CN106916752A - 制备纤维素酶和/或木聚糖酶的方法及其专用菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412，其保藏编号为CGMCC No.11334，还涉及该菌株用于生产纤维素酶和/或木聚糖酶的用途，还涉及使用该菌株制备纤维素酶和/或木聚糖酶的方法。该菌株生产的纤维素酶和/或木聚糖酶制剂耐高温，可以高效降解小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆等木质纤维素，将其水解为葡萄糖和木糖，可用于生产燃料乙醇、有机酸等生物产品。

Description

制备纤维素酶和/或木聚糖酶的方法及其专用菌株
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体地涉及一种制备纤维素酶和/或木聚糖酶的方法及其专用菌株。
背景技术
纤维素酶(cellulose)又称纤维素酶系，是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们协同作用，将纤维素降解为寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖。纤维素酶主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成。
纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。用于生产纤维素酶的细菌有梭菌属(Clostridium)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、杆菌属(Bacillus)、高温单胞菌属(Thermomonospora)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、拟杆菌属(Bacteriodes)、欧文氏菌属(Erwinia)、醋弧菌属(Acetovibrio)、小双孢菌属(Microbispora)和链霉菌属(Streptomyces)等。其中，纤维单胞菌(C.fimi)和高温单胞菌(T.fusca)是被广泛研究的两种产生纤维素酶的细菌。如中国专利申请CN104232522A公开了一株从堆肥中分离筛选出来的能产纤维素酶的细菌(Achromobacter xylosoxidans),保藏编号为CCTCC No.M2013365，该菌经28h发酵后纤维素酶活为0.183U/mL。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，例如白绢菌(Sclerotium rolfsii)、白腐真菌(P.chrysosporium)以及木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖菌属(Schizophyllum)和青霉属(Penicillium)等种属中的一些真菌，其中木霉属是研究最广泛的纤维素酶产生菌。中国专利申请CN104263658A公开了一种里氏木霉菌株(Trichoderma reesei)CGMCC NO.9644，该菌蛋白分泌能力强，具有更强的纤维素酶生产能力，其所产滤纸酶活比出发菌株提高了13～31％。中国专利申请CN104328057A公开了采用空间诱变筛选培育的高产纤维素酶的里氏木霉(Trichoderma reesei)CGMCC NO.9537，其滤纸酶活力提高了25.83％～34.49％。
目前市场上销售的纤维素酶约20％来自木霉属和曲霉属。大部分纤维素酶的酶解温度为40～50℃，但在生产实践中，由于很多工业生产环境都是高温环境(如酒精发酵)，因此耐高温酶比常温酶更具实用意义。同时，耐高温酶还具有以下诸多优点:(1)高温反应，减少杂菌污染，提高产物纯度；(2)室温贮藏期较长；(3)一定程度可抗化学变性(如耐表面活性剂)；(4)可用热处理去除大量杂蛋白，易于大规模生产与纯化。故，耐高温酶成为纤维素降解酶研究中的一大热点。
发明内容
发明人通过不懈努力，从高温堆肥中筛选出一株具有同时产纤维素酶和/或木聚糖酶的嗜热菌，经形态观察和分子生物学技术鉴定，该菌株属于嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)，将其命名为嗜热子囊菌UJS1412。该菌株能够用于生产纤维素酶和/或木聚糖酶，该菌株生产的纤维素酶和/或木聚糖酶制剂耐高温，可以高效降解小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆等木质纤维素，将其水解为葡萄糖和木糖，可用于生产燃料乙醇、有机酸等生物产品。
在此基础上，本发明涉及以下几个方面：
本发明的第一方面涉及一种嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412，其保藏编号为CGMCC No.11334。
