CN106929425A - 一种耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶、其制备方法和应用 - Google Patents

一种耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶、其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程和生物质能源技术领域，涉及一种耐高温的酸性嗜热子囊菌纤维素酶、其制备方法和应用。具体地，一种耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶，其由保藏号为CGMCC No.11334的菌株制得。具体地，本发明以嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)深层发酵醪为原料，经离心取上清液、硫酸铵沉淀、透析、阴离子交换柱和分子筛柱层析等步骤分离纯化获得。该纤维素酶分子量范围为35～80kDa，最适温度为60～70℃，最适pH值为4.0～6.0，Mn2+等对酶有一定的促进作用；高温60℃处理1h酶活较未处理时变化不大，热稳定性较好。本发明中的耐高温酸性纤维素酶在生物质能源、木质纤维素综合利用、洗衣涤剂行业、食品行业、纺织行业和饲料加工等领域具有广阔的应用前景。

Description

一种耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶、其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程和生物质能源技术领域，涉及一种耐高温的酸性嗜热子囊菌纤维素酶、其制备方法和应用。具体地，涉及该纤维素酶的发酵过程、分离纯化工艺以及酶解纤维素为葡萄糖的应用。
背景技术
木质纤维素资源的生物转化需要四类生化反应：生成纤维降解酶类、纤维素和半纤维素的酶水解、葡萄糖等六碳糖的酒精发酵、木糖等五碳糖的酒精发酵。在目前研究的纤维素酒精工艺中，这些反应通常要由不同的微生物在不同的条件下来完成，例如由木霉菌生产纤维素酶、由酒精酵母发酵葡萄糖、由毕赤酵母或专门构建的代谢工程菌来发酵木糖等。但目前木质纤维素制备燃料酒精技术的生产成本还比较高，其主要原因有：(1)纤维素酶生产技术不成熟，同步糖化发酵(SSF)技术的工艺尚不成熟；而高活力的纤维素酶，基因重组工程菌株一直被丹麦诺维信等少数企业所垄断，我国迄今为止尚无使用基因重组工程菌株进行产业化生产的企业。(2)半纤维素的主要降解产物木糖，不能被酿酒酵母直接利用。尽管国内外都开始了木糖代谢途径的酿酒酵母的构建，但是重组酵母中存在木酮糖激酶活力低，乙醇的产率不高等问题。(3)高底物浓度发酵技术尚未应用在纤维素酒精的生产中，山东一些小木质纤维素酒精厂(玉米芯为原料)乙醇含量只有2％，废水排放十分严重，分离成本高。
要实现纤维素物质到再生能源的转化，找到适合于工业生产的高比活力的纤维素酶系是关键步骤之一。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，包括内切葡聚糖酶(EC3. 2. 1. 4)、外切葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 91)和β-葡萄糖苷酶(EC3. 2. 1. 21)。滤纸酶(FPA)可表征纤维素酶系总的糖化能力。
目前纤维素酶广泛用于食品、医药、化工、能源等领域。纤维素作为一种有巨大潜力的可再生资源，利用微生物纤维素酶降解纤维素可以实现纤维素的转化利用。为了提高纤维素降解效率，耐极端条件的纤维素酶受到广泛关注，比如专利(公布号CN102911952 A)公布了一种能在pH6-10、50℃条件下保持较高相对活性的纤维素酶。
目前尚需要开发新的在高温以及酸性条件下具有良好活性的纤维素酶。
发明内容
