CN111057694A

CN111057694A - 一种来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶及其基因

Info

Publication number: CN111057694A
Application number: CN201911300775.XA
Authority: CN
Inventors: 杨舒黎; 周熊艳; 朱雅新; 顾招兵; 苟潇; 孔小艳; 吴东旺; 邓茗月
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2020-04-24
Anticipated expiration: 2039-12-17
Also published as: CN111057694B

Abstract

本发明涉及一种来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶基因（酶），属于基因工程领域，该高活性纤维素酶CMC‑1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该高活性纤维素酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明从构建的大额牛瘤胃细菌Fosmid文库中，筛选得到一个全长为1239 bp，编码413个氨基酸的纤维素酶基因CMC‑ 1。CMC‑1/pGEX‑6P‑1重组蛋白在E.coliBL21中能表达出羧甲基纤维素酶活性，CMC‑1酶反应的最适温度是50℃，最适pH为5.0；温度在40℃～55℃，pH在5.0～7.0时酶活较稳定。从大额牛瘤胃中获得CMC‑1基因，且能表达出纤维素酶活性，这对更深入地了解大额牛瘤胃中纤维素酶基因高效降解竹子等粗纤维饲料以及为后续运用分子改造等手段将高效纤维素酶基因开发成新型的酶资源提供了一定的理论基础和现实意义。

Description

一种来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶及其基因

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体的说，涉及一种来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶基因及其编码的酶。

背景技术

大额牛是以竹子为食一种特殊的珍稀牛种，在我国主要生长在云南省高黎贡山的独龙江和怒江流域。其体型庞大，外型与印度野牛最为相似，都拥有相同的染色体数(2n＝58)。研究发现自然条件下，大额牛的消化能力要明显强于当地牛种，体型也更大，通过实验比较了大额牛和普通黄牛在以稻草或竹子杆、竹子枝等为饲料时的表观消化率和瘤胃液中的IVDMD(干物质体外消化率)值的变化，发现大额牛都显著高于普通黄牛。这很可能是因为大额牛瘤胃中存在着异于其它牛种的微生物群落，能够产生高效的降解粗纤维的酶系，对饲料可以更好的消化与利用。

大额牛瘤胃中存在着丰富的微生物资源和新型纤维素酶基因，因此才能够消化竹子，并且表现出良好的生长性能。如果能够通过宏基因组学的方法发现大额牛瘤胃中高活性的降解纤维素酶基因，就能更深入地了解大额牛瘤胃细菌中的物种关系和功能活性；甚至运用分子改造等手段将高效基因开发生成新型的酶资源，运用于生活实践中来，将自然界中不易降解的纤维性物质转化成可利用的能源，解决能源短缺的危机。

发明内容

本发明提供了一种来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶基因及其编码的酶，为后续酶的高效表达及利用，继而开发成新型的酶资源等提供坚实的理论基础。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

所述的来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶CMC-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶CMC-1，其酶最适温度范围在40-50℃，酶最适pH范围在5.0-7.0。

所述的来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶基因，编码所述的高活性纤维素酶CMC-1。

所述的来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

包含所述高活性纤维素酶基因的重组表达载体。

包含所述高活性纤维素酶基因的重组表达载体CMC-1/pGEX-6P-1。

包含所述高活性纤维素酶基因的重组表达菌株。

本发明的有益效果：

本发明从构建的大额牛瘤胃细菌Fosmid文库中，筛选得到一个全长为1239bp，编码413个氨基酸的纤维素酶基因CMC-1。CMC-1基因编码产物与endoglucanase A familyprotein[Prevotella sp.CAG:732]覆盖率最高，为98％，同源性为68％。CMC-1蛋白系统进化树分析显示CMC-1基因编码产物有可能源于一个新的属种，推测CMC-1是一个新基因。CMC-1/pGEX-6P-1重组蛋白在E.coli BL₂₁中能表达出羧甲基纤维素酶活性，CMC-1酶反应的最适温度是50℃，最适pH为5.0；温度在40℃～55℃，pH在5.0～7.0时酶活较稳定。从大额牛瘤胃中获得的CMC-1基因可能是一个新基因，且能表达出纤维素酶活性，这对更深入地了解大额牛瘤胃中纤维素酶基因高效降解竹子等粗纤维饲料以及为后续运用分子改造等手段将高效纤维素酶基因开发成新型的酶资源提供了一定的理论基础和现实意义。