该菌株已于2015年09月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.11334，分类命名为嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)，菌株名称为UJS1412。
本发明所述的嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412的形态学特征为：所述嗜热子囊菌UJS1412在PDA平板培养基上于40～50℃下培养2～3天，菌丝呈乳白色稀疏网状；3天后渐转为棕黄色至深棕色，培养基背面观察呈浅黄色(如图1所示)。显微观察发现，菌丝呈明显的子囊菌特征，无色，光滑，具有分枝和隔膜；子囊孢子为卵圆形至椭圆形，壁光滑。
本发明所述的嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412能够用于生产纤维素酶和/或木聚糖酶，该菌生产的纤维素酶和/或木聚糖酶制剂可以高效降解小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆等木质纤维素，将其水解为葡萄糖和木糖，可用于生产燃料乙醇、有机酸等生物产品。
本发明的第二方面涉及嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412用于生产纤维素酶和/或木聚糖酶的用途。
本发明的第三方面涉及一种制备纤维素酶和/或木聚糖酶的方法，该方法使用本发明所述的嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412制备纤维素酶和/或木聚糖酶。
在一个优选的实施方案中，本发明第三方面所述的制备维素酶和/或木聚糖酶的方法，包括使用本发明所述的嗜热子囊菌株(Thermoascusaurantiacus)UJS1412进行液体发酵的步骤。优选的液体发酵的温度为40～50℃，例如40～45℃。优选的发酵时间为4～8天，例如4～7天，例如5天、6天或7天。发酵时优选的初始pH值为4.5～6.0，例如4.8、5.0、5.5或5.8。
在另一个优选的实施方案中，本发明第三方面所述的制备维素酶和/或木聚糖酶的方法中，发酵所用的碳源选自葡萄糖、麸皮、微晶纤维素、淀粉、羧甲基纤维素(CMC)、果糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖，优选以麸皮和/或微晶纤维素为碳源；发酵所用的氮源选自蛋白胨(例如胰蛋白胨、小麦蛋白胨、鱼粉蛋白胨)、牛肉膏、NH4Cl、尿素、(NH4)2SO4、酵母膏、玉米浆和NaNO3为氮源，优选以蛋白胨为氮源。发酵时，将碳源和碳源加水配制成液体，另外添加KH2PO4、CaCl2、MgSO4、吐温-80等营养物质。
在一个具体的实施方案中，本发明第三方面所述的制备纤维素酶和/或木聚糖酶的方法，该方法以麸皮和/或微晶纤维素为碳源，以蛋白胨为氮源，将其加水配制成浓度分别为3～30g/L，5～50g/L和0.5～5g/L的液体，另外添加KH2PO40.3～3g/L，CaCl2 0.1～0.5g/L、MgSO4 0.1～0.8g/L，吐温-800.1～1％(v/v)。优选将配置好的液体培养液置于250～500mL摇瓶或5～30L生物反应器中，40～50℃发酵4～7d。
采用本发明所述的制备方法制备得到的纤维素酶和/或木聚糖酶，相对于现有的纤维素酶，更耐高温，其酶解温度为40℃～80℃(例如40℃～70℃，40℃～65℃，40℃～60℃,45℃～60℃,48℃～60℃，50℃～60℃,51℃～60℃，52℃～60℃，53℃～60℃，54℃～60℃或55℃～60℃)，特别是温度为45℃～60℃时，还能保持较高的酶活性；其酶解pH为4～5.5(例如4～5，4～5.1，4～5.2，4～5.3或4～5.4)。本发明所述的制备方法制备得到的纤维素酶和/或木聚糖酶的滤纸酶活为2～12U/mL，CMC酶活为12～25U/mL，木聚糖酶活为50～280U/mL。
本发明的第四方面涉及一种纤维素酶和/或木聚糖酶制剂，该酶制剂由本发明第三方面任一项所述的制备方法制备得到，其酶解温度为40℃～80℃(例如40℃～70℃，40℃～65℃，40℃～60℃,45℃～60℃,48℃～60℃，50℃～60℃,51℃～60℃，52℃～60℃，53℃～60℃，54℃～60℃或55℃～60℃)，酶解pH为4～5.5(例如4～5，4～5.1，4～5.2，4～5.3或4～5.4)。该酶制剂的纸酶活为2～12U/mL，CMC酶活为12～25U/mL，木聚糖酶活为50～280U/mL。