本发明经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种具有耐高温的酸性嗜热子囊菌纤维素酶(下文中亦简称为纤维素酶)。该纤维素酶由嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)经过深层发酵、硫酸铵沉淀、透析、阴离子交换柱和分子筛柱层析等步骤制备。本发明人惊奇地发现，该纤维素酶具有良好的热稳定性，催化温度为60～70℃，并且在酸性条件下相对酶活较高，能够高效地降解纤维素为葡萄糖，可应用于木质纤维素综合利用、洗衣涤剂行业、食品行业、纺织行业和饲料加工等领域。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种制备发酵醪的方法，包括将保藏号为CGMCC No.11334的菌株进行活化和发酵培养的步骤；
优选地，包括下述步骤：
1)将所述菌株接入种子培养基中，于39～45℃培养12－64小时进行活化；优选地，培养24－48小时进行活化；
2)以体积分数为3％～10％的接种量接种至发酵培养基，于39～45℃发酵培养2－8天得到发酵醪；优选地，发酵培养6－7天。
优选地，上述步骤1)中的活化或步骤2)中的发酵培养在150～350rpm的恒温振荡器中进行。
在本发明的一个实施方案中，所述的制备发酵醪的方法，其中：
所述种子培养基包括：玉米淀粉15g/L、蛋白胨4g/L、K2HPO4 1g/L、Na2HPO4 1g/L、MgSO4 0.5g/L；
和/或
所述发酵培养基包括：麸皮3～30g/L，微晶纤维素5～50g/L，蛋白胨0.5～5g/L，KH2PO40.3～3g/L，CaCl2 0.1～0.5g/L、MgSO4 0.1～0.8g/L，吐温-80 0.1～1％(v:v)，；
优选地，所述发酵培养基包括：麸皮5g/L，微晶纤维素10g/L，蛋白胨2g/L，KH2PO42g/L，CaCl2 0.3g/L、MgSO4 0.3g/L，吐温-800.1％(v:v)；
优选地，所述种子培养基或者发酵培养基还含有1mL/L的微量元素液；所述微量元素液包含FeSO4·7H2O 5g/L、MnSO4·H2O 1.6g/L、ZnSO4·7H2O 1.4g/L、CoCl2·6H2O 3.7g/L。
本发明的另一方面涉及一种制备耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶的方法，包括将保藏号为CGMCC No.11334的菌株的发酵醪的上清或者发酵液的上清进行分离纯化的步骤；
优选地，包括下述步骤：
将保藏号为CGMCC No.11334的菌株的发酵醪或者发酵液离心取上清、浓缩、硫酸铵沉淀、透析、阴离子交换柱层析、分子筛柱层析；
更优选地，包括下述步骤：
(1)取保藏号为CGMCC No.11334的菌株的发酵醪或者发酵液，经5000～12000rpm离心，收集上清液，低温浓缩后，加入硫酸铵至饱和度为60～90％，静置12～48h，高速离心取沉淀；
(2)取上述(1)中的沉淀，加水复溶，将复溶液置入8000～14000Da的透析袋中，去离子水透析；
(3)收集上述(2)中的透析液，低温浓缩后，进行阴离子交换柱层析，依次用PBS和0.1mol/L，0.3mol/L，0.5mol/L NaCl(pH5.3)进行阶段性洗脱；OD280nm在线检测，收集的各洗脱部分；
(4)收集上述(3)中的PBS洗脱组分，进行分子筛柱层析，取纤维素酶活最高洗脱组分，低温浓缩后，经真空冷冻干燥，即得耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶；
优选地，上述各发酵醪独立地由本发明所述的制备发酵醪的方法制得。
本发明的再一方面涉及一种耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶，其由保藏号为CGMCC No.11334的菌株制得；优选地，其由上述制备耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶的方法制得。
实施例4－5的实验结果表明，本发明的纤维素酶分子量范围为35～80kDa，最适催化温度为60～70℃，最适pH值为4.0～6.0，Mn2+等对酶有一定的促进作用；高温60℃处理1h酶活较未处理时变化不大，热稳定性较好。
本发明的再一方面涉及一种制备葡萄糖的方法，包括使用本发明的耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶对秸秆进行降解的步骤。
在本发明的一个实施方案中，所述的制备葡萄糖的方法，其中，所述秸秆选自小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆中的任意一种、两种或者三种。
