CN106957853A - 一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法 - Google Patents

一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于发酵技术领域，公开了一种提高酵母细胞对复合抑制剂的方法以及获得酵母菌株。本发明所述提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法通过基因工程技术构建包含PRO1D154N,G220C突变体的重组质粒，转化酵母细胞，通过酵母菌株中的PRO1基因上第154位(D154N)和第220位(G220C)的同时突变，实现对酵母细胞耐受纤维素水解抑制物能力的调控，提高酵母细胞对复合抑制剂耐受性。本发明所述酵母菌株包含重组质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t，尤其是酵母菌株SyBE_Sc0150012。实验结果表明本发明所述酵母菌株对复合抑制剂耐受性能显著增强。

Description

一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及获得酵母菌株，尤其是利用脯氨酸合成途径中的关键基因PRO1提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及获得酵母菌株。
背景技术
人类社会对化石能源的依赖延伸到生活的方方面面。然而，由于化石燃料的不可再生性，石油逐渐成为困扰世界各国经济和社会发展的重大问题。为了应对日益严重的能源危机，以木质纤维素如农作物秸秆、城市固体垃圾等为原料，通过微生物发酵生产新的可替代能源-燃料乙醇成为各国研究者关注的热点。然而木质纤维素原料预处理过程中的高温高压条件会导致一系列对微生物细胞有毒的物质产生，主要包括呋喃类、弱酸类和酚类等，其中糠醛、乙酸和苯酚是三类抑制剂的典型代表。
酿酒酵母作为生产乙醇的传统菌株，广泛应用于工业生产中。天然的酿酒酵母对预处理过程中产生的大量抑制剂具有较低的耐受能力，影响后续的发酵效率和乙醇得率。而传统的脱毒步骤增加操作成本，降低纤维素乙醇的价格竞争优势。因此提高酵母菌株对抑制剂耐受性，尤其是对三种代表复合抑制剂的耐受能力，对推进纤维素乙醇的工业化生产具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及获得酵母菌株。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法，构建含有表达PRO1D154N,G220C突变体的重组质粒，转化酵母细胞。。
在一些实施方案中，所述重组质粒为pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t。
其中，所述PRO1D154N,G220C具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
本发明提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法中所述转化酵母细胞为酿酒酵母宿主菌。
在一些实施方案中，酿酒酵母宿主菌为酿酒酵母宿主菌BY4742。
本发明还提供了耐受复合抑制剂的酵母菌株，包含重组质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t的酵母菌株。
在一些实施方案中，所述酵母菌株为酿酒酵母宿主菌BY4742。
优选的，所述PRO1D154N,G220C具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
实验表明，本发明所述酵母菌株能明显增强对复合抑制剂的耐受性。因此，本发明还提供所述酵母菌株在复合抑制剂存在下发酵生产纤维素乙醇中的应用。
本发明还提供一种在复合抑制剂存在下发酵生产纤维素乙醇的方法，将本发明所述酵母菌株接种纤维素水解液发酵。
由上述技术方案可知，本发明提供了提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及获得酵母菌株。本发明所述提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法通过基因工程技术构建包含PRO1D154N,G220C突变体的重组质粒，转化酵母细胞，通过酵母菌株中的PRO1基因上第154位(D154N)和第220位(G220C)的同时突变，实现对酵母细胞耐受纤维素水解抑制物能力的调控，提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受性。本发明所述酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t的酵母菌株，尤其是酵母菌株SyBE_Sc0150012。实验结果表明本发明所述酵母菌株对复合抑制剂耐受性能显著增强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1所述pRS416-HXT7p-PRO1-TEF1t质粒谱图；