本发明的第五方面涉及一种纤维素酶和/或木聚糖酶制剂，该酶制剂的酶解温度为40℃～80℃(例如40℃～70℃，40℃～65℃，40℃～60℃,45℃～60℃,48℃～60℃，50℃～60℃,51℃～60℃，52℃～60℃，53℃～60℃，54℃～60℃或55℃～60℃)，酶解pH为4～5.5(例如4～5，4～5.1，4～5.2，4～5.3或4～5.4)。该酶制剂的纸酶活为2～12U/mL，CMC酶活为12～25U/mL，木聚糖酶活为50～280U/mL。该酶制剂可以由本发明第一方面所述的嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412经液体发酵制备得到，也可以由本发明第三方面任一项所述的制备维素酶和/或木聚糖酶的方法制备得到。
本发明的第六方面涉及本发明第四方面或第五方面所述的纤维素酶和/或木聚糖酶制剂在降解木质纤维素(例如小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆等)中的用途。
本发明的第七方面涉及一种降解木质纤维素(例如小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆等)的方法，该方法采用本发明第四方面或第五方面所述的纤维素酶和/或木聚糖酶制剂催化降解木质纤维素。
在一个优选的实施方案中，本发明第七方面所述的降解木质纤维素的方法，包括以下步骤：
1)预处理：用NaOH溶液(例如0.8～1.5mol/L，优选为1mol/L)预处理木质纤维素(例如小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆等)，洗涤至中性烘干；
2)将预处理后的木质纤维素配制成溶液(优选浓度为10～50g/L)，，加入所述的纤维素酶和/或木聚糖酶制剂进行酶解反应，
优选地，所述的纤维素酶和/或木聚糖酶制剂添加量为0.1～1mL酶液/g秸秆；
优选地，酶解温度为40℃～80℃(例如40℃～70℃，40℃～65℃，40℃～60℃,45℃～60℃,48℃～60℃，50℃～60℃,51℃～60℃，52℃～60℃，53℃～60℃，54℃～60℃或55℃～60℃)；
优选地，酶解pH为4.0～5.5(例如4～5，4～5.1，4～5.2，4～5.3或4～5.4)；
优选地，酶解时间为6～24小时。
在一个具体的实施方案中，本发明第七方面所述的降解木质纤维素的方法，包括以下步骤：将木质纤维素(例如小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆等)经的NaOH溶液(例如0.8～1.5mol/L，优选为1mol/L)预处理后洗涤至中性，烘干后配制成溶液(优选浓度为10～50g/L)，添加本发明第四方面或第五方面所述的纤维素酶和/或木聚糖酶制剂，添加量优选为0.1～1mL酶液/g秸秆，酶解温度40℃～80℃(例如40℃～70℃，40℃～65℃，40℃～60℃,45℃～60℃,48℃～60℃，50℃～60℃,51℃～60℃，52℃～60℃，53℃～60℃，54℃～60℃或55℃～60℃)，pH为4.0～5.5(例如4～5，4～5.1，4～5.2，4～5.3或4～5.4)，酶解时间优选为6～24小时。该方法酶解所得的葡萄糖和木糖对原料中葡萄糖和木糖的得率分别为50～90％和30～70％。
发明的有益效果
本发明提供的嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)UJS1412能够用于生产纤维素酶和/或木聚糖酶，该菌生产的纤维素酶和/或木聚糖酶制剂相对于现有的纤维素酶更耐高温，其酶解温度为40℃～80℃，特别是温度达到55℃～60℃时，还能保持较高的酶活性，可以高效降解小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆等木质纤维素，将其水解为葡萄糖和木糖，可用于生产燃料乙醇、有机酸等生物产品。
附图说明
图1：嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)UJS1412在平板上的形态；
图2：不同碳源对嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)UJS1412产酶能力的影响；
图3：不同氮源对嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)UJS1412产酶能力的影响；
图4：温度对嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)UJS1412产纤维素酶/木聚糖酶活的影响；
图5：pH对嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)UJS1412产纤维素酶/木聚糖酶活的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1菌株筛选、分离与鉴定
1.1菌株筛选与分离
