BRPI0615980A2 - método de identificação de genes que aumentam a toleráncia ao stress na levedura para melhorar a eficiência da levedura - Google Patents

Abstract

MéTODO DE IDENTIFICAçãO DE GENES QUE AUMENTAM A TOLERáNCIA AO STRESS NA LEVEDURA PARA MELHORAR A EFICIENCIA DA LEVEDURA. Revelam-se métodos para identificação de genes que aumentam a tolerância a stress ou perturbação na levedura, lista de identificação dos genes, e o uso destes genes para melhorar a eficiência da levedura.

Description

MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAM ATOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARA MELHORAR AEFICIÊNCIA DA LEVEDURA.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção trata da melhora do fermento para uma maisforte tolerância ao estresse. Mais especificamente, trata da identificação degenes que aumentam a sobrevivência das leveduras durante a produção deetanol, e o uso de tais genes para melhorar o desempenho das linhagens defermento.

CONTEXTO DA INVENÇÃO

Um fermento capaz de completar a produção de etanol semgrandes perdas em viabilidade é altamente desejado nas destilarias. Noentanto, as linhagens comumente usadas em destilarias perdem a viabilidaderapidamente, devido a alta concentração de etanol encontrada durante afermentação. Além do mais, o fermento também atua em temperaturas maiselevadas (especialmente em países tropicais), o que, juntamente com o etanol,reduz a viabilidade dramaticamente. Várias abordagens foram tomadas paramelhorar as linhagens de leveduras com alta tolerância a etanol e àtemperatura (termotolerância). Uma abordagem é testar a levedura isolada doambiente natural para as propriedades desejadas (Banat ET AL,1 998).Enquanto algumas linhagens possuem alta tolerância à temperatura ou aoetanol, elas podem não ter as propriedades desejadas, tais como maiorosmotolerância (por exemplo, a habilidade de suportar altas concentrações desolutos como sal e açúcar), taxa de fermentação mais rápida, e ausência deprodutos secundários indesejáveis. Outra abordagem é começar comlinhagens que já possuem algumas das propriedades desejadas, e melhorá-lasatravés da mutagênese e seleção para melhor sobrevivência durante afermentação (por exemplo, Ganesan et AL1 2003, Patente Indiana # 189737). Amaior limitação dessa abordagem é que a melhora é na maior parte devido àmutação em um único gene. Como vários genes controlam tolerância aoestresse, modificando-se mais do que apenas um único gene de tal espécieespera-se obter tolerância muito maior do que com genes isolados. Isso seráparticularmente válido para a tolerância ao estresse durante a fermentaçãoetanólica, já que as células de fermento encontram mais do que um tipo deestresse sob tais condições, como alta osmolaridade, alta concentração deetanol, e alta temperatura. Portando, se os genes que causam tolerância aesses efeitos são identificados, então eles podem ser racionalmentemanejados para aumentar a tolerância ao estresse. No entanto, não é fácilidentificar tais genes utilizando a genética de leveduras e as abordagens debiologia molecular convencionais, por causa das seguintes razões.

A abordagem convencional para identificar genes de fermentoenvolvidos em qualquer processo trata primeiro de identificar os mutantesdeficientes em tal processo, e os catalogar em diferentes grupos decomplementação genética através de análise genética, e finalmente identificaros genes utilizando ferramentas da biologia molecular de leveduras e DNArecombinante (Kaiser et al, 1994). Mutantes podem ser obtidos como mutantesespontâneos, ou induzidos por mutagênese química (Kaiser et al, 1994), pormutagênese por inserção de transposição (Ross-Macdonald et al., 1999), ouaté pela introdução de reservas de ribozima (Thompson, Patente Norte-Americana # 6,183,959). Uma posterior detecção de mutantes para fenótiposdesejados tipicamente envolve a manutenção de um grande número depotenciais leveduras mutantes como populações clonais (colônias) nasuperfície de um meio sólido não-seletivo em Placas de Petri1 e os rastreandosatravés da transferência deles para um meio sólido seletivo por replicação porplaca. As colônias incapazes de crescer no meio seletivo serão identificadas, eas colônias correspondentes serão retiradas do meio não-seletivo eposteriormente caracterizadas. Esse processo de identificação é chamado derastreamento de placa. No entanto, tal abordagem não é útil para identificargenes envolvidos na tolerância do estresse de fermentação, já que não hárastreamento de placa capaz de simular as condições encontradas pelasleveduras dentro do caldo de fermentação. Para tanto, foi desenvolvidoanteriormente em nosso laboratório um método capaz de simultaneamentemonitorar a movimentação de mutantes individuais de um micróbio empopulações mistas presentes em caldos líquidos (Sharma et al, 2001; Sharma& Ganesan, 2003, Patente Norte-Americana #6,528,257). Por tal método,vários genes com papéis importantes na tolerância ao estresse de fermentaçãopuderam ser identificados. Outros métodos que também facilitam omonitoramento simultâneo da movimentação de mutantes podem ser usadospara esse propósito (Brown & Smith1 1997, Patente Norte-Americana#5,612,180; Smith et al, 1996; Winzeler et al, 1999).

No entanto, identificar genes através de fenótipos de mutantestem certas limitações. Em primeiro lugar, não é fácil obter mutantesgeneticamente enfraquecidos que são essenciais para crescimento esobrevivência normas. Portanto, tais genes, que são também cruciais paraalguma outra função como a tolerância ao estresse, serão despercebidos. Emsegundo lugar, muitos genes são repetidos nas leveduras, por exemplo, existemais de um único gene provendo a mesma função ao organismo. Assim,mutando qualquer um deles não irá resultar em fenótipo discernível, e elespassarão despercebidos nos rastreamentos convencionais de mutantes. Alémdo mais, se o propósito de identificação de genes envolvidos em um processotal como tolerância ao estresse é em última análise melhorar o organismo,então identificar genes relevantes através de caça a mutantes não é semprebem-sucedido. A razão é que, embora um gene possa ser importante para umprocesso biológico por desempenhar uma etapa essencial no processo, elepode não estar desempenhando a etapa de taxa limitadora. De tal modo,superexpressando tal gene não resultará em melhora alguma no processo.Portanto, primeiro deve-se identificar todos os genes envolvidos em umprocesso, e depois superexpressando-os um a um para ver se eles aprimoramo processo isso é laborioso, dispendioso em tempo, e propenso à falha. Aquinós provemos um método alternativo que supera todas as limitações acima.

