(c)收集所述微生物；(d)回收所述醇；(e)使所述微生物与富含营养物质的培养基接触；(f)收集来自步骤(e)的微生物；以及(g)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触。在一些实施例中，步骤(c)-(g)可被重复。在一些实施例中，与碳底物的第一次接触在提取剂的存在下发生。在一些实施例中，提取剂可被包括在，例如，步骤(b)和(g)中。
在一些实施例中，所述方法包括(a)提供微生物，(b)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；(c)收集所述微生物；(d)使所收集的微生物暴露于低pH条件下；(e)收集步骤(d)的微生物；(f)使步骤(e)的微生物与富含营养物质的培养基接触；(g)收集步骤(f)的微生物；以及(h)使步骤(g)的微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；在一些实施例中，步骤(c)-(h)可被重复。在一些实施例中，所述方法还包括回收醇类的步骤。在一些实施例中，与碳底物的第一次接触在提取剂的存在下发生。
除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本专利申请(包括其定义)为准。此外，除非上下文另有所需，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。为所有目的，所有的出版物、专利、以及本文提及的其它参考资料均全文以引用方式并入本文。
为了进一步限定本发明，本文提供了以下术语和定义。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或它们的任何其它变型将被理解为是指包括指定的整数或整数组但不排除任何其它整数或整数组。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而能够包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非另外特别说明，否则“或”是指包含性的或，而不是指排它性的或。例如，以下中任一者均满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。
如本文所用，术语“由1/4组成”、或变型如“由1/4构成”或“包括”，如本说明书和权利要求通篇所使用的，表示任何所列举的整数或整数的组的涵盖，但是没有附加的整数或整数的组可被添加至所指定的方法、结构、或组合物。
如本文所用，如整个说明书和权利要求中所使用的，术语“基本上由...组成”或诸如“基本上由...组成”的不同时态的变型表明包括任何所列举的整数或整数的组，并且任选地包括未在实质上改变指定的方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何所列举的整数或整数的组(参见，例如，M.P.E.P.§2111.03)。
同样，涉及元素或组分实例(即次数)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”为非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施例，而是涵盖如专利申请所述的所有可能的实施例。
如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于产生浓缩物或溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等。术语“约”还包括由于产生自特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施例中，术语“约”指在报告数值的10％范围内，优选在报告数值的5％范围内。
在一些情况下，如本文所用，“生物质”是指产生发酵产物的微生物的细胞生物质，通常以g/L干细胞重量(dcw)的单位提供。
术语“发酵产物”包括所关注的任何所期望的产物，包括但不限于醇类(例如，低级烷基醇)诸如乙醇和丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸、衣康酸、1，3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、异丁酸盐等。
术语“醇”是指能够在发酵过程中由微生物产生的任何醇。醇包括具有1-10个碳原子的任何直链或支化的、饱和或不饱和的醇分子(例如，低级烷基醇)。例如，醇包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、和己醇。
术语“丁醇”是指1-丁醇、2-丁醇、2-丁酮、异丁醇、叔丁醇、或它们的混合物。异丁醇也被称为2-甲基-1-丙醇。
如本文所用，术语“丁醇生物合成途径”是指产生1-丁醇、2-丁醇、2-丁酮、或异丁醇的酶途径。例如，异丁醇生物合成途径在美国专利公开申请公布2007/0092957中公开，该专利以引用方式并入本文。
术语“异丁醇生物合成途径”是指生产异丁醇的酶途径。有时，“异丁醇生物合成途径”与“异丁醇生产途径”同义地被使用。
如本文所用，术语“1-丁醇生物合成途径”是指产生1-丁醇的酶途径。
如本文所用，术语“2-丁醇生物合成途径”是指产生2-丁醇的酶途径。
如本文所用，术语“2-丁酮生物合成途径”是指产生2-丁酮的酶途径。
如本文所用，术语“提取剂”是指可用于从发酵液中提取醇的一种或多种溶剂。在一些实施例中，所述溶剂可以是有机溶剂。
“重组宿主细胞”被定义为经过遗传学操作以表达生物合成生产途径的宿主细胞，其中该宿主细胞以相对于未经修饰的宿主细胞更高的量产生生物合成产物，或产生未经修饰的宿主细胞通常不产生的生物合成产物。术语“重组微生物宿主细胞”可与术语“重组宿主细胞”可互换地使用。
术语“可发酵的碳底物”是指能被微生物代谢的碳源，所述微生物诸如本文所公开的那些。适宜的可发酵的碳底物包括但不限于单糖，诸如葡萄糖或果糖；二糖诸如乳糖或蔗糖；低聚糖；多糖诸如淀粉、纤维素、木质纤维素、或半纤维素；一碳底物；脂肪酸；或它们的组合。
术语“磷酸二酯酶”是指具有催化磷酸二酯键的水解的酶活性的多肽(或多种多肽)。例如，磷酸二酯酶水解环核苷酸，3′-5′-环腺苷单磷酸(cAMP)和3′-5′-环鸟苷单磷酸(cGMP)。所述酶作为EC 3.1.4.17是已知的并且是可用的，例如，来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevistae)(GenBankNo：CAA64139、CAA96968)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)(GenBank ID AABY01000014)、米卡塔酵母(Saccharomyces mikatae)(AABZ01000018、AACH01000636)、库德里阿兹威酵母(Saccharomyceskurdriavzevii)(AACI02000304)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)(AACA01000014)、Vanderwaltozyma polyspora(XM001642700、AAXN01000222、NZ_AAZN01000222)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)(NC012994)。
如本文所用，术语“发酵培养基”是指任何的下列的混合物：水、糖类(可发酵的碳底物)、溶解的固体、悬浮的固体、产生发酵产物的微生物、发酵产物、以及发酵容器中容纳的材料的全部其他组分，在所述发酵容器中，由所存在的微生物通过可发酵的碳底物至发酵产物、水和二氧化碳(CO2)的反应产生发酵产物。有时，如本文所用，术语“发酵液”和“发酵混合物”可与“发酵培养基”同义地使用。
如本文所用，术语“有氧条件”是指存在氧气的生长条件。
如本文所用，术语“微氧条件”是指具有低水平的溶解氧的生长条件。例如，氧气水平可以是小于空气饱和度的约1％。
如本文所用，术语“厌氧条件”是指不存在氧气的生长条件。应当理解，在许多发酵过程中，在过程开始时存在初始量的氧气，但这些氧气随着发酵的进程被耗竭，使得大部分的过程是在可检测的氧气的不存在下进行的。
术语“碳底物”是指能够被本文所公开的微生物代谢的碳源。本文提供了碳底物的非限制性例子，包括但不限于单糖、寡糖、多糖、乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、甘油、二氧化碳、甲醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、右旋糖、以及它们的混合物。
如本文所用，术语“产丁醇菌”和“产异丁醇菌”分别是指能够产生丁醇或异丁醇的微生物。
如本文所用，术语“利用蔗糖的产异丁醇菌”是指能够从蔗糖产生异丁醇的微生物。此类微生物通常是包含工程化的异丁醇生物合成途径的重组微生物。
如本文所用，术语“收率”指以g/g表示的产物量/碳源量。可将收率例示为用葡萄糖作为碳源。应当理解，除非另外指明，将收率表达为理论收率的百分比。对于微生物或代谢途径，将“理论收率”定义为每个底物总量能够产生的产物最大量，所述最大量通过用于制备所述产物的代谢途径的化学计量而决定。例如，一种典型的葡萄糖至异丙醇的转化的理论收率是0.33g/g。如此，29.7g/g的从葡萄糖至异丙醇的收率将被表达为理论收率的90％或90％理论收率。应当理解，虽然在本公开中将收率例示为用葡萄糖作为碳源，本发明能够应用于其他碳源并且所述收率可能取决于使用的碳源而变化。本领域的技术人员能够计算不同碳源的收率。
如本文所用，术语“有效滴度”是指每升发酵培养基通过发酵产生的醇的总量。醇的总量包括：(i)发酵培养基中的醇的量；(ii)从有机提取剂回收的醇的量；以及(iii)如果利用气提，从气相回收的醇的量。
如本文所用，术语“有效速率”是指每小时的发酵每升发酵培养基通过发酵生产的醇的总量。
如本文所用，术语“有效收率”是指发酵期间由本文所述的微生物消耗每单位可发酵的碳底物产生的醇的量。
如本文所用，术语“特异性生产能力”是指细胞的每克干细胞重量每单位时间产生的醇的克数。
术语“衍生物”和“类似物”是指不同于本发明的酶，但保留了它们的基本特性的多肽。术语“衍生物”还可指不同于本发明的宿主细胞，但保留了它们的基本特性的宿主细胞。一般来讲，衍生物和类似物与本发明的酶是总体上非常相似的，并且在许多区是相同的。术语“来源于”、“衍生物”、和“类似物”当指本发明的酶时包括保留了所对应的天然多肽的活性或其催化域的活性的至少一些的任何多肽。
本文所公开的酶的衍生物是经过改变以表现出未见于天然多肽的特征的多肽。衍生物能够通过取代(例如氨基酸取代)、化学的、酶学的、或其他适合的方法被天然存在的氨基酸之外的部分(例如，可检测的部分诸如酶或放射性同位素)共价地修饰。衍生物的例子包括融合蛋白、或基于天然存在的蛋白质序列但已被改变的蛋白质。例如，蛋白质能够通过关于特定氨基酸序列、和/或特定二级、三级、和/或四级结构的知识而被设计。衍生物包括基于对天然的或合成的在先的序列(其随后被任选地修饰，经常但并不一定地赋予一些改善的功能)的知识被修饰的蛋白质。如此，这些序列或蛋白质被称为来源于特定蛋白质或氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，衍生物可保留与该衍生物所“来源于”的序列至少约50％的同一性、至少约60％的同一性、至少约70％的同一性、至少约80％的同一性、至少约90％的同一性、至少约95％的同一性、至少约97％的同一性、或至少约99％的同一性。在本发明的一些实施例中，如果使用分子遗传技术将酶的部分或全部的DNA序列扩增并置于新的宿主细胞内，则该酶被称为来源于天然存在于特定物种中的酶。
多肽和多核苷酸
如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也被称为肽键)线性连接组成的分子。术语“多肽”是指任何两个或更多个氨基酸的链，并且不涉及产物的特定长度。因此，定义“多肽”包括用于指两个或更多个氨基酸的单链或多链的肽、二肽、三肽、低聚肽、“蛋白质、”“氨基酸链、”或任何其他术语，并且术语“多肽”可用于取代任何这些术语或与它们互换使用。一条多肽可来源于天然生物源或由重组技术产生，但不一定是由一条指定的核酸序列翻译的。它可由任何方式生成，包括通过化学合成。用于本发明中的多肽包括全长的多肽和它们的片段。
如本文所用，“降低的活性”或“降低的表达”是指与导致活性或表达的降低的变化之前多肽的相同的生物学活性或表达相比，多肽的已知的生物学活性或表达的任何可测量的降低。此类变化能够包括多肽或编码多肽的多核苷酸的修饰，如本文所述。本文所公开的多肽的降低的活性或表达能够通过本领域所熟知的和本文所公开的方法测定。
如本文所用，“被除去的活性”或“被除去的表达”是指与导致活性或表达的除去的变化之前多肽的相同的生物学活性或表达相比，多肽的已知的生物学活性或表达的除去。此类变化能够包括多肽或编码多肽的多核苷酸的修饰，如本文所述。被除去的活性或表达包括与导致活性或表达的除去的变化之前多肽的相同的生物学活性或表达相比，不可测量的多肽的生物学活性或表达。本文所公开的多肽的被除去的活性或表达能够通过本领域所熟知的和本文所公开的方法测定。
如本文所用，“升高的活性”或“升高的表达”是指与导致活性或表达的升高的变化之前多肽的相同的生物学活性或表达相比，多肽的已知的生物学活性或表达的任何可测量的升高。此类变化能够包括多肽或编码多肽的多核苷酸的修饰，如本文所述。本文所公开的多肽的升高的活性或表达能够通过本领域所熟知的和本文所公开的方法测定。
“分离的”多肽或其片段、变体、或衍生物，是指不在其天然环境下的多肽。不需要特别的纯化水平。例如，分离的多肽能够从它原生的或天然的环境中去除。为了本发明的目的，在宿主细胞中重组产生的多肽和表达的蛋白质被认为是分离的，即为天然的或重组的多肽，其已通过任何适合的技术被分离、分馏、或部分地或充分地纯化。
本发明的多肽可具有约10；20；25；50；75；100；200；500；1,000；2,000；或更多个氨基酸的大小。多肽可具有限定的三维结构，但是它们不一定具有此类结构。具有限定的三维结构的多肽称为折叠多肽，并且不具有限定三维结构，而是可能采用多种不同构象的多肽称为非折叠多肽。
本发明的多肽也包括前述多肽的衍生物、类似物、或变体，以及它们的任何组合。术语“活性变体”、“活性片段”、“活性衍生物”、和“类似物”是指本发明的多肽。本发明多肽的变体包括具有由于氨基酸的取代、缺失和/或插入导致的修改的氨基酸序列的多肽。变体可为天然存在的或非天然存在的。非天然存在的变体可使用本领域已知的诱变技术产生。变体多肽可包含保守的或非保守的氨基酸取代、缺失、和/或添加。本发明多肽的衍生物可以是经过修改以表现出天然多肽不存在的附加特性的多肽。例子包括融合蛋白。变体多肽本文也可称为“多肽类似物。如本文所用，多肽的“衍生物”指具有一个或多个通过功能侧基反应化学衍生化的残基的目的多肽。“衍生物”也包括包含一个或多个天然存在的氨基酸(二十个标准氨基酸)衍生物的那些肽。例如，可将4-羟脯氨酸取代成脯氨酸；可将5-羟赖氨酸取代成赖氨酸；可将3-甲基组氨酸取代成组氨酸；可将高丝氨酸取代成丝氨酸；并且可将鸟氨酸取代成赖氨酸。
“片段”是本发明中所用的多肽或其他酶的独特部分，其与亲本全长序列相比序列相同但长度更短。片段可包含至多减去一个氨基酸残基的全长指定序列。例如，片段可包含约5个至约1000个连续的氨基酸残基。片段的长度可以是至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少75个、至少100个、至少150个、至少250、或至少500个连续的氨基酸残基。片段可优选选自分子的某些区。例如，多肽片段可包含某一长度的连续的氨基酸，其选自多肽前100个或200个氨基酸，如某些限定序列所示。清楚地是，这些长度是示例性的，并且本实施例包括由本说明书(包括序列表、表和图)支持的任何长度。
作为另外一种选择，编码这些相同或相似多肽的重组变体可通过利用基因编码中的“冗余”来合成或选择。可将多个密码子取代诸如产生多个限制性位点的沉默改变引入，以将克隆优化到质粒或病毒载体中或在宿主细胞体系中表达。
氨基酸“取代”可以是一个氨基酸替换为另一个具有相似结构和/或化学性质的氨基酸的结果，即，保守的氨基酸替换，或者可以是一个氨基酸替换为另一个具有不同结构和/或化学性质的氨基酸的结果，即，非保守的氨基酸替换。“保守”氨基酸取代可基于所涉及的残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质上的相似性进行。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；而带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。作为另外一种选择，“非保守的”氨基酸取代可以通过选择任何这些氨基酸在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两亲性性质方面的差异实现。“插入”或“缺失”可以在约1个至约20个氨基酸的范围内，更优选地在约1个至约10个氨基酸的范围内。通过系统地利用重组DNA技术产生多肽分子中的氨基酸的插入、缺失、或取代，并检测所得重组变体的活性，可以以实验方法确定所允许的变型。
如本文所用，术语“变体”(关于多肽)是指使用例如重组DNA技术诸如诱变生成的，通过氨基酸插入、缺失、突变、和取代而与本发明专门列举的多肽不同的多肽。通过将特定多肽的序列与同源的多肽(例如酵母或细菌的)的序列进行比较，并使高度同源区(保守区)中进行的氨基酸序列改变的数量最小化，或通过用共有序列代替氨基酸，可以发现用以确定哪些氨基酸残基可以被替代、添加、或缺失而不会破坏所关注的活性的指导。
具有与本发明的查询氨基酸序列至少有例如95％“同一性”的氨基酸或多肽序列的多肽指受试多肽的氨基酸序列与查询序列相同，不同的是受试多肽序列每100个查询氨基酸序列的氨基酸可包括至多五个氨基酸改变。换句话讲，为了获得具有与查询氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，受试序列中至多5％的氨基酸残基可被插入、缺失、或被另一个氨基酸取代。参考序列的这些改变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，或者发生在那些末端位置间的任何位置，散布在参考序列残基中的单个位置上或者在参考系列内的一个或多个邻接基团上。
实际上，可使用已知的计算机程序常规地测定是否任何特定的多肽与参考多肽为至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的。用于确定查询序列(例如，本发明的序列)与目的序列间的最佳总体匹配的优选方法(也称为全局序列比对)，可使用基于Brutlag等人(Comp.Appl.Biosci.6：237-245，1990)的FASTDB计算机程序确定。在序列比对中，查询和目的序列都是核苷酸序列或者都是氨基酸序列。所述全局序列比对的结果是百分比同一性。FASTDB氨基酸比对中使用的优选参数为：Matrix＝PAM0，k-tuple＝2，Mismatch Penalty＝1，Joining Penalty＝20，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Window Size＝序列长度，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty-0.05，Window Size＝500或者受试氨基酸序列的长度，取任何一个更短的。
如果由于N-或C-末端的缺失而不是由于内部缺失导致受试序列比查询序列更短，必须对结果进行人工修正。这是因为FASTDB程序当计算全局百分比同一性时不截短受试序列的N-末端和C-末端。对于相对于查询序列在N-末端和C-末端截短的受试序列，通过计算为受试序列的N-末端和C-末端的查询序列残基的数目来修正百分比同一性，上述残基不与对应的受试序列残基匹配/对齐，将它们计算为占查询序列总碱基的百分比。通过FASTDB序列比对的结果测定是否残基是匹配的/对齐的。然后从百分比同一性中减去通过上述FASTDB程序使用特定参数计算出的这个百分比以得到最终的百分比同一性评分。将这个最终的百分比同一性评分用于本发明的目的。仅认为不与查询序列匹配/对齐的受试序列的N-末端和C-末端残基适用于人工调节百分比同一性评分。即，仅有的在受试序列最远的N-末端和C-末端残基之外的查询残基位置。
例如，将90个氨基酸残基的受试序列与100个残基的查询序列进行比对以确定百分比同一性。缺失发生在受试序列的N-末端并且因此FASTDB比对不显示N-末端前10个残基的匹配/对齐。所述10个未配对的残基占序列的10％(在N-末端和C-末端未匹配的残基数目/查询序列中的残基总数)，因此从通过FASTDB程序计算的百分比同一性评分中减去10％。如果剩余的90个残基是完全匹配的，所述最终百分比同一性将为90％。在另一个实例中，90个残基的受试序列与100个残基的查询序列进行比较。这时所述缺失为内部缺失，因此在不与查询序列匹配/对齐的受试序列的N-末端或C-末端无残基。在这种情况下，不对通过FASTDB计算出的百分比同一性进行人工修正。再次，如FASTDB比对所示，仅有在受试序列N-末端和C-末端残基之外的残基位置不与查询序列匹配/对齐，它们被人工修正。出于本发明的目的，不进行其他的人工修正。
适用于本发明的多肽和其他酶及其片段由多核苷酸编码。术语“多核苷酸”旨在涵盖单个核酸以及多个核酸，并且指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病毒来源的RNA、或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(如酰胺键，诸如存在于肽核酸(PNA)中的酰胺键)。多核苷酸可包含全长cDNA序列的核苷酸序列，或其片段，包括非翻译的5′和3′序列以及编码序列。所述多核苷酸能够由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，其可为非改性的RNA或DNA，或改性的RNA或DNA。例如，多核苷酸可以由以下组成：单链和双链DNA、为单链和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA、和为单链和双链区的混合物的RNA、包含DNA和RNA的杂合分子(其可为单链的或，更典型地为双链的、或为单链和双链区的混合物)。“多核苷酸”涵盖了化学地、酶促地、或代谢地改性的形式。
术语“核酸”指任何一个或多个核酸片段，例如DNA或RNA片段，它们存在于多核苷酸中。如本发明所述的多核苷酸还包括合成产生的此类分子。本发明的多核苷酸可为宿主细胞天然具有的或异源的。此外，多核苷酸或核酸可为或可包含调控因子诸如启动子、核糖体结合位点、或转录终止子。
在某些实施例中，所述多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包括编码多肽的核酸的多核苷酸通常可包括启动子和/或其他转录或翻译调控因子，它们可操作地结合一个或多个编码区。可操作地结合是基因产物例如多肽的编码区与一个或多个调控序列以将基因产物的表达置于调控序列的影响或控制下的方式结合。两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)，如果启动子功能的诱导导致编码期望基因产物的mRNA转录并且如果两个DNA片段间的键本质不干扰表达调控序列引导基因产物表达的能力或干扰DNA模板被转录的能力，它们是“可操作地结合的”。因此，如果启动子能够影响核酸的转录，该启动子区将与编码多肽的核酸可操作地结合。除启动子之外的其他转录调控因子例如增强子、操纵子、阻遏蛋白和转录终止信号也能够与所述多核苷酸可操作地结合。适合的启动子和其他转录控制区描述于本文中，并且是本领域中为人们所熟知的。
多核苷酸序列能够被称为是“分离的”，它被从其天然的环境中移除出来。例如，出于本发明的目的，包含在载体中的编码具有酶活性(例如将底物转化成木酮糖的能力)的多肽或多肽片段的异源性多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的另一个例子包括异源宿主细胞拥有的重组多核苷酸或溶液中的纯化的(部分地或基本上)多核苷酸。根据本发明分离的多核苷酸或核酸还包括此类人工合成生产的分子。DNA聚合物形式的分离的多核苷酸片段可以由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
术语“基因”指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调控序列(5′非编码序列)和编码序列后的调控序列(3′非编码序列)。
如本文所用，“编码区”或“ORF”是核酸的一部分，其由翻译成氨基酸的密码子组成。虽然“终止密码子”(TAG、TGA、或TAA)不翻译成氨基酸，如果存在的话，可认为它是编码区的一部分，但是任何侧接序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5′和3′非翻译区等，不是编码区的一部分。“合适的调控序列”是指位于编码序列上游″(5′非编码序列)、中间、或下游(3′非编码序列)并影响相关的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
多种翻译调控因子是本领域的普通技术人员已知的。这些因子包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子、以及来源于病毒体系的因子(尤其是内部核糖体进入位点或IRES)。在其它实施例中，本发明的多核苷酸是RNA，例如信使RNA(mRNA)形式的RNA。本发明的RNA可以是单链的或双链的。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌肽或信号肽的附加编码区相关联，它们引导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。
如本文所用，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物体的基因组内，导致基因稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物体被称为“重组”或“转化”生物体。
如本文所用，术语“表达”指来源于本发明核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
如本文所用，术语“过表达″是指在宿主细胞中核酸或蛋白水平的增加。因此，可通过增加宿主细胞中内源性的序列的转录或翻译水平、或在宿主细胞中导入异源的序列导致过表达。也可通过增加核酸或蛋白序列的稳定性导致过表达。
术语“质粒”、“载体”和“盒”指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外因子，并且常常是环状双链DNA片段的形式。此类因子可以是线性或环状的、单链或双链DNA或RNA的、来源于任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已被接合或重组为能够将针对所选择的基因产物的启动子片段和DNA序列与适当的3′非翻译序列一起导入细胞中的独特构造。“转化盒”指含有外来基因并且除了该外来基因外还具有有利于特定宿主细胞转化的因子的特定载体。“表达盒”指包含外来基因并且除了该外来基因外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的因子的特定载体。
术语“人工的”指合成的、或非宿主细胞来源的组合物，例如化学合成的寡核苷酸。
术语“天然的”是指多核苷酸、基因或多肽的形式与天然存在的一样，带有其自身的调控序列(如果存在调控序列)。
术语“内源性的”当用于指多核苷酸、基因、或多肽时是指在生物体基因组中处于其天然位置的天然多核苷酸或基因，或者对于天然多肽，从基因组中的该位置被转录和翻译。
术语“异源性的”当用于指多核苷酸、基因、或多肽时是指通常不存在于宿主生物体中的多核苷酸、基因、或多肽。“异源性多核苷酸”包含天然编码区、或其部分，所述异源性多核苷酸以不同于对应的天然多核苷酸的形式被重新导入源生物体中。“异源性基因”包括天然编码区、或其部分，所述异源性基因以不同于对应的天然基因的形式被重新导入源生物体中，例如，不在所述生物体基因组中的天然位置上。例如，异源性基因可包括天然编码区，所述天然编码区为包括非天然的调控区的嵌合基因的一部分，所述异源性基因被重新导入天然宿主中。“转基因”是已通过转化方法被引入基因组中的基因。“异源性多肽”包括天然多肽，所述异源性多肽以不同于对应的天然多肽的形式被重新导入源生物体中。所述异源性多核苷酸或基因可通过例如基因转移的方式被导入宿主生物体。
如本文所用，术语“修饰”是指本文公开的导致所述多核苷酸编码的多肽活性改变的多核苷酸的变化，以及本文公开的导致多肽活性改变的多肽的变化。此类改变能够通过本领域熟知的方法实现，包括但不限于缺失、突变(例如，自发突变、随机诱变、由增变基因导致的诱变、或转座子诱变)、取代、插入、改变细胞定位、改变多核苷酸或多肽的状态(例如，甲基化、磷酸化或泛素化)、移除辅因子、化学修饰、共价修饰、用UV或X-射线照射、同源重组、有丝分裂重组、启动子置换法、和/或它们的组合。通过将特定多核苷酸或多肽的序列与同源的多核苷酸或多肽(例如酵母或细菌的)的序列进行比较，并使高度同源区(保守区)或共有序列中进行的修饰的数量最大化，可发现用以确定哪些核苷酸或氨基酸残基能够被修饰的指导。
如本文所用，术语“变体”(关于多核苷酸)是指使用例如重组DNA技术诸如诱变生成的，通过核苷酸的插入、缺失、突变、和取代而与本发明专门列举的多核苷酸不同的多核苷酸。编码相同或相似的多肽的重组多核苷酸变体可以被合成，或通过利用遗传密码中的“冗余”进行选择。可将各种密码子取代诸如产生各种限制性位点的沉默改变引入，以将克隆优化到质粒或病毒载体中以供表达。多核苷酸序列的多种突变可体现在所述多肽或添加到所述多肽的其它肽的结构域中以改变多肽中任意部分的性质。
术语“重组基因表达因子”是指表达一种或多种特异性蛋白质的核酸片段，包括针对所述蛋白质的编码序列前的调控序列(5′非编码序列)和针对所述蛋白质的编码序列后的调控序列(3′终止序列)。嵌合基因是重组基因表达因子。操纵子的编码区可以与可操作地连接的启动子和终止区一起形成重组基因表达因子。
“调控序列”是指位于编码序列上游(5′非编码序列)、内部、或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，并且能影响相关的编码序列的转录、RNA加工或RNA稳定性、或翻译。调控序列可包括启动子、增强子、操作子、抑制子、转录终止信号、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的核酸序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个来源于天然基因、或者可由来源于天然存在的不同启动子的不同因子组成、或者甚至包含合成的核酸片段。本领域的技术人员已知，不同的启动子可指导基因在不同的组织或细胞类型中、在不同的发育阶段、或响应于不同的环境或生理条件的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因被表达的启动子称为“组成型启动子”。在另一方面，“诱导型启动子”导致基因在该启动子被诱导或被启动子特异性的信号或分子开启时被表达。还应认识到因为在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。例如，应当理解，“FBA1启动子”能够被用于指来源于FBA1基因的启动子区的片段。
如本文所用，术语“终止子”是指位于编码序列下游的DNA序列。这包括聚腺苷酸化识别序列以及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。聚腺苷酸化信号的特征通常在于影响聚腺苷酸片段向mRNA前体的3’端的添加。所述3’区能够影响相关的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。已经认识到，由于大多数情况下调控序列的确切界限还未被彻底地界定，不同长度的DNA片段可具有相同的终止子活性。例如，应当理解，“CYC1终止子”能够被用于指来源于CYC1基因的终止子区的片段。
术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。
如本文所用，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物体的基因组内，导致基因稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物体被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。
如术语“密码子优化的”是指用于各种宿主转化的核酸分子的基因或编码区，则它是指在核酸分子的基因或编码区中的密码子改变，以反映在没有改变由DNA编码的多肽情况下宿主生物体典型的密码子使用情况。此类优化包括将至少一个、或多于一个、或显著的数目的密码子替换为在那种生物体中使用频率更高的一个或多个密码子。
包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的偏差，允许编码该基因的序列中的变型。由于每一密码子由三个核苷酸组成，而构成DNA的核苷酸限于四种特异性碱基，存在64种可能的核苷酸组合，其中的61种编码氨基酸(其余三种密码子编码结束翻译的信号)。显示了哪些密码子编码哪些氨基酸的“遗传密码”在本文中被重制为表1(即，标准遗传密码)。因此，许多氨基酸被分配了多于一种的密码子。例如，氨基酸，丙氨酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由六种三联体编码，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组成在宽范围内变化而不会改变由该DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。
表1
对于使用特定密码子来编码特定氨基酸向延伸中的肽链中的插入，许多生物体表现出偏好。密码子偏爱性或密码子偏好性、生物间的密码子使用的差异由遗传密码的简并性引起，并且在许多生物体中是有大量文献证明了的。密码子偏好性常与信使RNA(mRNA)的翻译效率有关，这继而据信取决于特别是被翻译的密码子的特性和特定转运RNA(tRNA)分子的可用性。所选择的tRNA在细胞中的优势一般而言反映了在肽的合成中最经常使用的密码子。相应地，可基于密码子优化对基因进行加工，以使基因在给定生物中的表达最优化。
考虑到对于多种多样的动物、植物和微生物物种可用的大量的基因序列，计算密码子使用的相对频率是可能的。密码子使用表是易得的，例如在http://www.kazusa.or.jp/codon/提供的“密码子使用数据库”，并且这些表格能够在许多方面被调整(参见，例如，Nakamura，等人Nucl.Acids Res.28：292，2000)。从GenBank Release128.0[2002年2月15日]计算的针对酵母的密码子使用表被重制为下文的表2(针对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因的密码子使用表)。该表使用mRNA命名，因此，该表使用存在于RNA中的尿嘧啶(U)，而不是存在于DNA中的胸腺嘧啶(T)。表2经过了调整，因此计算了每个氨基酸的频率，而非全部64个密码子。
表2
通过利用该表或类似的表，本领域的普通技术人员能够将这些频率应用于任何给定的多肽序列，并产生密码子优化的编码所述多肽的编码区的核酸片段，但其使用针对给定的物种优化的密码子。
以优化的频率随机分配密码子来编码给定的多肽序列，能够通过计算每种氨基酸的密码子频率，然后随机地为多肽序列分配密码子而人工地实现。此外，多种算法和计算机软件程序是本领域的普通技术人员容易获得的。例如，可得自DNASTAR，Inc.，(Madison，WI)的软件包中的“EditSeq”功能，可得自InforMax，Inc.，(Bethesda，MD)的套件中的backtranslation功能，和可得自Inc.，(San Diego，CA)的GCG-Wisconsin软件包中的“backtranslate”功能。此外，用以对编码区序列进行密码子优化的多种资源是可公开获得的，例如，在http://www.entelechon.com/bioinformatics/backtranslation.php？lang＝eng(Entelechon GmbH，Bad Abbach，Germany)的“backtranslation”功能和在http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/backtranseq可用的“backtranseq”功能。基于给定的频率构建基本的算法以分配密码子也能够由本领域的普通技术人员用基本的数学函数实现。
经密码子优化的编码区能够通过本领域的技术人员已知的多种方法设计，包括诸如http://www.umbc.edu/codon/sgd/(University of Maryland，Baltimore County，Baltimore，MD)的“synthetic gene designer”的软件包。
当在合适的温度和溶液离子强度的条件下，单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，多核苷酸或核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，诸如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交和洗涤条件为人们所熟知，示例参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)，尤其是在该文献第11章和表11.1中进行了例示。温度和离子强度的条件确定了杂交的“严格性”。可调节严格性条件以筛选中度相似的片段(诸如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(诸如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤确定严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC、0.5％SDS在室温下洗涤15分钟，然后用2X SSC、0.5％SDS在45℃下重复30分钟，再用0.2X SSC、0.5％SDS在50℃下重复洗涤两次，每次30分钟。更优选的一组严格条件采用更高的温度，其中洗涤与上述洗涤相同，不同的是最后两次在0.23SSC、0.5％SDS中洗涤30分钟时的温度被升高到60℃。另一组优选的高度严格条件是最后两次洗涤是在65℃用0.13SSC、0.1％SDS进行。例如，另一组严格条件包括在0.1X SSC、0.1％SDS中在65℃杂交并用2X SSC、0.1％SDS洗涤，随后用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤。