高温堆肥样品采自江苏省句容市郊，采样时间为2014年8月10日。将采集高温堆肥样品用无菌水振荡，取适量涂布秸秆分离筛选琼脂平板(筛选琼脂平板由1mol/L NaOH预处理的小麦秸秆10g/L，琼脂15g/L制成)。挑取透明水解圈较大的菌落至培养液中(培养液由1mol/L NaOH预处理的小麦秸秆20g/L，蛋白胨5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L配制而成，自然pH)，40℃200rpm摇瓶培养36小时，测定发酵液中木聚糖酶及纤维素酶酶活，最后筛选得到1株同时产纤维素酶和木聚糖酶的高产菌株，命名为UJS1412，斜面和冷冻干燥保藏。
将筛选获得的菌株，接种于PDA培养基平板上，分别置于40℃，45℃和50℃下培养，观察菌丝呈乳白色发散状生长，菌丝之间呈稀疏网状；3天后渐转为棕黄色至深棕色，培养基背面观察呈浅黄色(如图1所示)。玻片培养，显微镜下对菌丝、分生孢子梗、分生孢子等形态特征进行观察，发现菌丝呈明显的子囊菌特征，为无色，光滑，具分枝和隔膜；子囊孢子呈卵圆形至椭圆形、壁光滑。
1.2基于18s rDNA序列的分子鉴定
一、仪器与试剂
1、仪器
仪器名称 仪器来源 型号
测序仪 Applied Biosystems 3730XL
DNA电泳槽 北京六一仪器厂 DYCP-31DN
稳压电泳仪 北京六一仪器厂 DYY-5
电热恒温水槽 上海一恒科学仪器有限公司 DK-8D
凝胶成像仪 上海复日科技仪器有限公司 FR980
恒温培养箱 太仓市科教器材厂 DHP-9162
恒温摇床 太仓市实验设备厂 TH2-C
PCR仪 Applied Biosystems 2720thermal cycler
冷冻高速离心机 BBI HC-2518R
Surf系列精密单道可调移液器 生工 SP10-1000
2、试剂
二、实验过程
1、基因组DNA提取
采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海)有限公司)提取菌株UJS1412的基因组DNA，具体的提取步骤参见产品说明书。
2、PCR扩增
采用真菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SEQ ID NO：1))及ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQID NO：2)扩增菌株整个ITS序列(内部转录间隔区，internal transcriberspacer)序列。
PCR反应体系：
PCR循环条件：
3、凝胶电泳
1％琼脂糖电泳，150V、100mA 20min电泳观察(见电泳图DNALadder Mix make)。
4、纯化回收
PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带，纯化方式见SK8131说明书。
5、连接
将PCR产物经胶回收纯化、过PCR柱纯化，与pGEM-T连接，具体步骤按18-T Vector连接试剂盒操作。
6、感受态细胞(E.coli JM109)的制备：(氯化钙法)
6.1从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100ml LB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转/分)。
6.2在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。
6.3于4℃,以4000转/分离心10分钟，回收细胞。
6.4倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。
6.5以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。
6.6于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。
6.7倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。
6.8每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2(含20％甘油)重悬每份细胞沉淀。
6.9将细胞分装成小份(100μl/支)，放于-70℃冻存。
7、连接产物转化
7.1取100μL感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。
7.2加入10μL连接液，轻轻混匀。冰上放置30分钟。
7.342℃水浴热激90秒。冰上放置15～20分钟。
7.4加400μL LB培养基，37℃200～250rpm振荡培养1小时。
7.5用枪头吸取200μL培养菌液，涂布在预先用20μL 100mM IPTG和100l 20mg/ml X-gal涂布的氨苄青霉素平板上。