附图说明

图1是fosmid文库纤维素酶活性阳性克隆的筛选。

图2是CMC-1蛋白的组件结构。

图3是CMC-1蛋白的系统进化树。

图4是CMC-1/pGEX-6P-1在TOP10活性检测图。

图5是CMC-1基因PCR电泳图；其中，M：1kb ladder DNA Marker；1、2、3：CMC-1PCR产物。

图6是CMC-1/pGEX-6P-1转入BL21的平板检测。

图7是不同诱导时间SDS-PAGE电泳图；其中，1-6：6、8、10、12、14、16小时诱导表达蛋白；M：蛋白Maker。

图8是不同诱导温度SDS-PAGE电泳图；其中，M：蛋白Maker；1-5：4℃、16℃、28℃、32℃、37℃诱导表达的蛋白样品。

图9是CMC-1纯化蛋白SDS-PAGE电泳图；其中，M：蛋白Maker；1：上清(5uL)；2：沉淀(5uL)；3：穿透峰(5uL)；4、5、6：纯化后的样品(5uL、5uL、5uL)。

图10是纯化表达蛋白的纤维素酶活性检测。

图11是蛋白质浓度标准曲线。

图12是葡萄糖浓度标准曲线。

图13是CMC-1酶反应最适底物浓度。

图14是CMC-1酶反应最适温度。

图15是CMC-1酶反应最适pH值。

图16是CMC-1酶反应的热稳定性。

图17是CMC-1酶反应的pH稳定性。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

【实施例1】纤维素酶基因的定位与分析

1、Fosmid文库中纤维素酶活性阳性克隆筛选

用含有0.5％羧甲基纤维素为底物的LB平板对已构建的Fosmid文库进行纤维素酶(CMC)活性阳性克隆筛选。平板用0.2％的刚果红染色30min，NaCl(1M/L)脱色30mim，菌落周围出现透明水解圈为阳性克隆。根据菌落周围的水解圈大小初步分析酶活性的强弱，水解圈最大的阳性克隆被认为活性做强。随后挑选活性最强的阳性克隆(命名为CMC-1基因)进行测序以及开展后续的基因功能分析和基因表达。

2.CMC-1序列分析

测序得到一个全长为1239bp的基因CMC-1，编码413个氨基酸；预测CMC-1编码的蛋白质等电点(pI)为5.68，理论分子量(MW)为47026.01Da，其编码的氨基酸序列显示第76-384个氨基酸是糖苷水解酶家族5功能域，CMC-1蛋白的组件结构(见图2)。

3.CMC-1蛋白的同源性比对结果及进化树的构建

CMC-1基因编码产物的氨基酸序列与GenBank数据库登录的部分纤维素酶的氨基酸序列(表1)进行完全比对，比对结果显示CMC-1基因编码产物与endoglucanase A familyprotein[Prevotella sp.CAG:732]覆盖率高达98％，同源性达68％。将比对结果用系统进化分析软件Mega7分别进行Maximum Likelihood method分析，绘制出系统进化树见图3。

表1 CMC-1蛋白序列同源性比对部分结果

系统进化分析显示CMC-1基因编码产物独立成支；CMC-1基因编码产物与其他细菌种类在进化距离上相距较远，相似程度不高；CMC-1基因编码产物有可能源于一个新的属种。

【实施例2】纤维素酶CMC-1基因原核表达

一、方法

1.PCR验证CMC-1基因

根据测得的基因序列，以原始CMC-1基因Fosmid质粒DNA作为模板，设计引物。在引物的5’端分别加上EcoRI和SamI的酶切位点(引物中下划线部分)，通过以下引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增：

CMC-1引物:

FP：5'-CGGAATTCGGCTCAGTAGAGAGCAGCAAC-3'(下划线为EcoRI识别位点)

RP：5'-TTCCCGGGTAATTGGCGTTTCGCATT-3'(下划线为SamI识别位点)

PCR扩增体系：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min 30s，72℃延伸5min；共32个循环。电泳回收目的片段。

2.CMC-1/pGEX-6P-1重组表达体系的构建

挑取pGEX-6P-1/E.coli DH_5α菌株，在LA平板(含AMP)中划线，37℃过夜培养。取单个菌落接种于100mL LB(含AMP)培养基中，37℃培养(220r/min)。至OD₆₀₀值达到0.8以上，提取表达质粒。用限制性内切酶EcoRI和SmaI消化PCR-CMC-1片段及表达载体质粒pGEX-6P-1。37℃消化2h，25℃消化2h。将酶切产物琼脂糖凝胶电泳分离，根据胶试剂盒说明书胶回收纯化目的片段CMC-1和载体pGEX-6P-1。两者在T₄ DNA连接酶作用下16℃连接16h，再转入感受态细胞E.coli BMTOP10中。筛选含重组子的菌株并接种于4mL含AMP的LB培养基中37℃，220r/min培养过夜，次日提取重组质粒，进行PCR验证和送博迈德公司测序鉴定。同时将重组子接种到CMC为底物的LA(含AMP)平板上，次日用刚果红染色法确定重组克隆是否有纤维素酶活性。