Além disso, nosso método também supera a limitação da falta de placas derastreamento.

Uma outra abordagem para atribuir uma função a genes édeterminar os perfis de expressão gênica utilizando microarranjos. Através dosperfis de expressão genética, os níveis de expressão de quase todos os genesde um organismo são simultaneamente determinados (por exemplo, Hughes etai., 2000; Wu et al, 2001; Fabrizio et al, 2005; Vrana et al., 2003). Se umconjunto de genes é mais expressado sob uma determinada condiçãocomparada com outra, então é assumido que tais genes possuem algum papela desempenhar sob a primeira condição. No entanto, essa assumpção não éapoiada por estudos onde tentativas foram feitas para correlacionar aexpressão de genes com os seus papéis sob uma condição ambientalparticular (Giaever et al, 2002; Birrel et al., 2002). A correlação encontrada eradificilmente melhor do que o que pode ser visto por sorte e, portanto, atribuiruma função a um gene baseado em níveis de expressão pode serdesorientador. Em contraste, os métodos baseados em mutação (citadosacima) que atribuem funções baseados em fenótipos mutantes são muito maisconfiáveis em atribuir papéis biológicos a genes. De maneira similar, métodos(discutidos abaixo) que são baseados na superexpressão deliberada de genestambém são confiáveis, já que eles podem também atribuir papéis biológicos agenes baseados no fenótipo do organismo.

A presente invenção envolve simultaneamente rastrear genes queatravés da superexpressão aprimoram nas leveduras a tolerância ao estresse.Isso é em contraste com métodos conhecidos que superexpressam um genepor vez para aprimorar a tolerância ao stress; por exemplo, superexpressão doHAL1, YAK1, SOD1, SOD2 e TPS1 individualmente demonstrou aumento natolerância a várias condições de estresse (Chen et al, 1995; Davidson et al,1996; Gaxiola et al, 1992; Hartley et al, 1994; Soto et al, 1999). Em muitosoutros casos, linhagens de leveduras foram manejadas utilizando a estratégiade superexpressão de modo que estas fermentassem eficientementesubstratos como amido, celobiose, lactose, xilose, etc. (Adam et al, 1995;Muslin et al, 2000; Walfridson et al, 1995). Superexpressão do GPD1demonstrou o aumento da produção de glicerol por 1.5-2.5 vezes (Remize et al,1999). Nós desenvolvemos nosso método para superar a limitação da falta derastreamento por placa para a tolerância ao estresse de fermentação, etambém a falta de muita compreensão sobre os genes envolvidos nesteprocesso. Ao invés de primeiro identificar os genes envolvidos na tolerância aoestresse, e depois superexpressá-los um por um para ver se há aumento natolerância ao estresse, em nosso método uma abordagem inovadora é tomadapara diretamente identificar os genes que aprimoram a tolerância ao estresseatravés da superexpressão. Rastreamentos de superexpressão na escala degenoma foram suportados por outros, por exemplo, para identificar fenótiposletais ou de crescimento prejudicado (Espinet et al, 1995; Boyer et al, 2004), epara identificar genes de ciclo de célula previamente não caracterizados (Stevenson et al, 2001). Todos esses rastreamentos usufruíram da vantagemde rastreamentos em placas para identificar as propriedades desejadas doorganismo. Em contraste, em nosso método, os genes que conferem atolerância ao estresse aprimorada são identificados a partir de um pool mistode um grande número de transformantes de levedura superexpressando diferentes genes. Isso é particularmente vantajoso para identificar genesconferindo fenótipos para os quais não há rastreamento em placa, como ostolerantes ao estresse fermentativo.

RESUMO DA INVENÇÃO.

A presente invenção envolve o desenvolvimento de um método para identificação simultânea de genes que conferem fenótipos desejados,através do rastreamento de uma população mista de transformantes delevaduras. Uma coleção de plasmídeos carregando diferentes genes com osseus respectivos promotores ou sob o controle de um forte promotor sãotransformados em leveduras. A coleção deve ser grande o suficiente para carregar quase todos os genes de um organismo com alta probabilidade. Opool de transformantes de levedura é então sujeitado a seleção, por exemplo,para melhor sobrevivência sob condições de fermentação. As células quesobrevivem a uma rodada de seleção são então sujeitadas a uma outra rodadade seleção. Em uma abordagem, a seleção é repetida por cerca de seis vezes.

Ao final, o pool de sobreviventes é esperado para ter quase todos aquelestransformantes que são capazes de sobreviver às condições de seleção bemmelhor do que o pool inicial de transformantes, que podem ser confirmadosatravés da comparação da performance entre esses dois pools. Para garantirque a sobrevivência aprimorada é devido aos genes carregados nosplasmídeos, e não por causa de qualquer mutação no genoma do organismo,os plasmídeos são recuperados das leveduras, os quais são restransformadosem leveduras do tipo selvagem e o fenótipo confirmado. Os genes carregadosnesses plasmídeos são então identificados por métodos como seqüenciamentode DNA. Esses genes então são estudados um por um para confirmar os seuspais na tolerância ao estresse. A expressão desses genes pode então sermodulada em leveduras, uma por vez, ou em combinação, para aprimorar odesempenho da levedura durante a fermentação. Em outra abordagem, o poolde transformantes de levedura é sujeito à seleção por apenas algumasrodadas. Ao final dessa seleção, esse pool estará enriquecido com aqueles capazes de sobreviver melhor do que a população média, mas a sobrevivênciada maioria dos transformantes será similar ao do pool inicial de transformantes.Para identificar os genes carregados pelos melhores sobreviventes, asseguintes etapas devem ser seguidas. O DNA total é isolado da populaçãoinicial de transformantes e da população selecionada. A inserção de DNA carregado nos plasmídeos, do DNA total, é seletivamente amplificado utilizandoprimitivos específicos para plasmídeos. Os fragmentos da inserção de DNAamplificado da população inicial de transformantes é rotulado com uma tintafluorescente, e aquele da população selecionada, com outra tinta fluorescente.As probas de DNA rotulado são então misturadas e hibridizadas para ummicroarranjo manchado com DNA correspondente a quase todos os genes dofermento. As manchas de DNA no microarranjo que demonstram sinal deaprimoramento para a proba correspondente à população selecionadacomparada com aquela da população inicial são então identificadas. O papeldesses genes é posteriormente confirmado através de experimentos adicionais envolvendo superexpressão individual ou exclusão desses genes (deleção).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

De acordo, a presente invenção proporciona um método paraidentificar genes que, através de superexpressão, aprimoram a tolerância dasleveduras ao estresse, o que compreende em,

-Transformar leveduras com uma coleção de genes de leveduraclonadas em um plasmídeo para prover um grande número de transformantesde levedura.