在本发明的一个实施方案中，所述的制备葡萄糖的方法，其中，相对于每g秸秆，所述耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶的用量为≥50U。
在本发明的一些实施方式中，所述的制备葡萄糖的方法，其特征在于如下的(1)-(3)项中的任意一项、两项或者三项，
(1)降解的温度为60～70℃，优选70℃；
(2)pH为4～6，优选为5；
(3)加入Mn2+；优选地，Mn2+的终浓度为5mM/L。
在本发明的一些实施方式中，所述的制备葡萄糖的方法，其中，降解的时间为≥12小时，优选为≥24小时。
取玉米、小麦或水稻等秸秆，分别加入嗜热子囊菌纤维素酶酶液(用量为50U/g秸秆)酶解12h，HPLC法测定其葡萄糖含量，经计算，其酶解所得的葡萄糖对原料中葡萄糖的得率为50～90％。
本发明的再一方面涉及本发明的耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶在纤维素降解和/或葡萄糖制备中的用途。
发明的有益效果
本发明提供了一种全新结构的嗜热子囊菌纤维素酶，具有良好的催化秸秆水解成葡萄糖的活性，其酶解所得的葡萄糖对原料中葡萄糖的得率为50～90％。该酶有望可以应用到于木质纤维素综合利用、洗衣涤剂行业、食品行业、纺织行业和饲料加工等领域。该酶的制备方法是以嗜热子囊菌深层发酵醪为原料，从中分离纯化出具有耐热的酸性纤维素酶，制备工艺简单、易行，因此具有广阔的应用前景和潜在的经济效益。本发明的纤维素酶具有木聚糖酶活、滤纸酶活和CMC酶活(羧甲基纤维素钠酶活)。
附图说明
图1：嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)UJS1412在平板上的形态。图1A，45℃条件下培养3天；图1B，45℃条件下培养5天)。
图2：本发明嗜热子囊菌纤维素酶的DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析图。
图3：本发明嗜热子囊菌纤维素酶的SDS-PAGE图。
图4：反应温度对本发明嗜热子囊菌纤维素酶活的影响。
图5：反应pH对本发明嗜热子囊菌纤维素酶活的影响。
图6：金属离子对本发明嗜热子囊菌纤维素酶活的影响。
图7：本发明嗜热子囊菌纤维素酶的温度耐受性。
关于生物材料保藏的说明：
菌株UJS1412，其于2015年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.11334，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：菌株的分离与鉴定
1.菌株的分离和保藏
高温堆肥样品采自江苏省句容市郊，采样时间为2014年8月10日。将采集高温堆肥样品用无菌水振荡，取适量涂布秸秆分离筛选琼脂平板(1mol/L NaOH预处理的小麦秸秆10g/L，琼脂15g/L)。挑取透明水解圈较大的菌落至1mol/L NaOH预处理的小麦秸秆20g/L，蛋白胨5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl0.5g/L，自然pH，40℃200rpm摇瓶培养36h，测定发酵液中木聚糖酶及纤维素酶酶活，最后得到1株同时产纤维素酶和木聚糖酶的高产菌株，命名为UJS1412，斜面和冷冻干燥保藏。
该菌株UJS1412于2015年9月8日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.11334，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
2.菌株的鉴定
将菌株UJS1412接种于PDA培养基平板上，分别置于40℃，45℃和50℃下培养，观察菌丝呈乳白色发散状生长，菌丝之间呈稀疏网状(图1A，45℃条件下培养3天)；5天后渐转为棕黄色至深棕色，培养基背面观察呈浅黄色(图1B，45℃条件下培养5天)。
玻片培养，显微镜下对菌丝、分生孢子梗、分生孢子等形态特征进行观察，发现菌丝呈明显的子囊菌特征，为无色，光滑，具分枝和隔膜；子囊孢子卵圆形至椭圆形、壁光滑。
基于18s rDNA序列的分子鉴定：。