杂交需要两种核酸含有互补序列，但取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补的程度，它们为本领域熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的公式(参见，例如，Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更为重要，并且寡核苷酸的长度确定其特异性(参见，例如，Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个实施例中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸；更优选至少约20个核苷酸；并且最优选长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”是指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定而鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410，1993)的算法通过计算机自动化的序列比较和鉴定完成。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有十个或更多连续的氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个连续的核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(例如Southern杂交)和基因分离(例如细菌菌落或噬斑的原位杂交)的方法中。此外，12-15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”包含的序列足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书教导了编码特定蛋白质的完整氨基酸和核苷酸序列。具有如本文报道序列的有益效果，技术人员现在可使用全部公布序列或它们的主要部分用于本领域技术人员已知的目的。相应地，本发明包括如本文所提供的完全序列，以及那些上述序列的基本部分。
术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
如本领域所已知的，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较而确定。本领域中“同一性”也意为多肽或多核苷酸序列之间的序列关联度，视情况而定，如由此类序列字符串的匹配来测定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于下列文献中所公开的那些：Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)Oxford University：NY(1988)；Biocomputing：Informatics and GenomeProjects(Smith，D.W.编辑)Academic：NY(1993)；Computer Analystsof Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humania：NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.编辑)Academic(1987)；和Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)Stockton：NY(1991)。
设计确定同一性的优选方法来给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中被编成了代码。序列比对和百分比同一性计算可以用生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)中的MegAlignTM程序进行。序列的多重比对可使用“Clustal比对方法”进行，该方法涵盖若干个不同的算法，包括对应于被称为Clustal V的比对方法的“Clustal V比对方法”(公开于Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153，1989；Higgins等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191，1992)并且可以在生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)中的MegAlignTM程序中找到。对于多重比对，默认值对应于GAP PENALTY＝10并且GAP LENGTHPENALTY＝10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5、以及DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，GAPPENALTY＝5，WINDOW＝4、以及DIAGONALS SAVED＝4。在用ClustalV程序进行序列比对后，有可能通过观察相同程序中的序列距离表来获得百分比同一性。此外，也可以使用“Clustal W比对方法”，该方法对应于称为Clustal W的比对方法(描述于Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153，1989；Higgins等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191，1992)并且可以在生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)中的MegAlignTM v6.1程序中找到。用于多重比对的默认参数可以是GAPPENALTY＝10、GAP LENGTH PENALTY＝0.2、Delay Divergen Seqs(％)＝30、DNA Transition Weight＝0.5、Protein Weight Matrix＝Gonnet系列、DNA Weight Matrix＝IUB。在使用Clustal W程序对序列进行比对之后，有可能通过查看同一程序中的序列距离表来获得百分比同一性。
术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。序列分析软件可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件可包括但不限于：GCG程序包(Wisconsin Package版本9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul，等人J.Mol.Biol.215：403-410，1990)；DNASTAR(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)；Sequencher(Gene CodesCorporation，Ann Arbor，MI)；和结合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date1992，111-20.编辑：Suhai，Sandor，Plenum：New York，NY)。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，除非另外指明，否则分析结果将基于所参考程序的默认值。在此所用的“默认值”是指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
具有与本发明的参考核苷酸序列至少，例如，95％相同的核苷酸序列的核酸或多核苷酸是指多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，不同的是该多核苷酸序列每100个参考核苷酸序列的核苷酸可包括至多五个点突变。换句话讲，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可被删除或被另一个核苷酸取代，或者可将占参考序列至多5％的总核苷酸的多个核苷酸插入参考序列中。
实际上，可使用已知的计算机程序常规地测定是否任何特定的核酸分子或多肽与本发明的核苷酸序列或多肽序列为至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的。用于确定查询序列(例如，本发明的序列)与目的序列间的最佳总体匹配的优选方法(也称为全局序列比对)，可使用基于Brutlag等人(Comp.Appl.Biosci.6：237-245，1990)的算法的FASTDB计算机程序确定。在一个序列比对中，查询和目的序列都是DNA序列。通过将尿嘧啶(U)转换为胸腺嘧啶(T)，能够对RNA序列进行比较。所述全局序列比对的结果是百分比同一性。在用于计算百分比同一性的DNA序列的FASTDB比对中使用的优选参数是：Matrix＝Unitary，k-tuple＝4，Mismatch Penalty＝1，Joining Penalty-30，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Gap Penalty＝5，Gap SizePenalty＝0.05，Window Size＝500或者受试核苷酸序列的长度，取任何一个更短的。
如果因为5′或3′末端的缺失而不是由于内部缺失导致受试序列比查询序列更短，必须对结果进行人工修正。这是因为FASTDB程序当计算百分比同一性时不截短受试序列的5′和3′末端。对于相对于查询序列在5′末端和3′末端截短的受试序列，通过计算为受试序列的5′末端和3′末端的查询序列碱基的数目来修正百分比同一性，上述碱基不是匹配的/对齐的，将它们计算为占查询序列总碱基的百分比。通过FASTDB序列比对的结果测定是否核苷酸是匹配的/对齐的。然后从百分比同一性中减去通过上述FASTDB程序使用特定参数计算出的这个百分比以得到最终的百分比同一性评分。将这个修正评分用于本发明的目的。如FASTDB比对所示，仅有在受试序列5′-末端和3′-末端碱基之外的碱基不与查询序列匹配/对齐，将它们进行计算以人工调节百分比同一性评分。
例如，90个碱基的受试序列与100个碱基的查询序列进行比对以确定百分比同一性。缺失发生在受试序列的5′末端并且因此FASTDB比对不显示5′末端前10个碱基的匹配/对齐。所述10个未配对的碱基占序列的10％(在5′末端和3′末端未匹配的碱基数目/查询序列中的碱基总数)，因此从通过FASTDB程序计算的百分比同一性评分中减去10％。如果剩余的90个碱基是完全匹配的，所述最终百分比同一性将为90％。在另一个实例中，将90个碱基的受试序列与100个碱基的查询序列进行比较。这时所述缺失为内部缺失，使得在不与查询序列匹配/对齐的受试序列的5′或3′上没有碱基。在这种情况下，不对通过FASTDB计算出的百分比同一性进行人工修正。再次，仅人工修正不与查询序列匹配/对齐的受试序列的5′和3′碱基。出于本发明的目的，不进行其他的人工修正。
本文使用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且被描述于例如下列的文献中：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)；和Silhavy，T.J.、Bennan，M.L.、和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.，等人Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版(1987)。另外的方法描述于Methods in Enzymology，第194卷，Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology(部分A，2004，Christine Guthrie和Gerald R.Fink(编辑)，Elsevier Academic Press，SanDiego，CA)中。
用于增加或减少靶基因的基因表达的方法是本领域技术人员熟知的。酵母中基因表达的方法是本领域已知的，例如Methods in Enzymology，第194卷，Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology(部分A，2004，Christine Guthrie和Gerald R.Fink(编辑)，Elsevier Academic Press，San Diego，Calif.)中所描述的。用于增加表达的方法包括增加整合在表达靶蛋白的基因组中或质粒上的基因数，和使用比天然启动子的表达更高表达的启动子。可操作地连接到所构建的用于表达的嵌合基因中的启动子包括，例如，组成型启动子如FBA1、TDH3、ADH1、和GPM1，以及诱导型启动子如GAL1、GAL10、和CUP1。可在用于表达的嵌合基因构建体中使用的适宜的转录终止子包括但不限于FBA1t、TDH3t、GPM1t、ERG10t、GAL1t、CYC1t和ADH1t。
适宜的启动子、转录终止子、和编码区可被克隆到大肠杆菌(E.coli)-酵母穿梭载体中并转化到酵母细胞中。这些载体既可在大肠杆菌菌株中增殖也可在酵母菌株中增殖。载体通常包含选择性标记和允许在目标宿主中自主复制或染色体整合的序列。例如，用于酵母中的质粒是穿梭载体pRS423、pRS424、pRS425和pRS4269American Type CultureCollection(Rockville，MD))，它们包含大肠杆菌(E.coli)复制起点(例如，pMB1)、酵母2μ复制起点，以及用于营养选择的标记。这四种载体的选择性标记是HIS3(载体pRS423)、TRP1(载体pRS424)、LEU2(载体pRS425)和URA3(载体pRS426)。表达载体的构建，既可以通过大肠杆菌(E.coli)中标准的分子克隆技术进行，也可以通过酵母中的缺口修复重组方法进行。
用于降低表达的方法包括对编码基因进行基因修饰。对靶基因进行基因修饰以降低或除去表达的许多方法是本领域的技术人员已知的，并且可被用于构建生产宿主细胞诸如酵母。可被使用的修饰包括但不限于：编码蛋白质的整个基因或所述基因的一部分的缺失；向编码基因中(例如，在启动子或编码区)插入DNA片段使得蛋白质不被表达或以较低水平表达；向编码区中引入突变，突变的引入导致终止密码子的加入或移框，使得功能性蛋白质不被表达；以及向编码区中引入一个或多个突变以改变氨基酸，使得无功能的或活性较低的蛋白质被表达。此外，可通过表达反义RNA或干涉RNA从而阻止靶基因的表达，并且可引入导致共抑制的构建体。此外，转录物的合成或稳定性可通过突变被降低。类似地，从mRNA翻译为蛋白质的效率也可通过突变受到调控。全部这些方法均可由本领域的技术人员使用已知的或鉴定的编码靶蛋白的序列容易地实施。
靶编码序列周围的DNA序列在一些修饰方法中也是有用的。具体而言，围绕例如靶基因编码序列的DNA序列，对利用同源重组的修饰方法是有用的。在这样的方法中，靶基因侧接序列被置于选择性标记基因的边界处，以介导同源重组，从而使所述标记基因置换靶基因。同样，部分的靶基因序列和位于选择性标记基因边界处的靶基因侧接序列可被用于介导同源重组，从而使所述标记基因置换所述靶基因的一部分。此外，所述选择性标记可以被位点特异性重组位点限定边界，使得在对应的位点特异性重组酶表达之后，抗性基因被从靶基因处切除，而不会使后者再活化。位点特异性的重组留下重组位点，其破坏了靶蛋白的表达。也可以构建同源重组载体以在切除所述选择性标记后在靶基因中留下缺失，如本领域的技术人员所熟知的。
缺失可以利用有丝分裂重组产生，如Wach等人(Yeast 10：1793-1808，1994)所述。该方法涉及制备包含介于可短至20bp的基因组区之间的选择性标记的DNA片段，并且其与靶DNA序列结合。这种DNA片段可通过对所述选择性标记基因的PCR扩增制备，扩增采用与所述标记基因末端杂交的寡核苷酸作为引物并且包含能与酵母基因组重组的基因组区。线性DNA片段能够被有效地转入酵母中并与基因组重组，导致基因置换，包括伴随着靶基因序列的缺失的置换(如Methods in Enzymology，第194卷，第281-301页，1991中所述)。
此外，启动子置换方法可被用于交换内源转录调控因子，这允许了调控表达的其他途径(参见，例如，Mnaimneh等人，Cell118：31-44，2004)。
此外，编码活性的靶基因可通过随机诱变被破坏，随机诱变之后通过筛选鉴定出具有降低的活性的菌株。使用这种类型的方法，靶基因编码区或影响活性的任何其他基因组区的DNA序列不必是已知的。用于产生基因突变的方法是本领域中通用的和已知的，并可被用于制备突变体的应用中。常用的随机基因修饰方法(综述于Methods in Yeast Genetics，2005，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)包括自发突变、增变基因导致的突变、化学诱变、UV或X-射线照射、或转座子诱变。
酵母的化学诱变通常涉及用下列DNA诱变剂之一处理酵母细胞：甲磺酸乙酯(EMS)、亚硝酸、硫酸二乙酯、或N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基-胍(MNNG)。Spencer等人已综述了这些方法(Mutagenesis in Yeast，1996，Yeast Protocols：Methods in Cell and Molecular Biology.Humana Press，Totowa，N.J.)。采用EMS的化学诱变可如Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.中所述进行。采用紫外(UV)光或X-射线的照射也能够被用于在酵母细胞中产生随机诱变。通过UV照射的诱变的主要效应是会破坏DNA复制保真性的嘧啶二聚体的形成。酵母UV-诱变的规程可见于Spencer等人(Mutagenesis inYeast，1996，Yeast Protocols：Methods in Cell and Molecular Biology.Humana Press，Totowa，N.J.)。增变表型的引入也可被用于在酵母中产生随机的染色体突变。常用的增变表型可通过对下列基因中的一个或多个的破坏而获得：PMS1、MAG1、RAD18、或RAD51。非增变表型的恢复可通过插入野生型等位基因容易地实现。可以对从任何上述这些或其他已知的随机诱变方法产生的经修饰的细胞的集合针对降低的活性进行筛选。
磷酸二酯酶的修饰
在本发明的一些实施例中，微生物可包含被降低的或被除去的磷酸二酯酶活性。在一些实施例中，所述微生物还可包含异丁醇生物合成途径、1-丁醇生物合成途径、2-丁醇生物合成途径、或2-丁酮生物合成途径，如本文另外描述的。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(c)2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；(d)2-酮异戊酸至异丁醛；以及(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶活性、酮酸还原异构酶活性、二羟酸脱水酶活性、酮异戊酸脱羧酶活性、和醇脱氢酶活性。
在一些实施例中，所述微生物可包含1-丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述1-丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：(a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA的转化；(b)乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酰-CoA的转化；(c)3-羟丁酰-CoA至丁烯酰-CoA的转化；(d)丁烯酰-CoA至丁酰-CoA的转化；(e)丁酰-CoA至丁醛的转化；以及(f)丁醛至1-丁醇。在一些实施例中，所述1-丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰-CoA乙酰转移酶活性；3-羟丁酰-CoA脱氢酶活性；巴豆酸酶活性；丁酰-CoA脱氢酶活性；丁醛脱氢酶活性、和/或丁醇脱氢酶活性。
在一些实施例中，所述微生物可包含2-丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述2-丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至α-乙酰乳酸的转化；(b)α-乙酰乳酸至乙偶姻的转化；(c)乙偶姻至3-氨基-2-丁醇；(d)3-氨基-2-丁醇至磷酸-3-氨基-2-丁醇；(e)磷酸-3-氨基-2-丁醇至2-丁酮；以及(f)-丁酮至2-丁醇。在一些实施例中，所述2-丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶活性；乙酰乳酸脱羧酶活性；乙偶姻胺化酶活性；氨基丁醇激酶活性；磷酸氨基丁醇磷酸化酶活性；和/或丁醇脱氢酶活性。
在一些实施例中，所述2-丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至α-乙酰乳酸的转化；(b)α-乙酰乳酸至乙偶姻的转化；(c)乙偶姻至2，3-丁二醇的转化；(d)2，3-丁二醇至2-丁酮的转化；以及(e)2-丁酮至2-丁醇。在一些实施例中，所述2-丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶活性；乙酰乳酸脱羧酶活性；丁二醇脱氢酶活性；丁二醇脱水酶活性；和/或丁醇脱氢酶活性。
在本发明的一些实施例中，微生物可包含编码具有磷酸二酯酶活性的多肽的多核苷酸或基因的修饰或破坏、或具有磷酸二酯酶活性的多肽的修饰或破坏。在一些实施例中，所述微生物可在编码具有磷酸二酯酶活性的多肽的内源性多核苷酸或基因中、或在具有磷酸二酯酶活性的内源性多肽中包含插入、缺失、突变、和/或取代。此类修饰、破坏、插入、缺失、突变、和/或取代可导致被降低的或被除去的磷酸二酯酶活性。在其他实施例中，具有磷酸二酯酶活性的多核苷酸、基因或多肽可对应于酶学委员会编号EC 3.1.4.17。
能够在本文所公开的微生物中作为修饰或灭活的靶标的磷酸二酯酶多核苷酸、基因、和多肽的例子包括但不限于SEQ ID NO：1-3。
可在本文所公开的微生物中作为修饰或灭活的靶标的磷酸二酯酶多核苷酸、基因、和多肽的其他例子包括但不限于与SEQ ID NO：1-3具有至少约70％至约75％、约75％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％序列同一性的磷酸二酯酶多核苷酸、基因、和/或多肽，其中此类多核苷酸或基因编码或此类多肽具有磷酸二酯酶活性。可在本文所公开的微生物中作为修饰或灭活的靶标的磷酸二酯酶多核苷酸、基因、和多肽的其他例子包括但不限于SEQID NO：1-3的活性变体、片段、或衍生物，其中此类多核苷酸或基因编码或此类多肽具有磷酸二酯酶活性。
在一些实施例中，其他磷酸二酯酶多核苷酸、基因、和/或多肽的序列，可利用本文所公开的和本领域中可获得的序列，在文献中和/或在技术人员所熟知的生物信息学数据库中被鉴定。例如，通过用已知的编码磷酸二酯酶的多核苷酸或多肽序列对可公开获得的数据库的BLAST检索可鉴定此类序列。在此类方法中，同一性可基于Clustal W比对方法，采用GAPPENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝0.1和Gonnet250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数。
此外，本文所公开的或本领域已知的磷酸二酯酶多核苷酸或多肽序列可被用于鉴定天然的其他磷酸二酯酶同源物。例如，本文所公开的编码磷酸二酯酶的核酸片段可被用于分离编码同源蛋白质的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的例子包括但不限于：核酸杂交方法；DNA和RNA扩增方法，如核酸扩增技术的多种使用所例示的[例如，聚合酶链反应(PCR)，美国专利4,683,202；ligase chainreaction(LCR)，Tabor，等人Proc.Acad.Sci.U.S.A.82：1074，1985；或链置换扩增反应(SDA)，Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392，1992]；和文库构建和互补筛选的方法。
在一些实施例中，与本文所公开的微生物相关的磷酸二酯酶多核苷酸、基因、和/或多肽可被修饰或破坏。对靶基因进行基因修饰和破坏，以降低或消除其表达的许多方法是本领域的普通技术人员已知的，并且可被用于产生本文所公开的微生物。能够被使用的修饰包括但不限于：编码磷酸二酯酶多肽的整个基因或所述基因的一部分的缺失；向编码基因中(在启动子或编码区)插入DNA片段，使得蛋白质不被表达或以较低水平表达；向编码区中引入突变，突变的引入导致终止密码子的加入或移框，使得功能性蛋白质不被表达；和/或向编码区中引入一个或多个突变以改变氨基酸，从而表达无功能的或活性较低的蛋白质。在一些实施例中，靶基因的表达可被反义RNA或干扰RNA的表达阻止，并且构建体能够被导入，导致共抑制。在一些实施例中，转录物的合成或稳定性可通过突变降低。在一些实施例中，从mRNA翻译为蛋白质的效率可通过突变受到调控。这些方法均可由本领域的技术人员使用已知的或鉴定的编码靶蛋白的序列容易地实施。
在本文所公开的微生物中使得磷酸二酯酶活性被降低或消除的磷酸二酯酶的修饰可使用本领域已知的方法进行确认。例如，通过使用该磷酸二酯酶基因内部和外部的引物筛选的PCR、或通过使用针对该磷酸二酯酶基因序列设计的探针的Southern印迹，可确认特定磷酸二酯酶的破坏。作为另外一种选择，能够利用酶测定方法来测量磷酸二酯酶活性(例如，PDE测定，Mediomics，LLC，St.Louis，MO；PDE-GloTMPhosphodiesterase测定，Promega，Madison，WI；Younes，等人Anal.Biochem.417：36-40，2011)。
生物合成途径
可被使用的用于生产异丁醇的生物合成途径包括描述于美国专利7,851,188中的那些，该专利以引用方式并入本文。在一个实施例中，异丁醇生物合成途径可包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸，其可被例如乙酰羟酸还原异构酶催化；
c)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸，其可被例如乙酰羟酸脱水酶催化；
d)α-酮异戊酸至异丁醛，其可被例如支链α-酮酸脱羧酶催化；以及，
e)异丁醛至异丁醇，其可被例如支链醇脱氢酶催化。
在另一个实施例中，异丁醇生物合成途径可包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸，其可被例如酮醇酸还原异构酶催化；
c)2，3-二羟基异戊酸至a-酮异戊酸，其可被例如二羟酸脱水酶催化；
d)α-酮异戊酸至缬氨酸，其可被例如转氨酶或缬氨酸脱氢酶催化；
e)缬氨酸至异丁胺，其可被例如缬氨酸脱羧酶催化；
f)异丁胺至异丁醛，其可被例如ω转氨酶催化；以及，
g)异丁醛至异丁醇，其可被例如支链醇脱氢酶催化。
在另一个实施例中，异丁醇生物合成途径可包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸，其可被例如乙酰羟酸还原异构酶催化；
c)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸，其可被例如乙酰羟酸脱水酶催化；
d)α-酮异戊酸至异丁酰-CoA，其可被例如支链酮酸脱氢酶催化；
e)异丁酰-CoA至异丁醛，其可被例如乙酰化醛脱氢酶催化；以及，
f)异丁醛至异丁醇，其可被例如支链醇脱氢酶催化。
用于生产可使用的1-丁醇的生物合成途径包括在美国专利申请公布2008/0182308中描述的那些，该文献以引用的方式并入本文。在一个实施例中，1-丁醇生物合成途径可包括下列底物至产物的转化：
a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA，其可被例如乙酰-CoA乙酰转移酶催化；
b)乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酰-CoA，其可被例如3-羟丁酰-CoA脱氢酶催化；
c)3-羟丁酰-CoA至丁烯酰-CoA，其可被例如巴豆酸酶催化；
d)丁烯酰-CoA至丁酰-CoA，其可被例如丁酰-CoA脱氢酶催化；
e)丁酰-CoA至丁醛，其可被例如丁醛脱氢酶催化；以及，
f)丁醛至1-丁醇，其可被例如丁醇脱氢酶催化。
用于生产可使用的2-丁醇的生物合成途径包括在美国专利申请公布2007/0259410和美国专利申请公布2009/0155870中描述的那些，上述文献以引用的方式并入本文。在一个实施例中，2-丁醇生物合成途径可包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至α-乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
b)α-乙酰乳酸至乙偶姻，其可被例如乙酰乳酸脱羧酶催化；
c)乙偶姻至3-氨基-2-丁醇，其可被例如乙偶姻胺化酶催化；
d)3-氨基-2-丁醇至磷酸-3-氨基-2-丁醇，其可被例如氨基丁醇激酶催化；
e)磷酸-3-氨基-2-丁醇至2-丁酮，其可被例如磷酸氨基丁醇磷酸化酶催化；以及，
f)2-丁酮至2-丁醇，其可被例如丁醇脱氢酶催化。
在另一个实施例中，2-丁醇生物合成途径可包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至α-乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
b)α-乙酰乳酸至乙偶姻，其可被例如乙酰乳酸脱羧酶催化；
c)乙偶姻至2，3-丁二醇，其可被例如丁二醇脱氢酶催化；
d)2，3-丁二醇至2-丁酮，其可被例如二醇脱水酶催化；以及，
e)2-丁酮至2-丁醇，其可被例如丁醇脱氢酶催化。
用于生产可使用的2-丁酮的生物合成途径包括在美国专利申请公布2007/0259410和美国专利申请公布2009/0155870中描述的那些，它们以引用的方式并入本文。在一个实施例中，2-丁酮生物合成途径可包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至α-乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
b)α-乙酰乳酸至乙偶姻，其可被例如乙酰乳酸脱羧酶催化；
c)乙偶姻至3-氨基-2-丁醇，其可被例如乙偶姻胺化酶催化；
d)3-氨基-2-丁醇至磷酸-3-氨基-2-丁醇，其可被例如氨基丁醇激酶催化；以及，
e)磷酸-3-氨基-2-丁醇至2-丁酮，其可被例如磷酸氨基丁醇磷酸化酶催化。
在另一个实施例中，2-丁酮生物合成途径可包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至α-乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
b)α-乙酰乳酸至乙偶姻，其可被例如乙酰乳酸脱羧酶催化；
c)乙偶姻至2，3-丁二醇，其可被例如丁二醇脱氢酶催化；
d)2，3-丁二醇至2-丁酮，其可被例如二醇脱水酶催化。
在一些实施例中，本文所述的方法可从植物来源的碳源产生丁醇，避免了与用于生产丁醇的标准的石油化学工艺相关联的负面的环境影响。在一些实施例中，用于生产丁醇的方法利用了包含丁醇途径的重组宿主细胞。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径可包括对于重组宿主细胞而言异源的至少一种多核苷酸、至少两种多核苷酸、至少三种多核苷酸、或至少四种多核苷酸。在一些实施例中，在重组宿主细胞中丁醇生物合成途径的每种底物至产物的转化是由异源性多肽进行催化的。在一些实施例中，催化乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的底物至产物的转化的多肽和/或催化异丁醛至异丁醇的底物至产物的转化的多肽，能够利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)作为辅因子。
术语“乙酰羟酸合酶”、“乙酰乳酸合酶”、和“乙酰乳酸合成酶”(缩写为“ALS”)本文中可互换使用，用于指具有催化丙酮酸至乙酰乳酸和CO2的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)。已知乙酰乳酸合酶的例子为EC编号2.2.1.6(Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，SanDiego)。这些未经修饰的酶可得自多种来源，包括但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank登录号：CAB15618(SEQ ID NO：4)、Z99122(SEQ ID NO：5)、CAB07802(SEQ ID NO：272)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(GenBank登录号：AAA25079(SEQ ID NO：6)、M73842(SEQ ID NO：7))和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(GenBank登录号：AAA25161(SEQ ID NO：8)、L16975(SEQ ID NO：9))。
术语“酮醇酸还原异构酶”(“KARI”)、“乙酰羟酸异构还原酶”、和“乙酰羟酸还原异构酶”本文中可互换使用，用于指具有能够催化(S)-乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸反应的酶活性的多肽(或多种多肽)。KARI酶的例子可归类为EC编号EC 1.1.1.86(Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego)，并且来自多种微生物的是可用的，包括但不限于大肠杆菌(E.coli)(GenBank登录号：NP_418222(SEQ ID NO：10)、NC_000913(SEQ ID NO：11))、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(GenBank登录号：NP_013459(SEQ ID NO：12)、NC_001144(SEQ ID NO：13))、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)(GenBank登录号：CAF30210(SEQ ID NO：14)、BX957220(SEQ ID NO：15))、和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank No：CAB14789(SEQ ID NO：16)、Z99118(SEQ ID NO：17))。KARI包括粪厌氧棒状菌(Anaerostipescaccae)KARI变体“K9G9”和“K9D3”(分别为SEQ ID NO：18和19)。酮醇酸还原异构酶在美国专利申请公布2008/0261230、2009/0163376、和2010/0197519、以及PCT专利申请公布WO/2011/041415中有所描述，它们以引用的方式并入本文。本文所述的KARI的例子为来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1和荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)PF5突变体的那些。在一些实施例中，KARI利用NADH。在一些实施例中，KARI利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。
术语“乙酰羟酸脱水酶”和“二羟酸脱水酶”(“DHAD”)是指具有催化2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)。乙酰羟酸脱水酶的例子已知其EC编号为EC 4.2.1.9。此类酶可得自多种微生物，包括但不限于大肠杆菌(E.coli)(GenBank登录号：YP_026248(SEQ ID NO：20)、NC000913(SEQ ID NO：21))、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank No：NP_012550(SEQ ID NO：22)、NC 001142(SEQ ID NO：23))、海沼甲烷球菌(M.maripaludis)(GenBankNo：CAF29874(SEQ ID NO：24)、BX957219(SEQ ID NO：25))、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank No：CAB14105(SEQ ID NO：26)、Z99115(SEQ ID NO：27))、乳酸乳球菌(L.lactis)、和粗糙脉孢霉(N.crassa)。美国专利申请公布2010/0081154和美国专利7,851,188(上述文献以引用的方式并入本文)描述了二羟酸脱水酶(DHAD)，包括来自变异链球菌(Streptococcus mutans)的DHAD。