图2示实施例1所述pRS416-HXT7p-PRO1D154N-TEF1t质粒谱图；
图3示实施例1所述pRS416-HXT7p-PRO1G220C-TEF1t质粒谱图；
图4示实施例1所述pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t质粒谱图；
图5示实施例1所述PRO1突变体PRO1D154N,G220C的表达对酿酒酵母在含有复合抑制剂的液体培养基中生长能力的影响图；
图6示实施例2所述PRO1突变体PRO1D154N,G220C的表达对酿酒酵母在含有复合抑制剂的固体培养基中生长能力的影响图，其中图中每一列分别表示加入不同种子密度的菌液点，从左到右菌液点的种子密度OD600依次为50、5、0.5、0.05、0.005。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为实现本发明的目的，本发明采用了如下技术方案。
一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法，构建含有表达PRO1D154N,G220C突变体的重组质粒，转化酵母细胞。
本发明通过基因工程技术构建包含表达PRO1D154N,G220C突变体的重组质粒，转化酵母细胞，通过酵母菌株中的PRO1基因上第154位(D154N)和第220位(G220C)的同时突变，实现对酵母细胞耐受纤维素水解抑制物能力的调控，提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受性。
在一些实施方案中，所述重组质粒为pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t。
其中，所述PRO1D154N,G220C具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
本领域技术人员可以按照公知的方法构建本发明所述重组质粒。
在一些实施方案中，本发明所述方法分别扩增启动子HXT7p和终止子TEF1t，酶切后依次将启动子HXT7p和终止子TEF1t连入质粒pRS416中得到质粒pRS416-HXT7p-TEF1t；然后扩增PRO1D154N,G220C，酶切后插入到质粒pRS416-HXT7p-TEF1t中启动子HXT7p和终止子TEF1t中间，得到质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t，质粒谱图如图1所示。
所述PRO1D154N,G220C中的突变位点为D154N、G220C。即PRO1氨基酸序列中154位D突变为N、220位G突变为C。所述PRO1D154N,G220C具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。
本发明提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法中所述转化酵母细胞为酿酒酵母宿主菌。
在一些实施方案中，酿酒酵母宿主菌为酿酒酵母宿主菌BY4742。
本发明也提供了耐受复合抑制剂的酵母菌株。
在一些实施方案中，所述酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t的酵母菌株。
优选的，所述酵母菌株为酿酒酵母宿主菌BY4742。
在一些具体实施例中，所述耐受复合抑制剂的酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t的酿酒酵母宿主菌BY4742，命名为SyBE_Sc0150012。
实验表明，本发明所述酵母菌株能明显增强对复合抑制剂的耐受性。因此，本发明还提供所述酵母菌株在复合抑制剂存在下发酵生产纤维素乙醇中的应用。
其中，所述复合抑制剂为糠醛、乙酸和苯酚。
本发明还提供一种在复合抑制剂存在下发酵生产纤维素乙醇的方法，将本发明所述酵母菌株接种纤维素水解液发酵。
其中，纤维素水解液发酵含有糠醛、乙酸和苯酚。
由上述技术方案可知，本发明提供了提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及获得酵母菌株。本发明所述提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法通过基因工程技术构建包含PRO1D154N,G220C突变体的重组质粒，转化酵母细胞，通过酵母菌株中的PRO1基因上第154位(D154N)和第220位(G220C)的同时突变，实现对酵母细胞耐受纤维素水解抑制物能力的调控，提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受性。本发明所述酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t的酵母菌株，尤其是酵母菌株SyBE_Sc0150012。实验结果表明本发明所述酵母菌株对复合抑制剂耐受性能显著增强。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：PRO1D154N,G220C的表达增强酿酒酵母在含有复合抑制剂的液体培养基中的生长能力
