CN115896155A - 一种构建对乙醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种构建对乙醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，将过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181‑SOL1转化入宿主菌酿酒酵母出发菌株W303‑1A，在缺亮氨酸的CM固体培养基上培养2～3天后，筛选带有YEplac181‑SOL1质粒的转化子，构建得到对乙醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HGDAL‑175。所述酿酒酵母菌株HGDAL‑175在含有8％高浓度乙醇条件下较对照菌株W303‑1A‑YEplac181的细胞量有大幅提升，其细胞量与对照菌株相比提高了1.29倍。
Description
技术领域
本发明的技术方案涉及用于酵母使用载体引入DNA重组技术，具体地说是一种构建对乙醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法。
背景技术
乙醇是一种重要的工业原料，可用于制造醋酸、饮料、香精、染料、消毒剂等，也是有巨大市场潜力的清洁可再生生物燃料。目前，燃料乙醇主要由酿酒酵母等微生物发酵生产。但发酵过程中逐渐增加的乙醇浓度会抑制酵母细胞的生长，甚至死亡，导致发酵性能降低，限制了乙醇终产量的提高。专利ZL200510014727.6利用甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量，但发酵中后期菌株耐受性差。本专利将利用载体过表达SOL1基因提高酵母菌株的乙醇耐受性，为进一步提高乙醇产量奠定基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种构建对乙醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，运用分子生物学和基因重组技术改造酿酒酵母细胞，将过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1转化入宿主菌酿酒酵母出发菌株W303-1A，在缺亮氨酸的CM固体培养基上培养2～3天后，筛选带有YEplac181-SOL1质粒的转化子，构建得到对乙醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HGDAL-175，克服现有技术中存在的酵母细胞乙醇耐受性低导致的乙醇产量低的问题，为进一步构建具有更高性能的酵母菌株提供参考。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：一种构建对乙醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，运用分子生物学和基因重组技术改造酿酒酵母细胞，将过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1转化入宿主菌酿酒酵母出发菌株W303-1A，在缺亮氨酸的CM固体培养基上培养2～3天后，筛选带有YEplac181-SOL1质粒的转化子，构建得到对乙醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HGDAL-175，具体步骤如下：
第一步，过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1的构建：
(1.1)基因SOL1片段的合成：
根据酿酒酵母W303-1A染色体上SOL1基因序列设计引物对SOL1-U和SOL1-D(SOL1-U:5′–GGGCCCGAGCTCGATTGACCTCTGCCAGTAAG–3′；SOL1-D：5′–GGGCCCCTGCAGAATGAATGAATCAGCGACAT–3′)。以W303-1A染色体DNA为模板，用引物对SOL1-U和SOL1-D进行PCR扩增，合成基因SOL1片段；
(1.2)过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1的构建：
将质粒YEplac181和上述(1.1)步得到的基因SOL1片段分别用限制性内切酶SacⅠ和PstⅠ消化。消化质粒YEplac181的体系为：无菌水15μL、酶切缓冲液2μL、YEplac181 2μL、SacⅠ、PstⅠ各1μL；消化PCR产物SOL1基因片段的体系为：无菌水2.75μL、酶切缓冲液1.5μL、PCR产物10μL、SacⅠ、PstⅠ各0.375μL，上述体系分别在37℃条件下消化30min，之后用T4DNA连接酶将质粒YEplac181和基因SOL1片段连接，连接操作如下：在1.5mL离心管中，加入无菌水4.25μL、10×T4DNA连接酶缓冲液1μL、消化PCR产物体系4μL、消化质粒YEplac181体系0.5μL，最后加入T4DNA连接酶0.25μL，将体系混匀并置于25℃1～2h，得到连接产物，将该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过双酶切验证，构建得到过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1；