术语“支链α-酮酸脱羧酶”、“α-酮酸脱羧酶”、“α-酮异戊酸脱羧酶”或“2-酮异戊酸脱羧酶”(“KIVD”)是指具有催化α-酮异戊酸至异丁醛和CO2的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)。已知支链α-酮酸脱羧酶的例子为EC编号4.1.1.72，并且得自许多来源，包括但不限于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(Genbank登录号：AAS49166(SEQ ID NO：28)、AY548760(SEQ ID NO：29)；CAG34226(SEQ ID NO：30)、AJ746364(SEQID NO：31)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(GenBank No：NP_461346(SEQ ID NO：32)、NC_003197(SEQ ID NO：33))、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(GenBank No：NP_149189(SEQ ID NO：34)、NC_001988(SEQ ID NO：35))、M.caseolyticus(SEQ ID NO：36)、和格氏李斯特菌(L.grayi)(SEQ ID NO：37)。
术语“支链醇脱氢酶”(“ADH”)是指具有催化异丁醛至异丁醇的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)。支链醇脱氢酶的例子是已知EC编号1.1.1.265的酶，但是所述酶也可被归类为其它醇脱氢酶(具体地讲，EC1.1.1.1或1.1.1.2)。醇脱氢酶可以是NADPH依赖型或NADH依赖型。这些酶可得自多种来源，包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank No：NP_010656(SEQ ID NO：38)、NC_001136(SEQ ID NO：39)、NP_014051(SEQ ID NO：40)、NC_001145(SEQ ID NO：41))、大肠杆菌(E.coli)(GenBank No：NP_417484(SEQ ID NO：42)、NC_000913(SEQID NO：43))、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(GenBank No：NP_349892(SEQ ID NO：44)、NC_003030(SEQ ID NO：45)；NP_349891(SEQ ID NO：46)、NC_003030(SEQ ID NO：47))。美国专利申请公布2009/0269823描述了来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)的醇脱氢酶(ADH)SadB。醇脱氢酶还包括马肝脏ADH和印度拜耶林克氏菌(Beijerinkia indica)ADH(如美国专利申请公布2011/0269199所述，该文献以引用方式并入本文)。
术语“丁醇脱氢酶”是指多肽(或多种多肽)，其具有催化异丁醛至异丁醇转化或催化2-丁酮至2-丁醇转化的酶活性。丁醇脱氢酶是醇脱氢酶大家族中的一个子集。丁醇脱氢酶可为NAD-或NADP-依赖型。NAD-依赖型酶已知为EC 1.1.1.1并且可得自例如赤红球菌(Rhodococcus ruber)(GenBank No：CAD36475、AJ491307)。NADP-依赖型酶已知为EC 1.1.1.2并且可得自例如强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(GenBank No：AAC25556、AF013169)。另外，丁醇脱氢酶得自大肠杆菌(E.coli)(GenBank No：NP 417484、NC_000913)，环己醇脱氢酶可得自不动杆菌属(Acinetobacter sp.)(GenBank No：AAG10026、AF282240)。术语“丁醇脱氢酶”也指催化丁醛转化成1-丁醇的酶，其使用NADH或NADPH作为辅因子。丁醇脱氢酶可得自，例如，丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)(GenBank No：NP_149325，NC_001988；注意：这种酶具有醛和醇脱氢酶活性；NP_349891、NC_003030、NP_349892、NC_003030)和大肠杆菌(E.coli)(GenBank No：NP_417-484、NC_000913)。
术语“支链酮酸脱氢酶”是指具有催化α-酮异戊酸至异丁酰-CoA(异丁酰-辅酶A)转化的酶活性的多肽(或多种多肽)，通常使用NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作为电子受体。支链酮酸脱氢酶的例子已知其编号为EC 1.2.4.4。此类支链酮酸脱氢酶由四个亚基构成，并且来自所有亚基的序列可得自多种微生物，包括但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank No：CAB14336(SEQ ID NO：48)、Z99116(SEQ ID NO：49)；CAB14335(SEQ ID NO：50)、Z99116(SEQ ID NO：51)；CAB14334(SEQID NO：52)、Z99116(SEQ ID NO：53)；和CAB14337(SEQ ID NO：54)、Z99116(SEQ ID NO：55))和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)(GenBankNo：AAA65614(SEQ ID NO：56)、M57613(SEQ ID NO：57)；AAA65615(SEQ ID NO：58)、M57613(SEQ ID NO：59)；AAA65617(SEQ ID NO：60)、M57613(SEQ ID NO：61)；和AAA65618(SEQ ID NO：62)、M57613(SEQ ID NO：63))。
术语“酰化醛脱氢酶”是指具有催化异丁酰-CoA至异丁醛的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)，通常使用NADH或NADPH作为电子供体。已知酰化醛脱氢酶的例子为EC编号1.2.1.10和1.2.1.57。此类酶得自多种来源，包括但不限于拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)(GenBank No：AAD31841(SEQ ID NO：64)、AF157306(SEQ ID NO：65))、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(GenBank No：NP_149325(SEQ ID NO：66)、NC_001988(SEQ ID NO：67)；NP_149199(SEQ ID NO：68)、NC_001988(SEQ ID NO：69))，恶臭假单胞菌(P.putida)(GenBank No：AAA89106(SEQ ID NO：70)、U13232(SEQ ID NO：71))、和嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)(GenBank No：YP_145486(SEQ ID NO：72)、NC_006461(SEQ ID NO：73))。
术语“转氨酶”是指具有催化α-酮异戊酸至L-缬氨酸的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)，使用丙氨酸或谷氨酸盐作为胺供体。转氨酶的例子已知为EC编号2.6.1.42和2.6.1.66。这些酶可得自多个来源。丙氨酸依赖型酶的来源例子包括但不限于大肠杆菌(E.coli)(基因库编号：YP_026231(SEQ ID NO：74)、NC_000913(SEQ ID NO：75))和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(GenBank No：YP_093743(SEQ ID NO：76)、NC_006322(SEQ ID NO：77))。谷氨酸依赖型酶的来源例子包括但不限于大肠杆菌(E.coli)(基因库编号：YP_026247(SEQ ID NO：78)、NC_000913(SEQ ID NO：79))、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank登录号：NP_012682(SEQ ID NO：80)、NC_001142(SEQ IDNO：81))和嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)(GenBank No：NP_276546(SEQ ID NO：82)、NC_000916(SEQ ID NO：83))。
术语“缬氨酸脱氢酶”是指具有催化α-酮异戊酸至L-缬氨酸的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)，通常使用NAD(P)H作为电子供体并用氨作为胺供体。缬氨酸脱氢酶的例子已知为EC编号1.4.1.8和1.4.1.9并且此类酶可得自多个来源，包括但不限于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(GenBank No：NP_628270(SEQ ID NO：84)、NC_003888(SEQ ID NO：85))和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank No：CAB14339(SEQ IDNO：86)、Z99116(SEQ ID NO：87))。
术语“缬氨酸脱羧酶”是指具有催化L-缬氨酸至异丁胺和CO2的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)。缬氨酸脱羧酶的例子已知为EC编号4.1.1.14。此类酶存在于链霉菌属(Streptomyces)中，例如生绿链霉菌(Streptomyces viridifaciens)(GenBank No：AAN10242(SEQ ID NO：88)、AY116644(SEQ ID NO：89))。
术语“ω转氨酶”是指具有催化异丁胺至异丁醛的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)，使用适当的氨基酸作为胺供体。已知ω转氨酶的例子为EC编号2.6.1.18，并且得自许多来源，包括但不限于反硝化产碱菌(Alcaligenes denitrificans)(AAP92672，(SEQ ID NO：90)、AY330220(SEQ ID NO：91))、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)(GenBank No：YP_294474(SEQ ID NO：92)、NC_007347(SEQ ID NO：93))、沙雷菌(Shewanella oneidensis)(GenBank No：NP_719046(SEQ ID NO：94)、NC_004347(SEQ ID NO：95))、和恶臭假单胞菌(P.putida)(GenBank No：AAN66223(SEQ ID NO：96)、AE016776(SEQ ID NO：97))。
术语“乙酰-CoA乙酰转移酶”是指具有催化两个分子的乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA和辅酶A(CoA)的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)。乙酰-CoA乙酰转移酶的例子是具有对短链酰基-CoA和乙酰-CoA的底物偏好(在正向上反应)的乙酰-CoA乙酰转移酶，并且该酶归类为E.C.2.3.1.9[Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego]；但是具有更广泛底物范围的酶(E.C.2.3.1.16)也将具有功能。乙酰-CoA乙酰转移酶得自多种来源，例如大肠杆菌(E.coli)(GenBank No：NP_416728，NC_000913；NCBI氨基酸序列，NCBI核苷酸序列)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(GenBank No：NP_349476.1，NC_003030；NP_149242、NC_001988)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank No：NP_390297，NC_000964)、和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank No：NP_015297，NC_001148)。
术语“3-羟丁酰-CoA脱氢酶”是指具有催化乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酰-CoA的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)。3-羟丁酰-CoA脱氢酶的例子可以是NADH依赖型的、具有对(S)-3-羟丁酰-CoA或(R)-3-羟丁酰-CoA的底物偏好性。例子可分别归类为E.C.1.1.1.35和E.C.1.1.1.30。另外，3-羟丁酰-CoA脱氢酶可以是NADPH依赖型的，具有对(S)-3-羟丁酰-CoA或(R)-3-羟丁酰-CoA的底物偏好性，并且被分类为E.C.1.1.1.157和E.C.1.1.1.36。3-羟丁酰-CoA脱氢酶得自多种来源，例如丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(GenBank No：NP_349314、NC_003030)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank No：AAB09614，U29084)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)(GenBank No：YP_294481、NC_007347)、和真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)(GenBank No：AAA21973、J04987)。
术语“巴豆酸酶”是指具有催化3-羟丁酰-CoA至丁烯酰-CoA和H2O的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)。巴豆酸酶的例子可具有对(S)-3-羟丁酰-CoA或(R)-3-羟丁酰-CoA的底物偏好性，并可被分类为E.C.4.2.1.17和E.C.4.2.1.55。巴豆酸酶得自多种来源，例如大肠杆菌(E.coli)(GenBank No：NP_415911、NC_000913)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)(GenBank No：NP_349318、NC_003030)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank No：CAB13705，Z99113)、和豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)(GenBank No：BAA21816、D88825)。
术语“丁酰-CoA脱氢酶”是指具有催化丁烯酰-CoA至丁酰-CoA的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)。丁酰-CoA脱氢酶的例子可为NADH-依赖型的、NADPH-依赖型的、或黄素-依赖型的，并且可分别归类为E.C.1.3.1.44、E.C.1.3.1.38、和E.C.1.3.99.2。丁酰-CoA脱氢酶得自多种来源，例如丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(GenBank No：NP_347102、NC_003030)、小眼虫(Euglena gracilis)(GenBank No：Q5EU90、AY741582)、山丘链霉菌(Streptomyces collinus)(GenBank No：AAA92890，U37135)、和天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(GenBank No：CAA22721、AL939127)。
术语“丁醛脱氢酶”是指具有催化丁酰-CoA至丁醛的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)，使用NADH或NADPH作为辅因子。丁醛脱氢酶具有对NADH的偏好性，该酶已知为E.C.1.2.1.57并且得自例如拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)(GenBank No：AAD31841、AF157306)和丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(GenBank No：NP.sub.--149325、NC.sub.--001988)。
术语“异丁酰-CoA变位酶”是指具有催化丁酰-CoA至异丁酰-CoA的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)。这种酶使用辅酶B12作为辅因子。异丁酰-CoA变位酶的例子已知为EC编号5.4.99.13。这些酶存在于多种链霉菌属(Streptomyces)中，包括但不限于肉桂地链霉菌(Streptomycescinnamonensis)(GenBank No：AAC08713(SEQ ID NO：98)、U67612(SEQID NO：99)；CAB59633(SEQ ID NO：100)、AJ246005(SEQ ID NO：101))、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(GenBank No：CAB70645(SEQ IDNO：102)、AL939123(SEQ ID NO：103)；CAB92663(SEQ ID NO：104)、AL939121(SEQ ID NO：105))、和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)(GenBank No：NP_824008(SEQ ID NO：106)、NC_003155(SEQ ID NO：107)；NP_824637(SEQ ID NO：108)、NC_003155(SEQ ID NO：109))。
术语“乙酰乳酸脱羧酶”指具有催化α-乙酰乳酸转化成乙偶姻的酶活性的多肽(或多种多肽)。乙酰乳酸脱羧酶的例子已知编号为EC 4.1.1.5并且可来自，例如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank No：AAA22223，L04470)、土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)(GenBankNo：AAA25054，L04507)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(GenBank No：AAU43774、AY722056)。
术语“乙偶姻胺化酶”或“乙偶姻转氨酶”是指具有催化乙偶姻至3-氨基-2-丁醇的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)。乙偶姻胺化酶可利用辅因子5′-磷酸吡哆醛或NADH或NADPH。所得产物可在3-位点处具有(R)或(S)立体化学构型。磷酸吡哆醛依赖型酶可使用氨基酸诸如丙氨酸或谷氨酸作为氨基供体。NADH-和NADPH-依赖型酶可使用氨作为第二底物。NADH依赖型乙偶姻胺化酶的合适例子也称为氨基醇脱氢酶，由Ito等人(美国专利6,432,688)进行了描述。吡哆醛依赖型乙偶姻胺化酶的例子是胺：丙酮酸氨基转移酶(也称为胺：丙酮酸转氨酶)，如Shin和Kim所述(J.Org.Chem.67：2848-2853，2002)。
术语“乙偶姻激酶”指具有催化乙偶姻转化成磷酸乙偶姻的酶活性的多肽(或多种多肽)。乙偶姻激酶可利用ATP(三磷酸腺苷)或磷酸烯醇式丙酮酸作为反应的磷酸供体。对类似底物二羟基丙酮催化类似反应的酶包括例如已知为EC 2.7.1.29的酶(Garcia-Alles等人，Biochemistry43：13037-13046，2004)。
术语“磷酸乙偶姻胺化酶”是指具有催化磷酸乙偶姻至邻磷酸-3-氨基-2-丁醇的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)。磷酸乙偶姻胺化酶可利用辅因子5′-磷酸吡哆醛、NADH、或NADPH。所得产物可在3-位点处具有(R)或(S)立体化学构型。磷酸吡哆醛依赖型酶可使用氨基酸诸如丙氨酸或谷氨酸。NADH-和NADPH-依赖型酶可使用氨作为第二底物。虽然没有对催化这种磷酸乙偶姻反应的酶的报道，但是有一种磷酸吡哆醛依赖型酶，提出其对相似的底物磷酸丝氨醇进行相似的反应(Yasuta等人，Appl.Microbial.67：4999-5009，2001)。
术语“磷酸氨基丁醇磷酸化酶”，也称为“邻磷酸氨基醇裂解酶”，是指具有催化邻磷酸-3-氨基-2-丁醇至2-丁酮的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)。磷酸氨基丁醇磷酸裂解酶可利用辅因子5′-磷酸吡哆醛。有对催化相似底物磷酸-1-氨基-2-丙醇的类似反应的酶的报道(Jones等人，Biochem.J.134：167-182，1973)。美国专利申请公布2007/0259410描述了来自生物胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)的磷酸氨基丁醇磷酸裂解酶。
术语“氨基丁醇激酶”是指具有催化3-氨基-2-丁醇至邻磷酸-3-氨基-2-丁醇的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)。氨基丁醇激酶可利用ATP作为磷酸供体。虽然没有对3-氨基-2-丁醇催化这种反应的酶的报道，但是报道了催化对相似底物胆胺和1-氨基-2-丙醇的相似反应的酶(Jones等人，参见上文)。美国专利申请公布2009/0155870在实例14中描述了胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种(Erwinia carotovora subsp.Atroseptica)的氨基醇激酶。
术语“丁二醇脱氢酶”也称为“乙偶姻还原酶”，指具有催化乙偶姻转化成2，3-丁二醇的酶活性的多肽(或多种多肽)。丁二醛脱氢酶是醇脱氢酶大家族中的一个子集。丁二醇脱氢酶对于在醇类产物中的(R)-或(S)-立体化学生产可具有特异性。(S)-特异性丁二醇脱氢酶已知为EC1.1.1.76并且可来自，例如，肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)(GenBank No：BBA13085、D86412)。(R)-特异性丁二醇脱氢酶已知为EC1.1.1.4并且可来自，例如，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)(GenBank No：NP 830481，NC_004722；AAP07682、AE017000)、和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(GenBank No.AAK04995、AE006323)。
术语“丁二醇脱水酶”，也称为“二醇脱水酶”或“丙二醇脱水酶”，是指具有催化2，3-丁二醇至2-丁酮的转化的酶活性的多肽(或多种多肽)。丁二醇脱水酶可利用辅因子腺苷钴胺素(也称为辅酶Bw或维生素B12；但是维生素B12也可指不是辅酶B12的、其他形式的钴胺素)。腺苷钴胺素依赖型酶已知为EC 4.2.1.28并且可得自，例如，产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)[(GenBank No：AA08099(α亚基)，D45071；BAA08100(β亚基)，D45071；和BBA08101(γ亚基)，D45071(注意：所有三个亚基是活性所需的)]、和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)(GenBank No：AAC98384(α亚基)，AF102064；AAC98385(β亚基)，AF102064；AAC98386(γ亚基)，AF102064)。其他合适的二醇脱水酶包括但不限于B12依赖型二醇脱水酶，其得自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(GenBank No：AAB84102(大亚基)，AF026270；AAB84103(中亚基)，AF026270；AAB84104(小亚基)，AF026270)；和丘状菌落乳杆菌(Lactobacillus collinoides)(GenBank No：CAC82541(大亚基)，AJ297723；CAC82542(中亚基)；AJ297723；CAD01091(小亚基)，AJ297723)；和来自短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)(尤其是菌株CNRZ734和CNRZ735，Speranza等人，J.Agric.Food Chem.45：3476-3480，1997)的酶，以及编码相应酶的核苷酸序列。二醇脱水酶基因分离方法是本领域为人们所熟知的(例如美国专利5,686,276)。
术语“丙酮酸脱羧酶”(PDC)是指具有催化丙酮酸脱羧至乙醛和二氧化钛的酶活性的多肽(或多种多肽)。丙酮酸脱氢酶已知为EC编号4.1.1.1。这些酶存在于多种酵母中，包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank No：CAA97575(SEQ ID NO：110)、CAA97705(SEQ ID NO：112)、CAA97091(SEQ ID NO：114))。
应当理解，包含如本文所提供的异丁醇生物合成途径的微生物可还包含一个或多个附加的修饰。美国专利申请公布2009/0305363(以引用方式并入)公开了通过工程化酵母以表达定位于细胞溶胶的乙酰乳酸合酶和基本除去丙酮酸脱羧酶活性而提高丙酮酸至乙酰乳酸的转化。在一些实施例中，所述微生物可包含如美国专利申请公布2009/0305363(以引用的方式并入本文)所述的修饰以降低3-磷酸甘油脱氢酶活性和/或破坏至少一个编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的基因或破坏至少一个编码控制丙酮酸脱羧酶基因表达的调控因子的基因，包括如美国专利申请公布2010/0120105(以引用的方式并入本文)所述提供通过恩特纳-道德洛夫途径的提高碳通量或降低的等效平衡的对微生物的修饰。其他修改包括编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中的步骤的多肽的至少一种多核苷酸的整合。其他修改包括编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的内源性多核苷酸中的至少一个缺失、突变、和/或取代。在一些实施例中，所述具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽是为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)的YMR226c(SEQ ID NO：130、131)或其的同源物。另外的修饰包括编码具有醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的多肽的内源性多核苷酸中的插入、缺失、突变、和/或取代。在一些实施例中，具有醛脱氢酶活性的多肽是来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的ALD6或其同源物。其中酵母生产宿主细胞是pdc-的、具有降低的葡萄糖阻遏效应的基因修饰在美国专利申请公布2011/0124060中有所描述，该文献以引用的方式并入本文。在一些实施例中，缺失或下调的丙酮酸脱羧酶选自：PDC1、PDC5、PDC6、以及它们的组合。在一些实施例中，丙酮酸脱羧酶选自表3(PDC靶基因编码区和蛋白质的SEQ ID编号)中的那些酶。在一些实施例中，微生物可含有编码催化3-磷酸甘油醛至1，3-二磷酸甘油酸的转化的多肽的多核苷酸的缺失或下调。在一些实施例中，催化这种反应的酶是3-磷酸甘油醛脱氢酶。
表3
酵母可具有一个或多个编码丙酮酸脱羧酶的基因。例如，在光滑假丝酵母(Candida glabrata)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中有一个编码丙酮酸脱羧酶的基因，然而有三个由酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的PDC1、PCD5和PDC6基因编码的丙酮酸脱羧酶的同功酶。在一些实施例中，酵母细胞可具有至少一种失活的PDC基因。如果酵母细胞具有多于一种的表达的(活性的)PDC基因，则每个活性PDC基因可以被修饰或灭活，从而产生pdc-细胞。例如，在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，PDC1、PDC5、和PDC6基因可被修饰或灭活。如果一种PDC基因在所使用的发酵条件下是非活性的，则此类基因将不需要被修饰或灭活。
其他靶基因，诸如编码与SEQ ID NO：110、112、114、116、118、120、122、124、126、或128的丙酮酸脱羧酶具有至少约70-75％、至少约75-85％、至少约80-85％、至少约85％-90％、至少约90％-95％、或至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的丙酮酸脱羧酶蛋白质的那些，可以在技术人员所熟知的文献中和生物信息学数据库中被鉴定。
微生物还可包含(a)编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸；和(b)(i)在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变、和/或取代；和/或(ii)编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的至少一种异源性多核苷酸。在一些实施例中，影响Fe-S簇生物合成的多肽由AFT1、AFT2、FRA2、GRX3、或CCC1编码。AFT1和AFT2描述于PCT申请公布WO 2001/103300中，该文献以引用方式并入本文。在一些实施例中，影响Fe-S簇生物合成的多肽是组成型突变体AFT1L99A、AFT1 L102A、AFT1 C291F、或AFT1 C293F。
检测方法
本文公开了适合利用微生物(例如，重组宿主细胞)从碳底物生产丁醇的方法和工艺。利用碳底物生产异丁醇的能力能够利用本领域已知的方法确认，包括但不限于美国专利7,851,188中所描述的那些，该文献以引用方式并入本文。例如，为了确认用以生产异丁醇的对蔗糖的利用，能够通过本领域已知的多种方法测定培养基中的异丁醇浓度。例如，一种使用ShodexTM SH-1011柱和ShodexTM SH-G保护柱(Waters Corporation(Milford，MA))并联合折射率(RI)检测的特异性的高效液相色谱(HPLC)方法。用0.01M H2SO4作为流动相，以0.5mL/分钟流速和50℃的柱温实现色谱分离。在使用条件下异丁醇的保留时间为46.6分钟。作为另外一种选择，气相色谱法(GC)是可用的。例如，特异性的GC方法利用HP-INNOWax柱(30m×0.53mm内径，1μm膜厚度，AgilentTechnologies(Wilmington，DE))，配有火焰离子化检测器(FID)。载气为氦气，流速为4.5mL/分钟，在150℃用恒定顶压测量；注射分流比在200℃为1：25；炉温为45℃下保持1分钟，以10℃/分钟从45℃升温至220℃，并在220℃保持5分钟；并且FID检测在240℃、26mL/分钟的氦气补气条件下使用。异丁醇的保留时间为4.5分钟。
丁醇的生产
本文公开了适合用于生产丁醇并且利用了微生物(例如，重组宿主细胞)的方法和工艺，以及改善细胞活力和生产能力的方法。
术语“细胞再循环利用”或“细胞循环利用”是指在其中酵母或或其他微生物(例如，重组宿主细胞)被从发酵液中分离(诸如通过离心)，然后将酵母再循环回发酵罐的过程。
在一些实施例中，细胞循环利用步骤被重复至少约2次、至少约3次、至少约4次、至少约5次、至少约10次、至少约20次、至少约30次、至少约40次、至少约50次、至少约75次、至少约100次、至少约125次、至少约150次、至少约175次、至少约200次、至少约250次、至少约300次、至少约400次、至少约500次、或更多。
术语“酸洗涤的”、“经酸洗涤的”、或“酸洗涤”是指对细胞悬浮液的任何酸洗涤。在一些实施例中，所述细胞悬浮液可以是酵母或其他微生物(例如，重组宿主细胞)的悬浮液。酸洗涤克服了现有技术中与碳底物至丁醇或其他发酵产物的有效转化相关的，由于微生物污染物的存在而导致的困难。酸洗涤描述于美国专利申请公布2011/0207192中，该文献以引用方式并入本文。
在酸洗涤步骤中，通过酸的添加，微生物污染物被暴露在小于约2.0的pH。pH可以为大于约1，但小于3.0。这包括了二者之间的全部子值，例如至少约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8或2.9的pH，或者二者之间的任何pH被包括在本发明的范围之内。可采用的pH范围的例子包括至少约1.0至至少约3.0、至少约1.0至至少约2.9、至少约1.0至至少约2.8、至少约1.0至至少约2.75、至少约1.0至至少约2.5、至少约1.0至至少约2.4、至少约1.0至至少约2.3、至少约1.0至至少约2.2、至少约1.0至至少约2.1、或至少约1.0至至少约2.0。
在本发明的一个实施例中，酸是选自下列的无机酸：硫酸、盐酸、亚硫酸、磷酸和硝酸。
在一些实施例中，酸洗涤步骤被重复至少约2次、至少约3次、至少约4次、至少约5次、至少约10次、至少约20次、至少约30次、至少约40次、至少约50次、至少约75次、至少约100次、至少约125次、至少约150次、至少约175次、至少约200次、至少约250次、至少约300次、至少约400次、至少约500次、或更多。
在一些实施例中，重组宿主细胞在细胞循环利用过程中经受酸洗涤步骤。在一些实施例中，重组宿主细胞在细胞循环利用之后经受酸洗涤步骤。在一些实施例中，重组宿主细胞在每一细胞循环利用步骤中经受酸洗涤步骤。在一些实施例中，重组宿主细胞至少约每隔一个细胞循环利用步骤、至少约每三个细胞循环利用步骤、至少约每四个细胞循环利用步骤、至少约每五个细胞循环利用步骤、至少约每六个细胞循环利用步骤、至少约每七个细胞循环利用步骤、至少约每八个细胞循环利用步骤、至少约每九个细胞循环利用步骤、至少约每十个细胞循环利用步骤、至少约每十五个细胞循环利用步骤、至少约每二十个细胞循环利用步骤或更多，经受一个酸洗涤步骤。
术语“恢复活力”是指在其中酵母或其他微生物(例如，重组宿主细胞)被从发酵液中分离(诸如通过离心)，并被暴露于富含营养物质的培养基一段时间的过程。
术语“富含营养物质的培养基”是指可包含任何下列物质的培养基、制剂、或组合物：碳底物、氮、矿物质、痕量元素、和维生素。例如，富含营养物质的培养基可包含任何下列的：生物素、泛酸盐、叶酸、烟酸、氨基苯甲酸、吡哆素、核黄素、硫胺素、肌糖、钾(例如，磷酸钾)、硼酸、钙、铬、铜(例如，硫酸铜)、碘化物(例如，碘化钾)、铁(例如，氯化铁)、锂、镁(例如，硫酸镁)、锰(例如，硫酸锰)、钼、氯化钙、氯化钠、钒、锌(例如，硫酸锌)、酵母提取物、大豆蛋白胨等。
在一些实施例中，恢复活力过程可被重复至少约2次、至少约3次、至少约4次、至少约5次、至少约10次、至少约20次、或更多次。
在一些实施例中，重组宿主细胞在酸洗涤步骤之后经历恢复活力过程。在一些实施例中，重组宿主细胞在每一酸洗涤步骤之后经历恢复活力过程。在一些实施例中，重组宿主细胞至少约每隔一个酸洗涤步骤、至少约每三个酸洗涤步骤、至少约每四个酸洗涤步骤、至少约每五个酸洗涤步骤、至少约每六个酸洗涤步骤、至少约每七个酸洗涤步骤、至少约每八个酸洗涤步骤、至少约每九个酸洗涤步骤、至少约每十个酸洗涤步骤或更多，经受一个酸洗涤步骤。
本发明的一个实施例还涉及生产醇的方法，所述方法包括：
(a)提供微生物，其中所述微生物产生醇；
(b)使所述微生物与一种或多种碳源在其中醇被生产的条件下接触；
(c)收集所述微生物；
(d)回收所述醇；
(e)使步骤(c)的微生物与一种或多种碳源在其中醇被生产的条件下接触；
(f)重复步骤(c)-(e)；以及
任选地，使步骤(c)的所收集的微生物暴露于低pH条件下。
本发明的一个实施例还涉及生产丁醇的方法，所述方法包括：
(a)提供微生物，其中所述微生物产生丁醇；
(b)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中丁醇以有效收率被生产的条件下接触；
(c)收集所述微生物；
(d)回收丁醇；
(e)使步骤(c)的微生物与一种或多种碳底物在其中丁醇以有效收率被生产的条件下接触；
(f)重复步骤(c)-(e)；以及，任选地
使步骤(c)的微生物暴露于低pH条件下。
本发明的一个实施例还涉及生产醇的方法，所述方法包括：
(a)提供微生物，其中所述微生物产生醇；
(b)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；
(c)收集所述微生物；
(d)回收所述醇；
(e)使步骤(c)的微生物与富含营养物质的培养基接触；
(f)收集步骤(e)的微生物；
(g)使步骤(f)的微生物与一种或多种碳底物在其中醇以有效收率被生产的条件下接触；
(h)重复步骤(c)-(g)。
本发明的一个实施例还涉及生产丁醇的方法，所述方法包括：