3.CMC-1/pGEX-6P-1重组克隆导入表达宿主BL21

将重组的CMC-1/pGEX-6P-1的新纤维素酶基因质粒DNA转入到感受态细胞BL21中，筛选含重组子的菌株，挑菌接种到CMC为底物的LB(含AMP)平板上，次日用刚果红染色法确定重组克隆是否有纤维素酶活性。

刚果红染色法确定重组克隆有纤维素酶活性后，将含将重组子的表达菌BL21接种于100mL含AMP的YT培养基中37℃，220r/min，当菌液OD600达到0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG，继续诱导培养10h。

二、结果与分析

1.CMC-1/pGEX-6P-1重组克隆导入BMTop10后的平板检验

感受态细胞BL21十分不稳定，易丢失携带的目的片断，所以先将CMC-1/pGEX-6P-1转入BMTop10。由图4可知重组表达体系CMC-1/pGEX-6P-1构建成功，并获得了具有纤维素酶活性的重组子CMC-1-34，对CMC-1-34提取质粒，并送往博迈德测序同时进行PCR检验，CMC-1-34得到完整序列，与之前测序结果一致。

2.CMC-1/pGEX-6P-1PCR电泳结果

如图5，对重组后CMC-1-34/pGEX-6P-1克隆PCR检验，凝胶电泳证实CMC-1-34基因PCR产物大小在1kb左右，与测序结果一致。

3.CMC-1/pGEX-6P-1重组克隆导入BL21后的平板检验

将CMC-1-34质粒DNA转入BL21，并平板检测活性。由图6可知重组表达体系CMC-1-34成功导入表达宿主BL21，转化效率较高，并且活性得到增强。

4.重组克隆的诱导表达

4.1最佳诱导时间的研究

从图7可知以同水平接种CMC-1表达菌，于37℃摇床培养至OD₆₀₀约0.8后，分别用IPTG诱导至不同时间的菌体超声破碎后，取上清跑SDS-PAGE电泳检测，表明其最佳诱导时间为10-16小时均可。考虑短时高效性，本实验后续研究主要采用的诱导时间为10h。

4.2最佳诱导温度的研究

在不同温度水平下同时诱导表达菌，达10h后超声破碎菌体，取上清进行SDS-PAGE电泳检测，从图8中可知该表达菌最佳诱导温度为37℃，此温度下目的蛋白条带较浓较好。

4.3CMC-1蛋白的诱导与纯化

以最适合重组克隆表达的温度37℃培养表达菌，并以最适合的诱导时间诱导表达菌10h。取菌体并超生破碎，将上清中的蛋白通过FPLC装置(Fast protein liquidchromatography)纯化，将过柱前的上清、沉淀、穿透峰、纯化的蛋白成分经SDS-PAGE电泳后如图9。纯化过程中目的蛋白有一定的损失。

5.CMC-1蛋白纯化后的纤维素酶活性鉴定结果

将诱导表达纯化所得的1-9管CMC-1酶液和转化至BL21中未诱导的CMC-1菌体进行平板检测活性(如图10)，发现诱导后的CMC-1的活性明显强于诱导前；说明CMC-1纤维素素酶诱导效果较好。

【实施例3】酶学特性研究

1.CMC-1表达蛋白浓度的测定

采用Bradford法测蛋白浓度，Purified BSA(10mg/mL)为标准蛋白母液。以标准蛋白浓度(ug/mL)为横坐标和对应的光吸收值OD₅₉₅为纵坐标绘制标准蛋白曲线(图11)。相关系数为0.9933。

取纯化的CMC-1酶液，稀释50倍，采用标准蛋白测定方法，测定稀释50倍的纯化的CMC-1酶液，在酶标仪上测定OD₅₉₅吸光值，再根据标准蛋白曲线和蛋白浓度计算公式计算纯化的CMC-1酶液的浓度(蛋白含量)。计算结果为纯化的CMC-1酶液浓度为2.2096mg/mL。

2.葡萄糖浓度标准曲线的绘制

以葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标和对应的光吸收值OD₅₄₀为纵坐标绘制葡萄糖浓度标准曲线(图12)。相关系数为0.9936。

