CN114657071B - 一种高温降解纤维素的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高温降解纤维素的菌株及其应用，所述菌株为嗜热子囊菌（Thermoascus sp.）K1，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年05月07日，保藏编号为CGMCC No.21957。本发明提供的菌株可以在40℃~60℃下良好的生长，在以酒糟为底物、发酵培养基初始pH为3～5范围内能产生较高的纤维素酶，极大的提高了白酒酒糟的利用率，具有良好的应用前景。

Description

一种高温降解纤维素的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体地说是涉及一种高温降解纤维素的菌株及其应用。
背景技术
白酒糟是白酒产业主要的副产品，其含有丰富的营养成分，如淀粉、脂肪、蛋白质、维生素、氨基酸等，具有广阔的开发利用价值。2020年1～12月，白酒产量740.73万千升，按白酒与酒糟的产量比为1:3，可以计算出2020年酒糟的生产量大概是2222.19万吨，如此庞大的酒糟不能合理利用将会是资源浪费，也会污染环境。将酒糟重复利用制作饲料，不仅能有效缓解饲料短缺问题，也能促进白酒行业经济的发展。
纤维素是自然界中分布广泛、含量最多的有机物之一，分子结构非常的稳定，难以降解。酒糟中含有大量的纤维素，是制作酒糟饲料的主要限制因素，所以解决这一问题十分重要，利用纤维素降解酶这一生物法来实现纤维素的原料转化，是当前生物质资源研究的热点和重点。
高温菌是一类能在45℃以上生长和繁殖的嗜热微生物，降解性能好、代谢效率高，在很多领域都发挥着重要的作用。高温有利于纤维素降解但也会抑制微生物的生长，从而影响纤维素的快速降解。嗜热纤维素降解菌可降解纤维素，还可加速发酵进程，促进物料腐熟，添加高温纤维素降解菌剂可提高酒糟饲料的消化率和适口性。因此筛选耐受高温的纤维素降解菌，既有利于降低酒糟饲料中的粗纤维素含量，又能抑制杂菌的感染，提高酒糟饲料的安全性，在一定程度上提高酒糟的饲喂价值。
本发明筛选出高温的纤维素降解菌，通过对其进行相关特性研究，以期为后续高温菌剂的制备及有机饲料的生产奠定基础，这对于白酒糟发酵饲料生产技术的应用和推广具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高温降解纤维素的菌株及其应用，以解决现有技术中酒糟量大而难以降解利用的问题。
本发明技术方案为：一种高温降解纤维素的菌株，所述菌株为嗜热子囊菌(Thermoascus sp.)K1(具体种为Thermoascus aurantiacus)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年05月 07日，保藏编号为CGMCC No.21957。
菌株K1的形态特征：培养初期菌丝白色，呈稀疏网状，3d后，菌落表面有白色颗粒状出现，渐转为金黄色至锈棕色，5～6d左右产生黄色或者棕色的水珠状的分泌物，菌丝无色，光滑，具分枝和隔膜，分生孢子位于菌丝的末端，闭囊壳单生或簇生，球形或不规则状，黄棕色。
菌株K1的ITS序列为：
ATCAGGATCCTACCTGATCCGAGGTCACCTGGAAGATGTTGACGCGGGGTCGGGCT GAGGCTCCGGCCGGGCCTGCAAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGG ACGCGGCGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCCGCGGCGGGCGGGGACGGCGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGG AATGCCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTT GAAAGTTTTCACGATTTCTCACGCGACTCAGACGGCACGCCTTCAAAAGCTCAGCGTTCGAAGGGTCTCCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGGGACACGCCCCCCGGCGGCCTTGC GGCGGGCCCGCCGAAGCAACAGGGTACGGTACACACGGGTGGGAGGTTGGGCCCCGGAGGACCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCCTACGGAAGTCAT
菌株K1的分子生物学鉴定结果为：通过ITS序列比对，与Thermoascusaurantiacus同源性为99％以上，菌株K1的ITS序列系统进化树显示与Thermoascusaurantiacus同源。
所述菌株的适宜发酵条件为：温度40-60℃，pH3.0-5.0。
所述菌株的适宜发酵条件为：温度45-50℃，pH4.0。
所述的菌株在降解酒糟、生产酒糟饲料中的应用。
所述酒糟为白酒酒糟。
应用的具体方法为将所述菌株按0.5-2.0％的接种量接种到酒糟降解培养基中，然后于 40-60℃发酵培养25-35天。
单位份酒糟降解培养基为：酒糟8-12g、麸皮7-8g，蒸馏水25-35mL，pH3.0-5.0。
本发明的有益效果是：
1.在高温的条件下，该菌株有较高的纤维素酶活，可以有效降解酒糟中的纤维素，提高酒糟降解率。
2.菌株K1是一株耐高温、耐酸、耐酒精的纤维素降解菌株，适宜应用于酒糟饲料的生产中，可以有效的缓解饲料短缺问题，对白酒行业的发展和保护具有重要的意义，并带来一定的经济效益。
3.通过对菌株K1进行相关特性研究，以期为后续高温菌剂的制备及生物有机饲料的生产奠定理论基础。
附图说明
图1为菌株K1形态特征(左图)及生殖结构(右图)。
图2为菌株K1的基于ITS序列的系统进化树。
图3为菌株K1的温度生长曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，在下述实施例中未详细描述的过程和方法是本领域公知的常规方法，实施例中所用原料或试剂除另有说明外均为市售品，可通过商业渠道购得；pH自然指自然pH即在3-5范围内。
实施例1菌株的筛选、鉴定
所用培养基：
富集培养基：酒糟10g、蛋白胨1g、NaCl 5g、CaCl2 0.1g、KH2PO4 1g、(NH4)2SO4 2g、MgSO4·7H2O 0.5g、滤纸条1cm×5cm 5条、蒸馏水1L，pH自然。
分离培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、孟加拉红培养基。
马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1L，pH自然。
发酵培养基：酒糟10g、蛋白胨5g、NaCl 5g、KH2PO4 1g、(NH4)2SO4 2g、MgSO4·7H2O0.5g蒸馏水1L，pH自然。
酒糟降解培养基：酒糟10g、麸皮7.5g，蒸馏水30ml，pH自然。
1.菌株K1的分离、纯化和保藏
取河北大学校内的松针腐质土为样品，称取10g的土样倒入装有90mL无菌水的500mL 锥形瓶中，50℃、180rpm震荡培养，直到滤纸全部分解，然后按1％的接种量接入另一富集培养基中，反复驯化4-5次。
吸取1ml富集液进行梯度稀释，分别涂布于配置好的培养基中，放置50℃条件下培养，其中细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基；霉菌采用孟加拉红培养基；放线菌采用高氏一号培养基。多次进行平板划线进行菌种纯化得到单菌落，并于4℃斜面保存。
2初筛与复筛
将分离得到的菌株挑取2环接种到发酵培养基中，在50℃、180rpm条件下振荡培养，细菌培养1天，霉菌培养4天，放线菌培养7天，每组做3个平行，测定其滤纸酶活和纤维素酶活(见表1)，筛选出酶活高的一株菌株K1，菌体形态及生殖结构如图1所示。
表1：初筛与复筛测定结果
3.菌株的分子生物学鉴定
通过美国生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)BLAST 程序比对，发现本发明的CGMCC NO21957的菌株K1的ITS基因序列与NCBI中的Thermoascus aurantiacus具有较高的同源性，用megaX软件构建系统发育树(图2)，图2 显示菌株K1与Thermoascus aurantiacus同源，确定为嗜热子囊菌。
