CN110982767A - 一个细胞融合菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一个细胞融合菌株及其应用，涉及细胞融合技术领域。本发明所述细胞融合菌株的保藏编号为CGMCC NO.19010。将所述细胞融合菌株连续传代6次后接种24h对0.4％木糖的利用率为86.04％，对木糖的利用能力显著高于两亲本菌株。利用所述细胞融合菌株发酵转化预处理后的玉米秸秆在料水比1:9、糟层4cm、温度29℃、摇床转速120rpm、发酵时间4.5d、接种量8.5％，发酵后的玉米秸秆真蛋白从4.12％提高至21.87％，粗纤维从37.53％降低至16.37％，粗脂肪从4.43％提高至6.51％，粗灰分从5.84％降低至4.23％，发酵干糟含水率为9.59％，提高了玉米秸秆的饲用价值。

Description

一个细胞融合菌株及其应用

技术领域

本发明属于细胞融合技术领域，具体涉及一个细胞融合菌株及其应用。

背景技术

光合细菌(Photosynthetic Bacteria，简称PSB)是一类能进行不产氧光合作用的原核生物，自身生长营养要求低，能以黑暗好氧、光照厌氧、发酵等多种方式生长，因此广泛分布于自然界的沼泽、江海、湖泊、土壤和水田等地。菌体营富含蛋白质(65％)、可溶性糖(20％)、脂肪(7％)还含有抗病毒物质、促生长因子、生理活性物质，且无毒害，无副作用。目前已广泛应用在处理有机废水、生物制氢、生物制药、食品工业和动物饲养领域。近年来，光合细菌用于生产单细胞蛋白饲料的研究已相继报道，邱宏端等采用酿造酱渣培养荚膜红假单胞菌，发酵后测定粗蛋白和全氨基酸成分。结果表明，粗蛋白含量提高35％以上，氨基酸总量提高20％左右，将酱渣光合细菌蛋白饲料应用于鱼苗养殖实验表明，光合菌蛋白饲料能有效提高鱼苗成活率。张健等利用用沼泽红假单胞菌发酵啤酒糟制鱼饲料，达到国家草鱼鱼种配合饲料标准。张健等采用沼泽红假单胞菌和绿色木霉双菌分步发酵白酒糟和啤酒糟混糟，达到罗非鱼鱼种饲料标准。由此可见，光合细菌在生产单细胞蛋白饲料领域具有巨大潜力。

玉米秸秆富含粗纤维(37％)、总糖(12％)，并含少量蛋白质、维生素D、脂肪和矿物质等，是一种丰富的可再生资源。但粗纤维含量高，消化率低，蛋白质含量低等原因，玉米秸秆的研究主要集中在生产沼气、堆肥、还田等方面，用做饲料的不足10％。光合细菌因其营养要求低、代谢方式多样对玉米秸秆饲料化具有潜力。但光合细菌自身不能利用玉米秸秆的第二大降解产物—木糖，极大的限制了光合细菌转化秸秆饲中的应用，因此获得能高效利用木糖的改良光合菌株对秸秆饲料化具有极为重大的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一个细胞融合菌株，显著提高对木糖的利用能力，将其应用于玉米秸秆中，提高玉米秸秆的饲用价值。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一个细胞融合菌株，所述细胞融合菌株的保藏编号为 CGMCCNO.19010。

优选的，所述细胞融合菌株以休哈塔假丝酵母和沼泽红假单胞菌为亲本菌株；所述休哈塔假丝酵母的保藏编号为CGMCC NO.24317；所述沼泽红假单胞菌的保藏编号为CGMCC NO.12349。

本发明还提供了所述细胞融合菌株在降解木糖中的应用。

本发明还提供了所述细胞融合菌株在降解玉米秸秆中的应用。

优选的，在降解所述玉米秸秆前，还包括对玉米秸秆进行预处理，所述预处理包括：将玉米秸秆利用硫酸溶液酸化1h，得酸化糟；利用氨水处理所述酸化糟2h，得氨化糟；调节pH至5.0后，利用纤维素酶处理所述氨化糟 72h；