(a)提供微生物，其中所述微生物产生丁醇；
(b)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中丁醇以有效收率被生产的条件下接触；
(c)收集所述微生物；
(d)回收丁醇；
(e)使步骤(c)的微生物与富含营养物质的培养基接触；
(f)收集步骤(e)的微生物；
(g)使步骤(f)的微生物与一种或多种碳底物在其中丁醇以有效收率被生产的条件下接触；
(h)重复步骤(c)-(g)。
本发明的一个实施例还涉及生产醇的方法，所述方法包括：
(a)提供微生物，其中所述微生物产生醇；
(b)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；
(c)收集所述微生物；
(d)回收所述醇；
(e)使步骤(c)的微生物暴露于低pH条件下；
(f)收集来自步骤(e)的微生物；
(g)使步骤(f)的微生物与富含营养物质的培养基接触；
(h)收集步骤(g)的微生物；
(i)使步骤(h)的微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；以及
(j)任选地重复步骤(c)-(i)。
本发明的一个实施例还涉及生产丁醇的方法，所述方法包括：
(a)提供微生物，其中所述微生物产生丁醇；
(b)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中丁醇以有效收率被生产的条件下接触；
(c)收集所述微生物；
(d)回收丁醇；
(e)使步骤(c)的微生物暴露于低pH条件下；
(f)收集来自步骤(e)的微生物；
(g)使步骤(f)的微生物与富含营养物质的培养基接触；
(h)收集步骤(g)的微生物；
(i)使步骤(h)的微生物与一种或多种碳底物在其中丁醇以有效收率被生产的条件下接触；以及
(j)任选地重复步骤(c)-(i)。
在一些实施例中，pH小于或等于约2.0。在一些实施例中，pH条件可以为约2至约4。在一些实施例中，所收集的微生物可暴露于pH小于或等于约2.0的条件下至少一小时。在一些实施例中，所生产的醇是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、或己醇。在一些实施例中，所述丁醇是异丁醇、1-丁醇、2-丁醇、或2-丁酮。
在一些在其中丁醇被生产的实施例中，丁醇以至少约6g/L的浓度被回收。在一些实施例中，第二接触步骤(例如，步骤(e)、(g)、(i))的有效收率是第一接触步骤(例如，步骤(b))的有效收率的至少约90％。在一些实施例中，第二接触步骤(例如，步骤(e)、(g)、(i))的有效收率是第一接触步骤(例如，步骤(b))的有效收率的至少约99％。在一些实施例中，微生物被暴露至少约一小时和/或在至少约0.3％的丁醇的存在下。
在一些实施例中，所述微生物被循环利用至少5次。在一些实施例中，所述微生物被循环利用至少10次。在一些实施例中，所述微生物在循环利用步骤中被酸洗涤。在一些实施例中，所述微生物在循环利用步骤之后被酸洗涤。
在一些实施例中，在所期望的异丁醇的生产之后，微生物可被收集。收集可通过本领域已知的任何方法进行，包括，例如，离心。在一些实施例中，在酸洗涤步骤中，所收集的微生物可经受酸性条件，然后重新与碳底物接触。在本发明的一些采用细胞循环利用的实施例中，在使经酸处理的细胞与碳底物重新接触之前，酸可被添加至与发酵液分离的细胞悬浮液。在一些实施例中，可使所收集的微生物经受富含营养物质的培养基一段时间、收集、并使其与碳底物重新接触。在一些实施例中，微生物可在暴露于富含营养物质的培养基之前经受酸洗涤。
在一些实施例中，与碳底物的第一接触步骤可在厌氧条件下进行。在一些实施例中，与碳底物的第一接触步骤可在微氧条件下进行。在一些实施例中，循环利用可在厌氧条件中进行。在一些实施例中，循环利用可在微氧条件中进行。
在一些实施例中，所述碳底物选自：低聚糖、多糖、单糖、以及它们的混合物。在一些实施例中，所述碳底物选自：果糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、淀粉、纤维素、原料、乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、甘油、玉米醪、甘蔗、生物质、C5糖诸如木糖和阿拉伯糖、以及它们的混合物。
在一些实施例中，微生物在其中异丁醇被生产的条件下与碳底物接触。在一些实施例中，给定细胞密度的微生物可与适当的培养基一起被添加至发酵容器。在一些实施例中，所述培养基可包含碳底物，或碳底物可被分别地添加。在一些实施例中，碳底物在异丁醇的生产开始时和/或生产过程中可以以任何浓度存在。在一些实施例中，碳底物的初始浓度在约60至80g/L范围内。适合用于发酵的温度是本领域的技术人员已知的，并且取决于所采用的微生物的属和/或物种。在一些实施例中，适合的温度在25℃至43℃范围内。
在一些实施例中，接触直到至少约90％的蔗糖被利用或直到到达所期望的异丁醇有效滴度时才发生。在一些实施例中，异丁醇的有效滴度为至少约40g/L，至少约50g/L，至少约60g/L，至少约70g/L，至少约80g/L，至少约90g/L，或至少约100g/L、或至少约110g/L。
在一些实施例中，微生物可以在30℃至37℃的温度范围被温育。在一些实施例中，微生物可被温育一至五个小时的时间。在一些实施例中，微生物可在摇动器(Innova 44R，New Brunswick Scientific(CT，USA))中在搅拌(例如，100至400rpm)下被温育。
微生物与碳底物之间的接触可以是异丁醇由此被生产的任意长度的时间。在一些实施例中，微生物与一种或多种碳底物的接触为至少约8小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约72小时、至少约96小时、至少约120小时、至少约144小时、至少约168小时、至少约192小时、至少约216小时或更长。在一些实施例中，微生物在所述接触步骤之后被酸洗涤。在一些实施例中，接触进行少于8小时。
在一些实施例中，微生物在与碳底物的第一次接触时以至少约0.5gdcw/L的细胞密度存在。在一些实施例中，微生物在与碳底物接触以生产异丁醇之前，可以生长至至少约6gdcw/L的细胞密度。在一些实施例中，在与碳底物接触之前，细胞密度可以是至少约20gdcw/L、至少约25gdcw/L、或至少约35gdcw/L。
在一些实施例中，微生物具有至少约0.1g/gdcw/h的特异性生产能力。在一些实施例中，在与碳底物的第一次接触期间，丁醇以至少约0.1g/gdcw/h的有效速率被生产。在一些实施例中，与碳底物的第一次接触在提取剂的存在下发生。在一些实施例中，微生物维持至少约1.0g/gdcw/h的糖摄入速率。在一些实施例中，微生物维持至少约0.5g/g/hr的糖摄入速率。在一些实施例中，葡萄糖利用速率为至少约2.5g/gdcw/h。在一些实施例中，蔗糖摄入速率为至少约2.5g/gdcw/h。在一些实施例中，葡萄糖和果糖合并的摄入速率为至少约2.5g/gdcw/h。
在一些实施例中，与碳底物的第一次接触可在提取剂的存在下发生。在一些实施例中，与碳底物的第一次接触在提取剂的存在下在厌氧条件中发生。在一些实施例中，与碳底物的第一次接触在提取剂的存在下在微氧条件中发生。
在一些实施例中，微生物以至少约90％的有效收率、至少约91％的有效收率、至少约92％的有效收率、至少约93％的有效收率、至少约94％的有效收率、至少约95％的有效收率、至少约96％的有效收率、至少约97％的有效收率、至少约98％的有效收率、或至少约99％的有效收率生产丁醇。在一些实施例中，微生物以至少约55％至至少约75％的有效收率、至少约50％至至少约80％的有效收率、至少约45％至至少约85％的有效收率、至少约40％至至少约90％的有效收率、至少约35％至至少约95％的有效收率、至少约30％至至少约99％的有效收率、至少约25％至至少约99％的有效收率、至少约10％至至少约99％的有效收率或至少约10％至至少约100％的有效收率生产丁醇。
在一些实施例中，所述微生物可以是重组宿主细胞。在一些实施例中，所述重组宿主细胞可包含丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(c)2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；(d)2-酮异戊酸至异丁醛；以及(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶活性、酮酸还原异构酶活性、二羟酸脱水酶活性、酮异戊酸脱羧酶活性、和醇脱氢酶活性。
在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径可包括编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(c)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；(d)α-酮异戊酸至异丁酰-CoA；(e)异丁酰-CoA至异丁醛；以及(f)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶活性；乙酰羟酸还原异构酶活性；乙酰羟酸脱水酶活性；支链酮酸脱氢酶活性；醛脱氢酶活性；和直链醇脱氢酶活性。
在一些实施例中，所述重组宿主细胞可包含1-丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述1-丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：(a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA；(b)乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酰-CoA；(c)3-羟丁酰-CoA至丁烯酰-CoA；(d)丁烯酰-CoA至丁酰-CoA；(e)丁酰-CoA至丁醛；以及(f)丁醛至1-丁醇。在一些实施例中，所述1-丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰-CoA乙酰转移酶活性；3-羟丁酰-CoA脱氢酶活性；巴豆酸酶活性；丁酰-CoA脱氢酶活性；丁醛脱氢酶活性、和丁醇脱氢酶活性。
在一些实施例中，所述重组宿主细胞可包含2-丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述2-丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至α-乙酰乳酸；(b)α-乙酰乳酸至乙偶姻；(c)乙偶姻至3-氨基-2-丁醇；(d)3-氨基-2-丁醇至磷酸-3-氨基-2-丁醇；(e)磷酸-3-氨基-2-丁醇至2-丁酮；以及(f)-丁酮至2-丁醇。在一些实施例中，所述2-丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶活性；乙酰乳酸脱羧酶活性；乙偶姻胺化酶活性；氨基丁醇激酶活性；磷酸氨基丁醇磷酸化酶活性；以及丁醇脱氢酶活性。
在一些实施例中，所述2-丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至α-乙酰乳酸；(b)α-乙酰乳酸至乙偶姻；(c)乙偶姻至2，3-丁二醇；(d)2，3-丁二醇至2-丁酮；以及(e)2-丁酮至2-丁醇。在一些实施例中，所述2-丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶活性；乙酰乳酸脱羧酶活性；丁二醇脱氢酶活性；丁二醇脱水酶活性；和丁醇脱氢酶活性。
在一些实施例中，一种或多种底物至产物的转化利用NADH或NADPH作为辅因子。在一些实施例中，NADH是优选的辅因子。
在一些实施例中，所述重组宿主细胞的丁醇途径包含至少一种多肽，所述至少一种多肽选自具有下列酶学委员会编号的酶：EC 2.2.1.6、EC1.1.1.86、EC 4.2.1.9、EC 4.1.1.72、EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.265、EC 1.1.1.2、EC 1.2.4.4、EC 1.3.99.2、EC 1.2.1.57、EC 1.2.1.10、EC 2.6.1.66、EC2.6.1.42、EC 1.4.1.9、EC 1.4.1.8、EC 4.1.1.14、EC 2.6.1.18、EC 2.3.1.9、EC 2.3.1.16、EC 1.1.130、EC 1.1.1.35、EC 1.1.1.157、EC 1.1.1.36、EC4.2.1.17、EC 4.2.1.55、EC 1.3.1.44、EC 1.3.1.38、EC 5.4.99.13、EC4.1.1.5、EC 2.7.1.29、EC 1.1.1.76、EC 1.2.1.57、和EC 4.2.1.28。
在一些实施例中，所述重组宿主细胞的丁醇途径包含至少一种选自下列一组酶的多肽：乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸异构还原酶、乙酰羟酸脱水酶、支链α-酮酸脱羧酶、支链醇脱氢酶、酰化醛脱氢酶、支链酮酸脱氢酶、丁酰-CoA脱氢酶、丁醛脱氢酶、转氨酶、缬氨酸脱氢酶、缬氨酸脱羧酶、ω-转氨酶、乙酰-CoA乙酰转移酶、3-羟丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脱氢酶、异丁酰-CoA变位酶、乙酰乳酸脱羧酶、乙偶姻胺化酶、丁醇脱氢酶、丁醛脱氢酶、乙偶姻激酶、磷酸乙偶姻胺化酶、磷酸氨基丁醇磷酸化酶、氨基丁醇激酶、丁二醇脱氢酶、和丁二醇脱水酶。
在一些实施例中，来自所述生物合成途径的酶被定位至细胞溶胶。在一些实施例中，来自所述生物合成途径的通常被定位至线粒体的酶被定位至细胞溶胶。在一些实施例中，来自所述生物合成途径的酶通过线粒体定位序列的移除被定位至细胞溶胶。在一些实施例中，通过如例如美国专利7,851,188(该文献全文以引用方式并入本文)中所述生成新的起始密码子，消除了线粒体定位。在一些实施例中，来自所述生物合成途径的被定位至细胞溶胶的酶是DHAD。在一些实施例中，来自所述生物合成途径的被定位至细胞溶胶的酶是KARI。
在一些实施例中，所述重组宿主细胞可包含一种或多种改变了cAMP信号转导途径的一种或多种组分的表达和/或活性的修饰。在一些实施例中，所述重组宿主细胞可包含一种或多种改变了一种或多种磷酸二酯酶的表达和/或活性的修饰。在一些实施例中，所述重组宿主细胞可包含被降低的或被除去的磷酸二酯酶和/或磷酸二酯酶活性。在一些实施例中，所述重组宿主细胞可包含编码具有磷酸二酯酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，所述重组宿主细胞可在编码具有磷酸二酯酶活性的多肽的内源性多核苷酸中包含插入、缺失、突变、和/或取代。在一些实施例中，具有磷酸二酯酶活性的多肽对应于酶学委员会编号EC 3.1.4.17。在一些实施例中，具有磷酸二酯酶活性的多肽是PDE1。
在一些实施例中，所述重组宿主细胞不表达丙酮酸脱羧酶或具有降低的所述丙酮酸脱羧酶的表达。在一些实施例中，所述表达的降低是编码丙酮酸脱羧酶的基因的插入、缺失、突变、和/或取代的结果。在一些实施例中，所述重组宿主细胞可包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，所述重组宿主细胞可在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性多核苷酸中包含插入、缺失、突变、和/或取代。在一些实施例中，具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自：PDC1、PDC5、PDC6、以及它们的组合。在一些实施例中，编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性多核苷酸选自：PDC1、PDC5、PDC6、以及它们的组合。
在一些实施例中，所述重组宿主细胞不表达3-磷酸甘油醛脱氢酶或具有降低的所述3-磷酸甘油醛脱氢酶的表达。在一些实施例中，所述表达的降低是编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因的插入、缺失、突变、和/或取代的结果。在一些实施例中，所述重组宿主细胞不表达BDH1或具有降低的所述BDH1的表达。在一些实施例中，所述表达的降低是编码BDH1的基因的插入、缺失、突变、和/或取代的结果。在一些实施例中，所述重组宿主细胞不表达编码乙酰乳酸还原酶的基因或具有降低的所述编码乙酰乳酸还原酶的基因的表达。在一些实施例中，所述表达的降低是编码YMR226c的基因的插入、缺失、突变、和/或取代的结果。
本发明还涉及包含如本文所述的重组宿主细胞的组合物。在一些实施例中，所述组合物还包含富含营养物质的培养基。在一些实施例中，所述组合物可具有至少约2的pH。在一些实施例中，所述组合物可具有小于或等于约2的pH。在一些实施例中，所述组合物可具有约2至约4的pH。在一些实施例中，所述组合物的重组宿主细胞可以是酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、或毕赤酵母属(Pichia)的成员。在一些实施例中，所述组合物的重组宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施例中，所述重组宿主细胞可包含工程化的酶，所述工程化的酶催化乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的底物至产物的转化。
产丁醇菌
在一些实施例中，所述重组宿主细胞可以是产丁醇菌。在一些实施例中，所述产丁醇菌可以是产异丁醇菌。在一些实施例中，适合的产异丁醇菌包括适合用于基因修饰和重组基因表达的任何酵母宿主。在一些实施例中，所述产异丁醇菌宿主细胞可以是裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、或酵母属(Saccharomyces)的成员。在一些实施例中，所述宿主细胞可以是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、白假丝酵母(Candida albicans)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、大肠杆菌(E.coli)、或植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。在一些实施例中，所述宿主细胞是酵母宿主细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞是酵母属(Saccharomyces)的成员。在一些实施例中，所述宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。在一些实施例中，所述宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是本领域已知的，并且可得自多种来源，包括但不限于American Type CultureCollection(Rockville，MD)、Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre、LeSaffre、Gert Strand AB、Ferm Solutions、North American Bioproducts、Martrex、和Lallemand。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)包括但不限于BY4741、CEN.PK 113-7D、Ethanolyeast、Ferm ProTM yeast、XR yeast、Gert StrandPrestige Batch Turbo alcohol yeast、Gert Strand Pot Distillers yeast、GertStrand Distillers Turbo yeast、FerMaxTM Green yeast、FerMaxTM Gold yeast、yeast、BG-1、PE-2、CAT-1、CBS7959、CBS7960和CBS7961。
“PNY860”是指来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株，其于2011年7月21日在American Type Culture Collection，PatentDepository10801University Boulevard，Manassas，VA20110-2209根据Budapest Treaty被保藏在ATCC，并且具有专利保藏命名PTA-12007。
在一些实施例中，所述产异丁醇菌是PNY860的衍生物。在一些实施例中，所述产异丁醇菌是菌株PNY860的单倍体衍生物。在一些实施例中，所述产异丁醇菌是菌株PNY860的不结孢子的衍生物。在一些实施例中，所述产异丁醇菌是菌株PNY860的未接合的衍生物。
碳底物
适合的碳底物可包括但不限于单糖，诸如果糖或葡萄糖；低聚糖诸如乳糖、麦芽糖、半乳糖、或蔗糖；多糖诸如淀粉或纤维素，或它们的混合物和来自可再生的原料诸如干酪乳清渗透物、玉米浆、糖用甜菜糖蜜、和大麦芽的未纯化的混合物。其他碳底物可包括乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、或甘油。
“糖”包括单糖诸如果糖或葡萄糖；低聚糖诸如乳糖、麦芽糖、半乳糖、或蔗糖；多糖诸如淀粉或纤维素；C5糖诸如木糖和阿拉伯糖；以及它们的混合物。
此外，碳底物还可以是已被证明可以被代谢转化为关键生物化学中间体的一碳底物诸如二氧化碳、或甲醇。除了一碳和二碳底物之外，甲基营养生物体也已知可以利用多种其他含碳化合物，诸如甲胺、葡糖胺及用于代谢活动的多种氨基酸。例如，甲基营养酵母已知可利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.Growth C1 Compd.，[Int.Symp.]，7th(1993)，415-32，编辑：Murrell，J.Collin；Kelly，Don P.Publisher：Intercept，Andover，UK)。类似地，假丝酵母属的多种菌种将会代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.153：485-489，1990)。因此，预期本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并将仅受限于微生物的选择。
尽管预期以上提及的所有碳底物以及它们的混合物均适用于本发明，但是在一些实施例中，对于经过修饰以利用C5糖的酵母细胞，碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖，或者是它们与C5糖诸如木糖和阿拉伯糖的混合物。蔗糖可来源于可再生的糖源诸如甘蔗、糖用甜菜、木薯、甜高粱、以及它们的混合物。葡萄糖和右旋糖可通过淀粉基原料包括谷物诸如玉米、小麦、黑麦、大麦、燕麦、以及它们的混合物的糖化来源于可再生的谷物来源。此外，可发酵的糖类可通过预处理和糖化过程来源于可再生的纤维素的或木质纤维素的生物质，例如，如美国专利申请公布2007/0031918A1中所述，该专利以引用方式并入本文。生物质包括包含纤维素的材料，以及任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。生物质还可包含附加的组分，例如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的例子包括但不限于：玉米粒、玉米芯、作物残余如玉米壳、玉米秸秆、玉米纤维、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、蔗渣、高粱、大豆、获取自谷物、叶、木屑、锯末、动物粪肥、以及它们的混合物的研磨物的组分。
在一些实施例中，所述碳底物是来源于玉米的葡萄糖。在一些实施例中，所述碳底物是来源于小麦的葡萄糖。在一些实施例中，所述碳底物是来源于甘蔗的蔗糖。
除适合的碳源之外，发酵培养基还可包含本领域的技术人员已知的适合培养物的生长和促进本文所述的酶途径的适合的矿物、盐、辅因子、缓冲液和其他组分。
发酵条件
通常，使细胞在约20℃至约40℃的温度范围内在合适的培养基中生长。本发明中适合的生长培养基包括常规的商品化制备的培养基，诸如沙氏葡糖(SD)液体培养基、酵母培养基(YM)液体培养基、或包含酵母氮源、硫酸铵和右旋糖(作为碳/能源)的液体培养基，或针对大多数酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株的生长优化比例的蛋白胨、酵母提取物、和右旋糖的共混物(YPD培养基)。其他限定或合成生长培养基也可被使用，并且适合特定微生物的生长的培养基将是微生物学或发酵科学领域的技术人员已知的。已知可以直接或间接调节分解代谢物阻遏的试剂的使用，例如环腺苷酸2′：3′-单磷酸，也可以被掺入发酵培养基中。
适合发酵的pH范围是约pH 5.0至约pH 9.0。在一个实施例中，约pH6.0至约pH 8.0被用于初始条件。适宜酵母发酵的pH值范围通常为约pH3.0至约pH 9.0。在一个实施例中，约pH 5.0至约pH 8.0被用于初始条件。适宜其他微生物发酵的pH值范围为约pH 3.0至约pH 7.5。在一个实施例中，约pH 4.5至约pH 6.5被用于初始条件。
发酵可以在有氧或厌氧条件下进行。在一个实施例中，厌氧或微氧条件可被用于发酵。
工业分批和连续发酵
异丁醇或其他发酵产物可使用分批发酵方法被生产。经典的分批发酵是封闭体系，在其中培养基的组成在发酵开始时被设定，并且在发酵过程中不受人工改变。标准的分批体系的变型是补料-分批体系。补料-分批发酵方法也适用于本发明，并且包括典型的分批体系，不同之处在于底物随着发酵过程递增地被添加。当分解代谢物阻遏倾向于抑制细胞的代谢时以及当期望在培养基中具有有限量的底物时，补料-分批体系是有用的。分批发酵和补料-分批发酵在本领域内是常用的且众所周知，并且例子可见于如下文献：Thomas D.Brock，Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.、或Deshpande，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227，1992。
异丁醇或其他发酵产物还可以使用连续发酵方法被生产。连续发酵是一种开放式系统，其中将设定好的发酵培养基连续加入发酵容器(例如生物反应器)，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续发酵一般而言使培养物维持在恒定的高密度，其中细胞主要处于对数期生长。连续发酵考虑到影响细胞生长或终产物浓度的一种因素或任何数量的因素的调节。调节用于连续发酵的营养物质和生长因子的方法以及使产物形成的速率最大化的技术是工业微生物学领域为人们所熟知的，Brock详述了多种方法，参见上文。
预期异丁醇或其他发酵产物的生产可以采用分批、分批补料或连续工艺实施，并且任何已知的发酵模式将是合适的。此外，预期细胞可作为全细胞催化剂被固定在基质上，并经受发酵条件以生产异丁醇。
从发酵培养基分离异丁醇的方法
生物生产的异丁醇或其他发酵的醇可使用本领域已知的用于ABE发酵的方法从发酵培养基中分离(参见，例如，Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.，49：639-648，1998；Groot，等人Process.Biochem.27：61-75，1992；和其中的参考文献)。例如，可通过离心、过滤、滗析等从发酵培养基移除固体。然后，异丁醇可采用诸如蒸馏、共沸蒸馏、液-液提取、吸附、气提、膜蒸发、全蒸发或它们的组合的方法从发酵培养基中分离。
因为异丁醇与水形成低沸点的共沸混合物，蒸馏可被用于分离混合物直至其共沸组成。蒸馏可与其他分离方法结合使用，以获得共沸物附近的分离。可与蒸馏结合使用以分离并纯化异丁醇的方法包括但不限于滗析、液-液提取、吸附和基于膜的技术。此外，可使用共沸蒸馏用夹带剂(参见，例如，Doherty和Malone，Conceptual Design of Distillation Systems，McGraw Hill，New York，2001)分离异丁醇。
异丁醇-水混合物形成非均相共沸物，使得蒸馏可与滗析结合使用以分离并纯化异丁醇。在该方法中，包含异丁醇的发酵液被蒸馏至接近共沸组成。然后，浓缩共沸混合物，通过滗析从发酵培养基分离异丁醇。滗出的水相可作为回流返回至蒸馏塔。富含异丁醇的滗析有机相还可通过蒸馏(例如，在第二蒸馏塔中)进一步被纯化。
也可使用液-液提取结合蒸馏从发酵培养基中分离异丁醇。在该方法中，利用使用适当溶剂的液-液提取从发酵液提取异丁醇。然后蒸馏含异丁醇的有机相以从溶剂中分离异丁醇。
蒸馏结合吸附也可用于从发酵培养基中分离异丁醇。在该方法中，包含异丁醇的发酵液蒸馏至接近共沸组成，然后通过使用吸附剂诸如分子筛(Aden等人，Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design andEconomics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and EnzymaticHydrolysis for Corn Stover，报告NREL/TP-510-32438，National RenewableEnergy Laboratory，2002年6月)除去残留的水分。
此外，可使用蒸馏结合全蒸发从发酵培养基中分离并纯化异丁醇。在该方法中，将包含异丁醇的发酵液蒸馏至接近共沸组成，然后通过亲水性膜利用全蒸发来除去剩余的水(Guo等人，J.Membr.Sci.，245：199-210，2004)。其他蒸馏方法也可被使用，包括美国专利申请公布2011/0162953；美国专利申请公布2011/0162954；美国专利申请公布2011/0288345；美国专利申请公布2011/0288344；和美国专利申请公布2011/0315541中所描述的那些；它们每个全文以引用方式并入本文。
原位产物移除(ISPR)(也被称为提取发酵)可用于从生产其的发酵容器中移出异丁醇或其它发酵性醇类，从而使微生物能够以高收率生产异丁醇。如本领域已描述的用于移出发酵性醇类的一种ISPR方法是液-液提取。概括地讲，就异丁醇发酵而言，例如，使包含微生物的发酵培养基在异丁醇浓度达到毒性水平之前的时间与提取剂(例如有机提取剂)接触。提取剂和所述发酵培养基形成两相混合物。进入提取剂相的异丁醇部分降低了包含微生物的水相中的浓度，从而限制了微生物在抑制性的异丁醇中的暴露。
液-液提取可按照，例如，美国专利申请公布2009/0305370中所描述的方法进行，其公开内容全文并入本文。美国专利公开申请公布2009/0305370描述了产生并使用液-液提取从发酵液中回收异丁醇的方法，所述方法包括使发酵液与与水不混溶的提取剂接触以形成包含水相和有机相的两相混合物的步骤。提取剂可以是选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的C12至C22脂肪醇、C12至C22脂肪酸、C12至C22脂肪酸的酯、C12至C22脂肪醛、以及它们的混合物的有机提取剂。用于ISPR的提取剂可以是非醇提取剂。ISPR提取剂可以是外源有机提取剂，诸如油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、十四醇、硬脂醇、烷基烷醇、1-十一醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、十一醛、月桂醛、20-甲基十一醛、三辛基氧化膦、以及它们的混合物。其他提取剂和方法描述于美国专利申请公布2010/0143994；美国专利申请公布2010/0143995；美国专利申请公布2010/0143992；美国专利申请公布2010/0143993；美国专利申请公布2011/0097773；美国专利申请公布2011/0159558；美国专利申请公布2011/0136193中；它们每个全文以引用方式并入本文。
在一些实施例中，通过使发酵培养基中的醇与有机酸(例如，脂肪酸)和能够使所述醇与所述有机酸酯化的催化剂接触，可以形成酯。在此类实施例中，所述有机酸可作为ISPR提取剂，其中分配了醇酯。所述有机酸可被提供至发酵容器和/或来源于添加至发酵容器中提供可发酵碳的生物质。原料中存在的脂质可被催化水解为有机酸，并且相同的催化剂(例如，酶)可将有机酸和醇酯化。所述催化剂可在发酵前被提供至原料，或者可在提供原料前或与其同时被提供到发酵容器中。当所述催化剂被提供至发酵容器中时，可通过所述脂类水解为有机酸和基本上同时发生的有机酸与发酵容器中存在的醇的酯化反应，而获得醇酯。非来源于原料的有机酸和/或天然的油也可被添加至发酵容器中，其中所述天然的油被水解为有机酸。任何未与醇酯化的有机酸均可作为ISPR提取剂的一部分。包含醇酯的提取剂可以被从发酵培养基分离，并且可从所述提取剂回收醇。在一些实施例中，提取剂可被再循环至发酵容器中。因此，就异丁醇的生产而言，例如，异丁醇向酯的转化降低了发酵培养基中的游离异丁醇浓度，保护了微生物免受提高的异丁醇浓度的毒性作用影响。此外，未分级的谷物可用做原料而不用分离其中的脂类，因为这些脂类可被催化水解为有机酸，从而降低ISPR提取剂中脂类积累速率。其他醇产物回收和/或ISPR方法可以被采用，包括美国专利申请公布2009/0305370；美国专利申请公布2010/0221802；美国专利申请公布2010/0279370；美国专利申请公布2011/0097773；美国专利申请公布2011/0312044；美国专利申请公布2011/0312043；美国专利申请公布2012/0035398；美国专利申请公布2012/0211348；和美国专利申请公布2012/0156738中所描述的那些；它们每个全文以引用方式并入本文。
原位产物移除可以以分批模式或连续模式进行。在连续模式的ISPR中，产物被连续地从发酵容器(例如，反应器)中移出。在分批模式的ISPR中，将一定体积的有机提取剂加入到发酵容器并且提取剂在该过程期间不被除去。就ISPR而言，有机提取剂可以在发酵开始的时候与发酵培养基接触，从而形成一种双相的发酵培养基。作为另外一种选择，所述有机提取剂可以在当所述微生物已达到所期望的生长量之后接触发酵培养基，其中所述生长量的达到可以通过测定培养物的光密度而确定。另外，有机提取剂可在发酵培养基中的醇水平达到预先选定的水平时接触发酵培养基。在按照本发明的一些实施例的异丁醇生产的情况下，所述有机酸提取剂可在发酵培养基中的异丁醇浓度到达毒性水平之前接触发酵培养基，以便使异丁醇与有机酸酯化产生异丁醇酯，从而降低异丁醇在发酵容器中的浓度。在获得了期望的有效异丁醇酯滴度后，可从发酵容器中移出包含酯的有机相(并与构成水相的发酵液分离)。在一些实施例中，包含酯的有机相在发酵容器中可用的可发酵糖的发酵基本上完成之后被从水相分离。任何阶段中的异丁醇滴度能够通过本领域中已知的方法被测定，诸如通过高效液相色谱法(HPLC)或气相色谱法，如例如美国专利申请公布2009/0305370中所述，该文献以引用方式并入本文。
实例
本发明将在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，尽管这些实例说明了本发明的实施例，但仅是以例证的方式给出的。从上文的讨论和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本发明的特性，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能对本发明进行各种变化和修改以适应不同的用途和条件。
一般方法
在实例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且被Sambrook等人(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，(Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，1989)和Ausubel等人(Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，由Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版，1987)进行了描述。
适于细菌培养物维持和生长的材料和方法是本领域所熟知的。下列实例中适用的技术描述可在下列文献中查到：Manual of Methods for GeneralBacteriology(Phillipp等人编辑，American Society for Microbiology，Washington，DC.，1994)或Thomas D.Brock((Brock，Biotechnology：ATextbook of Industrial Microbiology，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)中。除非另外指明，用于细菌细胞生长和维持的所有试剂、限制性酶和材料得自Sigma-Aldrich Chemicals(St.Louis，MO)、BD Diagnostic Systems(Sparks，MD)、Invitrogen(Carlsbad，CA)、HiMedia(Mumbai，India)、SD Fine chemicals(India)、或Takara Bio Inc.(Shiga，Japan)。
缩写的含义如下：“sec”指秒，“min”指分钟，“h”指小时，“nm”指纳米，“uL”指微升，“mL”指毫升，“mg/mL”指毫克每毫升，“L”指升，“nm”指纳米，“mM”指毫摩尔，“M”指摩尔，“mmol”指毫摩尔，“μmole”指微摩尔，“kg”指千克，“g”指克，“μg”指微克，“ng”指纳克，“PCR”指聚合酶链反应，“OD”指光密度，“OD600”指在600nm波长下测量的光密度，“kDa”指千道尔顿，“g”也可指引力常数，“bp”指碱基对，“kbp”指千碱基对，“kb”指千碱基，“％”指百分比，“％w/v”指重量/体积百分比，“％v/v”指体积/体积百分比，“HPLC”指高效液相色谱，“g/L”指克每升，“μg/L”指微克每升，“ng/μL”指纳克每微升，“pmol/μL”指皮摩尔每微升，“RPM”指每分钟转数，“μmol/min/mg”指微摩尔每分钟每毫克，“w/v”指每单位体积重量，“v/v”指每单位体积体积。
实例1
具有PDE1缺失的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株的构建
