CN105754923A - 一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌及其实现方法 - Google Patents

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CN105754923A CN201610285023.0A CN201610285023A CN105754923A CN 105754923 A CN105754923 A CN 105754923A CN 201610285023 A CN201610285023 A CN 201610285023A CN 105754923 A CN105754923 A CN 105754923A
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Abstract

本发明属于酶基因工程及酶工程领域，尤其是涉及一种基于β?葡萄糖苷酶的工程菌及其实现方法。本发明从乌骨绵羊粪便中提取高活性β?葡萄糖苷酶的目的菌株，并对目的菌株鉴定到种的分类学水平，预测出高活性β?葡萄糖苷酶编码基因的全长序列，构建出具有编码基因的重组载体，并利用重组载体转化得到重组基因工程菌，本发明首次从乌骨绵羊粪便中筛选到一株高产β?葡萄糖苷酶降解菌<i>Streptomyces rochei</i>（娄彻氏链霉菌），获得β?葡萄糖苷酶<i>egl</i>全长基因后成功构建pET?32a?egl表达载体，并利用表达载体构建重组基因工程大肠杆菌，得到可量产的应用基因工程菌，克服现有技术中β‐葡萄糖苷酶多为胞内酶且表达量非常低等不足，为工业化发酵生产β‐葡萄糖苷酶提供一种新方法。

Description

一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌及其实现方法
技术领域
本发明属于酶基因工程及酶工程领域，尤其是涉及一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌及其实现方法。
背景技术
纤维素酶是能将纤维素水解成葡萄糖的一组酶的总称，分为内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.3.4)、外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase，EC3.2.1.21)。尽管β-葡萄糖苷酶不直接参与纤维素的降解，但是在纤维素降解过程中消除纤维二糖抑制内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶对纤维素降解有重要作用。
据报道，全球每年通过光合作用产生的纤维素高达1.55×109t，其中89％尚未被人类利用，而有研究表明，纤维素是生产新型生物乙醇的潜在的最佳原料。但是，在工业生产中，如何高效地将纤维物质降解成葡萄糖(glucose)、木糖(xylose)等可发酵糖是生物乙醇生产过程中最重要的技术瓶颈，倍受科研爱好者的关注。
目前工业以及农业上对β-葡萄糖苷酶的应用主要集中在如下几个方面。
能源领域：随着温室效应、赤潮、雾霾、石油枯竭现象的加重，人们开始探寻新型生物能源。其中，生物乙醇被认为是解决能源短缺，环境污染的主要原料之一。
畜牧领域：畜禽粗饲料中含有大量的纤维素，除了某些反刍以及单胃草食动物具有分解纤维素的能力，大部分的家畜家禽不具备此能力。β-葡萄糖苷酶作为新型饲料添加剂，能够分解复杂的纤维物质，生成容易消化吸收的小分子营养物质，能够促进食物在畜禽胃肠道的消化吸收，提高饲料的利用效率。
此外，β-葡萄糖苷酶在食品、造纸、洗涤、纺织等领域也有广泛的应用。
目前，各种纤维素酶基因均已在细菌中发现并被克隆。与真核生物纤维素酶基因相比，细菌纤维素酶基因具有不含内含子、易克隆、易表达及种类多等优势。微生物产生的β-葡萄糖苷酶种类较多，不同微生物来源的β-葡萄糖苷酶的性质差异较大，从而导致各具特色的应用范围，由于草食动物摄食种类广泛的植物，使存在其胃肠道中的微生物具备了相应的特殊生理、代谢特点，能产生各种酶类以分解食物中的淀粉、果胶、纤维素、蛋白质和脂肪等物质。因此，动物胃肠道微生物本身是一个巨大的、未开发的酶基因资源库，蕴涵着大量潜在的酶基因资源。因此，以动物胃肠道中的微生物为对象，对大分子多糖物质的分解利用机制进行探究，发现全新的纤维素酶基因序列并通过克隆和转基因的方式对目的基因进行外源表达，对新型纤维素酶制剂的开发及生产具有重大意义。