-Combinação dos transformantes a fim de obter uma populaçãoinicial de transformantes

-Sujeitar a população de transformantes a condições de seleçãode modo que a viabilidade da população celular decresça de 3 a 200 vezes,através disso enriquecendo aquelas células transformadas capazes desobreviver melhor durante essas condições,-Recuperar células sobreviventes e as cultivando em um meiomínimo definido que permita o crescimento apenas daquelas células que retêmplasmídeos,

-Sujeitar tais células a rodadas adicionais de seleção através darepetição das etapas c e d,

-Recuperar as células que sobreviveram por no mínimo trêsrodadas de seleção

-Comparar as populações de células selecionadas com apopulação inicial de células sob condições de seleção para confirmar asobrevivência aprimorada das células selecionadas,

-Colocar em placas o pool selecionado de células a fim de obtercolônias isoladas,

-Isolar o DNA de colônias individuais de leveduras e transformarem E. coli a fim de recuperar o plasmídeo presente nas colônias individuais delevedura,

-Transformar esses plasmídeos em leveduras e testar ostransformantes para checar se os plasmídeos realmente conferem tolerânciaaprimorada sob as condições de seleção, e,

-Identificar os genes carregados pelos plasmídeos, que conferema tolerância ao estresse aprimorada, por seqüenciamento.

Em uma incorporação da invenção, genes que contribuem a umaaptidão aprimorada durante a seleção são diretamente identificados utilizandohibridização de microarranjo, o que se compreende por,-transformar leveduras com uma coleção de genes de levedurasclonadas em um plasmídeo para prover um grande número de transformantesde levedura.

-Fazer a combinação dos transformantes a fim de prover umapopulação inicial de transformantes.

-Sujeitar a população de transformantes a condições de seleçãode tal modo que a viabilidade da população de células decresça de 3 a 200vezes, através disso enriquecendo aquelas células transformadas capazes desobreviver melhor durante essas condições,

-Recuperar células sobreviventes e as cultivando em um meiomínimo definido que permita o crescimento apenas daquelas células que retêmplasmídeos,

-Sujeitar tais células a rodadas adicionais de seleção através darepetição das etapas c e d,

-Recuperar as células que sobreviveram por no mínimo umarodada de seleção,

- Isolar o DNA total da população inicial de transformantes e dapopulação selecionada,

-Amplificar especificamente somente a inserção de DNAcarregado nos plasmídeos do total de DNA utilizando primers específicas paraplasmídeos,

-Rotular a inserção de fragmentos de DNA da população inicial detransformantes com uma tinta fluorescente, e aquele ta população selecionadacom outra tinta fluorescente,-Misturar e hibridizar as probas rotuladas para um microarranjomanchado com DNA correspondente a quase todos os genes da levedura.

-Identificar as manchas de DNA no microarranjo que demonstramsinais aprimorados para a proba correspondente P com a populaçãoselecionada comparada com aquela da população inicial e,

-Identificar genes que correspondem a essas manchas de DNAcomo aqueles que aumentam a tolerância ao estresse da levedura durante aseleção.

Em outra incorporação da invenção; leveduras são transformadascom uma coleção de genes de organismos que já são tolerantes ao estresseparticular.

E ainda em outra incorporação da invenção, plasmídeoscarregando genes altamente enriquecidos durante a seleção podem serdiretamente isolados a partir de coleção por hibridização de colônia.

Em ainda outra incorporação da invenção, a tolerância aoestresse das leveduras é melhorada através da transformação com plasmídeosque superexpressam os genes identificados acima.

Em ainda outra incorporação da invenção, o plasmídeo é umplasmídeo de expressão com um promotor indutível.

E em ainda outra incorporação da invenção, a tolerância aoestresse das leveduras é aprimorada através da modulação do nível deexpressão dos genes identificados acima, através da substituição do promotordo gene alvo presente no genoma da levedura com um promotor constitutivoou indutível.Em ainda outra incorporação da invenção, genes selecionados deum grupo consistindo de RPM, WSC2, WSC4, YIL055C, SRA1, SSK2, ECM39,MKT1, SOL1, e ADE16 são superexpressados singularmente ou emcombinação para aprimorar a tolerância ao estresse.

Em ainda outra incorporação da invenção, mais de um gene podeser simultaneamente superexpressado na mesma linhagem paraposteriormente melhorar a resistência ao estresse.

Em ainda outra incorporação da invenção, o estresse é aqueleencontrado por leveduras sob condições de produção de álcool,particularmente em altas temperaturas.

Em ainda outra incorporação da invenção, glucose é utilizadacomo matéria-prima para a produção de álcool.

Em ainda outra incorporação da invenção, sucrose ou melaço oqualquer outra fonte complexa de carbono é utilizada como matéria-prima paraa produção de álcool.

Em ainda outra incorporação da invenção, o organismo é umalinhagem de levedura de laboratório.

Em ainda outra incorporação da invenção, o organismo é umalinhagem de levedura industrial.

Em ainda outra incorporação da invenção, o organismo équalquer microorganismo que necessita de aprimoramento na tolerância aoestresse.

Em ainda outra incorporação da invenção, o estresse é qualquercondição adversa encontrada por microorganismos em indústrias.O processo da presente invenção é ilustrada nos exemplos dadosabaixo, que não devem, no entanto, constituir um limite do escopo da presenteinvenção.

EXEMPLO 1

Detecção de coleções de expressão genômica para genes queaprimoram tolerância ao estresse. A coleção genômica do DNA de levedurasfeita sobre o controle de um promotor constituinte ADH1 (Dehidrogenase deálcool 1), em um plasmídeo centromérico com URA3 como marcador deseleção foi obtido de uma coleção de Cultura do tipo Americano (CCTA). Alinhagem de levedura FY3 (Winston et al., 1995), obtida de Fred Winston(Departamento de Genética, Harvard Medicai School1 Boston, MA, 02115,EUA) foi utilizada para todas as transformações. Os plasmídeos dessa coleçãoforam transformados em linhagens FY3 por protocolo de transformação padrão(Kaiser et al, 1994). Transformantes (-IOaS) foram colocados em pool juntos esubmetidos a 6 rodadas de fermentação a 30° C. 0 tempo de colheita etransferência para as sucessivas rodadas foi feito com alvo em mente de matar90% das células. Em banho no meio mínimo ao fim de cada rodada revelouque aproximadamente 50% das células perderam seu plasmídeo. Depois derepetidas rodadas de fermentação ambas as populações foram tratadasseparadamente.