3.CMC-1酶反应最适底物浓度

如图在CMC-Na浓度(0.5％-5.0％)测定CMC-1酶酶活，浓度为3.5％时的相对酶活值最大，假定为100％，通过计算不同CMC-Na浓度下的相对酶活做曲线结果如图13。从图中可知，CMC-Na浓度在2.5％～5.0％之间时CMC-1酶的相对酶活在70％以上，0.5％时相对酶活最低，但仍还有相对最高酶活的20.4％。

4.CMC-1酶反应的最适温度

如图14，测定温度在20℃-60℃条件时CMC-1表达蛋白的酶活，结果与最适温度测定的CMC-1酶活比较(假定最适温度条件下的酶活性为100％)，计算以上不同温度条件下的相对酶活性。结果表明CMC-1酶活在50℃时最大，反应温度在40℃-55℃之间时CMC-1酶的相对酶活在70％以上，温度达到60℃时酶基本失活，温度在15℃时酶活性较低，但仍还有相对最高酶活的30.3％。

5.CMC-1酶反应的最适PH

在50℃的水浴条件下分别测定CMC-1蛋白在pH＝3.0-9.0时的酶活，假定最适pH条件下的酶活性为100％，分析不同pH条件下的相对酶活，结果如图15。由图可知，CMC-1在pH5.0时酶活性最强，pH在4.5-5.5时的相对酶活高于90％，pH在3.5以下和7.5以上时的相对酶活在50％以下，当pH＝8.5以上时，酶基本失活。因此CMC-1酶反应适宜的pH范围在4.5～5.5之间。

6.CMC-1酶的温度稳定性

以事先置于4℃保存的CMC-1酶液为最大酶活100％，分别计算各温度下的相对酶活。如图16，纯化酶在15℃-35℃条件下1h，CMC-1保持80％以上的酶活，在40℃-55℃条件下1h；酶活有60％左右，说明CMC-1酶在小于55℃的温度范围内较稳定；但当温度达到60℃时，酶十分不稳定，酶活下降至22.3％；而置于65℃条件下的酶，酶活下降90％；温度下降至70℃时酶活基本失活。此结果说明CMC-1酶在小于55℃的范围内还比较稳定。当高于55℃，酶就变得不稳定。

7.CMC-1酶的酸碱稳定性

以事先置于4℃保存的CMC-1酶液的活力为最大酶活100％，分别计算各pH值下的相对酶活。由图17可知，CMC-1酶在pH＝5.0～7.0时残留活力在90％以上，在pH＝3.5～8.0时残留活力在50％以上，pH＝3.0时仅剩15.5％的酶活。因此说明，纤维素酶CMC-1酶在pH5.0～7.0之间较稳定。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南农业大学