7.6平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。
8、蓝白斑筛选
当外源DNA片段插入到pUC57中后，由于外源DNA的核酸序列存在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物β-半乳糖苷酶α-片段的活性，因此重组克隆在X-gal/IPTG平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色，选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落。
9、质粒提取与测序
选择阳性克隆提取质粒并纯化。用M13+/-引物扩增(体系如上)。M13+/-引物测序。
上述菌种鉴定实验过程及测序工作由生工生物工程(上海)有限公司完成，所得的序列如SEQ ID NO：3序列所示。
菌株UJS1412的18S rDNA 序列测序结果用NCBI的BLAST 2.0进行同源分析，通过与Genbank核酸数据库对比后，发现其与Thermoascusaurantiacus ATCC 204492有95％左右的相似度，确定该菌株为嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)。
SEQ ID NO：3：
ACCTGCGGAAGGATCATTAAAGAGTTGGGGTCCTTCGGGGCCCGATCTCCCACCCTTTGTTGTCGCGAATTTGTTGCCTCGGCGGGTTTGCCTTTATGGCAGACGGGCTCCGGCCCACCCGCCGCAGGACCATTCAAACTCTGCTTTAACAATGCAGTTTGAGAAGATTTAATAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCAATCAAGCTACGCTTGGTATTGGGCGCGCGGCTTTTCCTTGCGAAAGGCCCGCCCGAAATGCATCGGCGAGGAAACCGACCCCCGGCGTGTTAGATTTCTGAACGTCAGGAGCACCGGTGCCCTCCGCCGTACAATCTTTTTTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATAC。
证明本发明菌株属于嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)。
该菌株已于2015年09月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.11334，分类命名为嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)，菌株名称为UJS1412。
实施例2嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412产纤维素酶/木聚糖酶的条件筛选
将保藏的菌株接入PDA斜面培养基(配制方法为：将200g马铃薯沸水中煮20min后，8层纱布过滤，取滤液，加入20g葡萄糖和20g琼脂，补加水至1L，pH自然。121℃条件下灭菌30min)，40℃培养7天进行活化。
将活化的菌株接入液体种子培养基(玉米淀粉15g/L、蛋白胨4g/L、K2HPO4 1g/L、Na2HPO4 1g/L、MgSO4 0.51mL/L的微量元素，pH自然。装液量100mL/250mL)中，40℃培养3天，制得种子液。
产酶液体培养基的配方：碳源10g/L、蛋白胨1g/L、酵母膏1g/L、KH2PO4 2g/L、CaCl2 0.3g/L、(NH4)2SO4 1.4g/L、MgSO4 0.3g/L、吐温-801mL/L，微量元素(FeSO4·7H2O 5g/L、MnSO4·H2O 1.6g/L、ZnSO4.·7H2O 1.4g/L、CoCl2·6H2O 3.7g/L)1mL/L，pH 6.5。分别添加葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、微晶纤维素、CMC和麸皮等作为产酶培养基中的碳源，筛选其最适的碳源。按10％(v/v)的接种量，28℃培养7天，分别测定滤纸酶活、CMC酶活以及木聚糖酶活，测定结果见表1和图2。
表1碳源对酶活的影响
注：微晶纤维素1购自国药集团化学试剂有限公司；微晶纤维素2购自上海楷洋生物技术有限公司
分别采用酵母膏、胰蛋白胨、小麦蛋白胨、鱼肉蛋白胨、牛肉膏、尿素、(NH4)2 SO4、NaNO3、NH4Cl等作为上述产酶培养基中的氮源，筛选其最适的氮源。按10％的接种量，28℃培养7天，分别测定滤纸酶活、CMC以及木聚糖酶活，测定结果见表2和图3。
表2氮源对酶活的影响