第二步，对乙醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HGDAL-175的构建：
将上述第一步中构建的过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1转化入酿酒酵母出发菌株W303-1A，在缺亮氨酸的CM固体培养基上培养2～3天后，筛选带有该质粒的转化子，构建得到对乙醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HGDAL-175。
大量实验证明：经上述方法一定能构建出对乙醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株HGDAL-175。
上述一种构建对乙醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，所述过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1转化入酿酒酵母出发菌株W303-1A操作方法是：
(1)将平板上的酿酒酵母出发菌株W303-1A接入5mLYPD液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养过夜；
(2)将担体ss-DNA(2mg/mL)于沸水浴煮5分钟后，迅速置于冰上2分钟；
(3)取上述(1)得到的酿酒酵母培养液1.5mL置于离心管中，13000rpm离心30s，收集菌体，弃上清；
(4)往上述(3)的离心管中加入360μL的转化混合物，在漩涡分离器上高速振荡混匀，转化混合物的配置如下：
(5)将上述(4)得到的转化体系混匀后于42℃水浴30分钟；
(6)将上述(5)处理后的转化体系用离心机转速为13000rpm离心30s，收集菌体，弃上清；
(7)用100μL无菌水重悬上述(6)得到的菌体，涂布在缺亮氨酸的CM筛选平板上，30℃温度下培养2～3天，完成质粒YEplac181-SOL1转化入酿酒酵母出发菌株W303-1A。
一种过表达SOL1基因的应用，用于提高酵母细胞的生长和对乙醇的耐受性。
上述一种构建对乙醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，所用的原料物均是公知的并能从商购获得，其中：
大肠杆菌E.coli Top10′购自北京天根生化科技有限公司。
宿主菌酿酒酵母菌为W303-1A(MATa leu2-3,112ura3-1 trp1-92 his3-11,15ade2-1can1-100(Thomas andRothstein,1989))。
质粒YEplac181购自北京天根生化科技有限公司。
SOL1基因片段由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。
担体ss-DNA购自Sigma-Aldrich公司。
PEG4000为50％(w/v)、10×TE(pH7.5)10％和10×LiAc贮存液10％。
LB(Luria-Bertani)液体培养基：1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl，用NaOH调pH＝7.5，于121℃下蒸汽灭菌20min，冷却至室温加入氨苄青霉素，至终浓度为1g氨苄青霉素/L，得到LB液体培养基。
LB固体培养基：在调好pH值为7.5的LB液体培养基中加入1.5％的琼脂粉，于121℃下蒸汽灭菌20min，冷却至室温加入氨苄青霉素，至终浓度为1g氨苄青霉素/L，得到LB固体培养基。
YPD液体培养基：1％酵母提取物和2％蛋白胨，在pH自然条件下，121℃蒸汽灭菌20min，再加入单独灭菌的40％葡萄糖至终浓度为2％。
YPD固体培养基：在YPD液体培养基中加入1.5％(w/v)琼脂粉，于121℃下蒸汽灭菌20min。
完全极限培养基(CM)：0.67％YNB(Bacto Yeast Nitrogen Base without AminoAcids(Difco))和0.83g/LDropout Power，其中DropoutPower由以下成分构成：腺嘌呤50mg/L、亮氨酸100m/L、精氨酸20mg/L、赖氨酸30mg/L、天冬氨100mg/L、甲硫氨酸20mg/L、谷氨酸100mg/L、苯丙氨酸50mg/L、组氨酸100mg/L、丝氨酸150mg/L、异亮氨酸30mg/L、苏氨酸150mg/L、色氨酸100mg/L、酪氨酸30mg/L、尿嘧啶50mg/L、缬氨酸150mg/L。
省却上述特定的氨基酸成分，则做成选择性培养基，液体培养基调节pH为5.6，固体培养基调节pH为6.5，再加入1.5％的琼脂，于121℃蒸汽灭菌25min。
上述涉及的％，除特别注明之外，均为质量百分比。
上述一种构建对乙醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，其中根据酿酒酵母W303-1A染色体上SOL1基因序列设计扩增引物，合成基因SOL1片段是由基因合成公司完成的。