菌株PNY1500来源于CEN.PK 113-7D(CBS 8340；CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre(Netherlands)并包含URA3和HIS3基因的缺失。
URA3缺失
为删除内源URA3编码区，ura3::loxP-kanMX-loxP以盒聚合酶链反应扩增自pLA54模板DNA(SEQ ID NO：132)。pLA54包含乳酸克鲁维酵母(K.lactis)TEF1启动子和kanMX标记，并且侧接了loxP位点以允许Cre重组酶参与重组并移除标记。使用DNA聚合酶(New EnglandBioLabs Inc(Ipswich，MA))和引物BK505与BK506(SEQ ID NO：133和134)进行PCR。所述每个引物的URA3部分来源于URA3启动子上游5′区，和编码区下游3′区，使得loxP-kanMX-loxP标记的整合导致URA3编码区的替换。利用标准基因技术(Methods in Yeast Genetics，2005，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)将所述PCR产物转化到CEN.PK 113-7D中并且于30℃在包含G-418(，100μg/mL)的YPD上选择转化体。通过PCR筛选转化体以确认正确的整合，所用引物为LA468和LA492(SEQ ID NO：135和136)，并命名为CEN.PK 113-7D ura3Δ::kanMX。
HIS3缺失
通过改编自Akada等人(Yeast 23：399-405，2006)的无痕删除方法进行了HIS3的删除。用于无痕删除的PCR盒通过重叠PCR组合四个片段(A-B-U-C)制备。所述PCR盒包含一个选择/反选标记，URA3(片段U)，由天然的CEN.PK 113-7D URA3基因，连同启动子(URA3基因上游250bp)和终止子(URA3基因下游150bp)区组成。片段A和C每个长500bp，它们对应于紧接靶基因(片段A)上游的500bp和靶基因3′的500bp(片段C)。片段A和C被用于通过同源重组将所述盒整合进染色体。片段B(500bp长)对应于紧接靶基因的500bp下游，并被用于通过同源重组从染色体切除URA3标记和片段C，因为当所述盒被整合进染色体中时，产生了对应于片段B的序列的直接重复。
用于无痕HIS3删除的PCR盒的四个片段的扩增使用HighFidelity PCR Master Mix(New England BioLabs Inc.(Ipswich，MA))并用CEN.PK 113-7D基因组DNA作为模板，用Yeast/Bact试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。HIS3片段A的扩增使用引物oBP452(SEQ ID NO：137)和引物oBP453(SEQ ID NO：138)，其包含与HIS3片段B的5′端同源的5′尾。HIS3片段B的扩增采用引物oBP454(SEQ IDNO：139)，其包含与HIS3片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP455(SEQ ID NO：140)，其包含与HIS3片段U的5′端同源的5′尾。HIS3片段U的扩增采用引物oBP456(SEQ ID NO：141)，其包含与HIS3片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP457(SEQ ID NO：142)，其包含与HIS3片段C的5′端同源的5′尾。HIS3片段C的扩增采用引物oBP458(SEQ ID NO：143)，其包含与HIS3片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP459(SEQ IDNO：144)。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen，Valencia，CA)纯化。HIS3片段AB通过混合HIS3片段A和HIS3片段B并用引物oBP452(SEQ ID NO：137)和oBP455(SEQ ID NO：140)进行扩增的重叠PCR构建的。HIS3片段UC是通过混合HIS3片段U和HIS3片段C并用引物oBP456(SEQ ID NO：141)和oBP459(SEQ ID NO：144)进行扩增的重叠PCR构建的。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上，然后通过Gel Extraction kit(Qiagen(Valencia，CA))纯化。HIS3ABUC盒通过混合HIS3片段AB和HIS3片段UC并用引物oBP452(SEQ ID NO：137)和oBP459(SEQ IDNO：144)进行扩增的重叠PCR构建的。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen(Valencia，CA))纯化。
制备CEN.PK 113-7D ura3Δ::kanMX的感受态细胞，并用HIS3ABUCPCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(ZymoResearch Corporation(Irvine，CA))。转化混合物在30℃被接种至缺少尿嘧啶的补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上具有his3敲除的转化体用PCR进行筛选，所用引物为oBP460(SEQ ID NO：145)和oBP461(SEQID NO：146)，使用用Yeast/Bact试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备的基因组DNA。选择了一株正确的转化体作为菌株CEN.PK 113-7D ura3Δ::kanMX his3Δ::URA3。
KanMX标记从ura3Δ位点的移除和URA3标记从his3Δ位点的移除
使用Frozen-EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(Zymo ResearchCorporation(Irvine，CA))，通过用pRS423::PGAL1-cre(SEQ ID NO：147)转化CEN.PK 113-7D ura3Δ::kanMX his3Δ::URA3，并在30℃接种至缺少组氨酸和尿嘧啶并补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上，移除了KanMX标记。转化体于30℃在补充了10g/L半乳糖的YP上生长～6个小时以诱导CRE重组酶和KanMX标记的切除，并在30℃接种至YPD(20g/L葡萄糖)平板上进行恢复。分离物在YPD中过夜生长并在30℃接种至包含5-氟-乳清酸(5-FOA，1g/L)的合成完全培养基上以选择失去了URA3标记的分离物。抗5-FOA的分离物被接种到YPD上并在其中生长，以移除pRS423::PGAL1-cre(SEQ ID NO：147)质粒。通过在YPD+G-418平板、缺少尿嘧啶的合成完全培养基平板、和缺少组氨酸的合成完全培养基平板上的生长测定，检测分离物中KanMX标记、URA3标记、和pRS423::PGAL1-cre质粒的丢失。选择了对G-418敏感并且是尿嘧啶和组氨酸营养缺陷型的正确的分离物作为菌株CEN.PK 113-7D ura3Δ::loxP his3Δ，并命名为PNY1500(BP857)。所述缺失和标记移除通过PCR和测序确认，所用引物对于ura3Δ为oBP450(SEQ ID NO：148)和oBP451(SEQ ID NO：149)，对于his3Δ为引物oBP460(SEQ ID NO：145)和oBP461(SEQ ID NO：146)，并使用了用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备的基因组DNA。
在PNY01500单倍体菌株中进行了基因删除。通过与包含与靶基因同源的上游和下游的盒的同源重组，构建了染色体基因删除。使用G-418抗性标记或在缺少尿嘧啶的培养基上生长，选择了转化体。使用具有待破坏的基因上游和下游50-55bp侧接的特异性引物，通过PCR构建了基因破坏盒。利用Cre-lox系统实现了标记的循环利用。
为了删除内源性PDE1编码区，从pLA59(SEQ ID NO：150)PCR扩增了删除盒，其包含URA3p-URA3-URA3t盒，侧接了退化的loxP71和loxP66位点，用于URA3标记的移除。PCR使用DNA聚合酶(New England BioLabs Inc.(Ipswich，MA))和引物PDE1F URA3(SEQID NO：151)和PDE1R URA3(SEQ ID NO：152)进行。使用标准的基因技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，第201-202页)将PCR产物转化到PNY01500中，并在合成完全培养基(1X不含氨基酸的酵母氮源、1X缺少尿嘧啶并补充了20g/L葡萄糖的氨基酸混合物)上于30℃进行选择。通过菌落PCR筛选了转化体，使用了用以验证上述整合盒的存在的引物URA IR和PDE1F(SEQ IDNO：153和154)，和引物URAIF和PDE1R(SEQ ID NO：155和156)。为了除去上述盒的URA3标记，用pRS423::GAL1p-cre(SEQ ID NO：147)转化了细胞，并于30℃在缺少组氨酸的合成完全培养基(1X酵母氮源、1X无组氨酸的氨基酸混合物，补充了20g/L葡萄糖)上选择转化体。将转化体接种在补充了5g/L半乳糖的酵母提取物+蛋白胨(YP)琼脂平板上，以诱导Cre重组酶的表达。通过将菌落点种到缺少尿嘧啶并补充了20g/L葡萄糖的合成完全培养基上，以验证生长的不存在，确认了标记的移除。使用引物PDE1F和PDE1R(SEQ ID NO：154和156)，并用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备的基因组DNA，还通过PCR和测序确认了缺失和标记的移除。所得到的PNY01500的PDE1缺失菌株被命名为PNY03001(MATa ura3Δ::loxP his3Δpde1Δ::loxp71/66)。
实例2
用于生产异丁醇的菌株的构建
通过在转动架上于30℃在2mL孢子生成前培养基(0.8％酵母提取物、0.3％蛋白胨、10％葡萄糖)中生长过夜，然后1∶10稀释在新鲜的孢子生成前培养基中并再生长4小时，测试了酵母菌株PNY860(ATCC专利保藏物命名PTA-12007，保藏于2011年7月21日)的孢子生成能力(Codón，等人Appl.Environ.Microbiol.61：630-638，1995)。通过离心回收了细胞，重悬在2mL孢子生成培养基(0.5％乙酸钾)中，并在转动架上于30℃温育4天。显微镜检查显示发生了孢子生成。大约30％的细胞是子囊的形式，大约一半的子囊包含四个孢子。通过离心回收了孢子生成培养物(100μL)并重悬在(50μg/mL 1M山梨醇)中，并于室温温育20分钟。将一份等分试样(5μL)转移至皮氏培养皿，按照制造商的说明书，使用Singer MSM解剖显微镜(Singer Instrument Co.Ltd.(Somerset UK))解剖了18个四分体。于30℃温育平板3天，对孢子活力进行评分。图1显示了四分体解剖平板。
为了鉴定接合型，通过菌落PCR分析了来自两个四分体的四个孢子菌落(参见，例如，Huxley，等人Trends Genet.6：236，1990)，PCR使用了High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs Inc.(Ipswich，MA))和三种寡核苷酸引物，AK09-1_MAT(SEQ ID NO：272)、AK09-2_HML(SEQ ID NO：273)、和AK09-03_HMR(SEQ ID NO：274)。
通过悬浮在0.02M NaOH中并加热至99℃10分钟，裂解了来自菌落的细胞。然后，在PCR反应中将上述细胞裂解物的一部分用作模板，PCR按照制造商所建议的使用了Taq聚合酶(Promega(Madison WI))。通过琼脂糖凝胶电泳分析了PCR产物。预期接合型α的菌株产生404bp的产物，预期接合型a的菌株产生544bp的产物，而二倍体应当产生两个条带。图2显示了亲本菌株PNY860产生了两个条带，而孢子子代仅产生了一个显著的条带，为～400bp或～550bp(尽管有一些产生了其他大小的模糊条带)。这些结果表明，PNY860是二倍体，并且主要是异宗配合的(尽管可能发生了低水平的接合型转换)。
基于PCR片段大小，能够推论接合型如下文的表4：
表4
酵母菌株 接合型
PNY860 二倍体
PNY860-1A a
PNY860-1B α
PNY860-1C a
PNY860-1D α
PNY860-2A a
PNY860-2B α
PNY860-2C a
PNY860-2D α
为了确认这些指配，使来自四分体1(PNY860-1)的孢子杂交，通过在显微镜下观察接合子的形成对接合进行了评分，得到了表5中的下列结果：
表5
横向 预期的 观察到的
A×B 接合 接合
C×D 接合 接合
A×C 无接合 无接合
C×D 无接合 无接合
对酵母菌株命名如下：PNY860-1A被命名为PNY891、PNY860-1B被命名为PNY0892、PNY860-1C被命名为PNY893、而PNY860-1D被命名为PNY0894。
选择了单倍体菌株(PNY891 MATa和PNY0894 MATα)作为用于异丁醇生产的宿主。在上述单倍体菌株中进行了基因删除和整合，以构建适合异丁醇生产的菌株背景。通过与包含与靶基因同源的上游和下游、或用于选择转化体的G-418抗性标记或URA3基因的PCR盒的同源重组，进行了染色体的基因删除。对于基因的整合，待整合的基因被包含在了PCR盒中。使用Cre-lox系统或无痕删除方法(Akada，等人Yeast23：399，2006)实现了选择性标记的循环利用。
首先，在PNY891 MATa中进行了基因删除(URA3、HIS3、PDC6、和PDC1)并整合(ilvD进入PDC1位点)，以构建PNY1703(＝MATaura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD)。其次，使PNY1703与PNY0894 MATα接合以产生二倍体。使得到的二倍体生成孢子，然后解剖四分体，针对在葡萄糖和乙醇培养基上的生长表型和携带ura3Δ::loxPhis3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD的基因型，对孢子分离子进行了筛选。分离了两种接合型单倍体，PNY1713(＝MATα ura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD)和PNY1714(＝MATa ura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD)。第三，在PNY1714菌株背景中进行了基因删除(PDC5、FRA2、GPD2、BDH1、和YMR226c)并整合(kivD、ilvD、alsS、和ilvD-adh分别进入PDC5、FRA2、GPD2、和BDH1位点)，以构建PNY1758(＝MATa ura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvDpdc5Δ::kivD(y)fra2Δ::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)gpd2Δ::loxP71/66-FBA1p-alsS bdh1Δ::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-ILV5p-adh ymr226cΔ)。第四，用包含K9D3.KARI基因的pWZ009(SEQ ID NO：158)和包含ilvD基因的pWZ001(SEQ ID NO：159)这两种质粒转化了PNY1758，以构建产异丁醇菌PNY1775(＝MATa ura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD pdc5Δ::kivD(y)fra2Δ::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)gpd2Δ::loxP71/66-FBA1p-alsSbdh1Δ::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-ILV5p-adh ymr226cΔ/pWZ009，pWZ001)。
URA3缺失
为了删除内源性URA3编码区，从pLA54(SEQ ID NO：132)PCR扩增了删除盒，其包含侧接了loxP位点的TEF1p-kanMX-TEF1t盒，以允许体内同源重组和KanMX标记随后的移除。PCR使用DNA聚合酶(NewEngland BioLabs Inc.(Ipswich，MA))和引物BK505(SEQ ID NO：133)和BK506(SEQ ID NO：134)进行。所述每个引物的URA3部分来源于URA3ATG 180bp上游的5′区，和编码区78bp下游的3′区，使得KanMX盒的整合导致URA3编码区的替换。使用标准的基因技术(Methods in YeastGenetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)将PCR产物转化到单倍体菌株PNY891中，并于30℃在补充了2％葡萄糖和G-418(100μg/mL)的丰富培养基上选择转化体。将转化体点种在补充了2％葡萄糖的丰富培养基上，复制物接种在缺少尿嘧啶并补充了2％葡萄糖的合成的完全培养基上，以鉴定尿嘧啶营养缺陷型。使用引物LA468(SEQ ID NO：135)和LA492(SEQ ID NO：136)，通过菌落PCR筛选了这些菌斑，以验证上述整合盒的存在。得到了URA3突变体；NYLA96(＝MATa ura3Δ::loxP-kanMX-loxP)。
HIS3缺失
为了删除内源性HIS3编码区，从pLA33(SEQ ID NO：160)PCR扩增了删除盒，其包含侧接了loxP位点的URA3p-URA3-URA3t盒，以允许体内同源重组和URA3标记随后的移除。PCR使用DNA聚合酶(NewEngland BioLabs Inc.(Ipswich，MA))和引物315(SEQ ID NO：161)和316(SEQ ID NO：162)进行。所述每个引物的HIS3部分来源于HIS3 ATG 50bp上游的5′区，和编码区50bp下游的3′区，使得URA3盒的整合导致HIS3编码区的替换。使用标准的基因技术(Methods in Yeast Genetics，2005，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)将PCR产物转化到NYLA96中，并于30℃在缺少尿嘧啶并补充了2％葡萄糖的合成的完全培养基上进行选择。使用引物92(SEQ ID NO：163)和346(SEQID NO：164)，通过菌落PCR筛选了转化体，以验证上述整合盒的存在。通过用pRS423::GAL1p-cre(SEQ ID NO：147)转化并于30℃接种在缺少组氨酸并补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上，循环利用了URA3标记。将转化体接种在补充了0.5％半乳糖的酵母提取物+蛋白胨(YP)琼脂平板上，以诱导Cre重组酶的表达。通过将菌落点种到缺少尿嘧啶并补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上，以验证生长的不存在，确认了标记的移除。另外，通过将菌落于30℃点种至补充了2％葡萄糖和G-418(100μg/mL)的丰富培养基以验证生长的不存在，确认了用于删除URA3的KanMX盒的标记移除。所得到的URA3和HIS3缺失菌株被命名为NYLA107(＝MATaura3Δ::loxP his3Δ::loxP)。
PDC6缺失
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有三个PDC基因(PDC1、PDC5、PDC6)，编码丙酮酸脱羧酶的三种不同的同功酶。丙酮酸脱羧酶催化乙醇发酵的第一个步骤，从糖酵解中所生成的丙酮酸产生乙醛。
按照无痕删除方法(Akada，等人Yeast 23：399，2006)，通过与包含与PDC6编码区同源的上游(片段A)和下游(片段B)、用于选择转化体的连同启动子(URA3基因的250bp上游)和终止子(URA3基因的150bp下游)的URA3基因(片段U)、和PDC6编码区的3′区(片段C)的PCR盒(A-B-U-C)的同源重组，删除了PDC6编码序列。用于PDC6无痕删除的PCR盒的四个片段(A、B、U、C)，是以PNY891基因组DNA作为模板，使用High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabsInc.(Ipswich，MA))扩增的。PNY891基因组DNA是用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备的。PDC6片段A的扩增使用引物oBP440(SEQ ID NO：165)和引物oBP441(SEQ ID NO：166)，其包含与PDC6片段B的5′端同源的3′尾。PDC6片段B的扩增使用引物oBP442(SEQ ID NO：167)，其包含与PDC6片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP443(SEQ ID NO：168)，其包含与PDC6片段U的5′端同源的5′尾。PDC6片段U使用引物oBP444(SEQ ID NO：169)，其包含与PDC6片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP445(SEQ ID NO：170)，其包含与PDC6片段C的5′端同源的5′尾。PDC6片段C的扩增使用引物oBP446(SEQ ID NO：171)，其包含与PDC6片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP447(SEQ ID NO：172)。PCR产物用PCR Purificationkit(Qiagen(Valencia，CA))纯化。PDC6片段A-B通过混合PDC6片段A和PDC6片段B并用引物oBP440(SEQ ID NO：165)和oBP443(SEQ ID NO：168)进行扩增的重叠PCR构建的。PDC6片段U-C通过混合PDC6片段U和PDC6片段C并用引物oBP444(SEQ ID NO：169)和oBP447(SEQ IDNO：172)进行扩增的重叠PCR构建的。通过在琼脂糖凝胶上，然后使用凝胶提取试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))凝胶纯化了所得到的PCR产物。PDC6A-B-U-C盒通过混合PDC6片段A-B和PDC6片段U-C并用引物oBP440(SEQ ID NO：165)和oBP447(SEQ ID NO：172)进行扩增的重叠PCR构建的。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen(Valencia，CA))纯化。
制备了NYLA107的感受态细胞，并用PDC6 A-B-U-C PCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(Zymo ResearchCorporation(Irvine，CA))。转化混合物于30℃接种在缺少尿嘧啶并补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上。具有pdc6敲除的转化体用PCR进行筛选，所用引物为oBP448(SEQ ID NO：173)和oBP449(SEQ ID NO：174)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备。为了从染色体移除URA3标记，使正确的转化体在YPD中生长过夜，并于30℃接种到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的分离物。所述缺失和标记移除通过PCR和测序确认，所用引物为oBP448(SEQ ID NO：173)和oBP449(SEQ ID NO：174)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备。来自分离物的PDC6基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，所用PDC6的编码序列的特异性引物为oBP554(SEQ ID NO：175)和oBP555(SEQ ID NO：176)。选择了正确的分离物作为菌株PNY1702(＝MATa ura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6Δ)。
PDC1缺失和ilvD整合
通过与包含与PDC1编码区同源的上游(片段A)和下游(片段B)、ilvD编码区(片段ilvD)、用于选择转化体的连同启动子和终止子的URA3基因(片段U)、和PDC1编码区的3′区(片段C)的PCR盒(A-ilvD-B-U-C)的同源重组，删除了PDC1编码区并替换为来自变异链球菌(Streptococcus mutans)ATCC No.700610的ilvD编码区。对于用于PDC1缺失-ilvD整合的PCR盒，使用High Fidelity PCR Master Mix(NewEngland BioLabs Inc.(Ipswich，MA))并以用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备的NYLA83(描述于美国专利申请公布2011/0312043中，该文献以引用方式并入本文)基因组DNA作为模板，扩增了随后为来自变异链球菌(Streptococcus mutans)的ilvD编码区的A片段。PDC1片段A-ilvD的扩增使用引物oBP513(SEQ ID NO：177)和引物oBP515(SEQ ID NO：178)，其包含与PDC1片段B的5′端同源的5′尾。对于用于PDC1缺失-ilvD整合的PCR盒，使用High Fidelity PCRMaster Mix(New England BioLabs Inc.(Ipswich，MA))并以用 Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备的PNY891基因组DNA作为模板，扩增了B、U、和C片段。PDC1片段B的扩增使用引物oBP516(SEQ ID NO：179)，其包含与PDC1片段A-ilvD的3′端同源的5′尾，和引物oBP517(SEQ ID NO：180)，其包含与PDC1片段U的5′端同源的5′尾。PDC1片段U的扩增使用引物oBP518(SEQ ID NO：181)，其包含与PDC1片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP519(SEQ ID NO：182)，其包含与PDC1片段C的5′端同源的5′尾。PDC1片段C的扩增使用引物oBP520(SEQ ID NO：183)，其包含与PDC1片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP521(SEQ ID NO：184)。PCR产物用PCR Purificationkit(Qiagen(Valencia，CA))纯化。PDC1片段A-ilvD-B通过混合PDC1片段A-ilvD和PDC1片段B并用引物oBP513和oBP517进行扩增的重叠PCR构建的。PDC1片段U-C通过混合PDC1片段U和PDC1片段C并用引物oBP518(SEQ ID NO：181)和oBP521(SEQ ID NO：184)进行扩增的重叠PCR构建的。通过在琼脂糖凝胶上，然后使用凝胶提取试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))凝胶纯化了所得到的PCR产物。PDC1 A-ilvD-B-U-C盒通过混合PDC1片段A-ilvD-B和PDC1片段U-C并用引物oBP513(SEQID NO：177)和oBP521(SEQ ID NO：184)进行扩增的重叠PCR构建的。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen(Valencia，CA))纯化。
制备了PNY1702的感受态细胞，并用PDC1 A-ilvD-B-U-C PCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(Zymo ResearchCorporation(Irvine，CA))。转化混合物于30℃被接种在补充了2％的葡萄糖、不含尿嘧啶补充剂的合成完全培养基上。具有pdc1敲除ilvD整合的转化体用PCR进行筛选，所用引物为oBP511(SEQ ID NO：185)和oBP512(SEQ ID NO：186)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备。来自分离物的PDC1基因的不存在通过PCR阴性结果来证明，所用PDC1的编码序列的特异性引物为oBP550(SEQ ID NO：187)和oBP551(SEQ ID NO：188)。为了从染色体移除URA3标记，使正确的转化体在YPD中生长过夜，并于30℃接种到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的分离物。PDC1的缺失、ilvD的整合、和标记的移除是通过PCR确认的，所用引物为ilvDSm(1354F)(SEQ ID NO：189)和oBP512(SEQ ID NO：186)，并用引物ilvDSm(788R)(SEQ ID NO：190)和ilvDSm(1354F)(SEQ ID NO：189)进行测序，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备。选择了正确的分离物作为菌株PNY1703(＝MATa ura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD)。
进行了PNY1703 MATa×PNY0894 MATα接合、孢子生成、和四分体解剖，以分离PNY1713(＝MATαura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD)和PNY1714(＝MATa ura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD)。
通过于30℃在YPD上杂交PNY1703 MATa和PNY0894 MATα过夜，产生了二倍体(MATa/α)细胞。将可能的二倍体划线接种到YPD平板上并于30℃温育4天，以分离单菌落。为了鉴定二倍体，进行了菌落PCR(Huxley，等人，Trends Genet.6：236，1990)，PCR使用了High Fidelity PCRMaster Mix(New England BioLabs Inc.(Ipswich，MA))和三种寡核苷酸引物：对应于在MAT基因座右翼并指向MAT基因座的序列的MAT1(SEQ ID NO：191)，对应于位于MATα和HMLα的α-特异性区内的序列的MAT2(SEQID NO：192)，和对应于位于MATa和HMRa的a-特异性区内的序列的MAT3(SEQ ID NO：193)。通过MATα-特异性的404bp和MATa-特异性的544bp两种PCR产物的产生，确定了二倍体菌落。使得到的二倍体生长在孢子生成前培养基中生长，然后接种至孢子生成培养基中(Codón，等人，ApplEnviron Microbiol.61：630，1995)。3天后，通过显微镜检测了孢子生成效率。用0.05mg/mL(Zymo Research Corporation(Irvine，CA))；使用来自Methods in Yeast Genetics，2000，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(Cold Spring Harbor，NY)的方法消化了孢子。解剖了八(8)个YPD上的四分体平板(18个四分体每平板，总计144个四分体，576个孢子)，并置于30℃4天。为了针对基因型ura3Δ和his3Δ以及在乙醇和葡萄糖培养基上的生长表型筛选孢子子代，使用酵母复制物接种设备(Corastyles(Hendersonville，NC))，对YPD平板上的孢子顺序地将复制物接种在：1)缺少尿嘧啶(ura)并补充了2％葡萄糖的合成完全(SC)培养基，2)缺少组氨酸(his)并补充了2％葡萄糖的SC，然后是3)补充了0.5％乙醇培养基的SC。选择在SC-ura和SC-his平板上生长失败，但在SC+0.5％乙醇和YPD平板上生长的孢子，并进行PCR分析以确定它们的接合型(Huxley，等人，Trends Genet.6：236，1990)。为了确定孢子是否包含pdc1Δ::ilvD，使用引物oBP512(SEQ ID NO：186)和ilvDSm(1354F)(SEQ IDNO：189)，通过菌落PCR检测了所选择的孢子。包含pdc1Δ::ilvD的孢子产生预期的962bp的PCR产物，但没有该缺失的那些不产生PCR产物。然后针对PDC6的缺失，PCR检测了阳性的孢子，所用引物为BP448(SEQ IDNO：173)和BP449(SEQ ID NO：174)。预期的PCR片段大小就包含pdc6Δ的细胞而言是1.3kbp，就包含野生型PDC6基因的细胞而言是2.9kbp。针对两种接合型选择了正确的分离物，并命名为PNY1713(＝MATαura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD)和PNY1714(＝MATa ura3Δ::loxPhis3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD)。
PDC5缺失和kivD(y)整合
通过与包含与PDC5编码区同源的上游(片段A)和下游(片段B)、针对在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达经密码子优化的kivD(y)编码区(片段kivD(y))、用于选择转化体的连同启动子和终止子的URA3基因(片段U)、和PDC5编码区的3′区(片段C)的PCR盒(A-kivD(y)-B-U-C)的同源重组，删除了PDC5编码区并替换为来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的kivD编码区。
PDC5片段A扩增自作为模板的PNY891基因组DNA，使用High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs Inc.(Ipswich，MA))并用引物T-A(PDC5)(SEQ ID NO：194)和包含与kivD(y)的5′端同源的3′尾的引物B-A(kivD)(SEQ ID NO：195)进行扩增。kivD(y)编码序列扩增自作为模板的(SEQ ID NO：196)，所用引物为T-kivD(A)(SEQ ID NO：197)，其包含与PDC5片段A的3′端同源的5′尾，和引物B-kivD(B)(SEQ ID NO：198)，其包含与PDC5片段B的5′端同源的3′尾。PDC5片段A-kivD(y)通过混合PDC5片段A和kivD(y)并用引物T-A(PDC5)和B-A(kivD)进行扩增的重叠PCR构建的。PDC5片段B被克隆进pUC19-URA3MCS，以构建PDC5A-kivD(y)-B-U-C PCR盒的B-U部分。所得到的质粒被命名为pUC19-URA3-sadB-PDC5片段B(SEQ ID NO：199)。质粒pUC19-URA3-sadB-PDC5片段B被用作模板，用于扩增PDC5片段B-片段U，使用引物T-B(kivD)(SEQID NO：200)，其包含与kivD(y)片段的3′末端同源的5′尾，和引物oBP546(SEQ ID NO：201)，其包含与PDC5片段C的5′端同源的3′尾。PDC5片段C的扩增使用引物oBP547(SEQ ID NO：202)，其包含与PDC5片段B-片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP539(SEQ ID NO：203)。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen(Valencia，CA))纯化。PDC5片段B-片段U-片段C通过混合PDC5片段B-片段U和PDC5片段C并用引物T-B(kivD)(SEQ ID NO：200)和oBP539(SEQ ID NO：203)进行扩增的重叠PCR构建的。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上，然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))纯化。PDC5 A-kivD(y)-B-U-C盒是通过重叠PCR，通过混合PDC5片段A-kivD(y)片段和PDC5片段B-片段U-PDC5片段C而生成，并用引物T-A(PDC5)(SEQ ID NO：194)和oBP539(SEQ ID NO：203)进行扩增。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen(Valencia，CA))纯化。