Resultados de seleção a 38°: Da população selecionada,plasmídeos foram tirados por protocolos padrão e transformados em E. coliJM109. Plasmídeos foram purificados dos transformantes por métodostradicionais (Sambrook et al, 1989) e digeridos com a enzima de restriçãoXho1. Plasmídeos demonstrando padrões de digestão similares foramposteriormente digeridos com um conjunto de duas ou três enzimas (Xhol,Xbal, e EcoRV). 25 plasmídeos demonstrando padrões de digestão singularesforam então transformados em leveduras, e os estudos de sua fermentaçãoforam feitos a 38° com a linhagem de controle transformada somente comvetor. Dos 25 plasmídeos, 10 mostraram aumento de 20 a 1000 vezes emviabilidade depois de 49-52 horas de fermentação, produzindo um pouco maisou a mesma quantidade de álcool comparando com o controle. OSequenciamento feito com um primer específico de promotor de ADH1 e buscaBLAST por similaridade de seqüência (Atshul et al, 1997) demonstrou quetodos os nove insertos completaram o gene RPM, incluindo o seu promotor.Além disso, o gene RPM esteve presente em ambas orientações com respeitoao promotor ADH1. A partir disso, pode ser inferido que a introdução de umacópia adicional do RPM expressa de seu próprio promotor é o suficiente paraprover a tolerância aprimorada ao estresse durante a fermentação.

Resultados de seleção a 30° : A população obtida depois de 6rodadas de repetida seleção foi comparada com população paterna inicial nãoselecionada em termos de viabilidade e taxa de produção de etanol. Enquantoa taxa de produção de etanol manteve-se comparável, a populaçãoselecionada demonstrou aproximadamente 150 vezes maior sobrevivência doque a população paterna depois de 127 horas de fermentação. Para descartara possibilidade de contribuição de qualquer mutação espontânea enriquecidaem viabilidade aprimorada, plasmídeos foram recuperados da populaçãoselecionada e transformados em um pool de 100 E. coli JM109. Plasmídeosisolados de um pool aleatório de 1000 colônias de E. coli foram transformadosde volta em leveduras de linhagem FY3 através de protocolos padrão.Aproximadamente 20,000 transformantes de levedura foram colocados juntosem pool e sujeitos a uma rodada adicional de fermentação a 30°. Essestransformantes demonstraram viabilidade muito melhor do que a linhagempaterna, confirmando que os genes carregados nos plasmídeos conferemtolerância aprimorada a estresse. Tais plasmídeos foram novamentetransferidos a E. Coli, e plasmídeos de 38 colônias foram isolados e analisadospor restrição de digestão para identificar clones singulares. Quinze plasmídeossingulares foram transformados de volta em FY3 e comparados emfermentação a 30° em sobrevivência releva e produção de etanol tendo emvista a população controle. Entre esses, nove pareceram promissores. Osgenes carregados por esses plasmídeos foram identificados porseqüênciamento utilizando primer específico para ADH, e busca BLAST porsimilaridade de seqüência. Dentre os nove clones, cinco corresponderam aWSC4, três carregavam o gene não caracterizado YIL055C e um carregava uminserto de aproximadamente 2.9-Kb compreendendo por todo o CAP2, a maiorparte do SRA1 e uma pequena porção do CKA1. Estudos posteriores foramfeitos para confirmar o papel de tais genes na fermentação.

EXEMPLO 2

Caracterização do RPM. Dos estudos preliminares, baseados emseqüenciamento, inferimos que a adição de uma única cópia do RPI1 (inibidor1 de pathway Ras cAMP) é o suficiente para prover tolerância aprimorada aoestresse durante fermentação. Portanto, subclonamos o inserto 2.6kb inteiroisolado de um dos clones RPM no site Xhoi de um vetor integrativo Prs306.Esse vetor foi linearizado dentro do gene URA3 do vetor e transformado nalinhagem FY3 para integração visada no lócus URA3 do genoma.Transformantes foram selecionados por protrofia de uracila em placas de meiomínimas. Uma cópia adicional do RPM então foi integrada no genoma.Anteriormente, estudos demonstraram que os perturbantes do RM não sãoletais (Kim et al, 1991). Perturbantes do RPM foram feios através de mutagênese insercional utilizando primers específicos de Tn3. A linhagens desuperexpressão e perturbação foram então utilizadas para estudos defermentação realizados a 38° e 30°. Estudos de fermentação a 38° foram feitoscom 20% de glucose por 38 a 44 horas enquanto estudos de fermentação a30° foram feitos com 25% de glucose por 108 a 114 horas. A viabilidade foimonitorada ao fim da fermentação. Linhagens com uma cópia adicional doRPI1 demonstraram aprimoramento de sobrevivência muitas vezes maiorcomparadas com a população de controle em ambos os estudos a 30 e 38°. Aslinhagens com a cópia perturbada do RPM demonstraram sobrevivênciaconsideravelmente reduzida, confirmando o papel do RPM na tolerância aoestresse. Mas as linhagens com uma cópia adicional do RPI1 demonstraramuma taxa vagarosa de fermentação no começo, embora não houve diferençana quantidade de etanol finalmente feita comparada com as linhagens do tiposelvagem.

Estudos de cultura mista: pode ser argüido que a melhora nasobrevivência vista na linhagem de superexpressão do RPI1 é devido a taxavagarosa de fermentação. Para eliminar tal possibilidade, fermentações emcultura mista foram realizadas. Linhagens com uma cópia adicional do RPMforam misturadas em igual proporção com uma população de controle do tiposelvagem tendo o marcador de resistência G418. O marcador de resistênciaG418 não afeta o desempenho ou a viabilidade de células durante afermentação, mas serve como marcador para distinguir a linhagem de controleda linhagem de testes após a fermentação mista. A taxa de fermentação dacultura mista foi comparável àquela de linhagem de tipo selvagem. Após afermentação, a linhagem de teste com cópia adicional do RPM demonstrousobrevivência aproximadamente cem vezes maior do que a de tipo selvagemtanto em 38° (tabela 1 A) como em 30° (tabela 1 B). Em contraste, a viabilidadeda linhagem com o RPM apagado foi extremamente pobre comparada com alinhagem de controle. Tais resultados demonstram que o RPM é crucial para atolerância da levedura ao estresse durante fermentação etanólica.