上述一种构建对乙醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，所用的操作工艺是本领域技术人员所掌握的。
本发明的有益效果如下：
与现有技术相比，本发明具有如下突出的实质性特点是，本发明是运用分子生物学和基因重组技术改造酿酒酵母细胞，宿主菌为酿酒酵母菌，同时转入过表达基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1，运用基因重组DNA技术改造酿酒酵母细胞，操作简单，节省成本，构建了对乙醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株。
与现有技术相比，本发明的显著进步是：运用本发明方法所构建的酿酒酵母菌株解决了目前制约乙醇产量进一步提高的菌株对乙醇耐受性低的关键技术问题，为利用生物法合成乙醇提供优良的菌株，而且本发明的创新点为首次发现过表达SOL1基因可以提高酵母细胞的生长和对乙醇的耐受性，设计引物对SOL1-U和SOL1-D并合成SOL1基因片段，用构建的重组载体YEplac181-SOL1过表达合成的SOL1基因片段可提高酵母细胞乙醇耐受性，使用的基因为SOL1，其编码的蛋白Sol1在结构上类似于被称为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的蛋白质，其主要功能为控制tRNA由细胞核输出到胞浆。具体为：本发明方法制得的“酿酒酵母菌株HGDAL-175”与对照菌株相比乙醇耐受性大幅提高：在含有8％乙醇压力条件的缺亮氨酸的CM液体培养基中发酵培养48小时，其细胞量与对照菌株相比提高了约30％(详见对图1的说明)。这些数据说明，本发明方法制得的“酿酒酵母菌株HGDAL-175”比出发菌株对乙醇的耐受性好，说明该菌株对酿酒酵母乙醇发酵产量的提高具有较好效果，为促进乙醇发酵工业的发展奠定基础。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为8％乙醇压力条件下菌株发酵生长情况。
图2为质粒YEplac181-SOL1的限制性内切酶图谱。
图3为基因SOL1的DNA序列，图中划线部分是开放阅读框，也就是基因的编码区。
具体实施方式
图1所示实施例表明，由时间-OD600曲线显示，在含有8％乙醇的缺亮氨酸的CM液体培养基中培养48小时，本发明方法制得的菌株HGDAL-175即W303-1A-YEplac181-SOL1的最终细胞量是对照菌株即W303-1A-YEplac181的1.29倍，该方法得到的菌株乙醇耐受性比出发菌株提高了将约30％。
图2所示实施例表明，质粒YEplac181-SOL1是在质粒YEplac181上插入SOL1的DNA序列，SOL1基因序列两端的限制性内切酶酶切位点是SacⅠ和PstⅠ。
实施例1
运用分子生物学和基因重组技术改造酿酒酵母细胞，将过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1转化入宿主菌为酿酒酵母出发菌株W303-1A(MATa leu2-3,112ura3-1trp1-92 his3-11,15ade2-1 can1-100(Thomas andRothstein,1989))，具体步骤如下：
第一步，过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1的构建：
(1.1)基因SOL1片段的合成：
根据酿酒酵母W303-1A染色体上SOL1基因序列设计引物对SOL1-U和SOL1-D(SOL1-U:5′–GGGCCCGAGCTCGATTGACCTCTGCCAGTAAG–3′；SOL1-D：5′–GGGCCCCTGCAGAATGAATGAATCAGCGACAT–3′)。以W303-1A染色体DNA为模板，用引物对SOL1-U和SOL1-D进行PCR扩增，合成SOL1基因片段，其序列见图3；
(1.2)过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1的构建：
将质粒YEplac181和上述(1.1)步得到的基因SOL1片段分别用限制性内切酶SacⅠ和PstⅠ消化。消化质粒YEplac181体系为：无菌水15μL、酶切缓冲液2μL、YEplac181 2μL、SacⅠ、PstⅠ各1μL；消化PCR产物SOL1基因片段体系为：无菌水2.75μL、酶切缓冲液1.5μL、PCR产物10μL、SacⅠ、PstⅠ各0.375μL，上述体系分别在37℃条件下消化30min，之后用T4DNA连接酶将质粒YEplac181和SOL1基因片段连接，连接操作如下：在1.5mL离心管中，加入无菌水4.25μL、10×T4DNA连接酶缓冲液1μL、消化PCR产物体系4μL、消化质粒YEplac181体系0.5μL，最后加入T4DNA连接酶0.25μL，将体系混匀并置于25℃1～2h，得到连接产物，将该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过双酶切验证，构建得到过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1；