发明内容
针对以上技术问题，本发明的目的在于提供一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌及其实现方法，从乌骨绵羊粪便中提取高活性β-葡萄糖苷酶的目的菌株，并对目的菌株鉴定到种的分类学水平，预测出高活性β-葡萄糖苷酶编码基因的全长序列，构建出具有编码基因的重组质粒，并利用重组质粒转化到BL21(DE3)得到重组纤维素酶基因工程菌。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌，所述的工程菌为外源表达β-葡萄糖苷酶的大肠杆菌，其中，所述的β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还公开了β-葡萄糖苷酶的编码基因，其序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的工程菌含有β-葡萄糖苷酶重组大肠杆菌表达载体，该载体包含如SEQ IDNO.2的β-葡萄糖苷酶的编码基因。
上述基于β-葡萄糖苷酶的工程菌的实现方法，其具体步骤为:
1)高活性β-葡萄糖苷酶生产菌株筛选
通过功能筛选培养基从乌骨绵羊粪便中筛选出具有高活性β-葡萄糖苷酶的菌株，进行复筛后纯培养，得到目的菌株；
2)目的菌株种属鉴定
a.首先对目的菌株种进行形态学鉴定，确认目的菌株种为细菌；
b.通过16S rDNA分子鉴定方法将目的菌株种鉴定到属分类学水平；
c.根据此属微生物β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列设计简并引物获取β-葡萄糖苷酶基因部分序列，NCBI Blast比对发现，与S.rochei中β-葡萄糖苷酶基因eglS(X73953.1)的相似性最大，高达99％，其次与Streptomyces sp.G12β-葡萄糖苷酶基因(HE862416.1)和Streptomyces xylophagus strain KX6的β-葡萄糖苷酶基因(FJ441063.1)相似性相对较大，高达96％，其余均低于96％。筛选同源性大于96％的β-葡萄糖苷酶编码区CDS序列，分析比对编码区前后部分的碱基差异性，设计另一对简并引物进行PCR验证并获取β-葡萄糖苷酶基因全长CDS序列，鉴定到种的分类学水平，验证后对目的基因进行克隆并测序；
3)pET-32a-egl表达载体及基因工程菌构建
构建β-葡萄糖苷酶重组大肠杆菌表达载体pET-32a-egl，将该表达载体导入BL21(DE3)大肠杆菌中诱导表达,得到基于β-葡萄糖苷酶的工程菌。
进一步，作为优选，在步骤2)目的菌株种属鉴定的过程中，进行16S rDNA分子鉴定的步骤为：
提取目的菌基因组DNA，根据细菌16S rDNA保守区设计引物对目的基因进行PCR扩增，通用引物如下：
P1-F：5ˊ-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3ˊ
P1-R：5ˊ-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3ˊ
反应体系如下：10×PCR Buffer 3.0uL，2mmol/L dNTPs Mix 2.5uL，10pmol/LP1-F/P1-R引物各0.5uL，模板DNA 3uL，Ex Taq DNA聚合酶0.5uL，加20uL ddH2O定容到30uL；
PCR反应程序：95℃预变性5min，94℃40s，55℃退火40s，72℃延伸90s，共34个循环，最后72℃延伸8min。反应完成，4℃保存。取5uL PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统观察结果并拍照。
作为基于β-葡萄糖苷酶的工程菌的应用，本发明公开了工程菌在制备重组纤维素酶中的应用。
作为基于β-葡萄糖苷酶的工程菌的应用，本发明还公开了工程菌制备的β-葡萄糖苷酶在纤维二糖类物质降解中的应用。
进一步，作为优选，作为基于β-葡萄糖苷酶的工程菌的应用，本发明还公开了工程菌产生的β-葡萄糖苷酶的最适反应温度在40℃，最适pH在8.0。
本发明的有益效果：