所述硫酸溶液的质量分数为0.75％。

优选的，所述酸化时，玉米秸秆和硫酸溶液的质量比为1:5；所述酸化的温度为150℃。

优选的，所述氨化的温度为100℃。

优选的，所述纤维素酶的添加量为200U/g。

优选的，所述纤维素酶处理时的温度为50℃，在处理过程中伴随摇床震荡，所述震荡的转速为120rpm。

优选的，所述降解的温度为29℃，所述降解的时间为5d，所述降解时所述细胞融合菌株的接种体积为所述玉米秸秆体积的10％。

相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：以休哈塔假丝酵母和沼泽红假单胞菌为亲本菌株进行细胞融合，得到一个细胞融合菌株，并已完成保藏。结果表明，沼泽红假单胞菌、休哈塔假丝酵母和连续传代6次后的融合子RZZ接种24h对0.4％木糖的利用率分别为3.2％、37.36％和86.04％，融合子RZZ对木糖的利用能力显著高于两亲本菌株。将融合子发酵转化预处理后的玉米秸秆在料水比1:9、糟层4cm、温度29℃、摇床转速120rpm、发酵时间4.5d、接种量8.5％，发酵后的玉米秸秆真蛋白从4.12％提高至21.87％，粗纤维从37.53％降低至16.37％，粗脂肪从4.43％提高至6.51％，粗灰分从5.84％降低至4.23％，发酵干糟含水率为9.59％，提高了玉米秸秆的饲用价值。

附图说明

图1为响应面曲面图和相应等高线。

生物保藏信息

细胞融合菌株RZZ，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.19010；

休哈塔假丝酵母的保藏编号为CGMCC NO.24317；

所述沼泽红假单胞菌的保藏编号为CGMCC NO.12349。

具体实施方式

本发明提供了一个细胞融合菌株，所述细胞融合菌株的保藏编号为 CGMCCNO.19010。

本发明所述细胞融合菌株优选以休哈塔假丝酵母和沼泽红假单胞菌为亲本菌株；所述休哈塔假丝酵母的保藏编号为CGMCC NO.24317；所述沼泽红假单胞菌的保藏编号为CGMCC NO.12349。本发明所述亲本菌株优选购自于CGMCC。本发明所述融合菌的制备方法优选为原生质体融合。本发明对所述原生质体融合的方法并没有特殊限定，优选的包括原生质体制备、原生质体融合和遗传稳定性实验。本发明对所述原生质体制备、原生质体融合和遗传稳定性实验的方法并没有特殊限定，优选的参照王怡平等的方法制备光合细菌原生质体，参照王玉水等的方法进行原生质体融合，用影印法进行遗传稳定性实验。

本发明还提供了所述细胞融合菌株在降解木糖中的应用。

在本发明中将所述细胞融合菌株以1％的接种量接入100mL含有以木糖为唯一碳源的培养液中培养，测定接种0h、24h、48h、72h后培养液中木糖含量变化，结果显示，所述细胞融合菌株对木糖利用率为86.04％，72h后利用率为92％。可见所述细胞融合菌株对木糖的利用能力显著提高，具有高效利用木糖的能力。

本发明还提供了所述细胞融合菌株在降解玉米秸秆中的应用。

本发明所述应用中，在降解所述玉米秸秆前，优选还包括对玉米秸秆进行预处理，所述预处理包括：将玉米秸秆利用硫酸溶液酸化1h，得酸化糟；利用氨水处理所述酸化糟2h，得氨化糟；调节所述氨化糟pH至5.0后，利用纤维素酶处理所述氨化糟72h；所述硫酸溶液的质量分数为0.75％。

本发明所述酸化时，玉米秸秆和硫酸溶液的体积比优选为1:5；所述酸化的温度优选为150℃。本发明所述氨化处理的温度优选为100℃。本发明所述纤维素酶的添加量优选为200U/g。本发明所述纤维素酶处理时的温度优选为50℃，在处理过程中伴随摇床震荡，所述震荡的转速优选为120rpm。

本发明利用所述细胞融合菌株降解预处理后的玉米秸秆，所述降解的温度优选为29℃，所述降解的时间优选为4.5d，所述降解时所述细胞融合菌株的接种体积优选为所述玉米秸秆体积的8.5％。

下面结合实施例对本发明提供的一个细胞融合菌株及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.1菌种与原料

