CN106987572B - 一种厌氧发酵玉米秸秆生产木聚糖酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种厌氧发酵玉米秸秆生产木聚糖酶的方法。该方法中使用的发酵菌剂是从青藏高原的天祝南泥湾牧场全放牧牦牛瘤胃液中分离的自然共存的厌氧真菌和反刍兽甲烷短杆菌共培养物（PiromycesYak TZ+M.ruminantium），该共培养物该在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12952。以该共培养物为菌剂对玉米秸秆进行厌氧发酵可以高效生产木聚糖酶，7天培养期内共培养物降解玉米秸秆产生木聚糖酶酶活性高达6905 mU，且发酵时间短，发酵工艺简便，具有广阔的应用开发前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术可再生能源领域，具体为一种厌氧发酵玉米秸秆生产木聚糖酶的方法。
背景技术
玉米是我国的主要粮食作物，播种面积广泛，每年伴随产生的秸秆数量也是非常巨大的。目前我国农村的大量玉米秸秆资源完全处于高消耗、高污染、低利用率、低产出状况，玉米秸秆作为能源物质没有得到合理开发利用。通过厌氧消化处理可将玉米秸秆进行资源再生，但现有的厌氧消化技术存在技术效率低，推广难度大的问题。
木聚糖酶系是一类降解木聚糖的酶系，可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素。木聚糖酶可以应用在酿造、饲料工业中。木聚糖酶可以分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料用粮中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，并因而更易取可溶性脂类成分。木聚糖酶可以将饲料的非淀粉多糖（NSPS）分解成较小聚合度的低聚木糖，从而改善饲料性能，消除或降低非淀粉多糖在动物肠胃中因粘度较大而引起的抗营养作用同时它可以破坏植物细胞壁的结构，提高内源性消化酶的活性，提高饲料养分的利用。另外，木聚糖酶在造纸、食品和纺织等行业中的应用也较为广泛。
通过厌氧发酵玉米秸秆生产木聚糖酶，其难点主要集中在木质纤维素的水解过程。常见的预处理木质纤维素方法有机械法、热处理法、化学处理，这些都能有效的促进厌氧消化，但这些预处理方法成本高，不环保。普通的微生物处理也存在较多缺陷，单一微生物处理效果不好，人工构件的复合菌群效果也不理想，各菌种间存在相互拮抗的表现，导致预处理时间长，转化效率低，目前尚未有完备的方案进行玉米秸秆的厌氧发酵来生产木聚糖酶。
发明内容
本发明的目的是客服上述技术的不足，提出一种厌氧发酵玉米秸秆生产木聚糖酶的方法。
本发明中厌氧发酵使用的菌种，是从青藏高原天祝牧场全放牧牦牛瘤胃内容物中分离的自然共存的厌氧真菌和反刍兽甲烷短杆菌共培养物，PiromycesYak TZ+M. ruminantium。该共培养物保藏在中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.12952，保藏日期为2016年11月25日，分类命名为：“一株厌氧真菌Piromyces与反刍兽甲烷短杆菌（Methenobrevibacter ruminantium）的共培养物”。
本发明提供的方法，具体包括如下步骤：
（1）PiromycesYak TZ+M. ruminantium共培养物菌剂的制备
将PiromycesYak TZ+M. ruminantium共培养物菌液以10 %（v/v）接种量接种到厌氧培养基中，加入1%（w/v）干燥粉碎的小麦秸秆作为底物，同时加入复合抗生素传代培养，置39℃厌氧培养72h即得到高活力菌剂。
厌氧培养基配方：酵母膏 1.0 g，蛋白胨 1.0 g，NaHCO3 7.0 g，刃天青 (1.0 g/L) 1 mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7 g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃ 离心20 min后的上清170 mL，盐溶液 I 165 mL，盐溶液 II 165 mL，蒸馏水定容至1000 mL。
盐溶液 I 包括 NaCl 6 g，(NH4)2SO4 3 g ，KH2PO4 3 g ，CaCl2·2H2O 0.4 g，MgSO4·2H2O 0.6 g，蒸馏水定容至1000 mL。
盐溶液 II 包括4 gK2HPO4，蒸馏水定容至1000 mL。
加入秸秆底物后除氧。高温高压灭菌。
作为优选，复合抗生素为青霉素钠和硫酸链霉素，在厌氧培养基的终浓度分别为1600 IU/mL和2000 IU/mL。