基因组DNA提取：采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海)有限公司)提取菌株UJS1412的基因组DNA，具体的提取步骤参见产品说明书。
PCR扩增采用真菌通用引物：
ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SEQ ID NO:1)，以及
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID NO:2)，扩增菌株整个ITS序列(内部转录间隔区，internal transcriber spacer)。
PCR反应体系如下：
试剂 体积(μl)
模板(基因组DNA 20-50ng/μl) 0.5
10×Buffer(with Mg2+) 2.5
dNTP(各2.5mM) 1
酶 0.2
F(10uM) 0.5
R(10uM) 0.5
加双蒸H2O至 25
PCR循环条件如下：
将PCR产物进行凝胶电泳：1％琼脂糖电泳，150V、100mA 20min电泳。切割目的DNA条带，纯化回收。
将PCR产物经胶回收纯化、过PCR柱纯化，与pGEM-T连接，具体步骤按Takara18-T Vector连接试剂盒操作。经过连接产物转化，蓝白斑筛选，提取阳性克隆提取质粒并纯化。用M13+/-引物扩增(体系如上)。M13+/-引物测序。测序工作由生工生物工程(上海)有限公司完成，所得的序列如SEQ ID NO:3序列所示。
ACCTGCGGAAGGATCATTAAAGAGTTGGGGTCCTTCGGGGCCCGATCTCCCACCCTTTGTTGTCGCGAATTTGTTGCCTCGGCGGGTTTGCCTTTATGGCAGACGGGCTCCGGCCCACCCGCCGCAGGACCATTCAAACTCTGCTTTAACAATGCAGTTTGAGAAGATTTAATAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCAATCAAGCTACGCTTGGTATTGGGCGCGCGGCTTTTCCTTGCGAAAGGCCCGCCCGAAATGCATCGGCGAGGAAACCGACCCCCGGCGTGTTAGATTTCTGAACGTCAGGAGCACCGGTGCCCTCCGCCGTACAATCTTTTTTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATAC(SEQ ID NO:3)
将菌株的18S rDNA序列测序结果用NCBI的BLAST 2.0进行同源分析，搜索Genbank核酸数据库，对比发现其与ThermoascusaurantiacusATCC 204492有95％左右的相似度。因此，将该菌株鉴定为嗜热子囊菌Thermoascus aurantiacus。
实施例2：嗜热子囊菌发酵醪的制备
将菌株UJS1412接入种子培养基(玉米淀粉15g/L、蛋白胨4g/L、K2HPO4 1g/L、Na2HPO4 1g/L、MgSO4 0.5g/L、1mL/L的微量元素液(含FeSO4·7H2O 5g/L、MnSO4·H2O 1.6g/L、ZnSO4·7H2O 1.4g/L、CoCl2·6H2O 3.7g/L)，pH自然)中40℃培养48h，收集种子液。
按5％(v/v)接种于发酵培养基(麸皮5g/L，微晶纤维素10g/L，蛋白胨2g/L，KH2PO42g/L，CaCl2 0.3g/L、MgSO4 0.3g/L，吐温-800.1％(v:v)，1mL/L的微量元素液(含FeSO4·7H2O 5g/L、MnSO4·H2O1.6g/L、ZnSO4·7H2O 1.4g/L、CoCl2·6H2O 3.7g/L)pH 6.5)中，42℃培养6天后，制备得到发酵醪。
实施例3：嗜热子囊菌纤维素酶的分离纯化
将实施例2所得发酵醪经6000rpm离心，收集上清液，低温浓缩后，加入硫酸铵至饱和度为80％，静置24h，高速离心取沉淀；将沉淀加少量水复溶，将复溶液置入8000～14000Da的透析袋中，去离子水透析；透析液经低温浓缩后，进行DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析，依次用PBS和0.1mol/L，0.3mol/L，0.5mol/L NaCl(pH5.3)进行阶段性洗脱；OD280nm在线检测，收集的各洗脱部分等组分；收集PBS洗脱组分，进行Sephadex G 75分子筛柱层析，如图2所示。取纤维素酶活最高洗脱组分，低温浓缩后，经真空冷冻干燥，即得本发明的耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶。用于下面的实施例4-7。