菌种：沼泽红假单胞菌，休哈塔假丝酵母均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心编号分别为CGMCC NO.12349，CGMCC NO.24317。

原料：采集四川宜宾南溪区收获玉米籽实后的玉米秸秆，就地粉碎至 5～8cm，在85℃恒温鼓风干燥箱中烘干至水分10％以下，再用多功能粉碎机粉碎过40目筛。

1.2主要仪器与试剂

F800型纤维测定仪；SOX500型脂肪测定仪，海能仪器；Kjeltec 8400 型凯氏定氮仪，FOSS。溶菌酶、蜗牛酶

1.3主要培养基

光合菌种子培养基(g/L)：NaHCO₃ 1.0，KH₂PO₄ 1.0，Na₂SO₃ 0.1， MgSO₄·7H₂O0.01，CaCl₂ 0.0005，FeSO₄·7H₂O 0.001，NH₄Cl 1.0，酵母膏1.0，蛋白胨1.0，乙酸钠5.0，pH值为7.0；

酵母基础培养基：葡萄糖1％、酵母膏0.5％、蛋白胨1％，pH5.0；

高渗再生培养基：固体基础培养基+17％蔗糖。培养基使用前121℃湿热灭菌20min。

选择培养基：高渗再生培养基+链霉素或制霉菌素各100U/mL，链霉素和制霉菌素用蒸馏水配成10000U/mL的溶液，抽滤除菌后加入灭菌后的高渗再生培养基中。

1.4细胞融合

1)原生质体制备。光合细菌原生质体制备参照王怡平等；休哈塔假丝酵母原生质体制备。将休哈塔假丝酵母接种于酵母基础培养基中，30℃，120rpm 培养培养至细菌对数生长期，移取1mL菌液于离心管中，5000r/min，离心 5min用无菌水洗涤菌体2次后，以山梨醇、巯基乙醇、EDTA以及蜗牛酶浓度和酶反应时间为可变相，三次重复实验，探讨其对于原生质体制备的影响，分别设置为：山梨醇(0.5％、1％、1.5％)、巯基乙醇(0.1、0.2、0.3)30℃、 EDTA(0.1％、0.3％、0.5％)处理30min，5000r/min离心5min收集菌体沉淀，蜗牛酶浓度(0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL)和酶反应时间(30min、 40min、50min)。离心后用无菌水洗涤2次后，将原生质体重新悬浮于SMM 冲液中，涂布平板，计算原生质体形成率、再生率计算如下，结果如表1所示。

A：未经酶处理的菌液在固体基础培养基平板上，28℃培养3d生长的菌落数；

B：经酶处理后的菌液在固体基础培养基平板上，28℃培养3d生长的菌落数；

C：经酶处理后的菌液在高渗再生培养基平板上，28℃培养3d生长的菌落数；

表1休哈塔假丝酵母原生质体形成率、再生率影响因素

注：k为各水平平均值，R为各水平平均值极差

可见，影响休哈他假丝酵母原生质体形成率的因素顺序为巯基乙醇浓度 (2.96)>山梨醇浓度(2.21)>EDTA浓度(1.93)>作用时间(1.02)>蜗牛酶浓度(0.82)，影响休哈他假丝酵母原生质体再生率的因素顺序为巯基乙醇浓度 (3.09)>EDTA浓度(1.37)>蜗牛酶浓度(0.85)>山梨醇浓度(0.37)>反应时间 (0.22)。可以看出，巯基乙醇浓度对休哈他假丝酵母的原生质体的形成率的影响居首位，山梨醇浓度居第二位。而对休哈他原生质体再生率的影响中巯基乙醇浓度仍居首位，EDTA浓度居第二位，巯基乙醇浓度其原生质体形成与再生有重要影响。

2)原生质体融合。原生质体融合方法参照王玉水等，将融合后的菌液涂布平板，培养1～3天后统计菌落，融合率计算为：融合率＝MS2上的菌落数 /MS1上的菌落数*10^-6。结果如表2所示：