1、培养基的配制
SC-Ura液体培养基：葡萄糖20g/L，YNB 6.7g/L，氨基酸缺省混合物2g/L，20mg/L组氨酸，20mg/L亮氨酸，20mg/L色氨酸，115℃灭菌15min。
SC-Ura固体培养基：葡萄糖20g/L，YNB 6.7g/L，氨基酸缺省混合物2g/L，20mg/L组氨酸，20mg/L亮氨酸，20mg/L色氨酸，20g/L琼脂粉，115℃灭菌15min。
发酵培养基：SC-Ura液体培养基，在接种前加入纤维素水解液抑制剂糠醛、苯酚和乙酸，使得糠醛的含量为0.78g/L，乙酸的含量为3.18g/L，苯酚的含量为0.3g/L。
2、质粒构建与酵母转化
2.1、质粒构建
以酿酒酵母S288C的基因组为模版，以表1中的HXT7p_F为上游引物，HXT7p_R为下游引物，扩增启动子HXT7p；以下表中的TEF1t_F为上游引物，TEF1t_R为下游引物，扩增终止子TEF1t。使用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切启动子HXT7p片段，利用连接体系1将片段HXT7p连入质粒pRS416，形成质粒pRS416-HXT7p。使用限制性内切酶SalI和XhoI酶切终止子TEF1t片段和质粒pRS416-HXT7p，利用连接体系2将片段TEF1t同时连入质粒pRS416-HXT7p中，得到质粒pRS416-HXT7p-TEF1t。
以PRO1_F为上游引物，PRO1_R为下游引物，以酿酒酵母S288C的基因组为模版，采用PCR体系1扩增PRO1片段。之后使用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切片段PRO1和质粒pRS416-HXT7p-TEF1t，利用连接体系3将基因PRO1插入到启动子HXT7p和终止子TEF1t中间，得到质粒pRS416-HXT7p-PRO1-TEF1t，质粒谱图如图1所示。
以PRO1_F为上游引物，P154_R为下游引物，以酿酒酵母S288C的基因组为模版，采用PCR体系1扩增PRO1D154N-1片段，以P154_F为上游引物，PRO1_R为下游引物，以酿酒酵母S288C的基因组为模版，采用PCR体系1扩增基因PRO1D154N-2片段，以PRO1_F为上游引物，PRO1_R为下游引物，以片段PRO1D154N-1和PRO1D154N-2为模版，采用PCR体系2进行重叠延伸PCR，得到片段PRO1D154N。之后使用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切片段PRO1D154N和质粒pRS416-HXT7p-TEF1t，利用连接体系4将基因PRO1D154N插入到启动子HXT7p和终止子TEF1t中间，得到质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N-TEF1t，质粒谱图如图2所示。
以PRO1_F为上游引物，P220_R为下游引物，以酿酒酵母S288C的基因组为模版，采用PCR体系1扩增PRO1G220C-1片段，以P220_F为上游引物，PRO1_R为下游引物，以酿酒酵母S288C的基因组为模版，采用PCR体系1扩增基因PRO1G220C-2片段，以PRO1_F为上游引物，PRO1_R为下游引物，以片段PRO1G220C-1和PRO1G220C-2为模版，采用PCR体系2进行重叠延伸PCR，得到片段PRO1G220C。之后使用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切片段PRO1G220C和质粒pRS416-HXT7p-TEF1t，利用连接体系5将基因PRO1G220C插入到启动子HXT7p和终止子TEF1t中间，得到质粒pRS416-HXT7p-PRO1G220C-TEF1t，质粒谱图如图3所示。
以PRO1_F为上游引物，P220_R为下游引物，以质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N-TEF1t为模版，采用PCR体系1扩增PRO1D154N,G220C-1片段，以P220_F为上游引物，PRO1_R为下游引物，以pRS416-HXT7p-PRO1D154N-TEF1t为模版，采用PCR体系1扩增基因PRO1D154N,G220C-2片段，以PRO1_F为上游引物，PRO1_R为下游引物，以片段PRO1D154N,G220C-1和PRO1D154N,G220C-2为模版，采用PCR体系2进行重叠延伸PCR，得到片段PRO1D154N,G220C。之后使用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切片段PRO1D154N,G220C和质粒pRS416-HXT7p-TEF1t，利用连接体系6将基因PRO1D154N,G220C插入到启动子HXT7p和终止子TEF1t中间，得到质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t，质粒谱图如图4所示。