1、本发明首次从乌骨绵羊粪便中筛选到一株高产β-葡萄糖苷酶降解菌Streptomyces rochei(娄彻氏链霉菌)，并用30％甘油保存于-80℃，获得Streptomycesrochei的β-葡萄糖苷酶egl全长基因后成功构建pET-32a-egl表达载体，并利用表达载体构建重组基因工程大肠杆菌，得到可量产的应用基因工程菌，克服现有技术中β‐葡萄糖苷酶表达量非常低等不足，应用基因工程菌表达本发明所述的β‐葡萄糖苷酶基因制备β‐葡萄糖苷酶，可为工业化发酵生产β‐葡萄糖苷酶提供一种新方法。
2、本发明通过对酶反应条件的优化，发现egl基因编码的β-葡萄糖苷酶最适反应温度为40℃，最适pH8.0，并且根据对底物有最适底物浓度，在本研究中，由于底物是pNPG，添加10uL粗酶液，底物浓度为30mM时候催化效率最高。
3.本发明优化后酶活高达1085U/mL，在同样β-葡萄糖苷酶测定方法下，酶活普遍高于国内外同行。
4.本发明β-葡萄糖苷酶属于分泌蛋白，便于实践中的应用。
附图说明
图1为纤维素降解菌在CMC-Na平板上的降解透明圈；
图2为纤维素降解菌在七叶苷平板上的降解透明圈；
图3为对硝基苯酚pNP标准曲线；
图4为B5菌形态学鉴定；
图5为基于B5菌株16S rDNA序列系统进化树；
图6为egl基因部分基因序列M-egl系统进化树；
图7为目的基因全长PCR(M:DL 2000DNA Marker，1—6：目的基因)；
图8为EGL蛋白信号肽预测；
图9为EGL蛋白跨膜区预测；
图10为为pET32a-egl重组质粒双酶切(M:DL 5000Marker；1：pET32a-egl质粒；2：pET32a-egl质粒双酶切)；
图11为SDS-PAGE电泳图(注：M:Premixed Protein Marker(Broad)；1：BL21(DE3)大肠杆菌空菌，2-4：分别诱导3h、8h、13h、18h的BL21(DE3)重组菌
图12为为温度对酶活影响；
图13 pH对酶活影响；
图14为底物浓度对酶活影响；
图15分泌蛋白EGL的验证。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.高活性β-葡萄糖苷酶生产菌株筛选
1.1培养基配置
1.1.1富集培养基：NaNO3 0.05％，K2HPO4 0.1％，MgSO4.7H2O 0.05％，KCl 0.05％，FeSO4.7H2O 0.0005％，滤纸0.2％，pH自然，1000mL蒸馏水
1.1.2刚果红纤维素鉴定培养基：KH2PO4 0.2％，MgSO4 0.05％，(NH4)2SO4 0.1％，琼脂粉1.5％，CMC-Na 1.5％，NaCl 0.05％，pH自然，1000mL蒸馏水
1.1.3β-葡萄糖苷酶筛选培养基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，0.1％七叶苷(Esculin hydrate)，0.25％柠檬酸铁铵，蒸馏水定容1000mL，1.5％琼脂粉，pH＝7.0
1.1.4蛋白胨0.2％，酵母膏0.1％，(NH4)2SO4 0.4％，CMC-Na 2％，NaCl 0.3％，K2HPO4 0.2％，MgSO4.7H2O 0.1％，FeSO4.7H2O 0.1％，MnSO4.7H20 0.0005％，定容1000mL，pH＝7.0。
1.2纤维素降解菌的筛选
1.2.1初筛
取1g新鲜的乌骨绵羊粪便溶解于10mL的无菌水中，充分混匀后取1mL的悬浮液加入到盛有50mL富集培养基的三角锥形瓶中，37℃下180r/min培养72h后，用微量移液器吸取0.1mL富集液于刚果红纤维素鉴定培养基作平板涂布，37℃恒温培养待长出菌落后用灭菌的牙签挑取单一的菌落于新的2个纤维素鉴定培养基中培养24h后，取其中一个培养皿用0.1％的刚果红溶液染色30min，1％的NaCl溶液脱色10min，5％的乙酸溶液固定5min(图1)，标记H/C(透明圈与菌落直径比)的大小(表1)。从另一个培养皿中选择H/C大的10珠菌株，标记D/C(表1)，然后再接种于β-葡萄糖苷酶筛选培养基平板上进行筛选(图2)，挑选黑色水解圈较大的6珠菌株。重复筛选纯化3次。纯化后的菌种扩大要瓶培养后分别与等体积的60％的甘油溶液混匀于-80℃保存。
表1 不同细菌在CMC-Na和七叶苷鉴别培养基上的透明圈/菌落直径比值
1.2.2复筛