（2）玉米秸秆发酵生产木聚糖酶
吸取步骤（1）制备的菌剂，按10%（v/v）接种量接入以1%（w/v）玉米秸秆为底物的与步骤（1）相同的厌氧培养基中，同时加入复合抗生素，39℃厌氧培养7天。
作为优选，复合抗生素为青霉素钠和硫酸链霉素，在厌氧培养基的终浓度分别为1600 IU/mL和2000 IU/mL。
本发明中采用的厌氧真菌和反刍兽甲烷短杆菌共培养物PiromycesYak TZ+M. ruminantium是从牦牛瘤胃中分离获得的，长期的自然选择和进化使牦牛瘤胃成为一个高效木质纤维素降解酶系统，与人为混合的厌氧真菌和甲烷菌共培养物相比，牦牛瘤胃自然存在的厌氧真菌和甲烷菌共培养物具有独特优势和高效的木质纤维素降解能力。采用PiromycesYak TZ+M. ruminantium发酵玉米秸秆，7天厌氧培养期内产木聚糖酶活性可达到6905 mU。
在发酵过程中添加复合抗生素，可防止共培养物体系不受细菌污染，提高厌氧发酵效率。同时，本发明中采用的共培养物可以通过保藏在体外存活传代，发酵玉米秸秆可产生高活性木聚糖酶，且发酵工艺简单，对设备要求低，便于推广，在工业领域具有重要工业应用价值和开发前景。
通过天祝放牧牦牛瘤胃厌氧真菌和产甲烷菌共培养物厌氧发酵玉米秸秆可产生高活性木聚糖酶，可进一步提高玉米秸秆的使用率，显著提高经济效益。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的培养基如下：
厌氧培养基配方：酵母膏 1.0 g，蛋白胨 1.0 g，NaHCO3 7.0 g，刃天青 (1.0 g/L)1 mL，L-半胱氨酸盐酸盐 1.7 g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃ 离心20 min后的上清170mL，盐溶液I 165 mL，盐溶液II 165 mL，蒸馏水定容至1000 mL。
盐溶液I 包括 NaCl 6 g，(NH4)2SO4 3 g ，KH2PO4 3 g ，CaCl2·2H2O 0.4 g，MgSO4·2H2O 0.6 g，蒸馏水定容至1000 mL。
盐溶液 II 包括 4 gK2HPO4，蒸馏水定容至1000 mL。
加入秸秆底物后除氧。高温高压灭菌。
实施例一、PiromycesYak TZ+M. ruminantium菌剂的制备。
吸取1mL PiromycesYak TZ+M. ruminantium共培养物接种到20 mL体积的亨氏厌氧管中的9 mL以风干粉碎的小麦秸秆为底物的厌氧培养基中，同时加入复合抗生素，使其在厌氧培养基溶液的终浓度为青霉素1600 IU/mL和硫酸链霉素2000 IU/mL。39℃厌氧培养72h，即达到生长高峰，此时发酵液为高活力菌剂。
实施例二、厌氧发酵玉米秸秆生产木聚糖酶。
在100 mL体积厌氧发酵瓶中盛45 mL液体基本培养基，以0.5 g粉碎风干后的玉米秸秆为底物。除氧。灭菌。把传代培养72 h 的PiromycesYak TZ+M. ruminantium共培养物用无菌注射器吸取5 mL接种到上述加有玉米秸秆的厌氧培养基中，同时加入复合抗生素，使其在厌氧培养基溶液的终浓度为青霉素1600 IU/mL和硫酸链霉素2000 IU/mL，39 °C厌氧培养7天。
将共培养物的发酵液1000×g离心10 min，取上清液作为粗酶液，采用分光光度计用DNS法测定木聚糖酶酶活性。具体方法如下：稀释的粗酶液（稀释至OD值大约在0.2-0.8范围）、底物10 g/L桦木木聚糖 （SigmaX-0502）和50 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.8）置39°C预热15min，750 mL粗酶液中加入750 mL 磷酸钠缓冲液和500 mL底物，39°C反应15 min后，加入3000 mL DNS终止反应。沸水浴5 min后冷却至室温，取2000 mL于比色皿中，在540 nm下检测吸光值。根据木糖的标准曲线计算木聚糖酶活性。
1个酶活力单位（U）是指在以上所述酶促反应条件下，1 mL酶液在1 min 内自标准底物中释放1 µmol葡萄糖所需的酶量。
测定结果显示，玉米秸秆通过PiromycesYak TZ+M. ruminantium共培养物厌氧发酵7d后，其发酵液的木聚糖酶酶活性为6905 mU。
综上可知，本发明提供的方法，即采用天祝放牧牦牛瘤胃自然共培养物PiromycesYak TZ+M. ruminantium厌氧发酵玉米秸秆可产生大量高活性木聚糖酶，其酶活性高达6905 mU，具有重要的工业应用价值。
<110> 甘肃省科学院生物研究所
<120> 一种厌氧发酵玉米秸秆生产木聚糖酶的方法
<160> 2
<210> 1
<211> 394
<212> DNA