其中，滤纸酶活的测定方法为：将待测酶液用0.05mol/L，pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释适当倍数。实验组(加入1.0mL pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，50mg滤纸条、0.5mL酶液)，再取3支试管分别是空白管(加入1.5mL缓冲液)、酶对照组(1.0mL缓冲液、0.5mL酶液)、底物对照组(1.5mL缓冲液+滤纸条)。放入50℃水浴60分钟，水浴结束后，立即加入3.0mL二硝基水杨酸(DNS)混合终止酶反应，沸水中水浴5min，然后移至冰水中冷却。取0.2mL反应物加2.5mL水稀释，然后在540nm处测吸光度，用空白组调零。通过葡萄糖标准曲线线性回归方程求出葡萄糖的含量。
CMC酶活的测定：将待测酶液用0.05mol/L，pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释适当倍数。实验组(加入1.0mL 1％(w/v)CMC溶液、0.5mL酶液)，再取3支试管分别为空白管(加入1.5mL缓冲液)、酶对照组(1.0mL缓冲液、0.5mL酶液)、底物对照组(0.5mL缓冲液、1％(w/v)CMC溶液)。将试管放入50℃水浴锅中水浴30分钟，水浴后，加入3.0mLDNS混匀，沸水浴5min，然后移至冰水中冷却。取0.2mL混合物加2.5mL水稀释，然后在540nm处测吸光度，用空白管调零。通过葡萄糖标准曲线线性回归方程求出葡萄糖的含量。
滤纸酶活/CMC酶活计算公式：
X—纤维素酶(U/mL)；W—葡萄糖生成量(mg)；V—反应液中酶液加入量；5.56—1mg的葡萄糖的μmol数(1000/180＝5.56)；N—样品稀释倍数；T—反应时间；
木聚糖酶活的测定:将待测酶液用0.05mol/L，pH5.3的乙酸缓冲液稀释适当倍数。
实验组(加入1.0mL 1％(w/v)木聚糖溶液、1.0mL酶液)，再取3支试管分别为空白管(加入2.0mL缓冲液)、酶对照组(1.0mL缓冲液、1.0mL酶液)、底物对照组(1.0mL缓冲液、1.0mL 1％(w/v)木聚糖溶液)。置于40℃条件下反应30min，取出。迅速、准确地向三支试管中加入DNS试剂3.0mL，于空白管中准确加入稀释好的待测酶液1.0mL，将三支试管同时置于沸水浴中，准确计时，煮沸5min后取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL。以空白管在分光光度计540nm下较零，分别测量二支试管中样品的吸光度，取平均值，通过木糖标准曲线线性回归方程求出木糖的含量。
木聚糖酶活计算公式：
X—木聚糖酶(U/mL)；W—木糖生成量(mg)；V—反应液中酶液加入量；6.67—1mg的木聚糖的μmol数(1000/150＝6.67)；N—样品稀释倍数；T—反应时间。
根据表1和表2以及图2和图3所示，菌株UJS1412最适碳源为麸皮和结晶纤维素，最适氮源为蛋白胨。
当配置发酵培养基为：麸皮3g/L,微晶纤维素5g/L，蛋白胨0.5g/L，KH2PO40.3g/L，CaCl2 0.1g/L，MgSO4 0.1g/L，吐温-800.1％(v/v)，40℃，初始pH为4.5，发酵7天，发酵醪经离心去除菌体后既得酶制剂，检测结果显示：此时嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412所产的酶制剂，其滤纸酶活为2U/mL，CMC酶活为12U/mL，木聚糖酶活为50U/mL。
当配置发酵培养基为：麸皮10g/L,微晶纤维素15g/L，蛋白胨2g/L，KH2PO40.5g/L，CaCl2 0.3g/L，MgSO4 0.4g/L，吐温-800.5％(v/v)，45℃，初始pH为6.0，发酵7天，发酵醪经离心去除菌体后既得酶制剂，检测结果显示：此时嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412所产的酶制剂，其滤纸酶活为9U/mL，CMC酶活为17U/mL，木聚糖酶活为200U/mL。
当配置发酵培养基为：麸皮30g/L,微晶纤维素50g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO43g/L，CaCl2 0.5g/L，MgSO4 0.8g/L，吐温-801％(v/v)，40℃，初始pH为6.0，发酵7天，发酵醪经离心去除菌体后既得酶制剂，检测结果显示：此时嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412所产的酶制剂，其滤纸酶活为12U/mL，CMC酶活为25U/mL，木聚糖酶活为280U/mL。
实施例3嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412所产纤维素酶/木聚糖酶的酶学性质
