CN110938575A - 一株高效降解纤维菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株高效降解纤维菌株及其应用，它涉及微生物领域，本发明解决当前秸秆等农业废弃物难以降解的问题，本发明菌株为远青链霉菌(Streptomyces azureus)T23‑B，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年10月14日，保藏编号为：CGMCC No.18680。该菌株具有高降解纤维素的能力，产纤维素酶能力强，能够实现秸秆等农业废弃物的处理。本发明应用于纤维素降解领域。

Description

一株高效降解纤维菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株高效降解纤维素的微生物菌株及其应用。
背景技术
中国的耕种面积达到全球的7％，所产生的以玉米秸秆为主的各种农作物秸秆的产量当前已经达到7亿吨左右。对于秸秆等农业废弃物的处理方式有很多，当前可以用作饲料的制作，用作燃料，还有造纸等技术，但由于技术受限或运输困难等原因，大部分的秸秆等农业废弃物的处理仍然是焚烧的方式。这种方式的处理已经成为空气质量破坏的主要原因之一，不仅对环境造成污染，也是一种严重的资源浪费，因此对于秸秆及农业废弃物的环保利用已经刻不容缓。
秸秆等农业废弃物中大多含有高纤维素，半纤维素等，当前资源危机现象普遍，因此秸秆等农业废弃物也作为一种待加工的自然资源等待人们深度开发。因此将秸秆等农业废弃物进行发酵降解腐熟，使之成为可利用的肥料，不仅可以避免不正当的处理方式造成的环境污染问题，还能使得资源再利用，具有一定的生态效益和经济效益。
发明内容
本发明为了解决当前秸秆等农业废弃物难以降解的问题，提供一株干校讲解纤维素的微生物菌株及其应用。
本发明的一株高效降解纤维菌株，它为远青链霉菌(Streptomyces azureus)T23-B，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年10月14日，保藏编号为：CGMCC No.18680。
该菌株用于纤维素降解。
本发明的远青链霉菌(Streptomyces azureus)T23-B在稻秆粉培养基上培养后菌株的形态特征为：白色，圆形，表面突起，无光泽，具有土腥气味(如图1所示)。
本发明的菌株T23-B，该菌株具有高降解纤维素的能力，产纤维素酶能力强，能够实现秸秆等农业废弃物的处理，解决纤维素降解难的问题使得资源得以充分利用，通过生物学手段解决环境污染及资源利用的问题，降低处理秸秆等农作物的成本，其降解还田能够增加土壤肥力，提高农作物质量和产量，兼具经济生态双效益。
附图说明
图1为本发明菌株的菌落形态图；
图2为本发明菌株的系统发育树图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一株高效降解纤维菌株，它为远青链霉菌(Streptomyces azureus)T23-B，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年10月14日，保藏编号为：CGMCC No.18680。
本实施方式所述菌株通过腐烂树叶下的土壤中筛选分离得到，具体过程如下：
取来自哈尔滨市世界之窗公园的新鲜土壤8g，放入3g秸秆粉，加入100mL蒸馏水，在转速为160r/min条件下，振荡10天进行富集。取富集后的溶液1mL进行稀释，取10-3，10-4，10-5，10-6四个梯度的稀释液0.1mL，涂布在稻秆粉培养基中，在37℃条件下，培养2天，挑单菌落，反复划线纯化培养。
其中，上述稻秆粉培养基的配方为：磷酸二氢钾1g/L，七水合硫酸镁0.4g/L，氯化钙0.1g/L，氯化铁0.01g/L，氯化钠0.2g/L，硫酸铵3g/L，稻秆粉20g/L，琼脂18g/L。
本实施方式将上述分离纯化的单菌落挑至CMC-刚果红培养基上，测定降解纤维素能力，并测定纤维素酶活，将降解纤维素能力做好的菌株命名为T23-B。
本实施方式对菌株T23-B进行纤维素酶活力测定，测定方法为GB 20287-2006农用微生物菌剂，测得菌株T23-B培养4天后的发酵液的纤维素酶活为186.2U/mL。
本实施方式将分离得到的菌株提取总DNA后，进行PCR扩增，将扩增后的序列提交至GenBank进行序列比对，发现与Streptomyces azureus strain ATCC 14921的相似度达99％。另结合生理生化鉴定结果，最终确定T23-B为远青链霉菌(Streptomyces azureus)。
本实施方式得到的菌株T23-B通过提交GenBank后，构建系统发育树，如图2所示。
本实施方式提供了所述菌株T23-B的发酵培养方法，具体为：摇床培养法：从纯化好的平板中挑取菌落，接种到发酵培养基中，在37℃的条件下，120r/min振荡培养72h。