实施例4：耐高温的酸性嗜热子囊菌纤维素酶的结构表征
SDS-PAGE测定相对分子量：采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)判定纯化的耐高温酸性的嗜热子囊菌纤维素酶和纯度和相对分子量，其在电泳上为单一条带，分子量范围为35～80kDa。如图3所示。
MALDI-TOF-MS分析纯化酶的肽指纹图谱：将SDS-PAGE电泳得到的目的蛋白条带经0.1μg/μL胰蛋白酶4℃酶解30min，进行MALDI-TOF-MS(其中激光强度范围：20～30，质谱扫描范围750+，串联质谱碰撞诱导解离强度范围：120～150)分析。经MASCOT网站上将检测到的肽指纹图谱与NCBI冗余蛋白库进行搜寻鉴定，该酶含有的肽段序列为：RSGMGQGIVGYITGDAPLPRY(SEQ ID NO:4)。
实施例5：耐高温的酸性嗜热子囊菌纤维素酶的酶学性质
1.反应温度对纤维素酶活的影响
1.1将实施例3制得的纤维素酶用0.05mol/L，pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解并稀释适当倍数。
实验组：加入1.0mL pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，50mg滤纸条、0.5mL酶液。
空白管：加入1.5mL缓冲液。
酶对照组：1.0mL缓冲液、0.5mL酶液。
底物对照组：1.5mL缓冲液+滤纸条。
将各管反应温度分别调节为30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃反应60分钟后，立即加入3.0mL二硝基水杨酸(DNS)混合终止酶反应，沸水中水浴5min，然后移至冰水中冷却。取0.2mL反应物加2.5mL水稀释，然后在540nm处测吸光度，用空白组调零。通过葡萄糖标准曲线线性回归方程求出葡萄糖的含量，计算既得滤纸酶活。
1.2将待测酶液用0.05mol/L，pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释适当倍数。
实验组(加入1.0mL 1％(w/v)CMC溶液、0.5mL酶液)，再取3支试管分别为空白管(加入1.5mL缓冲液)、酶对照组(1.0mL缓冲液、0.5mL酶液)、底物对照组(0.5mL缓冲液、1％(w/v)CMC溶液)。
将反应温度分别调节为30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃反应30分钟后后，加入3.0mLDNS混匀，沸水浴5min，然后移至冰水中冷却。取0.2mL混合物加2.5mL水稀释，然后在540nm处测吸光度，用空白管调零。通过葡萄糖标准曲线线性回归方程求出葡萄糖的含量，计算CMC酶活。
滤纸酶活/CMC酶活计算公式：
X—纤维素酶(U/mL)；W—葡萄糖生成量(mg)；V—反应液中酶液加入量；5.56—1mg的葡萄糖的μmol数(1000/180＝5.56)；N—样品稀释倍数；T—反应时间(分钟)；
1.3将待测酶液用0.05mol/L，pH5.3的乙酸缓冲液稀释适当倍数。
实验组(加入1.0mL 1％(w/v)木聚糖溶液、1.0mL酶液)，再取3支试管分别为空白管(加入2.0mL缓冲液)、酶对照组(1.0mL缓冲液、1.0mL酶液)、底物对照组(1.0mL缓冲液、1.0mL 1％(w/v)木聚糖溶液)。
将反应温度分别调节为30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃反应30min，取出。迅速、准确地向三支试管中加入DNS试剂3.0mL，于空白管中准确加入稀释好的待测酶液1.0mL，将三支试管同时置于沸水浴中，准确计时，煮沸5min后取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL。以空白管在分光光度计540nm下较零，分别测量二支试管中样品的吸光度，取平均值，通过木糖标准曲线线性回归方程求出木糖的含量。