取实施例2制备的嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412所产酶制剂，分别加入1.0mL 1％(W/V)CMC(用0.05mol/L，pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液配制)、50±5mg滤纸条和1.0mL 1％(W/V)木聚糖溶液(用0.05mol/L，pH5.3的乙酸缓冲液配制)，将反应体系分别置于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃反应30min后分别测定滤纸酶活、CMC酶活和木聚糖酶活。以最高酶活值为100％，其余以此折算为最高活力的百分数为相对酶活，测定结果见表3及图4。由表3及图4可以看出，本发明的嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412所产酶制剂在温度为40℃～80℃范围内具有活性，在40℃～65℃(优选45℃～60℃)范围内具有比较高的活性，特别是温度为60℃时，滤纸酶活，CMC酶活和木聚糖酶还能够保持较高的催化活力，相对酶活分别为100％，90％和88％。
表3不同温度条件下纤维素酶/木聚糖酶活力
取实施例2制备的嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412所产酶制剂，分别加入1.0mL 1％(W/V)CMC(用0.05mol/L，pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液配制)、50±5mg滤纸条和1.0mL 1％(W/V)木聚糖溶液(用0.05mol/L，pH5.3的乙酸缓冲液配制)，别溶于pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10的缓冲液中，配成所需浓度的溶液。于60℃反应30min后分别测定滤纸酶活，CMC酶活和木聚糖酶活。以最高酶活值为100％，其余以此折算为最高活力的百分数为相对酶活，测定结果见表4及图5。由表4及图5可以看出，嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412所产酶制剂在pH值为4.0～5.5范围内具有较高活性，当pH值为5.0时，滤纸酶活，CMC酶活和木聚糖酶还能够保持较高的催化活力，相对酶活分别为100％，80％和100％。
表4不同pH值下纤维素/木聚糖酶活力
实施例4嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412所产纤维素酶/木聚糖酶的应用
取粉碎的水稻秸秆100g，加入1mol/L的NaOH溶液浸泡24h，水洗至中性后烘干，经HPLC法(色谱条件：Shodex Suger SH1011(8.0mmI.D×300mm)；流动相：0.005mol/L的稀硫酸溶液；流速：0.6mL/min；检测器：示差检测器；柱温：50oC；进样量：10μL)测定，葡萄糖和木糖在原料中的含量分别为76％和12％。取经前述获得的经NaOH预处理24小时后的玉米秸秆，加水配制成50g/L浓度，加入实施例2制备的嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412所产酶制剂0.1mL酶液/g秸秆，酶解温度45℃，pH为4.5，酶解6小时后取样测定。经HPLC分析，酶解液中葡萄糖和木糖对原料中葡萄糖和木糖的得率分别为50％和30％。
取粉碎的玉米秸秆100g，加入1mol/L的NaOH溶液浸泡24h，水洗至中性后烘干，经HPLC法(色谱条件：Shodex Suger SH1011(8.0mmI.D×300mm)；流动相：0.005mol/L的稀硫酸溶液；流速：0.6mL/min；检测器：示差检测器；柱温：50oC；进样量：10μL)测定，葡萄糖和木糖在原料中的含量分别为72％和18％。取经前述获得的经NaOH预处理24小时后的玉米秸秆，加水配制成50g/L浓度，加入实施例2制备的嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412所产酶制剂0.8mL酶液/g秸秆，酶解温度55℃，pH为5.5，酶解24小时后取样测定。经HPLC分析，酶解液中葡萄糖和木糖对原料中葡萄糖和木糖的得率分别为85％和57％。
取粉碎的小麦秸秆100g，加入1mol/L的NaOH溶液浸泡24h，水洗至中性后烘干，经HPLC法(色谱条件：Shodex Suger SH1011(8.0mmI.D×300mm)；流动相：0.005mol/L的稀硫酸溶液；流速：0.6mL/min；检测器：示差检测器；柱温：50oC；进样量：10μL)测定，葡萄糖和木糖在原料中的含量分别为68％和24％。取经前述获得的经NaOH预处理24小时后的小麦秸秆，加水配制成50g/L浓度，加入实施例2制备的嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412所产酶制剂1mL酶液/g秸秆，酶解温度60℃，pH为5.0，酶解12小时后取样测定。经HPLC分析，酶解液中葡萄糖和木糖对原料中葡萄糖和木糖的得率分别为90％和70％。