其中，所述发酵培养基配方为：磷酸二氢钾1g/L，七水合硫酸镁0.4g/L，氯化钙0.1g/L，氯化铁0.01g/L，氯化钠0.2g/L，硫酸铵3g/L。
本实施方式提供了所述菌株T23-B发酵液在纤维素降解中的应用。本发明所述菌株T23-B，及其发酵培养液可应用于秸秆等废弃农作物的降解中，能够加速其纤维素的降解，为农业、环境等多方面提供巨大帮助。
所述应用可为制备腐熟剂菌剂的应用。具体为：利用所述菌株进行扩培，并接种到发酵液中进行扩培，发育到最优生长曲线(即72h达对数生长期，得到最佳培养时间为72h，有效活菌数达到8.2cfu/ml)时，与载体进行混合，制备成物料腐熟剂。
前述腐熟菌剂制备过程中，所述载体为食用菌菌糠，载体经过研磨，过30目筛，并于121℃灭菌30min，于105℃烘箱中烘干备用。
所述应用制备方法为：发酵培养液与载体按照5：1比例混匀，添加4％保护剂(海藻糖)，与35℃烘干备用。
所述应用腐熟菌剂制备完成后，测得其含水率为15％，远青链霉菌T23-B有效活菌数为3.2×109cfu/g，纤维素酶活≥60U/g。
所述应用主要针对富含纤维素的物料进行降解。
可选的，所述富含纤维素的物料为玉米秸秆、水稻秸秆、枯枝落叶等农业废弃物，其新鲜含水率在20-30％。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述菌株T23-B的发酵培养方法为摇床培养方法：以体积百分含量为5％的接种量将菌株T23-B接种到发酵培养基中，在37℃，120r/min振荡培养72h。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述发酵培养基的配方为：磷酸二氢钾1g/L，七水合硫酸镁0.4g/L，氯化钙0.1g/L，氯化铁0.01g/L，氯化钠0.2g/L，硫酸铵3g/L，稻秆粉20g/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：采用含有所述菌株T23-B制备发酵液或培养液。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式一株高效降解纤维菌株的应用，它在纤维素降解的应用。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是：所述菌株T23-B扩繁的菌种或所述菌株T23-B制得的发酵液或培养液，与微生物菌剂载体混合，制备有机物料腐熟剂，对农业废物进行处理。其它与具体实施方式五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式五不同的是：所述微生物菌剂载体的水分≤15％，有机质≥60％，养分3～5％，载体负载量200～210g/L。其它与具体实施方式五相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式五不同的是：所述微生物菌剂载体的制备方法为将木耳食用菌菌糠载体机械粉碎，过30目筛，121℃灭菌30min，105℃烘干备用，并接种权利要求1所述的菌株，将菌液与木耳食用菌菌糠载体混匀，35℃烘干备用，得到微生物菌剂载体。其它与具体实施方式五相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式五不同的是：所述的制备有机物料腐熟剂对农业废物进行处理：将所述有机物料腐熟剂以质量比为0.3％的比例添加到农业废弃物中，混合均匀，调节水分含量在55％～65％，腐熟7～10天。其它与具体实施方式五相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式五不同的是：农业废弃物为含纤维素的农业废弃物。其它与具体实施方式五相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式五不同的是：农业废弃物为秸秆或杂草、落叶、果实外壳以及树枝。其它与具体实施方式五相同。
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是一下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用到的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例用于说明利用本发明所提供的远青链霉菌菌株如何让制备发酵培养液。
1.原料
固体培养基：磷酸二氢钾1g/L，七水合硫酸镁0.4g/L，氯化钙0.1g/L，氯化铁0.01g/L，氯化钠0.2g/L，硫酸铵3g/L，稻秆粉20g/L，琼脂18g/L。