表1 引物序列
Primer ID Sequence(5’-3’)
HXT7p_F CCCCCCGGGAGAAGGTTTTGGGACGCTC
HXT7p_R CGGAATTCTTTTTGATTAAAATTAAAAAAACTTTTTG
TEF1P_F CGCGGATCCAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTC
TEF1p_R CGGAATTCTTTGTAATTAAAACTTAGATTAGATTGCTAT
TEF1t_F ACGCGTCGACAAATAAGGAGATTGATAAGACTTTTC
TEF1t_R CCCTCGAGGGCTAACTCTCAACAGACAACAAC
PRO1_F CGGAATTCATGAAGGATGCTAATGAGAGTAAAT
PRO1_R ACGCGTCGACTCAACGAGGTGGGAATGCC
P154_F TGGTAACAATGACACTTTATCAGCAAT
P154_R ATTGCTGATAAAGTGTCATTGTTACCA
P220_F CGTTGGGACCTGTGGTATGG
P220_R CCATACCACAGGTCCCAACG
其中PCR扩增体系1为100μL：64.5μL ddH2O，20μL 5×Buffer，1μL DNA聚合酶，2.5μL 10mM dNTP，4μL DNA模板，4μL上游引物，4μL下游引物。PCR反应条件为：95℃5min进行1轮；95℃30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，进行30轮；72℃延伸10min进行1轮。
PCR扩增体系2为100μL：48.5μL ddH2O，20μL 5×Buffer，1μL DNA聚合酶，2.5μL 10mM dNTP，20μL DNA模版(片段1和片段2的摩尔比为1:1)，4μL上游引物，4μL下游引物。PCR反应条件为：95℃5min进行1轮；95℃30s，退火温度为65℃-51℃，每个循环降0.5℃，退火时间为30s，72℃延伸50s，进行28轮；95℃30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，进行8轮；72℃延伸10min进行1轮。柱回收PCR产物，50μL洗脱液溶解DNA样品。
酶切反应体系50μL：40μL DNA片段，5μL 10×Buffer，2.5μL酶1，2.5μL酶2；37℃酶切反应30min-50min，之后柱回收酶切产物，30μL洗脱液溶解DNA片段。
连接体系1为10μL：HXT7p片段7μL，载体1.5μL，10×Buffer 1μL，连接酶1μL。连接体系2为10μL：TEF1t片段7μL，载体1.5μL，10×Buffer 1μL，连接酶1μL。连接体系3为10μL：PRO1片段7μL，载体1.5μL，10×Buffer 1μL，连接酶1μL。连接体系4为10μL：PRO1D154N片段7μL，载体1.5μL，10×Buffer1μL，连接酶1μL。连接体系5为10μL：PRO1D220C片段7μL，载体1.5μL，10×Buffer 1μL，连接酶1μL。连接体系6为10μL：PRO1D154N,D220C片段7μL，载体1.5μL，10×Buffer 1μL，连接酶1μL。反应条件：22℃，30min。每次的连接产物都需转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，获得平板转化子，利用M13F与M13R这两个引物进行菌落PCR，筛选阳性转化子。
将阳性转化子接到LB-Amp液体培养基中，培养12小时，保存一份菌液，取少量样品送交公司进行DNA测序，将测序正确的质粒用于酵母转化。
2.2、酵母转化
将质粒pRS416、pRS416-HXT7p-PRO1-TEF1t、pRS416-HXT7p-PRO1D154N-TEF1t、pRS416-HXT7p-PRO1G220C-TEF1t和pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t转化酵母菌株BY4742，分别得到重组菌株SyBE_Sc0150011(BY4742/pRS416)、SyBE_Sc0150020(pRS416-HXT7p-PRO1-TEF1t)、SyBE_Sc0150019(BY4742/pRS416-HXT7p-PRO1D154N-TEF1t)、SyBE_Sc0150031(BY4742/pRS416-HXT7p-PRO1G220C-TEF1t)和SyBE_Sc0150012(BY4742/pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t)。