第二步，对乙醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HGDAL-175的构建：
将上述第一步中构建的过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1转化入酿酒酵母出发菌株W303-1A，在缺亮氨酸的CM固体培养基上培养2～3天后，筛选带有该质粒的转化子，构建得到对乙醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HGDAL-175。
所述过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1转化入酿酒酵母出发菌株W303-1A的操作方法是：
(1)将平板上的酿酒酵母出发菌株W303-1A接入5mLYPD液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养过夜；
(2)将担体ss-DNA(2mg/mL)于沸水浴煮5分钟后，迅速置于冰上2分钟，用后-20℃保存；
(3)取上述(1)得到的酿酒酵母培养液1.5mL置于离心管中，13000rpm离心30s，收集菌体，弃上清；
(4)往上述(3)的离心管中加入360μL的转化混合物，在漩涡分离器上高速振荡混匀，转化混合物的配置如下：
(5)将上述(4)得到的转化体系混匀后于42℃水浴30分钟；
(6)将上述(5)处理后的转化体系用离心机转速为13000rpm离心30s，收集菌体，弃上清；(7)用100μL无菌水重悬上述(6)得到的菌体，涂布在缺亮氨酸的CM筛选平板上，30℃温度下培养2～3天，完成质粒YEplac181-SOL1转化入酿酒酵母出发菌株W303-1A。
本实施例用于酵母使用载体引入DNA重组技术过表达SOL1基因，对现有的出发菌株进行改造，能获得大量的抗高浓度乙醇的酵母菌株，实现酿酒酵母发酵乙醇的高产，有助于提高企业产能，减少石油等化石燃料的燃烧对我国环境造成的污染。
实施例2
构建得到过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1；使用前将制得的对乙醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HGDAL-175以及对照菌株W303-1A-YEplac181接到缺亮氨酸的CM平板上进行活化处理，在含有8％乙醇压力条件的缺亮氨酸的CM液体培养基中培养，接种量为12％，葡萄糖初始浓度为2％，培养温度为30℃，pH为5.5，培养48h，初始OD600为0.5～1，前12h每2h取样一次，之后每6h取样一次，测定其细胞量。
通过对本实施例制得的酿酒酵母菌株HGDAL-175在含有8％乙醇的培养基中培养发现，本实施例所制得的酿酒酵母菌株HGDAL-175即W303-1A-YEplac181-SOL1在高浓度乙醇条件下较对照菌株W303-1A-YEplac181有大幅提升；在含有8％乙醇的缺亮氨酸的CM液体培养基中培养，本发明制得的菌株与对照菌株均在18h后细胞量基本趋于稳定，由图1中可知，酿酒酵母菌株HGDAL-175即W303-1A-YEplac181-SOL1在18h后高浓度(8％)乙醇条件下细胞量略有上升，而对照菌株即W303-1A-YEplac181的细胞量逐渐平稳、略有下降，但该时间段内其细胞量明显低于本发明所制得的酿酒酵母菌株HGDAL-175。这些数据表明，酿酒酵母菌株HGDAL-175的耐受性较对照菌株W303-1A-YEplac181有大幅度提高，该菌株对乙醇的高耐受性也使其能够在发酵过程中产生更多的乙醇。
除宿主菌为酿酒酵母出发菌株W303-1A选用为工业酿酒酵母菌株之外，其他同实施例1。
上述实施例中所用的原料物均是公知的并均从商购获得，所用的操作工艺是本领域的技术人员所掌握的。
本发明未尽事宜为公知技术。
Claims (6)
1.一种构建对乙醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，将过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1转化入宿主菌酿酒酵母出发菌株W303-1A，在缺亮氨酸的CM固体培养基上培养2～3天后，筛选带有YEplac181-SOL1质粒的转化子，构建得到对乙醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HGDAL-175。
2.根据权利要求1所述的构建对乙醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤是：
第一步，过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1的构建：
(1.1)基因SOL1片段的合成：