Tabela 1a

<table>table see original document page 18</column></row><table> Tabela 1 b

<table>table see original document page 18</column></row><table>

O RPM anteriormente fora identificado como um supressor de altacópia de mutação de Ras2, suprimindo o fenótipo da onda de calor induzido pela mutação de Ras2 (Kim et al, 1991). Estudos posteriores demonstram queo RPM é crucial para a tolerância ao estresse durante a fermentação etanólicatambém e sua superexpressão pode ser utilizada para aumentar asuperexpressão muitas vezes.

EXEMPLO 3

Caracterização do WSC4. Gene WSC4 (Cell Wall integrity and Stress Response; componente da integridade da parede celular e resposta aoestresse) , identificado a partir da fermentação a 30°, é conhecido por serrequerido para a translocação secretória de proteína, para manutenção daintegridade da parede celular e por resposta ao estresse no S. cerevisae(Verna et al, 1997). Para estudar o seu comportamento no estresse defermentação, o gene WSC4 completo, junto com o seu promotor, foisubclonado em vetor integrativo PRS306. Esse gene então foi integrado aogenoma por recombinação homóloga no lócus ura3, portanto aumentando emum o número de cópias. Perturbadores do WSC4 foram também feitos pormutagênese de transposição e posteriormente confirmados por seqüenciamento. Estudos de fermentação feitos a 30oC com 25% de glucosepor 108 horas demonstraram que ele pôde aumentar a sobrevivência de 5 a 10vezes comparado ao tipo selvagem. Posteriormente, estudos de fermentaçãoem cultura mista foram realizados com linhagens de tipo selvagem edemonstraram que o WSC4 de fato aumenta a tolerância da linhagem de S. cerevisae a estresse (tabela 2). Abundância de linhagens com deleção doWSC4 é consideravelmente reduzida no pool misto. Este estudo demonstraque o WSC4 pode ser explorado a fim de melhorar a tolerância ao estressedurante a fermentação.Tabela 2

<table>table see original document page 20</column></row><table>

EXEMPLO 4

Caracterização do YIL055c. YIL055c, um gene de funçãodesconhecida, foi também isolado do rastreamento de superexpressão a 30°.

Para confirmar o seu papel na tolerância ao estresse, o ORF desses genes foisubclonado sob o controle do forte promotor de GPD1 no vetor integrativoPgv8. O construto recombinante foi então integrado ao Iocus ura3 da linhagemFY3. Tal gene também foi perturbado por mutagênese de transposição econfirmado por seqüenciamento. Estudos de fermentação realizados a 30°,demonstraram que sob a superexpressão do YIL055c, a taxa de fermentaçãofoi consideravelmente reduzida, embora a fermentação possa completar talcomo a fermentação de um tipo selvagem. Perturbantes demonstraram taxa defermentação normal. Em cultura mista feita a 30°, essas linhagens desuperexpressão fermentaram em taxa igual a cultura de controle do tiposelvagem mista. Essas linhagens ainda confeririam sobrevivência aprimoradacomparadas com células do tipo selvagem (Tabela 3). Isso indica que asobrevivência aprimorada não é devido a taxa de fermentação reduzida. Opapel do YIL055c na tolerância ao estresse é bastante similar ao do RPM, e,portanto tais genes são parte provável do mesmo trajeto de resposta ao estresse.<table>table see original document page 21</column></row><table>

EXEMPLO 5

Caracterização do SRA1. Outro clone rastreado inclui três genes,incluindo um fragmento do SRA1. A parte SRA1 desse clone foi subclonadasob o controle do promotor forte GDP1 em Pgv8 e integrado ao genoma dalevedura. Estudos de fermentação foram realizados com o clone desuperexpressão do SRA1 a 30 demonstraram sobrevivência aprimorada váriasvezes após 108 horas de fermentação com 25% de açúcar. Linhagens com oSRA1 superexpresso mostraram atraso inicial na produção de etanol, mascompletaram a fermentação em tempo igual ao tomado pelo tipo selvagem.Estudos superiores de fermentação em cultura mista demonstraram taxa defermentação normal, mas sobrevivência aprimorada comparada à linhagem decontrole (Tabela 4). Perturbantes de SRA1 demonstraram sobrevivênciareduzida durante o próprio crescimento normal e portanto estudos defermentação não foram realizados com tais linhagens.

Tabela 4

<table>table see original document page 21</column></row><table>SRA1 possui atividade inibidora de cinese de proteínadependente de cAMP. Superexpressão do SRA1 alterna o equilíbrio deassociação ou dissociação do PKA (protein kinase inhibitor; inibidor de cinesede proteína) em suas subunidades em direção ao estado indissociado (Portelaet al, 2001). Ele também leva à hiperacumulação de glicogênio e resistênciaaprimorada a choque. Portanto, o SRA1 quando superexpresso leva a menosatividade de PKA e tolerância aprimorada ao estresse. Atividade de PKAreduzida resulta em taxa de crescimento reduzida (Van Dijck et al, 200). Issopoderia explicar a taxa de fermentação reduzida observada quando hásuperexpressão do SRA1. Mas a viabilidade melhorada em fermentação emcultura mista demonstra que a tolerância aumentada ao estresse não é devidoà taxa reduzida de fermentação. Isolamento do SRA1 por estratégia desuperexpressão prova a validade da estratégia, já que o papel do trajeto cAMPem tolerância ao estresse já está estabelecido através de estudos commutantes RAS.