根据羧甲基纤维素钠功能筛选培养基H/C的大小(表1)，挑选出6个黑色圈与菌株直径比(D/C)较大的菌株B2、B3、B4、B5、B8、B10作为后续复筛的目的菌(表2)，接种到液体发酵培养基中摇床培养后，测定β-葡萄糖苷酶活性，依据复筛的结果，筛选出β-葡萄糖苷酶酶活性较高的菌株B5作为后续研究对象。
表2 纤维素酶产生菌β-葡萄糖苷酶活性
2.目的菌株种属鉴定
2.1形态学鉴定
将筛选出来的菌株划线培养，用灭菌牙签挑单菌落滴有生理盐水的载玻片上涂片、固定、干燥后，滴加结晶紫染色1-2min，水洗；用碘液冲去残水，并用碘液覆盖1min，水洗；用滴管流加95％的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，脱色30s；用番红溶液复染2min，水洗；干燥后，用光学显微镜观察菌株的形态特征确定为细菌(图4)。
2.2基于16S rDNA分子鉴定
提取目的菌基因组DNA，根据细菌16S rDNA保守区设计引物对目的基因进行PCR扩增，通用引物如下：
P1-F：5ˊ-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3ˊ
P1-R：5ˊ-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3ˊ
反应体系如下：10×PCR Buffer 3.0uL，2mmol/L dNTPs Mix 2.5uL，10pmol/LP1-F/P1-R引物各0.5uL，模板DNA 3uL，Ex Taq DNA聚合酶0.5uL，加20uL ddH2O定容到30uL；
PCR反应程序：95℃预变性5min，94℃40s，55℃退火40s，72℃延伸90s，共34个循环，最后72℃延伸8min。反应完成，4℃保存。取5uL PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统观察结果并拍照。
PCR获得的16S rDNA基因按照TianGen凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收，然后根据pMD-19T连接试剂盒说明连接目的基因，导入H5α大肠杆菌中，摇床培养12h后通过菌落PCR验证，送昆明硕擎生物科技公司测序(SEQ ID NO.4)，并构建生物发育树(图5)。
3.β-葡萄糖苷酶基因克隆
提取目的菌基因组DNA，根据β-葡萄糖苷酶氨基酸保守区设计引物对目的基因进行PCR扩增，简并引物如下：
M-egl-F:5ˊ-GCCACCGACTCSGGCTTC-3ˊ
M-egl-R:5ˊ-CKGTTGAACCAGATCAT-3ˊ
PCR反应体系：10×PCR Buffer 3.0uL，2mmol/L dNTPs Mix 2.5uL，10pmol/L M-egl-F/M-egl-R引物各0.5uL，菌液3uL，Ex Taq DNA聚合酶0.5uL，加20uL ddH2O定容到30uL。
Touch down-PCR反应条件：
(1)95℃预变性5min；
(2)94℃40s，65℃退火40s(-1℃/cycle)，72℃延伸110s；
(3)72℃延伸110s；
(4)重复步骤2和3(10cycle)；
(5)94℃40s，58℃退火40s，72℃延伸110s；
(6)重复步骤5(25cycle)；
(7)72℃延伸5min；
(8)4℃保温
取5uL PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统观察结果并拍照。按照2.2的方法对目的基因克隆并测序(SEQ ID NO.3)。
通过对步骤3获得的目的基因M-egl基因生物信息学分析发现此β-葡萄糖苷酶基因可能来自Streptomyces rochei(娄彻氏链霉菌)，相似性高达99％，其次与Streptomycessp.G12β-葡萄糖苷酶基因(HE862416.1)和Streptomyces xylophagus strain KX6的β-葡萄糖苷酶基因(FJ441063.1)相似性相对较大，高达96％，其余均低于96％，生物进化树分析M-egl基因与Streptomyces rochei(娄彻氏链霉菌)聚成一簇(图5)。筛选同源性大于96％的β-葡萄糖苷酶编码区CDS序列，分析比对编码区前后部分的碱基差异性，并设计简并引物进行PCR验证，简并引物如下：
egl-F:5ˊ-ATGCCACGGTTACGGCAC-3ˊ