木聚糖酶活计算公式：
X—木聚糖酶(U/mL)；W—木糖生成量(mg)；V—反应液中酶液加入量；6.67—1mg的木聚糖的μmol数(1000/150＝6.67)；N—样品稀释倍数；T—反应时间(分钟)。
结果如图4所示。测定耐高温酸性的嗜热子囊菌纤维素酶的合适反应温度为60－70℃；综合考虑，特别是考虑滤纸酶活，最适反应温度为70℃左右。
2.反应pH对纤维素酶活的影响
将底物分别溶于pH2、3、4、5、6、7、8、9、10的缓冲液中，配成所需浓度的溶液。
分别参照上述1.中的操作方法，测定不同pH条件下该酶的滤纸酶活、纤维素酶活和木聚糖酶活。
结果如图5所示。合适发反应pH为4－6；经综合考虑，特别是考虑滤纸酶活，该酶最适pH为5.0左右。
3.金属离子对纤维素酶活的影响
3.1取等量酶液，分别加入等量的10mM的AgNO3、CaCl2、CoCl2、ZnCl2、MgSO4、CuSO4、FeSO4、MnSO4溶液混匀，将待测酶液用0.05mol/L，pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释适当倍数。
实验组(加入1.0mL pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，50mg滤纸条、0.5mL酶液)，再取3支试管分别是空白管(加入1.5mL缓冲液)、酶对照组(1.0mL缓冲液、0.5mL酶液)、底物对照组(1.5mL缓冲液+滤纸条)。
放入50℃水浴60分钟，水浴结束后，立即加入3.0mL二硝基水杨酸(DNS)混合终止酶反应，沸水中水浴5min，然后移至冰水中冷却。取0.2mL反应物加2.5mL水稀释，然后在540nm处测吸光度，用空白组调零。通过葡萄糖标准曲线线性回归方程求出葡萄糖的含量，计算滤纸酶活。
3.2取等量酶液，分别加入等量的10mM的AgNO3、CaCl2、CoCl2、ZnCl2、MgSO4、CuSO4、FeSO4、MnSO4溶液混匀，将待测酶液用0.05mol/L，pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释适当倍数。
实验组(加入1.0mL 1％(w/v)CMC溶液、0.5mL酶液)，再取3支试管分别为空白管(加入1.5mL缓冲液)、酶对照组(1.0mL缓冲液、0.5mL酶液)、底物对照组(0.5mL缓冲液、1％(w/v)CMC溶液)。
将试管放入50℃水浴锅中水浴30分钟，水浴后，加入3.0mLDNS混匀，沸水浴5min，然后移至冰水中冷却。取0.2mL混合物加2.5mL水稀释，然后在540nm处测吸光度，用空白管调零。通过葡萄糖标准曲线线性回归方程求出葡萄糖的含量，计算CMC酶活。
3.3取等量酶液，分别加入等量的10mM的AgNO3、CaCl2、CoCl2、ZnCl2、MgSO4、CuSO4、FeSO4、MnSO4溶液混匀，将待测酶液用0.05mol/L，pH5.3的乙酸缓冲液稀释适当倍数。
实验组(加入1.0mL 1％(w/v)木聚糖溶液、1.0mL酶液)，再取3支试管分别为空白管(加入2.0mL缓冲液)、酶对照组(1.0mL缓冲液、1.0mL酶液)、底物对照组(1.0mL缓冲液、1.0mL 1％(w/v)木聚糖溶液)。
置于40℃条件下反应30min，取出。迅速、准确地向三支试管中加入DNS试剂3.0mL，于空白管中准确加入稀释好的待测酶液1.0mL，将三支试管同时置于沸水浴中，准确计时，煮沸5min后取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL。以空白管在分光光度计540nm下较零，分别测量二支试管中样品的吸光度，取平均值，通过木糖标准曲线线性回归方程求出木糖的含量，分别计算木聚糖酶活。
结果如图6所示，Mn2+等对相对酶活有一定的促进作用，达到110％(主要考虑滤纸酶活)。
4.本发明纤维素酶的温度耐受性
4.1将酶液分别放入40、50、60、70、80℃水浴中保温0.5、1.0、1.5h，将待测酶液用0.05mol/L，pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释适当倍数。