制备了PNY1714的感受态细胞，并用PDC5 A-kivD(y)-B-U-C PCRR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(Zymo ResearchCorporation(Irvine，CA))。转化混合物于30℃接种至缺少尿嘧啶并补充了0.5％乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上。具有pdc5敲除kivD整合的转化体用PCR进行筛选，所用引物为oBP540(SEQ ID NO：204)和kivD(652R)(SEQ ID NO：205)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备。来自分离物的PDC5基因的不存在通过PCR阴性结果来证明，所用PDC5的编码序列的特异性引物为oBP552(SEQ ID NO：206)和oBP553(SEQ ID NO：207)。为了从染色体移除URA3标记，使MATα和MATa菌株的每一正确的转化体在YPE(0.5％乙醇)中生长过夜，并于30℃接种在补充了乙醇(无葡萄糖)并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的分离物。PDC5的缺失、kivD(y)的整合以及标记的移除是通过PCR确认的，所用引物为oBP540和oBP541，所用的基因组DNA用 Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备。通过DNA序列确认了kivD(y)编码区的正确整合，使用了引物kivD(652R)(SEQ ID NO：205)、kivD(602F)(SEQ ID NO：208)、和kivD(1250F)(SEQ ID NO：209)。正确的分离物被命名为菌株PNY1716(＝MATa ura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD pdc5Δ::kivD(y))。
FRA2缺失和UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)-TEF1t整合
通过同源重组删除了FRA2编码区并替换为盒UAS(PGK1)-FAB1p-ilvD(y)-TEF1t-HisG-URA3-HisG。盒UAS(PGK1)-FAB1p-ilvD(y)-TEF1t-HisG-URA3-HisG包含杂交启动子UAS(PGK1)-FAB1p、针对在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达经密码子优化的来自变异链球菌(Streptococcus mutans)ATCC No.700610的ilvD(y)编码区、TEF1t终止子、和连同启动子和终止子一起的URA3基因，侧接了HisG片段。
使用限制酶NotI和SalI消化了质粒pRS423-TPI1p-ilvD(y)(SEQ ID NO：210)，并在琼脂糖凝胶上随后用凝胶提取试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))纯化了2,270bp TPI1p-ilvD(y)片段。将TPI1p-ilvD(y)片段克隆进pMOD-URA3r2(SEQ ID NO：211)上的NotI和SalI位点，以构建pMOD-URA3r2-TPI1p-ilvD(y)。pMOD-URA3r2是基于pUC19的，并包含侧接了HisG片段的URA3基因的序列。PCR TEF1t(285bp)扩增自作为模板的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组DNA，使用High Fidelitv PCRMaster Mix(New England BioLabs Inc.(Ipswich，MA))并用引物T-TEF1t(NotI)(SEQ ID NO：212)和引物B-TEF1t(NotI)(SEQ ID NO：213)进行扩增。用限制性酶NotI消化了PCR TEF1t片段，然后克隆进pMOD-URA3r2-TPI1p-ilvD(y)上的NotI位点。使用T-DSmo(RPS5p)(SEQ ID NO：214)和B-TEF1t(NotI)(SEQ ID NO：213)，通过菌落PCR分析以2,009bp的预期大小确认了TEF1t的正确取向。所得到的质粒被命名为pMOD-URA3r2-TPI1p-ilvD(y)-TEF1t。然后，用杂交启动子UAS(PGK1)-FBA1p(SEQ ID NO：215)替换了pMOD-URA3r2-TPI1p-ilvD(y)-TEF1t上的TPI1p启动子。PCRUAS(PGK1)-FBA1p盒扩增自质粒pRS316-UAS(PGK1)-FBA1p-GUS(SEQ IDNO：216)，使用High Fidelity PCR Master Mix(New EnglandBioLabs Inc.(Ipswich，MA))并用引物T-U/PGK1(XhoApa)(SEQ ID NO：217)和引物B-FBA1(SpeI)(SEQ ID NO：218)进行扩增。用限制性酶XhoI和SpeI消化了PCR UAS(PGK1)-FBA1p产物，在琼脂糖凝胶上随后用凝胶提取试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))纯化了PCR片段。用限制性酶SalI和SpeI消化了pMOD-URA3r2-TPI 1p-ilvD(y)-TEF1t，在琼脂糖凝胶上随后用凝胶提取试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))纯化了缺少TPI1p的6,887bp质粒片段。将6,887bp的pMOD-URA3r2--ilvD(y)-TEF1t连接至用XhoI和SpeI消化的UAS(PGK1)-FBA1p产物，以构建pMOD-URA3r2-UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)-TEF1t(SEQ ID NO：219)。PCR盒UAS(PGK1)-FAB1p-ilvD(y)-TEF1t-HisG-URA3-HisG扩增自质粒pMOD-URA3r2-UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)-TEF1t，使用High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabsInc.(Ipswich，MA))并用包含FRA2 ATG 50bp上游的5′区的引物T-FRA(Dsm)(SEQ ID NO：220)，和包含FRA2编码区50bp下游的3′区的引物B-FRA(Dsm)(SEQ ID NO：221)进行扩增。PCR产物用PCR Purificationkit(Qiagen(Valencia，CA))纯化。
制备了PNY1716的感受态细胞，并用PCR盒UAS(PGK1)-FAB1p-ilvD(y)-TEF1t-HisG-URA3-HisG转化，使用Frozen-EZ Yeast TransformationIITM试剂盒(Zymo Research Corporation(Irvine，CA))。转化混合物在30℃接种至缺少尿嘧啶并补充了0.5％乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上。具有fra2敲除UAS(PGK1)-FAB1p-ilvD(y)-TEF1t-HisG-URA3-HisG整合的转化体用PCR进行筛选，所用引物为oBP602(SEQ ID NO：222)和B-TEF1t(NotI)，并使用了用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备的基因组DNA。为了从染色体移除URA3标记，使正确的转化体在YPE(0.5％乙醇)中生长过夜，并于30℃接种在补充了乙醇(无葡萄糖)并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的分离物。通过DNA测序确认了FRA2的缺失、UAS(PGK1)-FAB1p-ilvD(y)-TEF1t的整合、和URA3标记的移除，所用引物为DSm(o)50R(SEQ ID NO：223)、DSm(o)1F(SEQ ID NO：224)、DSm(o)688F(SEQ ID NO：225)、和DSm(o)1352F(SEQ ID NO：226)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备。正确的分离物被命名为菌株PNY1720(＝MATa ura3Δ::loxPhis3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD pdc5Δ::kivD(y)fra2Δ::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y))。
GPD2缺失和FBA1p-alsS整合
通过与包含侧接了退化的loxP71/loxP66位点的URA3p-URA3-URA3t盒、来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FBA1启动子、和来自枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168)的alsS(GenBank No.NC_000964)的PCR盒(URA3-FBA1p-alsS)的同源重组，删除了GPD2编码区并替换为FAB1启动子和alsS编码区。
侧接了loxP71/loxP66位点的PCR URA3p-URA3-URA3t片段扩增自pLA59(SEQ ID NO：150)，使用DNA聚合酶(New England BioLabsInc.(Ipswich，MA))并用包含GPD2 ATG 60bp上游的5′区的引物T-URA(gpd_60bp)(SEQ ID NO：227)和包含与FBA1p-alsS片段的5′端同源的3′尾的引物B-URA(alsS)(SEQ ID NO：228)进行扩增。PCR FBA1p-alsS片段扩增自pUC19-kan::pdc1::FBA-alsS::TRX1(SEQ ID NO：229)，使用DNA聚合酶(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)并用包含与URA3p-URA3-URA3t片段的3′端同源的5′尾的引物T-alsS(URA)(SEQ ID NO：230)和包含GPD2基因60bp下游的3′区的引物B-alsS(gpd_60bp)(SEQ ID NO：231)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上，然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))纯化。URA3-FBA1p-alsS盒是通过混合URA3p-URA3-URA3t片段和FBA1p-alsS片段并用引物T-URA(gpd_60bp)和B-alsS(gpd_60bp)进行扩增的重叠PCR构建的。PCR产物用PCR Purificationkit(Qiagen(Valencia，CA))纯化。
制备了PNY1720的感受态细胞，并用PCR盒URA3-FBA1p-alsS转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(Zymo ResearchCorporation(Irvine，CA)。转化混合物在30℃接种至缺少尿嘧啶并补充了0.5％乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上。具有gpd2敲除URA3-FBAlp-alsS整合的转化体用PCR进行筛选，所用引物为FBA-als1557(SEQ ID NO：232)和gpd2-down178(SEQ ID NO：233)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备。通过用pRS423::PGAL1-cre(SEQ ID NO：147)转化并在30℃接种至缺少组氨酸并补充了0.5％乙醇的合成完全培养基上，循环利用了URA3标记。将转化体划线接种至补充了0.5％乙醇并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，并且在30℃温育以选择失去了URA3标记的分离物。使抗5-FOA的分离物在YPE(0.5％乙醇)上生长，以移除pRS423::PGAL1-cre质粒。通过PCR检测了GPD2的缺失、FBA1p-alsS的整合、和标记的移除，所用引物为gpd2-up229(SEQ ID NO：234)和B-FBA1(SpeI)(SEQ ID NO：218)，并通过DNA测序进行了确认，所用引物为T-alsS(URA)、FBA-als752(SEQ ID NO：235)、FBA-als1557(SEQ ID NO：232)和gpd2-down178，并使用了用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备的基因组DNA。正确的分离物被命名为菌株PNY1725(＝MATaura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD pdc5Δ::kivD(y)fra2Δ::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)gpd2Δ::loxP71/66-FBA1p-alsS)。
BDH1缺失和UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-TEF1t-ILV5p-adh整合
通过同源重组删除了BDH1编码区并替换为盒UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-TEF1t-ILV5p-adh。BDH1缺失和UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-TEF1t-ILV5p-adh整合盒(A-UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-TEF1t-ILV5p-adh-B-U-C)包含与BDH1编码区同源的上游(片段A)和下游(片段B)、杂交启动子UAS(PGK1)-ENO2p、来自变异链球菌(Streptococcus mutans)ATCC No.700610的ilvD编码区、TEF1t终止子、ILV5p启动子、连同来自印度拜叶林克氏菌(Beijerinckia indica)的终止子一起的adh编码区、和用于选择转化体的连同启动子与终止子一起的URA3基因(片段U)、以及BDH1编码区的3′区(片段C)。片段A、UAS(PGK1)-ENO2p、ilvD、TEF1t、ILV5p、adh、片段B、片段U和片段C被克隆进基于pUC19的质粒，以构建pBP1339(＝pA-UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-TEF1t-ILV5p-adh-B-U-C)(SEQID NO：236)。PCR盒A-UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-TEF1t-ILV5p-adh-B-U-C扩增自pBP1339，使用DNA聚合酶(New England BioLabsInc.(Ipswich，MA))并用引物oBP685(SEQ ID NO：237)和oBP690(SEQ IDNO：238)进行扩增。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen(Valencia，CA))纯化。
制备了PNY1725的感受态细胞，并用PCR盒A-UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-TEF1t-ILV5p-adh-B-U-C转化，使用Frozen-EZ Yeast TransformationIITM试剂盒(Zymo Research Corporation(Irvine，CA))。转化混合物在30℃接种至缺少尿嘧啶并补充了0.5％乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上。具有bdh1敲除UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-TEF1t-ILV5p-adh-B-U整合的转化体用PCR进行筛选，所用引物为oBP726(SEQ ID NO：239)和DSm1354F(SEQ ID NO：240)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备。为了从染色体移除URA3标记，使正确的转化体在YPE(0.5％乙醇)中生长过夜，并于30℃接种在补充了乙醇(无葡萄糖)并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的分离物。通过DNA测序确认了BDH1的缺失、UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-TEF1t-ILV5p-adh的整合、和URA3标记的移除，所用引物为DSm788R(SEQ ID NO：241)、DSm696F(SEQ ID NO：242)、DSm1354F(SEQ ID NO：240)、ADHBi643R(SEQ ID NO：243)、和ADHBi554F(SEQ ID NO：244)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备。正确的分离物被命名为菌株PNY1730(＝MATa ura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD pdc5Δ::kivD(y)fra2Δ::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)-gpd2Δ::loxP71/66-FBA1p-alsSbdh1Δ::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-ILV5p-adh)。
YMR226c缺失
使用PCR扩增的2.0kb线性无痕删除盒，通过同源重组在菌株PNY1730中删除了基因YMR226c。所述盒构建自拼接的PCR扩增的片段，包含作为选择性标记的连同其天然启动子和终止子一起的URA3基因、用以促进删除盒的整合和天然插入序列的移除的侧接了YMR226c基因染色体座位的上游和下游的同源序列、和用以促进URA3标记的重组和移除的重复序列。1,208bp URA3表达盒PCR扩增自pLA33(SEQ ID NO：160)，使用了正向和反向PCR引物N1251(SEQ ID NO：245)和N1252(SEQ ID NO：246)。正向和反向引物N1253(SEQ ID NO：247)和N1254(SEQ ID NO：248)从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株PNY2211(MATaura3Δ::loxP his3Δpdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]-DHAD ilvD_Sm-PDC1t-P[FBA1]-ALS alsS_Bs-CYC1t pdc5Δ::P[PDC5]-ADH sadB_Ax-PDC5t gpd2Δ::loxP fra2Δadh1Δ::UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_Ll(y)-ADH1t)的基因组DNA制备物扩增了具有3’URA3重叠序列标签的250bp下游同源序列。正向和反向PCR引物N1256(SEQ ID NO：249)和N1255(SEQ ID NO：250)从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株PNY2211的基因组DNA制备物扩增了具有5’URA3重叠序列标签的250bp重复序列。正向和反向PCR引物N1257(SEQ ID NO：251)和N1258(SEQ ID NO：252)从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株PNY2211的基因组DNA制备物扩增了具有5’重复重叠序列标签的250bp上游同源序列。
大约1.5μg的PCR扩增的盒被转化到使用Frozen-EZ YeastTransformation IITM kit(Zymo Research Corporation(Irvine，CA))制备感受态的菌株PNY1730中，并将转化混合物于30℃接种在缺少尿嘧啶并补充了0.5％乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上，以选择具有整合的ymr226cΔ::URA3盒的细胞。在72至96小时后显现的转化体随后被短划线接种在相同的培养基上，并于30℃温育24至48小时。通过PCR针对ymr226cΔ::URA3筛选了短的菌痕，使用了与侧接的向内的染色体特异性引物N1239(SEQ ID NO：254)配对的5’向外的URA3删除盒特异性的内部引物N1249(SEQ ID NO：253)，和与侧接的向内的染色体特异性引物N1242(SEQ ID NO：256)配对的3’向外的URA3删除盒特异性引物N1250(SEQID NO：255)。阳性的PNY1730 ymr226cΔ::URA3 PCR筛选产生分别为598和726bp的5’和3’PCR产物。
在YPE(0.5％乙醇)中培养阳性的PNY1730 ymr226cΔ::URA3克隆过夜，然后于30℃接种在补充了乙醇(无葡萄糖)并且包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的分离物。使用5’和3’染色体特异性引物N1239和N1242，针对标记的失去PCR筛选了24至48小时后显现的菌落。阳性的PNY1730 ymr226cΔ无标记PCR筛选产生801bp的PCR产物。菌株PNY1730 ymr226cΔ被命名为PNY1758(＝MATaura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD pdc5Δ::kivD(y)fra2Δ::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)gpd2Δ::loxP71/66-FBA1p-alsS-bdh1Δ::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-ILV5p-adh ymr226cΔ)。
产异丁醇菌PNY1775的构建
用携带来自Anaerostipes caccae DSM 14662的K9D3.KARI基因的pWZ009(SEQ ID NO：158)和携带来自变异链球菌(Streptococcus mutans)ATCC No.700610的ilvD基因的pWZ001(SEQ ID NO：159)两种质粒转化了PNY1758。制备了PNY1775的感受态细胞，并使用Frozen-EZ YeastTransformation IITM试剂盒(Zymo Research Corporation(Irvine，CA))，用质粒pWZ009和pWZ001共转化了感受态细胞。于30℃将转化的细胞接种在缺少尿嘧啶和组氨酸并补充了0.5％乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上。所得到的转化体被命名为产异丁醇菌菌株PNY1775(＝MATa ura3Δ::loxPhis3Δ::loxP pdc6ΔpdcLΔ::ilvD pdc5Δ::kivD(y)fra2Δ::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)-gpd2Δ::loxP71/66-FBA1p-alsS bdh1Δ::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-ILV5p-adh ymr226cΔ/pWZ009，pWZ001)。
产异丁醇菌PNY1789的构建
菌株PNY1730(＝MATa ura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6ΔpdcLΔ::ilvDpdc5Δ::kivD(y)fra2Δ::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)-gpd2Δ::loxP71/66-FBA1p-alsS bdh1Δ::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-ILV5p-adh)被用于构建产异丁醇菌PNY1789。
用pdc5Δ::kivD.Lg.y替换pdc5Δ::kivD(y)
通过同源重组，用针对酿酒酵母(Saccahromyces cerevisiae)经密码子优化的格氏李斯特菌(Listeria grayi)kivD基因(＝kivD.Lg.y)替换了在PNY1730中pdc5Δ缺失区整合的乳酸乳球菌(Lactococuss lactis)kivD(y)编码区。
kivD.Lg.y整合盒(A-KivD.Lg.y-B-U-C)包含与PDC5编码区同源的上游(片段A)和下游(片段B)、来自格氏李斯特菌(Listeria grayi)的kivD.Lg.y编码区、用于转化体的选择的连同启动子和终止子一起的URA3基因(片段U)、和kivD.Li.y编码区的3′区(片段C)。片段A扩增自作为模板的PNY0891基因组DNA，使用了引物T-A(PDC5)(SEQ ID NO：194)、和B-A(kivDLg)(SEQ ID NO：257)，其包含与kivD.Li.y的5′端同源的5′尾。kivD.Li.y编码区扩增自pBP1719(＝pUC19-ura3MCS-U(PGK1)Pfbai-kivD Lg(y)-ADH1 BAC-kivD.LI片段C(SEQ ID NO：258)，使用了引物T-kivDLg(A)(SEQ ID NO：259)，其包含与片段A的3′端同源的5′尾，和引物B-kivDLg(B)(SEQ ID NO：260)，其包含与片段B的5’端同源的5’尾。片段B-U扩增自pBP904(＝pUC19-URA3-sadB-PDC5片段B)(SEQ ID NO：261)，使用了引物T-B(kivDLg)(SEQ ID NO：262)，其包含与kivD.Li.y的3′端同源的5′尾，和引物oBP546(新)(SEQ ID NO：263)，其包含与片段C的5′端同源的5′尾。片段C的扩增使用引物oBP547(新)(SEQ ID NO：264)，其包含与片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP539(新)(SEQ ID NO：265)。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen(Valencia，CA))纯化。片段A-KivD.Lg.y通过混合片段A和片段KivD.Lg.y并用引物T-A(PDC5)和B-kivDLg(B)进行扩增的重叠PCR构建的。片段B-U-C是通过混合片段B-U和片段C并用引物T-B(kivDLg)和oBP539(新)进行扩增的重叠PCR构建的。通过在琼脂糖凝胶上，然后使用凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)凝胶纯化了所得到的PCR产物。A-KivD.Lg.y-B-U-C盒是通过混合片段A-KivD.Lg.y和片段B-U-C并用引物T-A(PDC5)和oBP539(新)进行扩增的重叠PCR构建的。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen(Valencia，CA))纯化。
制备了PNY 1730的感受态细胞，并用PCR盒A-KivD.Lg.y-B-U-C转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(Zymo ResearchCorporation，Irvine，CA)。将转化混合物于30℃在缺少尿嘧啶并补充了0.5％乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上接种。使用用 Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备的基因组DNA，用引物组oBP540/kivDLg(569R)和kivDLg(530F)/oBP541，通过PCR筛选了具有A-KivD.Lg.y-B-U-C整合的转化体。为了从染色体移除URA3标记，使正确的转化体在YPE(0.5％乙醇)中生长过夜，并于30℃接种在补充了乙醇(无葡萄糖)并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的分离物。通过DNA测序确认了kivD(y)被kivD.Lg.y的替换，以及URA3标记的移除，测序使用了引物kivDLg(569R)(SEQ ID NO：266)、kivDLg(530F)(SEQ ID NO：267)、和kivDLg(1162F)(SEQ ID NO：268)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备。正确的分离株被命名为PNY1787(＝MATaura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD pdc5Δ::kivD.Lg.yfra2Δ::UAS(PGK1)-FBA 1p-ilvD.y gpd2Δ::loxP71/66-FBA 1p-alsSbdh1Δ::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-IL V5p-adh)。
HIS3+恢复
通过与包含HIS3编码区以及上游和下游同源序列的PCR盒的同源重组，在菌株PNY1787中恢复了被删除的HIS3编码区。
包含HIS3编码区以及上游和下游侧接区的HIS3编码PCR盒扩增自作为模板的PNY891基因组DNA，使用了引物T-HIS3(up300)(SEQ ID NO：269)和引物B-HIS3(down273)(SEQ ID NO：270)。通过在琼脂糖凝胶上，然后使用凝胶提取试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))凝胶纯化了所得到的PCR产物。制备了PNY 1773的感受态细胞，并使用Frozen-EZ YeastTransformation IITM试剂盒(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)，用HIS3+PCR盒转化了感受态细胞。将转化混合物于30℃在缺少组氨酸并补充了0.5％乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上接种。针对在缺少组氨酸并补充了0.5％乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上的生长筛选了具有HIS3+整合的转化体，并使用引物组T-HIS3(up300)和引物B-HIS3(down273)，通过菌落PCR进行确认。正确的分离株被命名为PNY1788(＝MATa ura3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD pdc5Δ::kivD.Lg.yfra2Δ::UAS(PGK1)-FBA 1p-ilvD.y gpd2Δ::loxP71/66-FBA1p-alsSbdh 1Δ::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-IL V5p-adh)。
用携带来自Anaerostipes caccae DSM 14662的K9D3.KARI基因和来自变异链球菌(Streptococcus mutans)ATCC No.700610的ilvD基因的质粒pNZ001(SEQ ID NO：271)转化了PNY 1788。制备了PNY 1788的感受态细胞，并使用Frozen-EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(Zymo ResearchCorporation，Irvine，CA)，用质粒pNZ001共转化了感受态细胞。于30℃将转化的细胞接种在缺少尿嘧啶并补充了0.5％乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上。所得到的转化体被命名为产异丁醇菌菌株PNY1789(＝MATaura3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD pdc5Δ::kivD(y)fra2Δ::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)-gpd2Δ::loxP71/66-FBA1p-alsS bdh1Δ::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-ILV5p-adh/pNZ001)。
实例3
具有PDE1缺失的产异丁醇菌的构建
为了删除PNY01758中的内源性PDE1编码区，从pLA59(SEQ ID NO：150)PCR扩增了删除盒，其包含URA3p-URA3-URA3t盒，侧接了退化的loxP71和loxP66位点，用于URA3标记的移除。PCR使用DNA聚合酶(New England BioLabs Inc.(Ipswich，MA))和引物PDE1 F URA3(SEQID NO：151)和PDE1 R URA3(SEQ ID NO：152)进行。使用标准的基因技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，第201-202页)将PCR产物转入了PNY01758，并在补充了5g/L乙醇的合成完全培养基(1X不含氨基酸的酵母氮源、1X缺少尿嘧啶的氨基酸混合物)上于30℃进行选择。通过菌落PCR筛选了转化体，使用了用以验证上述整合盒的存在的引物URAIR和PDE1F(SEQ ID NO：153和154)，和引物URAIF和PDE1R(SEQ ID NO：155和156)。为了除去上述盒的URA3标记，用pRS423::GAL1p-cre(SEQ ID NO：147)转化了细胞，并在补充了5g/L乙醇的合成完全培养基(1X不含氨基酸的酵母氮源、1X缺少尿嘧啶的氨基酸混合物)上于30℃选择转化体。转化体被接种在补充了0.5％半乳糖的酵母提取物+蛋白胨(YP)琼脂平板上，以诱导Cre重组酶的表达。通过将菌落点种到缺少尿嘧啶并补充了5g/L乙醇的合成的完全培养基上，以验证生长的不存在，确认了标记的移除。使用引物PDE1F和PDE1R(SEQ ID NO：154和156)，和用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen(Valencia，CA))制备的基因组，还通过PCR和测序确认了缺失和标记的移除。所得到的PNY01758的PDE1缺失的菌株被命名为PNY03040(＝MATa ura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD pdc5Δ::kivD(y)fra2Δ::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)gpd2Δ::loxP71/66-FBA1p-alsSbdh1Δ::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-ILV5p-adh ymr226cΔPDE1Δ::loxP71/66)。
产异丁醇菌PNY01759和PNY03041的构建
用携带来自Anaerostipes caccae DSM 14662的K9D3.KARI基因和携带来自变异链球菌(Streptococcus mutans)ATCC No.700610的ilvD基因的质粒pK9D3.OLE1p.IlvD(SEQ ID NO：157)转化了PNY01758和PNY03040。制备了PNY01758和PNY03040的感受态细胞，并使用Frozen-EZ YeastTransformation IITM试剂盒(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)，用质粒pK9D3.OLE1p.IlvD(SEQ ID NO：157)进行转化。于30℃将转化的细胞接种在缺少尿嘧啶并补充了0.5％乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上。所得到的转化体被命名为产异丁醇菌菌株PNY01759(＝MATa ura3Δ::loxPhis3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD pdc5Δ::kivD(y)fra2Δ::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)gpd2Δ::loxP71/66-FBA1p-alsS bdh1Δ::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-ILV5p-adh ymr226cΔ/pK9D3.OLE1p.IlvD)和PNY03041(＝MATa ura3Δ::loxPhis3Δ::loxP pdc6Δpdc1Δ::ilvD pdc5Δ::kivD(y)fra2Δ::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)gpd2Δ::loxP71/66-FBA1p-alsS bdh1Δ::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-ILV5p-adhymr226cΔPDE1Δ::loxP71/66/pK9D3.OLE1p.IlvD)。
使产异丁醇菌PNY01759和PNY03041在125mL通气烧瓶中生长于补充了2g/L蔗糖和5g/L乙醇的合成培养基(1X不含氨基酸的酵母氮源和不含尿嘧啶的酵母合成营养缺陷型培养基补充剂)中。使细胞于30℃在250rpm摇动下生长过夜。于30℃在缺少尿嘧啶并补充了5g/L乙醇(无葡萄糖)和2g/L蔗糖的合成完全培养基上纯化了PNY03041的两个独立的菌落，即3041#5和3041#18，并用于后续的实验。