egl-R:5ˊ-TCACRCGGTGCTGCAGGC-3ˊ
反应体系如下：10×PCR Buffer 3.0uL，2mmol/L dNTPs Mix 2.5uL，10pmol/Legl F/egl R引物各0.5uL，模板DNA 3uL，Ex Taq DNA聚合酶0.5uL，加20uL ddH2O定容到30uL；
PCR反应程序：95℃预变性5min，94℃40s，58℃退火40s，72℃延伸90s，共34个循环，最后72℃延伸8min。反应完成，4℃保存。取5uL PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统观察结果并拍照(图7)。按照2.2的方法对目的基因克隆并测序(SEQ IDNO.2)
通过对egl基因全长序列分析发现，egl全长基因与S.rochei中β-葡萄糖苷酶基因eglS(X73953.1)相似性高达99％,与其他菌种的相似性均低于95％,结合16S rDNA分析，egl基因来自Streptomyces rochei(娄彻氏链霉菌)。
4.pET-32a-egl表达载体及基因工程菌构建
通过设计带有Nco 1与Xba 1酶切位点的引物，对目的基因进行PCR扩增，导入H5α大肠杆菌中扩大培养，提取质粒进行双酶切，胶回收目的基因；同时，用Nco 1与Xba 1对pET-32a质粒进行双酶切，回收酶切产物，按照T4DNA连接酶说明书进行连接，构建pET-32a-egl表达载体。引物如下：
eglF-Nco1:5ˊ-CATGCCATGGCAATGCCACGGTTACGGCAC-3ˊ
eglR-Xba1:5ˊ-CTAGTCTAGATTACACGGTGCTGCAGGCGGT-3ˊ
反应体系如下：10×PCR Buffer 3.0uL，2mmol/L dNTPs Mix 2.5uL，10pmol/LeglF-Nco1/eglR-Xba1引物各0.5uL，模板DNA 3uL，Ex Taq DNA聚合酶0.5uL，加20uL ddH2O定容到30uL；
PCR反应程序：95℃预变性5min，94℃40s，58℃退火40s，72℃延伸90s，共34个循环，最后72℃延伸8min。
与pET-32a(+)载体进行T连接，条件如下：
连接体系：DNA 12uL(约0.3pmol)，载体DNA 4uL(约0.03pmol)，T4DNA Ligase2uL，T4DNA Ligase Buffer 2uL，ddH2O定容至25uL。
反应条件：16℃连接过夜。
将连接好的重组质粒pET-32a-egl导入100uL BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，混匀后冰浴30min后，42℃热激90S，冰浴5min，加入800uL LB液体培养基混匀，摇床培养2h，取100uL菌液涂平板，过夜培养后挑取单菌落纯培养，用30％的甘油于-80℃保菌。通过双酶切(图10)、菌落PCR验证后测序，无误后用IPTG诱导BL21(DE3)大肠杆菌表达。
5.β葡萄糖苷酶酶学性质分析
5.1SDS-PAGE验证
挑取经鉴定正确后的单菌落以及未导入目的基因的空载菌落(对照组)，分别接种到含有100mL的LB液体培养基(含1‰Amp)的三角瓶中进行震荡培养12h，以1％的接种量转接到新鲜的LB培养基(含1‰Amp)中继续培养至OD值约为0.6后，加入终浓度为1.0mM的IPTG诱导，于25℃继续诱导培养3h、8h、13h、18h，取1mL菌液在12000g离心3min收集菌体沉淀，超声波破碎，离心收集上清液，SDS-PAGE电泳分析(图11)，采用pNPG法检测β-葡萄糖苷酶活力。
5.2温度、pH、底物浓度对酶学性质的影响(图12，13，14)
5.3通过生物信息学预测此蛋白为分泌蛋白(图8,9)，并在后续实验得到证实(图15)。
本发明首次从乌骨绵羊粪便中筛选到一株高产β-葡萄糖苷酶降解菌Streptomyces rochei(娄彻氏链霉菌)，并用30％甘油保存于-80℃，获得Streptomycesrochei的β-葡萄糖苷酶egl全长基因后成功构建pET-32a-egl表达载体，并利用表达载体构建重组基因工程大肠杆菌，得到可量产的应用基因工程菌，克服现有技术中β‐葡萄糖苷酶多为胞内酶且表达量非常低等不足，应用基因工程菌表达本发明所述的β‐葡萄糖苷酶基因制备β‐葡萄糖苷酶，可为工业化发酵生产β‐葡萄糖苷酶提供一种新方法；通过对酶反应条件的优化，发现egl基因编码的β-葡萄糖苷酶最适反应温度为40℃，最适pH8.0，并且根据对底物有最适底物浓度，在本研究中，由于底物是pNPG，添加10uL粗酶液，底物浓度为30mM时候催化效率最高。