根据酿酒酵母W303-1A染色体上SOL1基因序列设计引物对SOL1-U和SOL1-D，SOL1-U:5′–GGGCCCGAGCTCGATTGACCTCTGCCAGTAAG–3′；SOL1-D：5′–GGGCCCCTGCAGAATGAATGAATCAGCGACAT–3′；以W303-1A染色体DNA为模板，用引物对SOL1-U和SOL1-D进行PCR扩增，合成基因SOL1片段；
(1.2)过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1的构建：
将质粒YEplac181和上述(1.1)步得到的基因SOL1片段分别用限制性内切酶SacⅠ和PstⅠ消化；消化质粒YEplac181的体系为：无菌水15μL、酶切缓冲液2μL、YEplac181 2μL、SacⅠ、PstⅠ各1μL；消化PCR产物SOL1基因片段的体系为：无菌水2.75μL、酶切缓冲液1.5μL、PCR产物10μL、SacⅠ、PstⅠ各0.375μL，上述体系分别在37℃条件下消化30min，之后用T4DNA连接酶将质粒YEplac181和基因SOL1片段连接，连接操作是：在1.5mL离心管中，加入无菌水4.25μL、10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL、消化PCR产物体系4μL、消化质粒YEplac181体系0.5μL，最后加入T4DNA连接酶0.25μL，将体系混匀并置于25℃1～2h，得到连接产物，将该连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养，然后提取质粒，通过双酶切验证，构建得到过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1；
第二步，对乙醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HGDAL-175的构建：
将上述第一步中构建的过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1转化入酿酒酵母出发菌株W303-1A，在缺亮氨酸的CM固体培养基上培养2～3天后，筛选带有该质粒的转化子，构建得到对乙醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HGDAL-175。
3.根据权利要求1所述的构建对乙醇具有高耐受性的酿酒酵母菌株的方法，所述过表达酿酒酵母基因SOL1的质粒YEplac181-SOL1转化入酿酒酵母出发菌株W303-1A的操作方法是：
(1)将平板上的酿酒酵母出发菌株W303-1A接入5mLYPD液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养过夜；
(2)将担体ss-DNA(2mg/mL)于沸水浴煮5分钟后，迅速置于冰上2分钟；
(3)取上述(1)得到的酿酒酵母培养液1.5mL置于离心管中，13000rpm离心30s，收集菌体，弃上清；
(4)往上述(3)的离心管中加入360μL的转化混合物，在漩涡分离器上高速振荡混匀，转化混合物的配置是：
(5)将上述(4)得到的转化体系混匀后于42℃水浴30分钟；
(6)将上述(5)处理后的转化体系用离心机转速为13000rpm离心30s，收集菌体，弃上清；
(7)用100μL无菌水重悬上述(6)得到的菌体，涂布在缺亮氨酸的CM筛选平板上，30℃温度下培养2～3天，完成质粒YEplac181-SOL1转化入酿酒酵母出发菌株W303-1A。
4.一种对乙醇有高耐受性的酿酒酵母菌株，其特征在于，采用权利要求1-3任一所述方法获得。
5.根据权利要求4所述的对乙醇有高耐受性的酿酒酵母菌株，其特征在于，使用前将所述对乙醇有高耐受性的酿酒酵母菌株HGDAL-175以及对照菌株W303-1A-YEplac181接到缺亮氨酸的CM平板上进行活化处理，在含有8％乙醇压力条件的缺亮氨酸的CM液体培养基中培养，接种量为12％，葡萄糖初始浓度为2％，培养温度为30℃，pH为5.5，培养48h，初始OD600为0.5～1，前12h每2h取样一次，之后每6h取样一次，测定其细胞量；
所述酿酒酵母菌株HGDAL-175在含有8％高浓度乙醇条件下较对照菌株W303-1A-YEplac181的细胞量有大幅提升，其细胞量与对照菌株相比提高了1.29倍。
6.一种过表达SOL1基因的应用，其特征在于，用于提高酵母细胞的生长和对乙醇的耐受性。
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| CN1158357A (zh) * | 1995-10-04 | 1997-09-03 | 宝酒造株式会社 | 调控金黄担子素敏感性的基因 |
| US20070092895A1 (en) * | 2005-07-26 | 2007-04-26 | Rekha Puria | Methods for identifying genes that increase yeast stress tolerance, and use of these genes for yeast strain improvement |
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