实施例2发酵特性实验
1.各温度下生长曲线的测定
将菌株点接到PDA培养基上，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下静置培养，每天测定菌落的大小，绘制曲线如图3所示。
2.菌株K1纤维素酶活和滤纸酶活的测定
酶活测定测定方法采用DNS法，参照中华人民共和国轻工行业标准QB 2583—2003《纤维素酶制剂》中适应酸性纤维素酶测定方法，测定滤纸酶活力和CMC酶活力。
CMC酶活力计算公式为：X1＝A×1/0.5×n×2
式中X1:羧甲基纤维素酶活力，u/g(或u/ml)；
A：吸光度在标准曲线上查得(或计算出)的还原糖量，mg；
1/0.5：换算成酶液1ml；
n：酶样的稀释倍数；
2：时间换算系数。
滤纸酶活力计算公式为：X2＝A×1/0.5×n
式中X2：样品的滤纸酶活力(FPA)，u/g(或u/ml)；
A：根据吸光度在标准曲线上查得(或计算出)的还原糖量，mg；
1/0.5：换算成酶液1ml；
n:酶样的稀释倍数。
主要测定步骤为：
①葡萄糖标准曲线的制备：取7支25ml具塞试管，分别加入葡萄糖标准溶液0ml、5ml、 7.5ml、10ml、12.5ml、15ml、17.5ml，加入1.5ml的柠檬酸缓冲液，再加入3ml的DNS，沸水浴10min，冷却后定容到25ml。以0号试管为空白对照，在540nm下测定吸光度，并绘制标准曲线。
②粗酶液的制备：将菌株接种到PDA培养基上50℃培养3d，用灭菌的牛津杯取相同大小的菌块，加入到发酵培养基中，50℃、180rpm振荡培养4d，将发酵液4000rpm离心10min，取上清液，即粗酶液。
③测定纤维素酶活力，根据公式计算纤维素酶活力。
测定结果如表2和表3所示。
表2：菌株K1不同温度下2种纤维素酶活力
菌株K1在40～60℃均能产生较高的纤维素酶活，CMC酶活在40℃～50℃范围内呈上升状态，在50℃达到最高值，50℃～60℃呈下降状态；滤纸酶活在40℃～45℃呈上升状态，在 45℃达到最高值，在45℃～60℃呈下降状态。综合CMC酶活力和滤纸酶活力，菌株K1的最佳发酵温度为50℃，该菌产酶属于高温产酶范畴。
表3：菌株K1在不同初始pH条件下2种纤维素酶活力
pH CMC酶活力(U/mL) 滤纸酶活力(U/mL)
2 0.231 0.098
3 5.257 0.965
4 8.902 1.885
5 8.366 1.710
6 0.269 0.098
菌株K1在pH2～6范围内均能产生纤维素酶活。CMC酶活和滤纸酶活在pH2～4范围内呈上升状态，在pH＝4时达到最高值，pH在4～6范围内呈下降状态。菌株K1的最佳发酵初始pH为4，该菌株属于耐酸产酶范畴。
实施例3菌株K1降解酒糟能力的测定
在50℃下，将菌株K1接种到酒糟降解培养基中作为试验组，对照组不接菌，在50℃条件下静止培养30天，将样品用蒸馏水全部洗涤出来，抽滤处理，最后将酒糟置于烘箱烘干至恒重。酒糟降解率的计算公式为：
酒糟降解率＝(处理前干质量-处理后干质量)/处理前干质量×100％
经菌株K1处理的酒糟失重率为41.36％，对照组的酒糟失重率为12.57％，菌株K1对酒糟降解率为28.79％。

Claims (4)

1.一种降解酒糟、生产酒糟饲料的菌株，其特征在于，所述菌株为嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus）K1，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年05月07日，保藏编号为CGMCCNo. 21957。
2.权利要求1所述的菌株在降解酒糟、生产酒糟饲料中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述酒糟为白酒酒糟。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，单位份酒糟降解培养基为：酒糟8-12g、麸皮7-8g，蒸馏水25-35mL，pH3.0-5.0。
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