本发明优化后酶活高达1085U/mL，在同样β-葡萄糖苷酶测定方法下，酶活普遍高于国内外同行。
最终，以上实施例和附图仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌，其特征在于：所述的工程菌为外源表达β-葡萄糖苷酶的大肠杆菌，其中，所述的β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌，其特征在于：所述的β-葡萄糖苷酶的编码基因如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌，其特征在于：所述的工程菌含有β-葡萄糖苷酶重组大肠杆菌表达载体，该载体包含如SEQ ID NO.2的β-葡萄糖苷酶的编码基因。
4.根据权利要求1所述的一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌的实现方法，其特征在于：其具体步骤为:
1)高活性β-葡萄糖苷酶生产菌株筛选
通过功能筛选培养基从乌骨绵羊粪便中筛选出具有高活性β-葡萄糖苷酶的菌株，进行复筛纯培养，得到目的菌株；
2)目的菌株种属鉴定
a.首先对目的菌株种进行形态学鉴定，确认目的菌株种为细菌；
b.通过16S rDNA分子鉴定方法将目的菌株种鉴定到属分类学水平；
c.根据此属微生物β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列设计简并引物获取β-葡萄糖苷酶基因部分序列，进行NCBI Blast比对，筛选出同源性大于96％的β-葡萄糖苷酶编码区CDS序列，分析比对编码区前后部分的碱基差异性，设计另一对简并引物进行PCR验证并获取β-葡萄糖苷酶基因全长CDS序列，鉴定到种的分类学水平，验证后对目的基因进行克隆并测序；
3)pET-32a-egl表达载体及基因工程菌构建
构建β-葡萄糖苷酶重组大肠杆菌表达载体pET-32a-egl，将该表达载体导入BL21(DE3)大肠杆菌中诱导表达,得到基于β-葡萄糖苷酶的工程菌。
5.根据权利要求1所述的一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌的实现方法，其特征在于：在步骤2)目的菌株种属鉴定的过程中，进行16S rDNA分子鉴定的步骤为：
提取目的菌基因组DNA，根据细菌16S rDNA保守区设计引物对目的基因进行PCR扩增，通用引物如下：
P1-F：5ˊ-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3ˊ
P1-R：5ˊ-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3ˊ
反应体系如下：10×PCR Buffer 3.0uL，2mmol/L dNTPs Mix 2.5uL，10pmol/L P1-F/P1-R引物各0.5uL，模板DNA 3uL，Ex Taq DNA聚合酶0.5uL，加20uL ddH2O定容到30uL；
PCR反应程序：95℃预变性5min，94℃40s，55℃退火40s，72℃延伸90s，共34个循环，最后72℃延伸8min。反应完成，4℃保存。取5uL PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统观察结果并拍照。
6.根据权利要求1所述的一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌的应用，其特征在于：所述的工程菌在制备重组纤维素酶中的应用。
7.根据权利要求1所述的一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌的应用，其特征在于：所述的工程菌制备的β-葡萄糖苷酶在纤维二糖类物质降解中的应用。
8.根据权利要求1所述的一种基于β-葡萄糖苷酶的工程菌的应用，其特征在于：所述的工程菌产生的β-葡萄糖苷酶的最适反应温度在40℃，最适pH在8.0。
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