<120> 一种来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶及其基因

<130> 20191206

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 413

<212> PRT

<213> Prevotella

<400> 1

Val Ile Tyr Asn Arg Glu Asn Asp Thr Thr Met Arg Leu Leu Ser Ile

1 5 10 15

Ser Leu Ala Ile Ile Ile Ser Leu Ala Cys Cys Gly Ser Val Glu Ser

20 25 30

Ser Asn Ile Glu Glu Pro Lys Pro Val Asp Asn Ala Ala Pro Thr Ala

35 40 45

Lys Gln Trp Asn Gly Glu Ile Thr Ala Gly Trp Asn Leu Gly Asn Gln

50 55 60

Phe Glu Cys Ser Ala Pro Gly Gln Glu His Tyr Ser Leu Asp Ile Gly

65 70 75 80

Met Pro Ala Asn Ser Ile Asn Ala Glu Thr Ala Trp Gly Asn Pro Lys

85 90 95

Val Thr Lys Asn Met Ile Lys Ala Val Lys Ala Ala Gly Phe Asn Ala

100 105 110

Ile Arg Ile Pro Ile Arg Trp Gln Cys His Ile Thr Asn Pro Gln Ala

115 120 125

Met Ser Val Asp Lys Ala Trp Met Ala Arg Val Lys Gln Val Val Asp

130 135 140

Trp Cys Leu Glu Leu Asp Met Lys Val Ile Ile Asn Thr His His Glu

145 150 155 160

Gln Trp Leu Glu Ser Arg Pro Leu Asn Arg Tyr Lys Glu Glu Asn Cys

165 170 175

Gln Lys Leu Ala Leu Leu Trp Phe Asn Ile Ala Ser Glu Phe Ala Asp

180 185 190

Tyr Asp Tyr Arg Leu Ala Phe Ala Gly Thr Asn Glu Val His Glu Lys

195 200 205

Asp Asn Trp Gly Lys Pro Thr Ala Glu Asn Leu Glu Val Gln Asn Ala

210 215 220

Tyr Asn Gln Thr Phe Val Asp Ile Val Arg Ala Thr Gly Gly Asn Asn

225 230 235 240

Ala Lys Arg His Leu Leu Val Gln Thr Tyr Val Cys Asn Pro Glu Phe

245 250 255

Gly Leu Ser Asn Gly Asp Phe Ile Ile Pro Thr Asp Ile Glu Gly Asn

260 265 270

Gly Asn Lys Tyr Met Ser Val Glu Ile His Tyr Tyr Asn Pro Trp Asp

275 280 285

Tyr Ala Gly Glu Gly Lys Tyr Tyr Tyr Trp Gly Glu Ala Tyr Ser Gln

290 295 300

Tyr Gly Glu Ile Ser Pro Ser Lys Glu Ala Asp Met Ile Asn Leu Phe

305 310 315 320

Asp Arg Val Ala Arg Thr Trp Gly Asp Lys Gly Leu Gly Ile Val Ile

325 330 335

Gly Glu Trp Gly Val Thr Asp His Tyr Lys Gly Asn Gln Thr Asp Leu

340 345 350

Met His Ala Asn Met Thr Tyr Tyr Cys Lys Thr Tyr Val Thr Glu Ala

355 360 365

Arg Lys Arg Gly Phe Ala Thr Phe Ile Trp Asp Asn Asn Ser Phe Gly

370 375 380

Asn Gly Met Glu Lys Tyr Gly Ile Phe Asp Arg Lys Asn Asn Met Lys

385 390 395 400

Val Lys Thr Pro Trp Ile Leu Asp Gly Ile Phe Ala Lys

405 410

<210> 2

<211> 1239

<212> DNA

<213> Prevotella ruminicola

<400> 2

gtgatatata atcgcgaaaa cgacactact atgagacttc tttcaatttc actcgcaatc 60

atcatttcgc tggcctgctg tggctcagta gagagcagca acattgaaga gccaaaaccg 120

gtggacaatg ctgcgccaac cgcaaagcaa tggaacggcg agataacagc cggctggaat 180

ctgggcaacc agtttgaatg ctcggcgcca ggacaagagc attacagtct ggacataggc 240

atgccggcta actccatcaa cgccgagacc gcatggggaa atcccaaagt aacaaaaaac 300

atgatcaagg ctgtgaaagc ggccggtttc aatgccatcc gcattcccat tcgatggcag 360

tgccacatca ccaaccctca agccatgagc gttgataagg cttggatggc ccgcgtcaag 420

caggtggttg actggtgtct tgaacttgac atgaaggtca taatcaacac ccaccatgag 480

caatggcttg aatcacgtcc ccttaatcgc tacaaagagg agaattgcca aaagctcgca 540

ttgttgtggt ttaacatcgc aagcgagttt gccgattacg actatcgtct tgcctttgcc 600

ggcaccaacg aggttcacga gaaagataac tggggcaagc caaccgccga gaatcttgag 660

gttcaaaatg cctacaacca gacttttgtt gacatcgttc gtgccacagg tggcaacaat 720

gccaagcgtc acctgctcgt tcagacctat gtgtgtaacc cagagtttgg tctcagcaac 780

ggcgacttca taatccccac cgacatcgag ggcaacggca acaaatacat gagcgtggaa 840

atccactact acaatccttg ggattatgcc ggtgaaggga aatactatta ctggggtgag 900

gcctacagcc agtatggcga aatctcgcca agcaaggagg ccgacatgat aaatctcttc 960

gaccgtgtgg caagaacatg gggcgacaaa ggcttgggaa tcgtgatagg cgaatggggc 1020

gttaccgacc actacaaagg caatcaaact gacttgatgc acgccaacat gacctactac 1080

tgcaagacct acgtcaccga ggcgcgcaag cgcggttttg ctaccttcat ttgggataac 1140

aacagttttg gcaacggtat ggagaaatat ggcattttcg accgcaagaa caacatgaag 1200

gtcaagactc cctggatttt agatggcatc ttcgcaaaa 1239

Claims

1.一种来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶CMC-1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶CMC-1，其特征在于：其酶最适温度范围在40-50℃，酶最适pH范围在5.0-7.0。

3.一种来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶基因，其特征在于：编码权利要求1所述的高活性纤维素酶CMC-1。

4.根据权利要求3所述的一种来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.包含权利要求3或4所述高活性纤维素酶基因的重组表达载体。

6.包含权利要求3或4所述高活性纤维素酶基因的重组表达载体CMC-1/pGEX-6P-1。

7.包含权利要求3或4所述高活性纤维素酶基因的重组表达菌株。