酵母转化采用传统的醋酸锂法：菌株BY4742在液体YPD培养基中30℃培养过夜，以初始OD600＝0.1接种于5mL液体YPD中培养5～7h，1.5mL离心管5000rpm收集细胞，水洗一遍，离心弃水，之后向细胞中加入1mL 0.1mol/L的LiAc离心弃废液，重复两遍，第二次尽量吸除LiAc，向残余细胞中分别加入40μL水、10μL质粒DNA、240μL PEG(50％m/V)、36mL 1.0mol/L LiAc、25μL ssDNA，剧烈震荡直至细胞完全混匀，30℃培养箱保温30min，42℃水浴中热激25min，4000rpm离心2min，弃上清，加入1mL无菌水，用小枪吹匀细胞，后4000rpm离心2min，弃上清，将细胞在无菌水中悬浮涂在SC-Ura平板上，30℃培养箱上培养。酵母转化子在SC-Ura培养基上筛选。
3、发酵
分别将菌株SyBE_Sc0150011、SyBE_Sc0150012、SyBE_Sc0150019、SyBE_Sc0150020和SyBE_Sc0150031在含有SC-Ura的固体培养基上活化，然后挑去单菌落接种于5mL的SC-Ura液体培养基中，在30℃、150rpm条件下培养12h。将一级种子接种于100mLSC-Ura液体培养基中，在30℃、150rpm条件下培养16h-20h。然后以OD600＝0.2的初始菌体浓度接种于100mL发酵培养基中，于30℃、150rpm条件下培养，测定培养过程中菌体的生长曲线，结果如图5所示。
图5显示，在含有复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚的培养条件下，对照菌株SyBE_Sc0150011经过长达100h的延滞期进入指数生长期，并在125h左右完成发酵。而质粒pRS416-HXT7p-PRO1-TEF1t、PRO1的154位氨基酸突变的质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N-TEF1t和PRO1的220位氨基酸突变的PRO1的pRS416-HXT7p-PRO1G220C-TEF1t的表达，使得菌株SyBE_Sc0150020、SyBE_Sc0150019和SyBE_Sc0150031在复合抑制剂条件下的液体培养基中生长能力有所增强，发酵时间缩短到100h左右。而PRO1154位和220位氨基酸的同时突变，使得表达质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t的菌株SyBE_Sc0150012在含有复合抑制剂的液体培养基中的生长能力显著增强，在33h左右就可进入生长稳定期。结果表明在酿酒酵母细胞中表达突变基因PRO1D154N,G220C，能够增强酵母菌株对复合抑制剂的耐受性，PRO1基因上第154位(D154N)和第220位(G220C)的同时突变，显著增加酵母细胞的复合抑制剂耐受性。
实施例2：PRO1D154N,G220C的表达增强酿酒酵母在含有复合抑制剂的固体培养基上的生长能力
1、培养基的配制
SC-Ura液体培养基：葡萄糖20g/L，YNB 6.7g/L，氨基酸缺省混合物2g/L，20mg/L组氨酸，20mg/L亮氨酸，20mg/L色氨酸，115℃灭菌15min。
SC-Ura固体培养基：葡萄糖20g/L，YNB 6.7g/L，氨基酸缺省混合物2g/L，20mg/L组氨酸，20mg/L亮氨酸，20mg/L色氨酸，20g/L琼脂粉，115℃灭菌15min。
生长培养基：SC-Ura固体培养基，加入纤维素水解液抑制剂糠醛、苯酚和乙酸，使得糠醛的含量为0.78g/L，乙酸的含量为3.18g/L，苯酚的含量为0.3g/L。
2、发酵
将实施例1所述菌株SyBE_Sc0150011、SyBE_Sc0150012、SyBE_Sc0150019、SyBE_Sc0150020和SyBE_Sc0150031在含有SC-Ura固体培养基上活化，然后挑取单菌落接种于5mL的SC-Ura液体培养基中，在30℃、150rpm条件下培养12h。将一级种子接种于100mL种子液体培养基中，在30℃、150rpm条件下培养16h-20h。然后将种子密度OD600浓缩到50，10倍倍比稀释至0.005，分别取5μL的菌液点到含有复合抑制剂的生长培养基上，30℃培养3天观察细胞生长，，结果如图6所示。
图6显示，在含有复合抑制的固体平板上，对照菌株SyBE_Sc0150011、SyBE_Sc0150020、SyBE_Sc0150019和SyBE_Sc0150031的第一个菌斑基本没有生长，而表达质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t的菌株SyBE_Sc0150012在含有复合抑制剂的固体培养基上表现出明显的生长优势。结果表明在酿酒酵母细胞中表达突变基因PRO1D154N,G220C，能够增强酵母菌株对复合抑制剂的耐受性，PRO1基因上第154位(D154N)和第220位(G220C)的同时突变，显著增加酵母细胞的复合抑制剂耐受性。