Claims (12)

1.嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412，其保藏编号为CGMCC No.11334。
2.权利要求1的嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412用于生产纤维素酶和/或木聚糖酶的用途。
3.一种制备纤维素酶和/或木聚糖酶的方法，该方法使用权利要求1的嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412制备纤维素酶和/或木聚糖酶。
4.权利要求3的制备方法，该方法包括使用权利要求1的嗜热子囊菌株(Thermoascus aurantiacus)UJS1412进行液体发酵的步骤，
优选地，液体发酵的温度为40～50℃，例如40～45℃；
优选地，发酵时间为4～8天，例如4～7天，例如5天、6天或7天；
优选地，发酵时的初始pH值为4.5～6.0，例如4.8、5.0、5.5或5.8。
5.权利要求4的制备方法，其特征在于，发酵所用的碳源选自葡萄糖、麸皮、微晶纤维素、淀粉、羧甲基纤维素(CMC)、果糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖，优选以麸皮和/或微晶纤维素为碳源；发酵所用的氮源选自蛋白胨(例如胰蛋白胨、小麦蛋白胨、鱼粉蛋白胨)、牛肉膏、NH4Cl、尿素、(NH4)2SO4、酵母膏、玉米浆和NaNO3为氮源，优选以蛋白胨为氮源，
优选在发酵时，将碳源和碳源加水配制成液体，另外添加KH2PO4、CaCl2、MgSO4、吐温-80等营养物质。
6.权利要求5的制备方法，其特征在于，以麸皮和/或微晶纤维素为碳源，以蛋白胨为氮源，将其加水配制成浓度分别为3～30g/L，5～50g/L和0.5～5g/L的液体，另外添加KH2PO40.3～3g/L，CaCl20.1～0.5g/L、MgSO40.1～0.8g/L，吐温-800.1～1％(v/v)。
7.一种纤维素酶和/或木聚糖酶制剂，其酶解温度为40℃～80℃(例如40℃～70℃，40℃～65℃，40℃～60℃,45℃～60℃,48℃～60℃，50℃～60℃,51℃～60℃，52℃～60℃，53℃～60℃，54℃～60℃或55℃～60℃)。
8.权利要求7的纤维素酶和/或木聚糖酶制剂，其酶解pH为4～5.5(例如4～5，4～5.1，4～5.2，4～5.3或4～5.4)。
9.权利要求7或8的纤维素酶和/或木聚糖酶制剂，其特征在于以下i)至iv)中的一项或多项：
i)纸酶活为2～12U/mL；
ii)CMC酶活为12～25U/mL；
iii)木聚糖酶活为50～280U/mL；
iv)该酶制剂由权利要求1所述的嗜热子囊菌株(Thermoascusaurantiacus)UJS1412经液体发酵制备得到，或者由权利要求3至6任一项所述的制备维素酶和/或木聚糖酶的方法制备得到。
10.权利要求7至9任一项所述的纤维素酶和/或木聚糖酶制剂在降解木质纤维素(例如小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆等)中的用途。
11.一种降解木质纤维素(例如小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆等)的方法，该方法采用权利要求7至9任一项所述的纤维素酶和/或木聚糖酶制剂催化降解木质纤维素。
12.权利要求11的降解木质纤维的方法，包括以下步骤：
1)预处理：用NaOH溶液(例如0.8～1.5mol/L，优选为1mol/L)预处理木质纤维素(例如小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆等)，洗涤至中性烘干；
2)将预处理后的木质纤维素配制成溶液(优选浓度为10～50g/L)，，加入所述的纤维素酶和/或木聚糖酶制剂进行酶解反应，
优选地，所述的纤维素酶和/或木聚糖酶制剂添加量为0.1～1mL酶液/g秸秆；
优选地，酶解温度为40℃～80℃(例如40℃～70℃，40℃～65℃，40℃～60℃,45℃～60℃,48℃～60℃，50℃～60℃,51℃～60℃，52℃～60℃，53℃～60℃，54℃～60℃或55℃～60℃)；
优选地，酶解pH为4.0～5.5(例如4～5，4～5.1，4～5.2，4～5.3或4～5.4)；
优选地，酶解时间为6～24小时。
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