EXEMPLO 6

Perfis de aptidão em escala de Genoma de linhagens desuperexpressão. Microarranjos são largamente explorados para monitorar todoo genoma em chip único. Isso dá uma melhor idéia das interações entremilhares de genes simultaneamente. Aqui nós utilizamos DNA baseado emmicroarranjo, para simultaneamente monitorar os genes presentes emplasmídeos, pelos seus papéis em estresse de fermentação. A linhagem delevedura FY3 foi transformada com o todo genoma de coleção desuperexpressão, como descrito no Exemplo 1. Um pool de aproximadamente20,000 transformantes foi cultivado em um meio mínimo por 24 horas,edividido em dois banhos. Um pool foi mantido com população não-selecionadaenquanto outro foi submetido a duas rodadas de fermentação a 38oC. Depoisde cada rodada células foram colhidas e cultivadas em meio mínimo paraenriquecer para células retendo plasmídeos. Ao final de duas rodadas, o DNAtotal foi isolado do pool de células selecionado e não-selecionado porprotocolos padrão(Kaiser et al, 1994). Fragmentos de inserto de DNA deplasmídeos presentes no DNA total foram especificamente amplificadosusando um primer (5'-CTCGAAGCTACGTCAGGG-3') complementar aseqüências adaptadoras presentes em ambos os lados do inserto de DNA.Uma reação PCR foi configurada em volume de 25ul. Ela conteve 100 ng dopadrão, 1X tampão Taq (NEB)1 0.4mM primer, 0.2mM dNTPs e 5U Taq DNApolimerase. Condições de ciclo térmico eram: desnaturação a 95°C por 5minutos, seguida por 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 1 minuto, recozidosa 60°C por 1 minuto e extensão a 72°C por 10 minutos. Os produtos PCRforam checados para uniformidade em padrão de tamanho em ambas aspopulações por eletroforese de gel de agarose e depois purificados utilizandokit de purificação PCR (Qiagen). Um ug de primers aleatórios (nonamer), 2ngde DNA de controle de Arabidopse, 0.5mM dNTPs sem dCTP, 1X buffer deklenow, 2ul de fluorophor (Cy5/Cy3 dCTP) e 50U de fragmento de DNApolimerase Klenow (NEB) foram adicionados. A reação foi incubada a 37C por12 horas e terminada pela adição de 2.5ul de 0.5M EDA. O produto rotulado foipurificado utilizando um kit de purificação PCR. A rotulação foi quantificadaatravés da comparação de diluição serial de amostra impura com amostra puraem uma lamina de vidro. Esses foram escaneados em microarranjo paradescobrir o percentual de incorporação. Para hibridização Cy5 e Cy3,fragmentos de DNA rotulado foram misturados em partes iguais e o volume foiaumentado a 18ul. Isso foi desnaturado a calor a 95oC por 2 minutos. Areação de hibridização de 80ul foi configurada. Nesses 18ul de proba rotulada,1X tampão de hibridização, 1.6ul 10% SDS e 40ul de formamide forammisturados. Esse volume inteiro é colocado em uma placa de vidro demicroarranjo e cuidadosamente coberto com a tampa rasa. Hibridização foiconfigurada em uma câmara de hibridização e incubada em banho de águaquente a 42oC por 12 horas. A lavagem dos slides foi feita seguindo osprotocolos padrão (Bowtell et al, 2002). Esses slides então foram escaneados em um scanner de microarranjo Axon 4000B. O Software Genepix Pro foiutilizado para a análise de dados. Experimentos foram feitos em duas coleçõesseparadas para verificar consistência. Além disso, experimentos de troca detinta foram também feitos para descartar viés na rotulação. Genes quemostram maior sinal para FNA de população comparada à população inicial são aqueles que ficaram enriquecidos durante a seleção, e, portanto possuemmaior aptidão durante as condições de seleção.

EXEMPLO 7

Hibridização de colônia para recuperar genes enriquecidosconferindo maior aptidão. Genes conferindo papel na tolerância ao estresse podem ser diretamente isolados da coleção genômica utilizando hibridizaçãode colônia. Probas de genes inteiras, foram preparadas para os genesconsistentemente enriquecidos em todos os microaarranjos. Plasmídeosrecuperados da população selecionada ao final de quatro rodadas defermentação foram transformados e E. coli através do protocolo padrão. 1000transformantes de E. Coli foram patched em placas LB-amp. Para ahibridização de colônia padrão utilizando membrana Hybond (N) nylone foiseguida (Sambrook et al, 1989). Para cada gene, muitos clones podem serisolados. Plasmídeos (de clones pegos aleatoriamente) foram isolados pelométodo de Iise alcalina, e restrição digerida com enzima Xhol para identificar insertos de tamanho singular. Aqueles parecendo singulares foramseqüenciados utilizando primer específico de ADH1. Esses foramposteriormente caracterizados e transformados em leveduras para confirmar oseu papel em tolerância ao estresse de fermentação. Alguns dos insertoscarregavam mais de um gene ou genes parciais adicionais. Além disso, osequênciamento ajudou a identificar a orientação dos genes em relação aopromotor de ADH1. Insertos correspondendo a RPI1, MKT1, ECM39, SOL1 eADE16 foram identificados e caracterizados utilizando tal abordagem.

EXEMPLO 8

Confirmação do papel do WSC2. Rastreamento baseado em microarranjo demonstrou que o WSC2 esteve altamente enriquecido em todosos arranjos de experimentos. Assim, clones de superexpressão e perturbaçãoforam realizados para confirmar o seu papel Clones de superexpressão foramobtidos trocando o seu promotor endógeno por um promotor de GPD1(Petracek et al, 2002), enquanto perturbantes foram feitos substituindo a regiãode codificação de WSC2 por marcador URA3. Esses foram transformados emlinhagens de deleção do URA3. Estudos de fermentação feitos a 38C com 20%de açúcar demonstraram que aos clones de superexpressão do WSC2sobrevivem de 50 a 100 vezes melhor que os tipos selvagens ao final dafermentação. Não é demonstrada qualquer mudança na taxa de fermentaçãocomparada com o tipo selvagem. Mesmo em estudos realizados em culturamista a 38oC, essa linhagem continuou predominante ao final da fermentaçãocomparada com a linhagem de controle G418AR (tabela 5). O WSC2 pertencea mesma família do WSC4 e é envolvido no trajeto de integridade da paredecelular. Genes WSC são funcionalmente redundantes. Alguém não podeidentificar seus papéis até que todos sejam deletados ou deletados emcombinação. No entanto, esta estratégia de superexpressão não podeidentificar o papel de membros individuais dos genes redundantes. A famíliaWSC é uma de moléculas sinalizadoras, que ativam DOWNSTREAM Rhol etrajeto de cinese MAP em resposta a estresse ambiental. Além do mais, não háefeito óbvio na taxa de crescimento ou fermentação, sugerindo que essesagem em maneira PKA independente. Assim, posterior exploração do trajeto degenes WSC pode ajudar a melhorar linhagens para maior tolerância aoestresse de fermentação.