实验组(加入1.0mL pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，50mg滤纸条、0.5mL酶液)，再取3支试管分别是空白管(加入1.5mL缓冲液)、酶对照组(1.0mL缓冲液、0.5mL酶液)、底物对照组(1.5mL缓冲液+滤纸条)。
放入50℃水浴60分钟，水浴结束后，立即加入3.0mL二硝基水杨酸(DNS)混合终止酶反应，沸水中水浴5min，然后移至冰水中冷却。取0.2mL反应物加2.5mL水稀释，然后在540nm处测吸光度，用空白组调零。通过葡萄糖标准曲线线性回归方程求出葡萄糖的含量，计算滤纸酶活。
4.2将酶液分别放入40、50、60、70、80℃水浴中保温0.5、1.0、1.5h，将待测酶液用0.05mol/L，pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释适当倍数。
实验组(加入1.0mL 1％(w/v)CMC溶液、0.5mL酶液)，再取3支试管分别为空白管(加入1.5mL缓冲液)、酶对照组(1.0mL缓冲液、0.5mL酶液)、底物对照组(0.5mL缓冲液、1％(w/v)CMC溶液)。
将试管放入50℃水浴锅中水浴30分钟，水浴后，加入3.0mLDNS混匀，沸水浴5min，然后移至冰水中冷却。取0.2mL混合物加2.5mL水稀释，然后在540nm处测吸光度，用空白管调零。通过葡萄糖标准曲线线性回归方程求出葡萄糖的含量，计算CMC酶活。
4.3将酶液分别放入40、50、60、70、80℃水浴中保温0.5、1.0、1.5h，将待测酶液用0.05mol/L，pH5.3的乙酸缓冲液稀释适当倍数。
实验组(加入1.0mL 1％(w/v)木聚糖溶液、1.0mL酶液)，再取3支试管分别为空白管(加入2.0mL缓冲液)、酶对照组(1.0mL缓冲液、1.0mL酶液)、底物对照组(1.0mL缓冲液、1.0mL 1％(w/v)木聚糖溶液)。
置于40℃条件下反应30min，取出。迅速、准确地向三支试管中加入DNS试剂3.0mL，于空白管中准确加入稀释好的待测酶液1.0mL，将三支试管同时置于沸水浴中，准确计时，煮沸5min后取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL。以空白管在分光光度计540nm下较零，分别测量二支试管中样品的吸光度，取平均值，通过木糖标准曲线线性回归方程求出木糖的含量，分别计算木聚糖酶活。
结果如图7所示，该酶在60℃处理1h后，相对酶活为93％(主要考虑滤纸酶活)。
实施例6：水解玉米秸秆实验
取干燥粉碎后粒径为40目的玉米秸秆5g，经HPLC法(色谱条件：Shodex Suger SH1011(8.0mm I.D×300mm)；流动相：0.005mol/L的稀硫酸溶液；流速：0.6mL/min；检测器：示差检测器；柱温：50℃；进样量：10μL)测定，葡萄糖在原料中的含量分别为56％。
另取干燥粉碎后粒径为40目的玉米秸秆10g，加入嗜热子囊菌纤维素酶酶液(用量为50U/g秸秆)酶解12h，参照上面的HPLC法测定其葡萄糖含量，经计算，其酶解所得的葡萄糖对原料中葡萄糖的得率为81％。
葡萄糖得率的计算公式为：
其中：
I：葡萄糖的得率(％)，
C1：酶解秸秆所产的葡萄糖浓度(g/L)，
C0：秸秆样品中葡萄糖浓度(稀硫酸水解)(g/L)。
实施例7：水解水稻秸秆实验
取干燥粉碎后粒径为30目的水稻秸秆5g，经HPLC法(色谱条件：Shodex Suger SH1011(8.0mm I.D×300mm)；流动相：0.005mol/L的稀硫酸溶液；流速：0.6mL/min；检测器：示差检测器；柱温：50℃；进样量：10μL)测定，葡萄糖和木糖在原料中的含量分别为48％和24％。
另取干燥粉碎后粒径为30目的水稻秸秆15g，加入嗜热子囊菌纤维素酶酶液(用量为50U/g秸秆)酶解24h，参照上面的HPLC法测定其葡萄糖含量，经实施例6中公式计算，其酶解所得的葡萄糖对原料中葡萄糖的得率为89％。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种制备发酵醪的方法，包括将保藏号为CGMCC No.11334的菌株进行活化和发酵培养的步骤；
优选地，包括下述步骤：