表2光合细菌与休哈塔假丝酵母原生质体融合率正交实验结果

注：k为各水平平均值，R为各水平平均值的极差

根据表2中各因素对休哈塔假丝酵母与光合菌融合率的各水平均值和极差分析表明，影响光合细菌和休哈他假丝酵母双亲原生质体融合率的因素顺序为Ga⁺浓度(3.02)>PEG₆₀₀(2.45)>作用时间(2.15)>反应温度(0.59)。因此适当的的Ga⁺浓度可以显著地提高双亲原生质体融合率。根据中各因素原生质体融合率平均值所对应的水平，双亲的最佳融合条件是：Ca²⁺浓度为 30mmol/L，PEG浓度为35％，融合时间为15min，温度为20℃。以上述条件进行双亲原生质体融合，测得融合率为8.6×10^-6。

3)遗传稳定性试验。将筛选得到的融合子，用影印法在含有链霉素或制霉菌素的选择培养基上交替连续传代6次后获得遗传稳定的融合子，甘油管保藏备用。

实施例2

融合子木糖利用能力测定

将实施例1中保存的菌株按1％的接种量接入100mL含有以木糖为唯一碳源的培养液中培养，测定接种0h、24h、48h、72h后培养液中木糖含量变化。结果如表3所示

表3融合子对木糖利用能力测定结果

注：RZZ为融合子；YZZ为沼泽红假单胞菌；XHT为休哈塔假丝酵母

由表3可以看出，三株菌接种24h后测定培养液木糖浓度结果显示，沼泽红假单胞菌、休哈塔假丝酵母和融合子对木糖利用率分别为3.2％、37.36％和86.04％，72h后利用率分别为31％、83.19％和92％。融合子RZZ对木糖的利用能力显著提高，比沼泽红假单胞菌提高了196.84％，比休哈他假丝酵母提高10.59％。综上所述，经融合后的菌株RZZ对木糖的利用能力高于两亲本菌株，具有高效利用木糖的能力。

实施例3

发酵转化秸秆及工艺优化

1)秸秆预处理。称取100g玉米秸秆于1L的烧杯中用0.75％稀硫酸调整固液比为，1:5后转至在1.5L不锈钢管式反应器中150℃酸化1h，得酸化糟，待温度和压力下降后开盖，加入10mL氨水100℃处理2h，得氨化糟，加 0.8％(v/v)氨水调节pH到5.0，加纤维素酶至200U/g物料，50℃，120rpm 摇床水解72小时。

2)发酵剂制备。采用三级培养工艺将实施例1保存的菌株后按80％接种量接种于酶处理糟中，28℃培养5d，为一级培养。以50％一级培养液接种量接种于酶处理糟中，培养条件不变，为二级培养，以二级培养液20％接种于酶处理糟中为三级培养，以三级培养液作为发酵剂。

3)接种发酵。酶处理糟按一定接种量接种诱变菌株发酵剂，加入无菌水，控制一定的料水比，在适宜的温度、摇床转速、糟层厚度等条件下发酵数天，每日用0.8％(v/v)调整pH为7。发酵后烘干测定其指标。

4)工艺优化。以温度、发酵时间、接种量、糟层厚度、摇床转速、料水比，起始pH为影响发酵的7个因子，根据Plackett-Burman设计法进行显著效应因子筛选。以最陡爬坡试验设计确定显著效应因子的中心点，后以此中心点进行中心组合设计(Central CompositeDesign)的响应曲面分析。将得到的融合子发酵转化玉米秸秆的优化条件进行验证，分析发酵糟中粗蛋白、真蛋白、粗纤维、粗脂肪、灰分和水分共六项指标：

根据Plackett-Burman法以温度、发酵时间、接种量、糟层厚度、摇床转速、料水比，起始pH为影响发酵的因子，设计试验，结果如表4所示。

表4 Plackett-Burman法因子设计及结果

鉴于在Plackett-Burman法试验中发酵温度、发酵时间、料水比(秸秆g：蒸馏水g)、接种量四个因素具有显著性(P＜0.05)，因此采用这四个因素预爬坡后做最陡爬坡配组设计。结果如表5所示，当发酵温度为30℃、发酵时间为5d、料水比为10、接种量为9％时，融合子发酵联合处理玉米秸秆后发酵糟中真蛋白含量显著提升(P＜0.05)，因此，这四个因素分别取30℃、5d、 10、9％做为中心点进一步做中心组合设计(Central Composite Design)。