Tabela 5 <table>table see original document page 26</column></row><table>

EXEMPLO 9

Outros genes identificados por perfis de aptidão. Muitos outrosgenes que apareceram consistentemente em todo o microarranjo confirmaramos seus papéis na tolerância ao estresse de fermentação através de estudosem cultura mista. Muitos plasmídeos isolados de uma população selecionadana segunda rodada, e identificados por hibridização de colônia por genesespecíficos, onde foram transformados em leveduras da linhagem FY3. Essestransformantes foram então sujeitos a estudos de fermentação em culturamista. Aí, linhagens de teste de superexpressão foram misturadas com umalinhagem de controle de tipo selvagem G418AR em igual proporção. Estudosde fermentação foram feitos a 380c com 20% de açúcar. Células sensíveis aG418 sobreviventes ao final da fermentação foram comparadas com célulasG418AR ao final da fermentação. No caso de ECM39 (tabela 6) e MKT1 9tabela7), clones de superexpressão em mais de 90% da população foram dominadospor linhagens de teste sensíveis a G418, enquanto no caso do ADE16 mais de85% da população correspondeu à linhagem de superexpressão de ADE16(tabela 8). Transformantes de SOL1 dominaram a população da cultura mistaem 80% (tabela 9). Genes ECM39, MKT1 e AD16 estiveram presentes emorientação oposta em relação ao promotor de ADH1 nos plasmídeos. Pareceque para tais genes a adição e uma única cópia é suficiente para conferirtolerância aprimorada ao estresse durante a fermentação. Embora todos essesgenes são conhecidos na literatura, somente nossa abordagem demonstrou osseus papeis em tolerância ao estresse fermentativo.

Tabela 6

<table>table see original document page 27</column></row><table>Tabela 7

<table>table see original document page 28</column></row><table> Tabela 8

<table>table see original document page 28</column></row><table> Tabela 9

<table>table see original document page 28</column></row><table>

Em resumo, a presente invenção possui diversas vantagens:

- Na presente invenção, quase todos os genes de um organismoque possivelmente podem aprimorar a tolerância ao estresse através dasuperexpressão são simultaneamente identificados. Isso contrasta com osmétodos conhecidos, onde genes envolvidos em tolerância ao estresse sãoprimeiro identificados, e depois superexpressos um por um para verificar seeles podem melhorar a tolerância ao estresse. A limitação dos métodos atuaisé que apenas alguns dos genes superexpressados resultarão em melhora. Arazão é porque apenas alguns dos genes envolvidos no processo serãoclasses limitantes, e somente se esses genes são superexpressados ocorreráalguma melhora. Por outro lado, em nossa abordagem somente aqueles genesque realmente aumentam a tolerância ao estresse são diretamenteidentificados. Portanto, nossa invenção é menos laboriosa e mais eficiente.

-A presente invenção também idêntica genes que são essenciaispara o crescimento assim como para tolerância ao estresse. Em contraste, asabordagens baseadas em mutação irão na maior parte desperceber tais genes,já que mutantes enfraquecidos nos genes essenciais não conseguirão crescerno primeiro lugar para eles para serem estudados posteriormente.

-A presente invenção também supera a limitação da fala deplacas de rastreamento e rastreamentos de placa para o estudo de certosfenótipos tal como tolerância ao estresse durante a fermentação etanólica emcaldos líquidos. Isso é possível já que ela permite a abundância de todos ostransformantes presentes em um único pool para ser quantitativamenteseguida, através do real monitoramento da abundância dos genes carregadosem plasmídeos presentes nesses transformantes. Isto é, os genes carregadosnos próprios plasmídeos servem como etiquetas de DNA para diferenciardiferentes transformantes presentes no pool.

-A presente invenção também permite com que as pequenascontribuições à aptidão causadas por diferentes genes possam serquantitativamente estudadas. Isso é possível já que todos os transformantessão estudados em um único pool e portanto experimentam condições idênticasde competição seletiva.REFERENCIAS

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Claims (23)

1. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAMA TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARA MELHORAR AEFICIÊNCIA DA LEVEDURA, caracterizado por ser um método paraidentificar genes para aumentar a tolerância de leveduras ao estresse, onde oreferido método esta compreende por:a. Transformar leveduras através de uma livraria de genes delevedura clonados em um plasmídeo a fim de provir um grandenúmero de transformantes de levedura.b. Fazer os banhos dos transformantes obtidos na etapa (a) a fim deprovir uma população inicial de transformantes.c: Sujeitar a população de transformantes obtidos na etapa (b) àcondições de seleção onde a viabilidade da população de célulasdecresce de 3 a 200 vezes, assim enriquecendo aquelas célulastransformadas que podem sobreviver melhor sob tais condições,d. Recuperar as células sobreviventes obtidas na etapa (c) ecultivando-as em um meio que permita o crescimento somentedaquelas células que retêm plasmídeos.e. Sujeitar as células obtidas na etapa (d) a rodadas adicionais deseleção através da repetição das etapas (c) e (d).f. Recuperar as células obtidas na etapa (e) que sobreviveram porao menos três rodadas de seleção.g. Comparar a população de células obtidas na etapa (f) com apopulação inicial de células sob condições de seleção a fim deconfirmar a sobrevivência aprimorada das células selecionadas,h. Colocar em placas o pool de células selecionadas obtidas naetapa (f) a fim de obter colônias isoladas,i. Isolar DNA de colônias individuais de levedura obtidas na etapa(g) e transformar em E. Coli a fim de recuperar o plasmídeo presenteem colônias individuais de levedura,j. Transformar os plasmídeos obtidos na etapa (i) em levedura etestar os transformantes a fim de checar se os plasmídeos realmenteconferem tolerância aprimorada sob as condições selecionadas,k. Identificar os genes carregados nos plasmídeos obtidos na etapa(j), que conferem tolerância aprimorada ao estresse, através deseqüenciamento.

2. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAMA TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARA MELHORAR AEFICIÊNCIA DA LEVEDURA, um método para identificar genes que aumentamtolerância de leveduras ao estresse como reivindicado na primeirareivindicação, caracterizado por que durante as condições de fermentação ométodo esta compreendido pelo seguinte processo:a. Transformar leveduras através de uma livraria de genes delevedura clonados em um plasmídeo a fim de provir um grandenúmero de transformantes de levedura.b. Fazer o banho dos transformantes obtidos na etapa (a) a fim deprovir uma população inicial de transformantes.c. Sujeitar a população de transformantes obtidos na etapa (b) àcondições de seleção onde a viabilidade da população de célulasdecresce de 3 a 200 vezes, assim enriquecendo aquelas célulastransformadas que podem sobreviver melhor sob tais condições,d. Recuperar as células sobreviventes obtidas na etapa (c) ecultivando-as em um meio que permita o crescimento somentedaquelas células que retêm plasmídeos.e. Sujeitar as células obtidas na etapa (d) a rodadas adicionais deseleção através da repetição das etapas (c) e (d).f. Recuperar as células obtidas na etapa (e) que sobreviveram poruma rodada de seleçãog. Isolar o DNA total da população inicial de transformantes e apopulação selecionada obtida na etapa (f)h. Amplificar especificamente somente o inserto de DNA carregadoem plasmídeos do DNA total obtido na etapa (g) através do uso deprimers específicos para plasmídeos.i. Rotular os fragmentos de inserto de DNA1 obtidos na etapa (h), dapopulação inicial com uma tintura fluorescente, e aqueles dapopulação selecionada, com outra tintura fluorescente,j. Misturar e hibridizar as probas rotuladas obtidas na etapa (i) paraum microarranjo manchado com DNA correspondente a quase todosos genes da levedura.k. Identificar as manchas de DNA no microarranjo obtidas na etapa(j) que demonstram sinal aprimorada para a proba correspondente apopulação selecionada compara com a população inicial, el. Isolar clones de plasmídeo recombinante que carregam os genesque correspondem às manchas de DNA obtidas na etapa (k) comoaqueles que aumentam nas leveduras a tolerância ao estressedurante a seleção.

3. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAMA TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARA MELHORAR AEFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método, como descrito nas reivindicações 1 e 2,caracterizado pelas leveduras serem transformadas com uma coleção degenes de organismos que já são tolerantes a um estresse em particular.

4. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAMA TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARA MELHORAR AEFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método, como descrito nas reivindicações 1 a 4,caracterizado pela linhagem de levedura utilizada ser S. cerevisiae.

5. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAMA TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARA MELHORAR AEFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método, como descrito nas reivindicações 1 a 4,caracterizado pelo plasmídeo ser um plasmídeo de expressão com promotorconstitutivo.

6. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAMA TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARA MELHORAR AEFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método, como descrito nas reivindicações 1 a 4,caracterizado pelo plasmídeo ser um plasmídeo de expressão com promotorindutível.

7. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAMA TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARA MELHORAR AEFICIÊNCIA DA LEVEDURA, caracterizado por ser um método para melhorara tolerância ao estresse em leveduras obtidas através da transformação complasmídeos recombinantes carregando os genes identificados nasreivindicações de 1 a 6.

8. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAMA TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARA MELHORAR AEFICIÊNCIA DA LEVEDURA, caracterizado por ser um método para melhorara tolerância ao estresse em leveduras através da transformação complasmídeos recombinantes que superexpressam os genes identificados nasreivindicações de 1 a 6, compreendendo por:a. Sub-clonagem da seqüência codificadora de um gene sob ocontrole de um promotor constitutivo a fim de obter um plasmídeorecombinante superexpressando o gene, e,b. Transformação da levedura com o dito plasmídeo recombinanteobtido na etapa (a) a fim de aumentar tolerância ao estresse.

9. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAMA TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARA MELHORAR AEFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método como o descrito na reivindicação 8,caracterizado pelo o plasmídeo ser um plasmídeo de expressão com umpromotor indutível.

10. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUEAUMENTAM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARAMELHORAR A EFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método como o descrito nasreivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo plasmídeo ser um plasmídeointegrante.

11. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUEAUMENTAM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARAMELHORAR A EFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método para melhorar atolerância a estresse em leveduras através da modulação do nível deexpressão dos genes-alvo identificados nas reivindicações de 1 a 6,caracterizado por ser feito através da substituição do promotor do gene-alvopresente no genoma da levedura com um forte promotor constitutivo.

12. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUEAUMENTAM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARAMELHORAR A EFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método como o descrito nareivindicação 11, caracterizado pelo promotor ser um promotor indutível.

13. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUEAUMENTAM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARAMELHORAR A EFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método para aprimorar atolerância ao estresse em leveduras como nas reivindicações de 1 a 12,caracterizado pelos genes serem selecionados a partir de um grupoconstituído por RPI1, WSC2, WSC4, YIL05CC, SRA1, ECM39, SSK2, MKT1,SOL1, e ADE16.

14. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUEAUMENTAM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARAMELHORAR A EFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método como o reivindicado nasreivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo estresse ser estressefermentativo sob condições de produção de álcool.

15. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUEAUMENTAM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARAMELHORAR A EFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método como o reivindicado nasreivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo estresse ser estressefermentativo sob condições de produção de álcool em alta temperatura na faixade 37°C a 40°C.

16. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUEAUMENTAM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARAMELHORAR A EFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método como o reivindicado nasreivindicações de 1 a 15, caracterizado pela glucose ou sucrose ser a matériaprima para a produção de álcool.

17. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUEAUMENTAM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARA MELHORAR A EFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método como o reivindicado nasreivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo melaço ou outras fontescomplexas de carbono servirem como a matéria prima para a produção deálcool.

18. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUEAU.MENTAM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARAMELHORAR A EFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método como o reivindicado nasreivindicações de 1 a 17, caracterizado pelo organismo ser de uma linhagemde levedura de laboratório.

19. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUEAUMENTAM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARAMELHORAR A EFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método como o reivindicado nasreivindicações de 1 a 17, caracterizado pelo organismo ser de uma linhagemde levedura industrial.

20.- MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUEAUMENTAM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARAMELHORAR A EFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método como o reivindicado nasreivindicações de 1 a 17, caracterizado pelo organismo ser qualquermicroorganismo que necessita de aprimoramento em tolerância a estresse.

21. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUEAUMENTAM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARAMELHORAR A EFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método como o reivindicado nasreivindicações de 1 a 20, caracterizado pelo estresse ser qualquer condiçãoadversa encontrada por microorganismos em indústrias.

22. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUEAUMENTAM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARAMELHORAR A EFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método como o reivindicado nasreivindicações de 1 a 22, caracterizado pelo uso de genes identificados paramelhora de linhagem de levedura.

23. - MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUEAUMENTAM A TOLERÂNCIA AO ESTRESSE NA LEVEDURA PARAMELHORAR A EFICIÊNCIA DA LEVEDURA, método como o reivindicado nasreivindicações de 1 a 22, caracterizado pelo uso dos genes selecionados apartir de um grupo constituído por RPM, WSC2, WSC4, YIL05CC, SRA1,ECM39, SSK2, MKT1, S0L1, e ADE16, para aprimoramento de linhagens delevedura.