Claims (9)

1.一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法，其特征在于，构建含有表达PRO1D154N,G220C突变体的重组质粒，转化酵母细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组质粒为pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PRO1D154N,G220C具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述酵母细胞为酿酒酵母宿主菌BY4742。
5.一种酵母菌株，其特征在于，包含重组质粒pRS416-HXT7p-PRO1D154N,G220C-TEF1t的酵母菌株。
6.根据权利要求5所述酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株为酿酒酵母宿主菌BY4742。
7.根据权利要求5或6所述酵母菌株，其特征在于，所述PRO1D154N,G220C具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
8.权利要求5-7任意一项所述酵母菌株在复合抑制剂存在下发酵生产纤维素乙醇中的应用。
9.一种在复合抑制剂存在下发酵生产纤维素乙醇的方法，其特征在于，权利要求5-7任意一项所述酵母菌株接种纤维素水解液发酵。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113528364A (zh) * 2021-06-28 2021-10-22 天津大学 一种基因在调控菌株对抑制剂耐受性中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102296034A (zh) * 2011-08-18 2011-12-28 天津大学 一种获得耐受多种抑制剂酵母菌株的方法
CN104031854A (zh) * 2014-06-20 2014-09-10 广西科学院 一株提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株及其构建方法
CN105154348A (zh) * 2015-08-05 2015-12-16 大连理工大学 一种提高酿酒酵母对纤维素水解液抑制物耐受性的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102296034A (zh) * 2011-08-18 2011-12-28 天津大学 一种获得耐受多种抑制剂酵母菌株的方法
CN104031854A (zh) * 2014-06-20 2014-09-10 广西科学院 一株提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株及其构建方法
CN105154348A (zh) * 2015-08-05 2015-12-16 大连理工大学 一种提高酿酒酵母对纤维素水解液抑制物耐受性的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WANG J ET AL: "global regulator engineering siginificantly improved escherichia coli tolerances toward inhibitors of lignocellulosic hydrolysates", 《BIOTECHNOLOGY BIOENGINEERING》 *
XIN WANG等: "Increasing proline and myo-inositol improves tolerance of Saccharomyces cerevisiae to the mixture of multiple lignocellulose-derived inhibitors", 《BIOTECHNOLOGY FOR BIOFUELS》 *
丁明珠: "酵母对纤维素水解液中复合抑制剂耐受的系统分析与解耦", 《中国博士学位论文全文数据库》 *
郝学才等: "酿酒酵母在纤维素乙醇生产中对毒性化合物的耐受机理研究进展", 《微生物学通报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113528364A (zh) * 2021-06-28 2021-10-22 天津大学 一种基因在调控菌株对抑制剂耐受性中的应用

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