1)将所述菌株接入种子培养基中，于39～45℃培养12－64小时进行活化；优选地，培养24－48小时进行活化；
2)以体积分数为3％～10％的接种量接种至发酵培养基，于39～45℃发酵培养2－8天得到发酵醪；优选地，发酵培养6－7天。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述种子培养基包括：玉米淀粉15g/L、蛋白胨4g/L、K2HPO41g/L、Na2HPO41g/L、MgSO40.5g/L；
和/或
所述发酵培养基包括：麸皮3～30g/L，微晶纤维素5～50g/L，蛋白胨0.5～5g/L，KH2PO40.3～3g/L，CaCl20.1～0.5g/L、MgSO40.1～0.8g/L，吐温-800.1～1％(v:v)，；
优选地，所述发酵培养基包括：麸皮5g/L，微晶纤维素10g/L，蛋白胨2g/L，KH2PO42g/L，CaCl20.3g/L、MgSO40.3g/L，吐温-800.1％(v:v)；
优选地，所述种子培养基或者发酵培养基还含有1mL/L的微量元素液；所述微量元素液包含FeSO4·7H2O 5g/L、MnSO4·H2O 1.6g/L、ZnSO4·7H2O 1.4g/L、CoCl2·6H2O 3.7g/L。
3.一种制备耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶的方法，包括将保藏号为CGMCC No.11334的菌株的发酵醪的上清或者发酵液的上清进行分离纯化的步骤；
优选地，包括下述步骤：
将保藏号为CGMCC No.11334的菌株的发酵醪或者发酵液离心取上清、浓缩、硫酸铵沉淀、透析、阴离子交换柱层析、分子筛柱层析；
更优选地，包括下述步骤：
(1)取保藏号为CGMCC No.11334的菌株的发酵醪或者发酵液，经5000～12000rpm离心，收集上清液，低温浓缩后，加入硫酸铵至饱和度为60～90％，静置12～48h，高速离心取沉淀；
(2)取上述(1)中的沉淀，加水复溶，将复溶液置入8000～14000Da的透析袋中，去离子水透析；
(3)收集上述(2)中的透析液，低温浓缩后，进行阴离子交换柱层析，依次用PBS和0.1mol/L，0.3mol/L，0.5mol/L NaCl(pH5.3)进行阶段性洗脱；OD280nm在线检测，收集的各洗脱部分；
(4)收集上述(3)中的PBS洗脱组分，进行分子筛柱层析，取纤维素酶活最高洗脱组分，低温浓缩后，经真空冷冻干燥，即得耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶；
优选地，上述各发酵醪独立地由权利要求1或2所述的方法制得。
4.一种耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶，其由保藏号为CGMCCNo.11334的菌株制得；优选地，其由权利要求3所述的方法制得。
5.一种制备葡萄糖的方法，包括使用权利要求4所述的耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶对秸秆进行降解的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述秸秆选自小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆中的任意一种、两种或者三种。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，相对于每g秸秆，所述耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶的用量为≥50U。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于如下的(1)-(3)项中的任意一项、两项或者三项，
(1)降解的温度为60～70℃，优选70℃；
(2)pH为4～6，优选为5；
(3)加入Mn2+；优选地，Mn2+的终浓度为5mM/L。
9.根据权利要求5所述的方法，其中，降解的时间为≥12小时，优选为≥24小时。
10.权利要求4所述的耐高温酸性嗜热子囊菌纤维素酶在纤维素降解和/或葡萄糖制备中的用途。
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