发酵培养液：CMC-Na 0.5g/100mL，蛋白胨0.3g/100mL，硫酸铵0.2g/100mL，磷酸二氢钾0.4g/100mL，氯化钙0.03g/100mL，硫酸镁0.03g/100mL，Tween-80 0.02g/100mL。
2.制备方法
从固体培养基平板上挑取菌株，接种到发酵培养液中，100mL发酵培养基于250mL三角瓶中，于37℃，120r/min振荡培养4天。
3.纤维素酶活的测定
(1)酶液的制备
将本发明的远青链霉菌(Streptomyces azureus)T23-B菌种接种于液体发酵培养基中(接种量为5％)，在37℃下，120r/min振荡培养4天，将培养好的发酵液底物放入离心管中，配平，4500r/min，离心10min。取上清液，所得为酶液。
(2)标准曲线的绘制
葡萄糖标准曲线：取25mL刻度管7支，分别向其中吸取葡萄糖标准液0、0.2、0.6、1.4、1.8、2.0mL，再向七支刻度管中加入蒸馏水至2mL。再向各管中加入2mL DNS(二硝基水杨酸)，于沸水中水浴5min。取出后冷却，冷却至室温后用蒸馏水稀释定容至25mL，振荡混匀后用分光光度计再540nm下进行比色，记录吸光度，绘制标准曲线，横坐标为葡萄糖含量，纵坐标为吸光度值。
(3)样品纤维素酶活的测定
取25mL刻度管，加入经适当稀释(初步测定吸光度值，测得吸光度值大于1则继续稀释，稀释到测得吸光度值为1以内的数值时不必继续稀释)后的步骤(1)酶液0.5mL，并加入1mL 1％的CMC-Na缓冲液，于50℃保温30min，然后向其中加入2mL DNS(二硝基水杨酸)，于沸水浴中5min，取出后冷却，用蒸馏水定容至25mL，而后在540nm下，用分光光度计进行比色，测定形成的还原糖(测得吸光度值为0.782)。
(4)试剂
葡萄糖标准溶液(1mg/mL)：准确称取0.100g葡萄糖荣誉少量蒸馏水中，定容至100mL。
DNS：准确称取10.0g 3,5二硝基水杨酸溶于少量蒸馏水中，加入20.0g氢氧化钠、200.0g酒石酸钾钠，再加入500mL蒸馏水，水浴加热溶解后再加入重蒸酚2.0g、无水亚硫酸钠0.5g，加热溶解，冷却后定容至1000mL。
1％CMC-Na缓冲液：称取1gCMC-Na于100mL烧杯中，加入20mL0.2mol/LpH为4.8的HAc-NaAc缓冲液，加热溶解，转移至100mL容量瓶中定容。
HAc-NaAc缓冲液：0.2mol/LHAc与0.2mol/LNaAc等体积混合，即为pH＝4.8。
HAc：11.32mL醋酸加入到1L容量瓶中定容。
NaAc：16.4g醋酸钠加入1L容量瓶中定容。
(5)仪器设备
电子天平，培养箱、摇床、水浴锅、分光光度计。
(6)纤维素酶活计算
CMC酶活(U)＝G×B/(0.5×30)
式中：G—样品中葡萄糖含量，单位μg；
B—酶液稀释倍数；
0.5—吸取酶液的量，单位mL；
30—反应时间，单位min。
(7)纤维素酶活检测结果
通过步骤(1)方法将本发明菌株T23-B振荡培养4天，测得发酵培养液的纤维素酶活为186.2U。由此说明，本发明中的菌株T23-B具有高纤维素酶活，与现有的降解纤维素的菌株相比其纤维素酶活高，降解纤维素能力强。
实施例2
本实施例用于说明实施例1所制备的发酵培养液用于秸秆等农作物降解中的应用。
1.腐熟目标
玉米秸秆，切割成5cm左右小段，含水率约42％。
2.腐熟菌剂的制备
选用农作物废弃物菌糠作为微生物菌剂载体，考虑其疏松多孔，易于菌体附着，并且利于环保，节约资源等优点。
食用菌菌糠载体经过研磨粉碎，过30目筛，并于121℃灭菌30min，于105℃烘箱中烘干备用。
将上述菌株T23-B发酵培养液(培养液为实施例1步骤(1)制的的菌液，其纤维素酶活为186.2U)与载体按照5：1比例混匀，添加4％保护剂(海藻糖)，与35℃烘干备用。
3.堆肥腐熟
将腐熟目标玉米秸秆与牛粪，以9：1混合，加入0.3％上述腐熟菌剂，混合均匀，调节水分至55-65％，设置空白对照并开始堆肥。
按上述方法进行堆肥操作，在第七天完成堆肥。秸秆降解效果参考NY/T 2722-2015的测定方法进行测定。结果显示添加腐熟菌剂组的秸秆失重率达到41.33％，空白组的秸秆失重率为5.07％。添加腐熟菌剂组的种子发芽率达96.6％，说明本组堆肥对种子基本达到无毒程度。此效果与现有水平相比，其降解纤维素快速明显，能够在一周之内完成堆肥，加速含有纤维素的农业废弃物的降解腐熟，并达到无毒程度的种子发芽率，在现有的基础水平上大大提高了纤维素的降解速率。
序列表
<110> 黑龙江大学
<120>一株高效降解纤维菌株及其应用
<160> 1
<210> 1
<211> 1406
<212> DNA
<213>远青链霉菌（Streptomyces azureus）。
cttcgacagc tccctcccac aaggggttgg gccaccggct tcgggtgtta ccgactttcg 60
tgacgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcagca atgctgatct 120
gcgattacta gcgactccga cttcatgggg tcgagttgca gaccccaatc cgaactgaga 180
ccggcttttt gagattcgct ccacctcgcg gtatcgcagc tcattgtacc ggccattgta 240
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cgagttgacc ccggcggtct cccgtgagtc cccagcacca caagggcctg ctggcaacac 360
gggacaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga 420
cagccatgca ccacctgtac accgaccaca aggggggcac tatctctaat gctttccggt 480
gtatgtcaag ccttggtaag gttcttcgcg ttgcgtcgaa ttaagccaca tgctccgccg 540
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ctggcacgta gttagccggc gcttcttctg caggtaccgt cactttcgct tcttccctgc 1020
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tcccagtgtg gccggtcgcc ctctcaggcc ggctacccgt cgtcgccttg gtgagccgtt 1200
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cttggatgcc caagtggatc agtatccggt attagacccc gtttccaggg cttgtcccag 1320
agtgcagggc agattgccca cgtgttactc acccgttcgc cactaatccc caccgaagtg 1380
gttcatcgtt cgacttgcat gtgtaa 1406

Claims (10)

1.一株高效降解纤维菌株，其特征在于它为远青链霉菌(Streptomyces azureus)T23-B，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年10月14日，保藏编号为：CGMCC No.18680。
2.根据权利要求1所述的一株高效降解纤维菌株，其特征在于所述菌株T23-B的发酵培养方法为摇床培养方法：以体积百分含量为5％的接种量将菌株T23-B接种到发酵培养基中，在37℃，120r/min振荡培养72h。
3.根据权利要求2所述的一株高效降解纤维菌株，其特征在于所述发酵培养基的配方为：磷酸二氢钾1g/L，七水合硫酸镁0.4g/L，氯化钙0.1g/L，氯化铁0.01g/L，氯化钠0.2g/L，硫酸铵3g/L，稻秆粉20g/L。
4.根据权利要求1所述的一株高效降解纤维菌株，其特征在于采用含有所述菌株T23-B制备发酵液或培养液。
5.如权利要求1至4任意一项所述的一株高效降解纤维菌株的应用，其特征在于该菌株用于纤维素降解。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述菌株T23-B扩繁的菌种或所述菌株T23-B制得的发酵液或培养液，与微生物菌剂载体混合，制备有机物料腐熟剂，对农业废物进行处理。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述微生物菌剂载体的水分≤15％，有机质≥60％，养分3～5％，载体负载量200～210g/L。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述微生物菌剂载体的制备方法为将木耳食用菌菌糠载体机械粉碎，过30目筛，121℃灭菌30min，105℃烘干备用，并接种权利要求1所述的菌株，将菌液与木耳食用菌菌糠载体混匀，35℃烘干备用，得到微生物菌剂载体。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的制备有机物料腐熟剂对农业废物进行处理：将所述有机物料腐熟剂以质量比为0.3％的比例添加到农业废弃物中，混合均匀，调节水分含量在55％～65％，腐熟7～10天。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于农业废弃物为含纤维素的农业废弃物。
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