实例4
PDE1缺失对蔗糖水解的影响
使细胞于30℃在YPD平板(10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、和20g/L葡萄糖)上生长24小时。将一整个接种环的PNY01500细胞或PNY03001(PDE1Δ)细胞(来自平板)接种至包含20g/L葡萄糖的20mL合成完全培养基(SC)(1X不含氨基酸的酵母氮源、1X补充了尿嘧啶和组氨酸的氨基酸混合物)中，并在30℃温育24小时。将细胞离心并重悬在包含43-44g/L蔗糖的SC培养基中。细胞的光密度被调节至10(OD600)，并于30℃以220rpm温育管。将样品(10mL体积)添加至50mL旋盖管中。在2、6、和8个小时的接种之后，从每一管取出大约0.5mL的样品、离心、并过滤除菌，然后分析残余的糖含量。使用YSI 2300 STAT PlusTMGlucose&LactateAnalyzer(YSI Life Sciences，Yellow Springs，Ohio)估测了培养基残余的蔗糖和葡萄糖含量。
在包含作为碳源的蔗糖的合成完全培养基中生长的PNY01500和PNY03001(PDE1Δ)残余的糖含量显示在表6中。PNY01500细胞和PNY03001细胞显示了在SC培养基中相似的蔗糖水解和糖消耗的模式。PDE1的缺失没有负面地影响蔗糖水解和糖消耗。
表6
实例5
在异丁醇存在下的蔗糖水解
将一整个接种环的PNY01500细胞或PNY03001(PDE1Δ)细胞(来自平板)接种至包含20g/L葡萄糖的20mLSC培养基(1X不含氨基酸的酵母氮源、1X补充了尿嘧啶和组氨酸的氨基酸混合物)中，并在30℃温育24小时。将细胞离心并重悬在包含43-44g/L蔗糖和15g/L异丁醇的SC培养基中。细胞的光密度被调节至10(OD600)，并于30℃以220rpm温育管16小时。将样品(10mL体积)添加至50mL旋盖管中。在0小时以及接种3和5小时后，从每一管收集了大约0.5mL的样品。离心样品，并在分析残余的糖含量前过滤除菌。使用HPX 87N柱，300×7.8mm(BioRadLaboratories，Hercules，CA)，通过HPLC(1260 Infinity System，Agilent LifeSciences(Santa Clara，CA))估测了残余的蔗糖、葡萄糖、果糖、和乙醇含量。
在包含蔗糖和异丁醇的合成完全培养基中生长的PNY01500和PNY03001(PDE1Δ)残余的糖含量显示在表7中。比较了PNY01500和PNY03001在包含15g/L异丁醇的合成完全培养基中的蔗糖水解速率。PNY01500细胞和PNY03001细胞显示了在包含15g/L异丁醇的SC培养基中不同的蔗糖水解和糖消耗的模式。PNY03001细胞以比PNY01500更快的速率水解蔗糖。在5小时的温育后，PNY03001还消耗水解的糖类并产生了比PNY01500多50％的乙醇。PDE1的缺失有利地影响了在异丁醇存在下的蔗糖水解和糖代谢。PDE1缺失似乎已经改善了发酵性能。
表7
实例6
PDE1敲除菌株中的蔗糖水解和异丁醇滴度
如实例5中所述使PNY01759和PNY03041细胞(3041#5和3041#18)生长，通过在25℃以3000rpm离心5分钟使细胞沉淀并弃去上清液。
生产期
使用生产培养基(表8和9)在50mL旋盖管中将细胞稀释至10(OD600)，约7-8g/L干细胞重量。在使用前用0.22μm滤纸对培养基过滤除菌。于30℃以200rpm搅动管20小时，并以4000rpm离心5分钟。保存样品，用于通过HPLC对残余的蔗糖和产生的异丁醇进行分析。然后对细胞沉淀物进行酸洗涤。
表8
*MES：(2-(N-吗啉代)乙磺酸
表9
酸洗涤期
将细胞沉淀物重悬在10mL酸洗涤培养基(AWM)，pH2(表10)中，并于30℃以200rpm搅动120分钟。
表10
细胞的循环利用
在酸洗涤期之后，通过以3000rpm离心4分钟收集细胞；弃去上清液，将10mL新鲜的PM添加至细胞。温育细胞，并收集样品用于HPLC，以测定残余的蔗糖含量。在每一生产期之后，对细胞进行酸洗涤，然后循环利用细胞。
在于PM中20小时的温育之后，培养物中残余的蔗糖的定量显示，在细胞的酸洗涤之后，PNY01759中的蔗糖降解逐渐地下降(表11)。PNY03041(PDE1Δ)有效地水解蔗糖，并且在对细胞三轮酸洗涤之后没有蔗糖的积聚。培养物的残余的蔗糖含量在第二和第三轮酸洗涤之后升高。与PNY01759相比，PNY0341细胞在对细胞的酸洗涤之后产生了更多的异丁醇(表12)。这些结果表明，PDE1的缺失改善了蔗糖的水解并改善了产异丁醇菌的异丁醇滴度。
表11
产异丁醇菌 PNY01759 3041#5 3041#18
酸洗涤前残余的蔗糖含量(g/L) 0 0 0
第1轮酸洗涤后残余的蔗糖含量(g/L) 0.14(±0.1) 0 0
第2轮酸洗涤后残余的蔗糖含量(g/L) 4.0(±1.2) 0.25(±0.15) 0.15(±0.1)
第3轮酸洗涤后残余的蔗糖含量(g/L) 9.0(±1.5) 1.0(±0.4) 0.9(±0.5)
表12
实例7
酸洗涤后PDE1敲除的细胞活力
使产异丁醇菌菌株PNY01759和PNY03041(PDE1Δ)在125mL通气烧瓶中生长于补充了2g/L蔗糖和5g/L乙醇的SC培养基(1X不含氨基酸的酵母氮源和不含尿嘧啶的酵母合成营养缺陷型培养基)中。使细胞于30℃在250rpm摇动下生长过夜。通过在25℃以3000rpm离心5分钟使细胞沉淀，弃去上清液，并将细胞以20的初始OD600重悬在CPM中。使细胞经受严格的酸洗涤期和生产期，如实例6中所述。在酸洗涤期结束时移出样品一次，用于活细胞计数(CFU/mL)测定。出于此目的，将0.1mL的培养物稀释在1X酵母氮源中至10-7，并将0.005mL经稀释的培养物点种在缺少尿嘧啶并补充了5g/L乙醇作为碳源的合成完全培养基的琼脂平板上。在于30℃温育平板48-72小时后，在对菌落计数后计算了每1mL培养物的菌落形成单位数(CFU)。
在三次酸洗涤之后，PNY01759的活细胞计数降低至4×102，至PNY03041的活细胞计数在三次酸洗涤之后是6.5×104(表13)。产异丁醇菌中的PDE1基因敲除改善了对细胞的酸洗涤之后的细胞活力。
表13
实例8
在合成培养基中PDE1敲除的生长速率
将PNY03041(PDE1Δ)和PNY01759细胞以0.5的初始OD600接种在125mL通气烧瓶中的补充了2g/L蔗糖和5g/L乙醇的合成完全培养基(1X不含氨基酸的酵母氮源和不含尿嘧啶的酵母合成营养缺陷型培养基)中。于30℃以220rpm搅动温育烧瓶24小时。以2小时的间隔收集样品，并基于光密度计算了生长速率。与PNY01759相比，PDE1敲除的PNY03041的生长速率(μ)是更高的。PNY03041的生长速率是0.2，而PNY01759的生长速率是0.12。在丰富培养基YPE(10g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、和5g/L乙醇)中，PNY03041和PNY01759具有相似的生长速率(0.27-0.28)。
实例9
PDE1敲除的异丁醇耐受性
将PNY03041(PDE1Δ)和PNY01759细胞以0.5的初始OD600接种在125mL通气烧瓶中的补充了2g/L蔗糖和5g/L乙醇的合成完全培养基(1X不含氨基酸的酵母氮源和不含尿嘧啶的酵母合成营养缺陷型培养基)中。于30℃以220rpm搅动温育烧瓶24小时。通过离心回收了细胞，并用补充了30g/L异丁醇的相同培养基重悬至20(OD600)。以200rpm搅动温育细胞11小时。在时间0和11小时，在具有作为碳源的乙醇的合成完全培养基中进行了活细胞计数。出于此目的，将培养物稀释在1X酵母氮源培养基中至10-7，并将0.005mL经稀释的细胞悬浮液点种在琼脂平板上。于30℃温育平板48-72小时，并在对平板上的菌落计数后计算了CFU/mL。
结果示于表14中。与PNY01759相比，PNY03041在包含30g/L异丁醇的培养基中的细胞死亡是减少的。可以得出PDE1缺失改善了对异丁醇的耐受性的结论。
表14
实例10
细胞的循环利用
将PNY01775的细胞从甘油储液中划线接种至包含5g/L乙醇作为碳源的合成完全培养基平板(1X不含氨基酸的酵母氮源，1X不含组氨酸和尿嘧啶的营养缺陷型氨基酸，1％w/v琼脂)上。在30℃温育48小时后，将来自上述平板的一块细胞接种在125mL烧瓶中的包含2g/L蔗糖和5g/L乙醇作为碳源的20mL合成完全液体培养基中。于30℃在摇床(Innova44R，NewBrunswick Scientific，CT，USA)中以200rpm搅动下使细胞生长24小时。培养物被用于接种500mL生长培养基CIG#2(表15)。
表15
使细胞以0.3-0.5的初始OD600在500mL烧瓶中生长于100mL培养基中，并于30℃以200rpm温育。24小时后，通过以4000rpm离心5分钟收集细胞，并以10的初始OD600重悬在循环利用和生产培养基，CRP#2培养基中(表16)。
表16
生产期在包含10mL生产培养基和5mL高压蒸汽处理的提取剂16(Sasol Olefins&Surfactants GmbH，Germany)或提取剂混合物16+Trioctyl Phosphine Oxide(TOPO)(Sigma-Aldrich Co，St.Louis，MO，USA)的50mL旋盖管中进行。提取剂混合物(16+TOPO)是通过使50g TOPO缓慢溶解在40mL高压蒸汽处理的16中制备的。在添加生产培养基和提取剂后立即收集了0小时时间点(t＝0h)的样品。为了避免在0小时的取样过程中损失细胞，在收集样品前以4000rpm旋转管2分钟。从每一相(含水的以及有机提取剂相)收集了一毫升的样品。将管以45°的角度倾斜插入管架中，并于30℃以160rpm搅动温育。温育7小时后，将样品以4000rpm离心2分钟，并从每一相收集1mL样品。全部样品均储存于-80℃，直到通过使用HPX87N柱，300×7.8mm(BioRadLaboratories，Hercules，CA)的HPLC(1260Infinity System，Agilent LifeSciences，Santa Clara，CA)和使用HP-INNOWAX柱(30m×0.32mm and film0.25μm，Agilent Life Sciences，Santa Clara，CA)的气相色谱(7890A GC System，Agilent Life Sciences，Santa Clara，CA)针对糖类和代谢物进行进一步分析。在生产培养基(CRP#2)中七个小时的温育被认为是生产期。在每一生产期后，通过离心收集细胞并使其经受酸洗涤。
就酸洗涤而言，通过以4000rpm离心收集细胞，重悬在1mL酸洗涤培养基(使用硫酸将pH调节至2的CRP#2培养基)中，并通过涡旋混合。将管以45°的角度倾斜以防止细胞沉降在底部，并于30℃以200rpm温育1小时。上述时期被认为是酸洗涤期。经酸洗涤的细胞被重新用于(细胞循环利用，R)异丁醇的生产。
就细胞循环利用而言，在每一酸洗涤期后通过以4000rpm离心收集细胞，并重悬在10mL新鲜的生产培养基(CRP#2)和5mL高压蒸汽处理的提取剂中。
PNY1775在有或没有酸洗涤的情况下在提取剂，16(表17)或16与TOPO的混合物(表18)的存在下被循环利用。R-0、R-1等是指细胞经历的循环利用的次数。在酸洗涤的不存在下，在7次循环利用后观察到三个参数(异丁醇滴度、总的糖消耗、和特定糖摄入速率)的逐渐降低。在酸洗涤的存在下，在所测试的条件下，在3次循环利用后观察到异丁醇滴度、总的糖消耗速率、和特定糖摄入的降低。在第6循环结束时，酸洗涤的细胞具有与对照组的相比40％的糖消耗速率。上述结果显示，提取剂16或提取剂混合物16+TOPO没有负面地影响没有酸洗涤情况下的异丁醇生产。
表17
表18
实例11
恢复活力
本实例展示了产异丁醇菌PNY1775中糖消耗速率和异丁醇生产的恢复。在第7次循环利用的酸洗涤期结束时并且在16的存在下以4000rpm离心细胞5分钟。小心地移除培养基而避免移出沉淀物，并添加5mL CIG#2培养基。于30℃以200rpm温育细胞4小时。用富含营养物质的培养基对细胞的这一处理被称为恢复活力期。在恢复活力期之后，再次离心细胞如上，并将沉淀物重悬在新鲜的生产培养基(CRP#2)中。
恢复活力对产异丁醇菌PNY01775的效应显示在表19中。在恢复活力后，该产异丁醇菌具有0.52g/g/h的糖消耗速率，这是没有经过恢复活力的细胞的五倍。此外，在接下来的两个循环中，糖消耗速率被恢复为0.92g/g/h的速率。
表19
实例12
细胞循环利用和恢复活力
本实例描述了循环利用和恢复活力在产异丁醇菌PNY1789中对异丁醇滴度、残余的糖、和特定糖摄入速率的效应。将PNY01789细胞从甘油储液中划线接种至包含5g/L乙醇作为碳源的合成完全培养基平板(1X不含氨基酸的酵母氮源，1X不含组氨酸和尿嘧啶的营养缺陷型氨基酸，1％w/v琼脂)上。在30℃温育48小时后，将来自上述平板的一块细胞接种在125mL烧瓶中的包含2g/L蔗糖和5g/L乙醇作为碳源的20mL合成完全液体培养基中。使细胞于30℃在200rpm搅动下生长24小时。培养物被用于接种500mL生长培养基CIG#2。在该阶段，使细胞以0.3-0.5的初始OD600在500mL烧瓶中生长于100mL培养基中，并于30℃以200rpm温育。24小时后，通过以4000rpm离心5分钟收集细胞，并以10的初始OD600重悬在循环利用和生产培养基(CRP#2)中。生产期在包含10mL生产培养基和作为提取剂的5mL高压蒸汽处理的16的50mL旋盖管中进行。在添加生产培养基和提取剂后立即收集了0小时时间点(t＝0h)的样品。为了避免在0小时的取样过程中损失细胞，在收集样品前以4000rpm旋转管2分钟。从每一相(含水的以及有机提取剂相)收集了一毫升(1mL)的样品。将管以45°的角度倾斜插入管架中，并于30℃以160rpm搅动温育。温育10小时后，将样品以4000rpm离心2分钟，并从每一相收集1mL样品。全部样品均储存于-80℃，直到通过使用HPX87N柱，300×7.8mm(BioRadLaboratories，Hercules，CA)的HPLC(1260 Infinity System，Agilent LifeSciences，Santa Clara，CA)和使用HP-INNOWAX柱(30m×0.32mm and film0.25μm，Agilent Life Sciences，Santa Clara，CA)的气相色谱(7890A GC System，Agilent Life Sciences，Santa Clara，CA)针对糖类和代谢物进行进一步分析。在生产培养基(CRP#2)中七个小时的温育被认为是生产期。在每一生产期后，通过离心收集细胞并使其经受酸洗涤。
就酸洗涤而言，通过以4000rpm离心收集细胞，重悬在1mL酸洗涤培养基(使用硫酸将pH调节至2的CRP#2培养基)中，并通过涡旋混合。将管以45°的角度倾斜以防止细胞沉降在底部，并于30℃以200rpm温育1小时。上述时期被认为是酸洗涤期。经酸洗涤的细胞被重新用于(细胞循环利用，R)异丁醇的生产。
就细胞循环利用而言，在每一酸洗涤期后通过以4000rpm离心收集细胞，并重悬在10mL新鲜的生产培养基(CRP#2)和5mL高压蒸汽处理的16中。
对于恢复活力，在第7次循环利用的酸洗涤期结束时以4000×rpm离心细胞5分钟。小心地移除培养基而避免移出沉淀物，并添加5mL CIG#2培养基。于30℃以200rpm温育细胞4小时。在恢复活力期之后，再次离心细胞如上，并将沉淀物重悬在新鲜的生产培养基(CRP#2)中。
PNY1789在16的存在下在有酸洗涤的情况下被循环利用。结果示于表20中。在酸洗涤的存在下，在3次循环利用后观察到异丁醇滴度、总的糖消耗速率、和特定糖摄入的降低。在循环7的酸洗涤结束时，细胞具有与循环1的相比＞30％的糖消耗速率的降低。循环7之后的恢复活力使后续循环中的糖消耗速率提高了两倍或更多。
表20
实例13
酸洗涤
使产异丁醇菌菌株PNY1775在125mL通气烧瓶中生长在补充了76mg/L色氨酸、380mg/L亮氨酸、100mM MES pH6.0、0.2％蔗糖、和0.5％乙醇的合成培养基(不含氨基酸的酵母氮源和不含尿嘧啶、组氨酸、色氨酸、和亮氨酸的酵母合成营养缺陷型培养基补充剂)中。使细胞于30℃在250rpm摇动下生长过夜。以4000rpm离心过夜培养物5分钟，重悬在1mL CIG#2培养基中，并接种至125mL通气烧瓶中的50mL CIG#2培养基中。于30℃在摇床(Innova44R，New Brunswick Scientific，CT，USA)中以250rpm摇动下使细胞生长过夜。以4000rpm离心过夜培养物5分钟，重悬在1mL CRP#2培养基中，并接种至15mL锥形管中的9mL CRP#2培养基中，盖着盖子于30℃在转动架上使其生长。24小时后，通过HPLC分析了培养物上清液(使用Spin-X离心管过滤装置，Costar目录号8169收集)，如美国专利申请公布2007/0092957中所述，该文献以引用的方式并入本文。异丁醇滴度(g/L)是6.76±0.23(n＝2)。
将菌株PNY1775划线接种至新鲜的SE-His-Ura(1％乙醇)平板上，并于30℃温育大约48小时。从平板上移出细胞，在无菌微量离心管中重悬在1mL SE-His-Ura(1％乙醇)培养基中，并涡旋以得到均匀的悬浮液。然后，将细胞接种至带通气盖的125mL无菌烧瓶(一式两份的烧瓶)中的25mL SE-His-Ura培养基中，并于30℃以120rpm摇动温育。培养物的初始OD600为约0.5。在20小时的温育后，OD600已达到3.3。在两个50mL离心管中以4500rpm离心培养物5分钟。弃去上清液，将细胞重悬在500mLCIG#2培养基中，并分至四个500mL烧瓶中，每个包含125mL初始OD600为约0.5的培养物。在22小时的温育后，每一培养物的OD600经测量为3.23至3.62范围。离心了两瓶培养物，合并，并重悬在80mL CRP#2中，该培养物的OD为10.02(6gdcw/L)。
向六个15mL锥形旋盖离心管中各移入十毫升(10mL)上述培养物，并于30℃在旋转架上温育培养物。这产生了用于对照组和酸洗涤处理的一式三份的样品。
温育上述管7小时的生长期。在7小时结束时，离心上述管，收集上清液，一部分过滤用于HPLC分析。全部的上清液均储存在4℃。然后，将对照样品沉淀物开着管盖在室温静置一小时。酸洗涤样品沉淀物各自重悬在1mL酸洗涤培养基中。通过吸打温和地混匀，使细胞重悬。然后于30℃以120rpm摇动温育样品大约50分钟。在酸洗涤温育结束时，以4500rpm离心酸洗涤培养物3分钟。用移液器小心地移出酸洗涤上清液，以不扰动任何细胞，并将上清液弃去。
所有的细胞沉淀物均重悬在10mL新鲜的CRP#2中。盖紧管子，于30℃在旋转架上温育，开始下一个生产期。
通过HPLC(如美国专利申请公布2007/0092957中所述)分析了所有的培养物上清液(使用Spin-X离心管过滤装置，Costar目录号8169收集)。使用柱，300×7.8mm(BioRad Laboratories，Hercules，CA)，通过HPLC分析了蔗糖、葡萄糖、和果糖。其他化合物是使用ShodexTM糖柱，300mm L×8mm ID，通过HPLC分析的。结果示于表21中。
表21
表21中的数据显示，在对照组和酸洗涤处理的培养物中，糖利用速率在两个循环后均提高了。此外，在对照组和酸处理的样品中，从循环1至10的异丁醇收率均是相似的。在对照组和酸洗涤组中，途径中间体(αKIV、DHIV、和异丁酸)的浓度在各循环中均是相似的，表明异丁醇生物合成途径的酶是活化的，并且没有因暴露于低pH而失活。
从上述描述中，显然的是已实现了本发明的目标。尽管只列出了某些实施例，替代实施例和各种修改形式从上文的描述中将对本领域的技术人员而言显而易见，并且在本发明的实质和范围内。不使用超出常规的实验，本领域的技术人员将认识到，或者能够确认，本文所述的发明的具体实施例的许多等同物。此类等同物旨在被以下权利要求书涵盖。
在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均指示本发明所属领域的技术人员的技术水平，并且以引用方式并入本文至如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体且单独地指明为出于所有目的以引用方式并入的相同程度。

Claims (71)

1.用于制备丁醇的方法，其包括：
(a)提供产丁醇菌，
(b)使所述产丁醇菌与一种或多种碳底物在其中丁醇以有效收率被生产的条件下接触；
(c)收集所述产丁醇菌；
(d)以至少约6g/L的浓度回收丁醇；
(e)使(c)的所收集的产丁醇菌与一种或多种碳底物在其中丁醇以有效收率被生产的条件下接触，并且其中所述有效收率为(b)的有效收率的至少约90％；
(f)重复步骤(c)-(e)；以及，任选地使(c)的所收集的产丁醇菌在至少约0.3％的丁醇的存在下暴露于pH小于或等于约2.0的条件下至少约1小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌为产异丁醇菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所制备的丁醇选自：异丁醇、1-丁醇、2-丁醇、2-丁酮、以及它们的混合物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)-e)被重复至少十次。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌包含工程化的丁醇生物合成途径。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述工程化的丁醇生物合成途径为工程化的异丁醇生物合成途径。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述工程化的丁醇途径包含至少一种多肽，所述至少一种多肽选自具有下列酶学委员会编号的一组酶：EC2.2.1.6、EC 1.1.1.86、EC 4.2.1.9、EC 4.1.1.72、EC 1.1.1.1、EC1.1.1.265、EC 1.1.1.2、EC 1.2.4.4、EC 1.3.99.2、EC 1.2.1.57、EC1.2.1.10、EC 2.6.1.66、EC 2.6.1.42、EC 1.4.1.9、EC 1.4.1.8、EC4.1.1.14、EC 2.6.1.18、EC 2.3.1.9、EC 2.3.1.16、EC 1.1.130、EC1.1.1.35、EC 1.1.1.157、EC 1.1.1.36、EC 4.2.1.17、EC 4.2.1.55、EC1.3.1.44、EC 1.3.1.38、EC 5.4.99.13、EC 4.1.1.5、EC 2.7.1.29、EC1.1.1.76、EC 1.2.1.57、和EC 4.2.1.28。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述工程化的丁醇途径包含至少一种选自下列一组酶的多肽：乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸异构还原酶、乙酰羟酸脱水酶、支链α-酮酸脱羧酶、支链醇脱氢酶、酰化醛脱氢酶、支链酮酸脱氢酶、丁酰-CoA脱氢酶、丁醛脱氢酶、转氨酶、缬氨酸脱氢酶、缬氨酸脱羧酶、ω-转氨酶、乙酰-CoA乙酰转移酶、3-羟丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脱氢酶、异丁酰-CoA变位酶、乙酰乳酸脱羧酶、乙偶姻胺化酶、丁醇脱氢酶、丁醛脱氢酶、乙偶姻激酶、磷酸乙偶姻胺化酶、磷酸氨基丁醇磷酸化酶、氨基丁醇激酶、丁二醇脱氢酶、和丁二醇脱水酶。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌为酵母。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述酵母为酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、或毕赤酵母属(Pichia)的成员。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌为PNY860的衍生物。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌还不表达丙酮酸脱羧酶或具有降低的所述丙酮酸脱羧酶的表达。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌还不表达3-磷酸甘油醛脱氢酶或具有降低的所述3-磷酸甘油醛脱氢酶的表达。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌还不表达磷酸二酯酶或具有降低的所述磷酸二酯酶的表达。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述磷酸二酯酶为PDE1。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌还不表达BDH1或具有降低的所述BDH1的表达。
18.根据权利要求1所述的方法，其中丁醇以(b)的有效收率的至少约99％在步骤(e)中被生产。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述产丁醇菌在(b)的接触中以至少约2gdcw/L的细胞密度存在。
20.根据权利要求1所述的方法，其中(b)的产丁醇菌对重复的步骤(c)-(e)的至少十个循环维持其特异性生产能力。
21.根据权利要求1所述的方法，其中丁醇在(b)中以至少约0.1g/gdcw/h的有效速率被生产。
22.根据权利要求1所述的方法，其中(b)的接触在提取剂的存在下进行。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述碳底物选自：低聚糖、多糖、单糖以及它们的混合物。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述碳底物选自：果糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、淀粉、纤维素、原料、乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、甘油、玉米醪、甘蔗、生物质、C5糖诸如木糖和阿拉伯糖、以及它们的混合物。
25.根据权利要求1所述的方法，其中(b)和(e)的接触在厌氧或微氧条件下进行。
26.根据权利要求6所述的方法，其中所述工程化的异丁醇途径包括下列
底物至产物的转化：
a.丙酮酸至乙酰乳酸；
b.乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；
c.2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；
d.α-酮异戊酸至异丁醛；以及
e.异丁醛至异丁醇。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述底物至产物的转化中的一种或多种利用NADH作为辅因子。
28.组合物，其具有小于约2的pH并包含利用蔗糖的、包含工程化的异丁醇途径的产异丁醇菌。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述利用蔗糖的产异丁醇菌为酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属、或毕赤酵母属的成员。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述利用蔗糖的产异丁醇菌为酿酒酵母。
31.根据权利要求28所述的组合物，其中所述利用蔗糖的产异丁醇菌为PNY860的衍生物。
32.根据权利要求28所述的组合物，其中所述利用蔗糖的产异丁醇菌包含工程化的酶，所述工程化的酶催化乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的底物至产物的转化。
33.根据权利要求13所述的方法，其中所述表达的降低为编码丙酮酸脱羧酶的基因的插入、突变、取代、和/或缺失的结果。
34.根据权利要求14所述的方法，其中所述表达的降低为编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因的插入、突变、取代、和/或缺失的结果。
35.根据权利要求15所述的方法，其中所述表达的降低为编码磷酸二酯酶的基因的插入、突变、取代、和/或缺失的结果。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述磷酸二酯酶为PDE1。
37.根据权利要求17所述的方法，其中所述表达的降低为编码BDH1的基因的插入、突变、取代、和/或缺失的结果。
38.根据权利要求13、14、15、16、17、33、34、35、36或37所述的方法，其中所述产丁醇菌还不表达编码乙酰乳酸还原酶的基因或具有降低的所述编码乙酰乳酸还原酶的基因的表达。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述表达的降低为编码YMR226C的基因的插入、突变、取代、和/或缺失的结果。
40.根据权利要求13所述的方法，其中所得的菌株的基因型为MATaura3Δ::loxP his3Δ::loxP pdc6Δ pdc1Δ::ilvD pdc5Δ::kivD(y)fra2Δ::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)gpd2Δ::loxP71/66-FBA1p-alsSbdh1Δ::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-IL V5p-adh ymr226cΔ/pWZ009，pWZ001。
41.包含被降低的或被除去的磷酸二酯酶和/或磷酸二酯酶活性的微生物，其中所述微生物产生丁醇。
42.根据权利要求41所述的微生物，其中所述微生物在编码具有磷酸二酯酶活性的多肽的内源性多核苷酸中包含插入、缺失、突变、和/或取代。
43.根据权利要求41或42所述的微生物，其中所述具有磷酸二酯酶活性的多肽对应于酶学委员会编号EC 3.1.4.17。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的微生物，其中具有磷酸二酯酶活性的所述多肽为PDE1。
45.根据权利要求41所述的微生物，其中所述微生物还包含工程化的丁醇生物合成途径。
46.根据权利要求45所述的微生物，其中所述工程化的丁醇生物合成途径为工程化的异丁醇生物合成途径。
47.根据权利要求46所述的微生物，其中所述工程化的异丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化：
(a)丙酮酸至乙酰乳酸；
(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；
(c)2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；
(d)2-酮异戊酸至异丁醛；以及
(e)异丁醛至异丁醇。
48.根据权利要求47所述的微生物，其中所述工程化的异丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶活性、酮酸还原异构酶活性、二羟酸脱水酶活性、酮异戊酸脱羧酶活性、和醇脱氢酶活性。
49.根据权利要求45所述的微生物，其中所述微生物还不表达丙酮酸脱羧酶或具有降低的所述丙酮酸脱羧酶的表达。
50.根据权利要求49所述的微生物，其中所述表达的降低为编码丙酮酸脱羧酶的基因的插入、突变、取代、和/或缺失的结果。
51.根据权利要求50所述的微生物，其中所述丙酮酸脱羧酶选自：PDC1、PDC5、PDC6、以及它们的组合。
52.根据权利要求45所述的微生物，其中所述微生物还不表达3-磷酸甘油醛脱氢酶或具有降低的所述3-磷酸甘油醛脱氢酶的表达。
53.根据权利要求52所述的微生物，其中所述表达的降低为编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因的插入、突变、取代、和/或缺失的结果。
54.根据权利要求45所述的微生物，其中所述微生物还不表达BDH1或具有降低的所述BDH1的表达。
55.根据权利要求54所述的微生物，其中所述表达的降低为编码BDH1的基因的插入、突变、取代、和/或缺失的结果。
56.根据权利要求45至55中任一项所述的微生物，其中所述微生物还不表达编码乙酰乳酸还原酶的基因或具有降低的所述编码乙酰乳酸还原酶的基因的表达。
57.根据权利要求56所述的微生物，其中所述表达的降低为编码YMR226C的基因的插入、突变、取代、和/或缺失的结果。
58.根据权利要求45至57中任一项所述的微生物，其中所述微生物为酵母细胞。
59.根据权利要求58所述的微生物，其中所述酵母细胞为选自下列的酵母属的成员：酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属、和毕赤酵母属。
60.用于改善细胞活力和生产能力的方法，其包括：
(a)收集来自醇发酵的微生物；以及
(b)使所述微生物与富含营养物质的培养基接触。
61.用于改善细胞活力和生产能力的方法，其包括：
(a)收集来自醇发酵的微生物；
(b)使所述微生物暴露于低pH条件下；
(c)收集来自步骤(b)的微生物；以及
(d)使所述微生物与富含营养物质的培养基接触。
62.用于生产醇的方法，其包括：
(a)提供根据权利要求45至59中任一项所述的微生物，其中所述微生物产生醇；
(b)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；
(c)收集所述微生物；
(d)回收所述醇；
(e)使步骤(c)的微生物与富含营养物质的培养基接触；
(f)收集步骤(e)的微生物；
(g)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；以及
(h)任选地重复步骤(c)-(g)。
63.用于生产醇的方法，其包括：
(a)提供根据权利要求45至59中任一项所述的微生物，其中所述微生物产生醇；
(b)使所述微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；
(c)收集所述微生物；
(d)回收所述醇；
(e)使步骤(c)的微生物暴露于低pH条件下；
(f)收集来自步骤(e)的微生物；
(g)使步骤(f)的微生物与富含营养物质的培养基接触；
(h)收集步骤(g)的微生物；
(i)使步骤(i)的微生物与一种或多种碳底物在其中醇被生产的条件下接触；以及
(j)任选地重复步骤(c)-(i)。
64.根据权利要求62或63所述的方法，其中使所述微生物与富含营养物质的培养基接触的步骤在有氧条件下进行。
65.根据权利要求61所述的方法，其中所述pH小于或等于约2。
66.根据权利要求63所述的方法，其中所述pH小于或等于约2。
67.根据权利要求61所述的方法，其中所述pH为约2至约4。
68.根据权利要求63所述的方法，其中所述pH为约2至约4。
69.根据权利要求62或63所述的方法，其中所述醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、和己醇。
70.根据权利要求69所述的方法，其中丁醇选自1-丁醇、2-丁醇、2-丁酮、异丁醇、叔丁醇、或它们的混合物。
71.组合物，其包含富含营养物质的培养基和根据权利要求45至59中任一项所述的微生物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110055191A (zh) * 2019-04-08 2019-07-26 浙江大学 分离自喷漆废水底泥的拜耶林克氏菌lm-w及其应用
CN110106098A (zh) * 2019-04-30 2019-08-09 广西科学院 一种高产丙酮酸的酿酒酵母工程菌株及其发酵方法

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8945899B2 (en) 2007-12-20 2015-02-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Ketol-acid reductoisomerase using NADH
WO2008130995A2 (en) 2007-04-18 2008-10-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fermentive production of isobutanol using highly active ketol-acid reductoisomerase enzymes
US8188250B2 (en) * 2008-04-28 2012-05-29 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Butanol dehydrogenase enzyme from the bacterium Achromobacter xylosoxidans
NZ600509A (en) 2009-12-29 2014-08-29 Butamax Tm Advanced Biofuels Alcohol dehydrogenases (adh) useful for fermentive production of lower alkyl alcohols
MX357290B (es) 2010-02-17 2018-07-04 Butamax Tm Advanced Biofuels Mejoramiento de la actividad de proteínas que requieren centros fe-s.
WO2012033832A2 (en) 2010-09-07 2012-03-15 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Integration of a polynucleotide encoding a polypeptide that catalyzes pyruvate to acetolactate conversion
EP2689014B1 (en) 2011-03-24 2019-04-24 Butamax (TM) Advanced Biofuels LLC Host cells and methods for production of isobutanol