表5最陡爬坡试验设计及结果

中心组合试验设计的结果如表6所示：

表6中心组合试验设计及结果

上式中，Y—真蛋白含量(％)；A—发酵温度(℃)；B—发酵时间(d)；C—料水比(玉米秸秆g/水g)；D—接种量。该模型显著性P(prob＞F)为0.0038＜ 0.05，失拟项P(prob＞F)为0.0654＞0.05不显著，因此方程具有显著意义，可做为响应值的预测。另外，通过方差分析，方程中A2、B²、C²、D²各项具有显著性(P＜0.05)，而其余项不显著。

响应面曲面图与相应等高线如图1所示，当发酵温度A、发酵时间B、料水比C与接种量D在考察水平范围内，可使响应面出现“兜底”。通过对方程优化，得到最佳条件为29℃、发酵4.5d、料水比值9.5、接种量8.5，重新进行融合子发酵，实际发酵干糟的真蛋白含量为(24.19±0.5)％，均值比预测值低。但若考虑预测值的相对偏差，这种差别实际上无显著意义(P＜0. 1)。另外，鉴于在建模过程中未考虑各项因素严重的交互作用，因此也可能造成实测值与预测值之间的差别。

将玉米秸秆经过预处理后，利用所述的融合细胞菌及相应的最适条件进行发酵，同时设置对比例，具体如表7所示：

表7预处理前后秸秆和不同发酵糟物质含量分析

由表7可知，稀酸-氨化联合预处理前后玉米秸秆中真蛋白、粗脂肪和水分无明显变化，因在0.75％的稀硫酸、150℃、1h酸化条件下，秸秆纤维结构被破坏，秸秆中超过80％半纤维素，少量纤维素和木质素降解会成葡萄糖、木糖等物质，后又加酶水解使大量纤维素降解。所以处理后粗纤维从 37.32％下降为16.56％。因预处理过程中加有氨水氨化，所以预处理后的粗蛋白含量由7.02％提升为11.31％。原菌种和融合子发酵后粗蛋白含量相较预处理前分别上升14.29％和26.56％，真蛋白分别上升10.33％和19.17％，粗脂肪分别上升0.56％和1.58％，灰分分别下降0.69％和0.74％，80℃烘干后含水率分别为9.83％和9.87％。综上，融合子发酵后玉米秸秆的真蛋白较原菌株提高8.84％，粗脂肪提升1.02％，粗纤维下降1.62％，灰分降低0.05％。综上所述，融合细胞菌RZZ发酵转化玉米秸秆生产单细胞蛋白饲料的能力显著优于原菌株，显著提升了真蛋白和粗蛋白的含量，提高了玉米秸秆的利用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一个细胞融合菌株，其特征在于，所述细胞融合菌株的保藏编号为CGMCC NO.19010。

2.根据权利要求1所述细胞融合菌株，其特征在于，所述细胞融合菌株以休哈塔假丝酵母和沼泽红假单胞菌为亲本菌株；所述休哈塔假丝酵母的保藏编号为CGMCC NO.24317；所述沼泽红假单胞菌的保藏编号为CGMCC NO.12349。

3.权利要求1或2所述细胞融合菌株在降解木糖中的应用。

4.权利要求1或2所述细胞融合菌株在降解玉米秸秆中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，在降解所述玉米秸秆前，还包括对玉米秸秆进行预处理，所述预处理包括：将玉米秸秆利用硫酸溶液酸化1h，得酸化糟；利用氨水处理所述酸化糟2h，得氨化糟；调节所述氨化糟的pH值至5.0后，利用纤维素酶处理所述氨化糟72h；

所述硫酸溶液的质量分数为0.75％。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述酸化时，玉米秸秆和硫酸溶液的质量比为1:5；所述酸化的温度为150℃。

7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述氨化处理的温度为100℃。

8.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述纤维素酶的添加量为200U/g。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述纤维素酶处理时的温度为50℃，在处理过程中伴随摇床震荡，所述震荡的转速为120rpm。

10.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述降解的温度为29℃，所述降解的时间为4.5d，所述降解时所述细胞融合菌株的接种体积为所述玉米秸秆体积的8.5％。

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