<213> Piromyces Yak TZ
<400> 1
gtaccgattg aatggcttag tgaatccttc ggattggcta tttttttctg gcaacagaat 60
taaactgcta aaaagttggg caaacttggt catttagagg aagtaaaagt cgtaacaagg 120
tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat taaaaaattg gagtgccgtt gttttggtca 180
ttattaatca tcctaccctt tgtgaatttg ttttgtgtaa taattttttt tgtctatccc 240
tgaagaagta gatattactt ttttttaggg aatagatttt aataattttt tcagtgaaaa 300
gaccattttt ttaaattaaa cattggtatt catttgtcta aattgtattt ttaataatta 360
aaaacaacct ttgacaatgg atctcgcacc tact 394
<210> 2
<211> 1263
<212> DNA
<213> M.ruminantium
<400> 2
gctcagtaac acgtggataa cctaccctta ggaccgggat aaccttggga aactgaggat 60
aatactggat aggcaatttt tcctgtaatg gttctttgtt taaatgtttt ttcgcctaag 120
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ttctgacggt gagggacgaa agttaggggc gcgaaccgga ttagataccc gggtagtcct 660
aactgtaaac gatgcggact tggtgttggg gtggctttga gctgctccag tgccgaaggg 720
aagctgttaa gtccgccgcc tgggaagtac ggtcgcaaga ctgaaactta aaggaattgg 780
cgggggggca ccacaacgcg tggagcctgc ggtttaattg gattcaacgc cggacgtctc 840
accagaggcg acagctgtat gatagccagg ttgatgactt tgcttgacta gctgagagga 900
ggtgcatggc cgccgtcagc tcgtaccgtg aggcgtcctg ttaagtcagg caacgagcga 960
gacccacgcc cttagttacc agcttgtcct ttttttggat gatgggcaca ctaaggggac 1020
cgcctatgat aaataggagg aaggagtgga cgacggtagg tccgtatgcc ccgaatcctc 1080
tgggcaacac gcgggctaca atggctgaga caatgggttc cgacaccgaa aggtggaggt 1140
aatcctctaa acttagtcgt agttcggatt gaggactgta actcgttctc atgaagctgg 1200
aatgcgtagt aatcgcgtat cactattgcg cggtgaatac gtccctgctc cttgcacaca 1260
tcg 1263
Claims (2)
1.一种厌氧发酵玉米秸秆生产木聚糖酶的方法，其特征在于，厌氧发酵使用的菌种是厌氧真菌(Piromyces sp.)Yak TZ和反刍兽甲烷短杆菌(M.ruminantium)的共培养物，该共培养物在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12952。
2.根据权利要求l所述的生产木聚糖酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)共培养物菌剂的制备：以10％(v/v)接种量向以1％(w/v)小麦秸秆为底物的厌氧培养基中接入如权利要求1所述的共培养物，加入1600IU/mL青霉素钠和2000IU/mL硫酸链霉素的复合抗生素，39℃厌氧培养72h；
(2)生产木聚糖酶：吸取步骤(l)所得菌剂，以10％(v/v)接种量接入以l％(w/v)玉米秸秆为底物的厌氧培养基中，加入1600IU/mL青霉素钠和2000IU/mL硫酸链霉素的复合抗生素，39℃厌氧培养7天。
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