KR20140146616A (ko) 2012-03-23 2014-12-26 부타맥스 어드밴스드 바이오퓨얼스 엘엘씨 부타놀로겐용 배지의 아세테이트 보충물
WO2013176909A2 (en) 2012-05-11 2013-11-28 Butamax Advanced Biofuels Llc Ketol-acid reductoisomerase enzymes and methods of use
WO2014031831A1 (en) 2012-08-22 2014-02-27 Butamax Advanced Biofuels Llc Production of fermentation products
WO2014047421A1 (en) 2012-09-21 2014-03-27 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Production of renewable hydrocarbon compositions
WO2014106107A2 (en) 2012-12-28 2014-07-03 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Dhad variants for butanol production
US9441250B2 (en) 2013-03-14 2016-09-13 Butamax Advanced Biofuels Llc Glycerol 3- phosphate dehydrogenase for butanol production
US9580705B2 (en) 2013-03-15 2017-02-28 Butamax Advanced Biofuels Llc DHAD variants and methods of screening
WO2014144210A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Butamax Advanced Biofuels Llc Competitive growth and/or production advantage for butanologen microorganism
BR112016029855B1 (pt) 2014-06-24 2023-01-17 Poet Research, Inc. Método para inocular leveduras para fermentação e sistema de fermentação para inocular leveduras entre dois ou mais reatores de fermentação
US10280438B2 (en) 2014-08-11 2019-05-07 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for the production of yeast
US9920312B2 (en) 2014-08-11 2018-03-20 Lallemand Hungary Liquidity Management Llc Mutations in iron-sulfur cluster proteins that improve xylose utilization
US20180237359A1 (en) * 2015-08-19 2018-08-23 Technology Holding, Llc Hybrid chem-bio method to produce diene molecules
US10248224B2 (en) * 2016-10-25 2019-04-02 Microsoft Technology Licensing, Llc Input based on interactions with a physical hinge

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101297042A (zh) * 2005-10-26 2008-10-29 纳幕尔杜邦公司 四碳醇的发酵生产
CN101432434A (zh) * 2005-09-29 2009-05-13 纳幕尔杜邦公司 4碳醇的发酵生产
WO2011159962A1 (en) * 2010-06-18 2011-12-22 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Supplementation of fatty acids for improving alcohol productivity

Family Cites Families (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1891841A (en) 1927-01-08 1932-12-20 Sak Soren Yeast propagation controlling method
GB294123A (en) 1927-01-14 1928-07-16 Soeren Sak Improvements in the production of yeast
US1937672A (en) 1928-04-25 1933-12-05 Wilbur White Chemical Company Method of accelerating propionic fermentation
US2016791A (en) 1934-12-05 1935-10-08 Edith M Riley Yeast
GB617502A (en) 1944-10-30 1949-02-07 Aluminium Plant & Vessel Co Improvements in or relating to the treatment of yeast and fermentation of beer
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5686276A (en) 1995-05-12 1997-11-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Bioconversion of a fermentable carbon source to 1,3-propanediol by a single microorganism
US6432688B1 (en) 1999-01-18 2002-08-13 Daicel Chemical Industries, Ltd. Amino alcohol dehydrogenase converts keto alcohol to amino alcohol and amino alcohol to keto alcohol
EP1046706A1 (en) 1999-04-21 2000-10-25 GEA Liquid Processing Scandanavia A/S Method and apparatus for the continuous biocatalytic conversion of aqueous solutions, having one or more degassing stages
US6366140B1 (en) 1999-07-01 2002-04-02 Vitesse Semiconductor Corporation High bandwidth clock buffer
US20030106437A1 (en) 2001-10-19 2003-06-12 Pajunen Esko Juhani Method and apparatus for the continuous biocatalytic conversion of aqueous solutions, having one or more degassing stages
CN1704469A (zh) 2004-05-31 2005-12-07 沈南英 一种中国冬虫夏草真菌的生产方法
WO2006110900A2 (en) 2005-04-12 2006-10-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Treatment of biomass to obtain ethanol
BRPI0615980A2 (pt) 2005-07-26 2011-05-31 Council Scient Ind Res método de identificação de genes que aumentam a toleráncia ao stress na levedura para melhorar a eficiência da levedura
US9297028B2 (en) 2005-09-29 2016-03-29 Butamax Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
US8273558B2 (en) 2005-10-26 2012-09-25 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
US8956850B2 (en) 2008-06-05 2015-02-17 Butamax Advanced Biofuels Llc Enhanced pyruvate to acetolactate conversion in yeast
US9303225B2 (en) 2005-10-26 2016-04-05 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for the production of isobutanol by recombinant yeast
US8945899B2 (en) 2007-12-20 2015-02-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Ketol-acid reductoisomerase using NADH
US8828704B2 (en) 2006-05-02 2014-09-09 Butamax Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
US8962298B2 (en) 2006-05-02 2015-02-24 Butamax Advanced Biofuels Llc Recombinant host cell comprising a diol dehydratase
US7659104B2 (en) 2006-05-05 2010-02-09 E.I. Du Pont De Nemours And Company Solvent tolerant microorganisms and methods of isolation
US7541173B2 (en) 2006-06-15 2009-06-02 E.I. Du Pont De Nemours And Company Solvent tolerant microorganisms and methods of isolation
US8017364B2 (en) 2006-12-12 2011-09-13 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Solvent tolerant microorganisms
WO2008130995A2 (en) 2007-04-18 2008-10-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fermentive production of isobutanol using highly active ketol-acid reductoisomerase enzymes
WO2009026706A1 (en) 2007-08-27 2009-03-05 Iogen Energy Corporation Method for the production of a fermentation product from a pretreated lignocellulosic feedstock
JP5730019B2 (ja) 2007-12-14 2015-06-03 ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー 発酵ブロス中のブタノール濃度を制御する方法
ES2575413T3 (es) 2007-12-20 2016-06-28 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Cetol-ácido reductoisomerasa que utiliza NADH
US8372612B2 (en) 2007-12-21 2013-02-12 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Production of four carbon alcohols using improved strain
US20090162911A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 E.I. Du Pont De Nemours And Company Strain for butanol production
US8518678B2 (en) 2007-12-21 2013-08-27 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Strain comprising increased expression of a CFA coding region for butanol production
MY180599A (en) 2008-02-23 2020-12-03 Weifu Lee James Designer organisms for photobiological butanol production from carbon dioxide and water
US8188250B2 (en) 2008-04-28 2012-05-29 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Butanol dehydrogenase enzyme from the bacterium Achromobacter xylosoxidans
US8389252B2 (en) 2008-05-12 2013-03-05 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Yeast strain for production of four carbon alcohols
WO2009143455A2 (en) 2008-05-22 2009-11-26 Microbia, Inc. Engineering resistance to aliphatic alcohols
US8828695B2 (en) 2008-06-04 2014-09-09 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for producing butanol using two-phase extractive fermentation
US20090305369A1 (en) 2008-06-04 2009-12-10 E.I.Du Pont De Nemours And Company Deletion mutants for the production of isobutanol
BRPI0909965A2 (pt) 2008-06-04 2015-08-04 Butamax Advanced Biofuels Llc Método para a recuperação de butanol a partir de um meio de fermentação e método para a produção de butanol
EP2342330A1 (en) 2008-09-29 2011-07-13 Butamax Advanced Biofuels Llc Enhanced iron-sulfur cluster formation for increased dihydroxy-acid dehydratase activity in lactic acid bacteria
BRPI0913681A2 (pt) 2008-09-29 2019-09-24 Butamax Advanced Biofuels Llc "célula bacteriana ácido-lática recombinante e método de produção de isobutanol"
CN102186983A (zh) 2008-09-29 2011-09-14 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 酵母中提高的异源Fe-S酶活性
BRPI0913547A2 (pt) 2008-09-29 2020-08-18 Butamax Advanced Biofuels Llc célula bacteriana ácido-lática recombinante, método para a produção de 2-butanol e método para a produção de 2-butanona
CN102186973B (zh) 2008-09-29 2017-08-15 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 细菌的[2Fe‑2S]二羟酸脱水酶的鉴定和用途
US20160222370A1 (en) 2008-09-29 2016-08-04 Butamax Advanced Biofuels Llc Recombinant Yeast Host Cell With Fe-S Cluster Proteins And Methods Of Using Thereof
BRPI0914521A2 (pt) 2008-10-27 2016-07-26 Butamax Advanced Biofuels Llc célula hospedeira microbiana recombinante, método de aumento da produção de isobutanol e método de produção de isobutanol
US8828694B2 (en) 2008-11-13 2014-09-09 Butamax Advanced Biofuels Llc Production of isobutanol in yeast mitochondria
US8465964B2 (en) 2008-11-13 2013-06-18 Butamax (TM) Advanced Biofules LLC Increased production of isobutanol in yeast with reduced mitochondrial amino acid biosynthesis
US8652823B2 (en) 2008-12-03 2014-02-18 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Strain for butanol production with increased membrane unsaturated trans fatty acids
US20100143992A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 E. I Du Pont De Nemours And Company Process for Fermentive Preparation of Alcohols and Recovery of Product
US20100143994A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 E. I. Du Pont De Memours And Company Process for fermentive preparation of alcohols and recovery of product
US20100143995A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for Fermentive Preparation of Alcohols and Recovery of Product
US20100143993A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 E.I. Du Pont De Nemours And Company Process for fermentive preparationfor alcolhols and recovery of product
US8557562B2 (en) 2008-12-29 2013-10-15 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Yeast with increased butanol tolerance involving filamentous growth response
US8455225B2 (en) 2008-12-29 2013-06-04 Butamax Advanced Biofuels Llc Yeast with increased butanol tolerance involving high osmolarity/glycerol response pathway
US8795992B2 (en) 2008-12-29 2014-08-05 Butamax Advanced Biofuels Llc Yeast with increased butanol tolerance involving cell wall integrity pathway
US7972825B2 (en) 2009-02-13 2011-07-05 Ene003, Llc Integrated apparatus for ethanol production and extraction
US8614085B2 (en) 2009-02-27 2013-12-24 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Yeast with increased butanol tolerance involving a multidrug efflux pump gene
WO2010119339A2 (en) 2009-04-13 2010-10-21 Butamax™ Advanced Biofuels LLC Method for producing butanol using extractive fermentation
US8968522B2 (en) 2009-07-15 2015-03-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Recovery of butanol isomers from a mixture of butanol isomers, water, and an organic extractant
US8968523B2 (en) 2009-07-15 2015-03-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Recovery of butanol isomers from a mixture of butanol isomers, water, and an organic extractant
US9169499B2 (en) 2009-09-29 2015-10-27 Butamax Advanced Biofuels Llc Flux to acetolactate-derived products in lactic acid bacteria
US9260708B2 (en) 2009-09-29 2016-02-16 Butamax Advanced Biofuels Llc Yeast production host cells
BR112012007168A2 (pt) 2009-09-29 2019-09-24 Butamax Advanced Biofuels Llc "célula de levedura, célula microbiana que produz isobutanol, célula hospedeira microbiana, método para conversão de acetolacto em diidróxi-isovalerato, método para a produção de isobutanol e plasmídeo"
US20110195505A1 (en) 2009-10-08 2011-08-11 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Bacterial strains for butanol production
IN2012DN03440A (zh) 2009-11-23 2015-10-23 Butamax Tm Advanced Biofuels
US8373008B2 (en) 2009-11-23 2013-02-12 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Recovery of butanol from a mixture of butanol, water, and an organic extractant
BR112012012211A2 (pt) 2009-11-23 2017-05-09 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc método para a recuperação de butanol e método para a produção de butanol
US8373009B2 (en) 2009-11-23 2013-02-12 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Recovery of butanol from a mixture of butanol, water, and an organic extractant
US8906204B2 (en) 2009-12-21 2014-12-09 Butamax Advanced Biofuels Llc Methods for alcohol recovery and concentration of stillage by-products
NZ600509A (en) 2009-12-29 2014-08-29 Butamax Tm Advanced Biofuels Alcohol dehydrogenases (adh) useful for fermentive production of lower alkyl alcohols
NZ600585A (en) 2009-12-29 2014-07-25 Butamax Tm Advanced Biofuels Expression of hexose kinase in recombinant host cells
US8574406B2 (en) 2010-02-09 2013-11-05 Butamax Advanced Biofuels Llc Process to remove product alcohol from a fermentation by vaporization under vacuum
WO2011097711A1 (en) 2010-02-10 2011-08-18 Iogen Energy Corporation Method for the production of a fermentation product from lignocellulosic feedstocks
MX357290B (es) 2010-02-17 2018-07-04 Butamax Tm Advanced Biofuels Mejoramiento de la actividad de proteínas que requieren centros fe-s.
US8759049B2 (en) 2010-02-25 2014-06-24 Iogen Energy Corporation Method for the production of a fermentation product from a sugar hydrolysate
WO2011159894A1 (en) 2010-06-17 2011-12-22 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Yeast production culture for the production of butanol
JP2013528399A (ja) 2010-06-18 2013-07-11 ブタマックス（ティーエム） アドバンスド バイオフューエルズ エルエルシー 抽出発酵におけるアルコール除去のための、油に由来する抽出溶媒
US8871488B2 (en) 2010-06-18 2014-10-28 Butamax Advanced Biofuels Llc Recombinant host cells comprising phosphoketolases
AU2011296554A1 (en) 2010-09-02 2013-02-21 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Process to remove product alcohol from a fermentation by vaporization under vacuum
WO2012033832A2 (en) 2010-09-07 2012-03-15 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Integration of a polynucleotide encoding a polypeptide that catalyzes pyruvate to acetolactate conversion
US20140080188A1 (en) 2011-03-09 2014-03-20 Gevo, Inc. Yeast microorganisms with reduced 2,3-butanediol accumulation for improved production of fuels, chemicals, and amino acids
EP2689014B1 (en) 2011-03-24 2019-04-24 Butamax (TM) Advanced Biofuels LLC Host cells and methods for production of isobutanol
US20120258873A1 (en) 2011-04-06 2012-10-11 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Reduction of 2,3-dihydroxy-2-methyl butyrate (dhmb) in butanol production
WO2012173659A2 (en) 2011-06-17 2012-12-20 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Lignocellulosic hydrolysates as feedstocks for isobutanol fermentation
EP2737073B1 (en) 2011-07-28 2021-10-20 Butamax Advanced Biofuels LLC Keto-isovalerate decarboxylase enzymes and methods of use thereof
US9181566B2 (en) 2011-12-30 2015-11-10 Butamax Advanced Biofuels Llc Genetic switches for butanol production
KR20140146616A (ko) 2012-03-23 2014-12-26 부타맥스 어드밴스드 바이오퓨얼스 엘엘씨 부타놀로겐용 배지의 아세테이트 보충물
WO2013176909A2 (en) 2012-05-11 2013-11-28 Butamax Advanced Biofuels Llc Ketol-acid reductoisomerase enzymes and methods of use
WO2014031831A1 (en) 2012-08-22 2014-02-27 Butamax Advanced Biofuels Llc Production of fermentation products
WO2014047421A1 (en) 2012-09-21 2014-03-27 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Production of renewable hydrocarbon compositions
AU2013323427A1 (en) 2012-09-26 2015-03-05 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Polypeptides with ketol-acid reductoisomerase activity
US9273330B2 (en) 2012-10-03 2016-03-01 Butamax Advanced Biofuels Llc Butanol tolerance in microorganisms
WO2014106107A2 (en) 2012-12-28 2014-07-03 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Dhad variants for butanol production
US20140186911A1 (en) 2012-12-28 2014-07-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Recombinant host cells and methods for producing butanol
US9441250B2 (en) 2013-03-14 2016-09-13 Butamax Advanced Biofuels Llc Glycerol 3- phosphate dehydrogenase for butanol production
US9580705B2 (en) 2013-03-15 2017-02-28 Butamax Advanced Biofuels Llc DHAD variants and methods of screening
WO2014144210A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Butamax Advanced Biofuels Llc Competitive growth and/or production advantage for butanologen microorganism
WO2015009601A1 (en) 2013-07-16 2015-01-22 Butamax Advanced Biofuels Llc Yeast with increased butanol tolerance involving cell wall proteins

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101432434A (zh) * 2005-09-29 2009-05-13 纳幕尔杜邦公司 4碳醇的发酵生产
CN101297042A (zh) * 2005-10-26 2008-10-29 纳幕尔杜邦公司 四碳醇的发酵生产
WO2011159962A1 (en) * 2010-06-18 2011-12-22 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Supplementation of fatty acids for improving alcohol productivity

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STEEN E.J.等: "Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol", 《MICROBIAL CELL FACTORIES》 *
王海明等: "啤酒厂酵母的酸洗", 《酿酒科技》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110055191A (zh) * 2019-04-08 2019-07-26 浙江大学 分离自喷漆废水底泥的拜耶林克氏菌lm-w及其应用
CN110106098A (zh) * 2019-04-30 2019-08-09 广西科学院 一种高产丙酮酸的酿酒酵母工程菌株及其发酵方法
CN110106098B (zh) * 2019-04-30 2022-05-20 广西科学院 一种高产丙酮酸的酿酒酵母工程菌株及其发酵方法

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