CN102041251A

CN102041251A - 葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶RuBGX2及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN102041251A
Application number: CN2009101977037A
Authority: CN
Inventors: 吕红; 包蕾; 周峻岗; 袁汉英; 詹志春
Original assignee: WUHAN SUNHY BIOLOGY CO Ltd; Fudan University
Current assignee: WUHAN SUNHY BIOLOGY CO Ltd; Fudan University
Priority date: 2009-10-26
Filing date: 2009-10-26
Publication date: 2011-05-04
Anticipated expiration: 2029-10-26
Also published as: CN102041251B

Abstract

本发明属生物工程领域，涉及一种新型β葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶RuBGX2及其编码基因与应用。RuBGX2的氨基酸编码序列包含SEQ ID NO 2序列第18-755位。RuBGX2来源于中国牦牛瘤胃微生物，通过对瘤胃宏基因组cosmid文库和亚克隆文库的功能筛选、测序分析获得编码一种新型β葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶RuBGX2的新基因。本发明的β葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能酶可广泛应用于纤维素的降解，包括纤维素生物转化、化工、纺织、食品、生物能源、饲料添加、医药工业方面应用等领域。利用本发明的RuBGX2双功能酶降解木质纤维，能够减少添加酶的种类，简化酶解工艺。

Description

葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶RuBGX2及其编码基因和应用

技术领域

本发明属生物工程领域，涉及一种葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶及其制备方法和应用。本发明还提供了该葡萄糖苷酶/木糖苷酶的重组质粒和重组基因工程菌株。

背景技术

木质纤维素是地球上分布最广，含量最丰富的可再生性碳水化合物，主要由纤维素，半纤维素和木质素组成。其中纤维素的水解，需要内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(又称为纤维二糖水解酶)和β-葡萄糖苷酶这三种纤维素酶的共同作用；而半纤维素的水解则需要内切β-1，4-木聚糖酶和β-1，4-木糖苷酶这两种酶的共同作用。

葡萄糖苷酶和木糖苷酶在纤维素和半纤维素主链的降解中主要是水解纤维寡糖(主要是纤维二糖)和木寡糖，解除纤维寡糖和木寡糖对内切纤维素酶和木聚糖酶的产物抑制效应，使内切纤维素酶和木聚糖酶能够充分的发挥作用；同时，如果要将纤维素和半纤维素充分水解为葡萄糖和木糖，葡萄糖苷酶和木糖苷酶是不可或缺的。

β葡萄糖苷酶能水解二糖，纤维寡糖和烷基、芳基葡萄糖苷中的β葡萄糖苷键，根据氨基酸序列的相似性，它们属于糖苷水解酶家族1和3。木糖苷酶能水解木寡糖，烷基、芳基木寡糖中的β木糖苷键，根据氨基酸序列的相似性，它们属于糖苷水解酶家族3，39，43，52，54。

目前已发现和克隆了为数众多的纤维素酶，据不完全统计，国内外共记录了产纤维素酶的菌株大约已有53个属的几千个菌株，其中绝大部分是通过传统的分离培养方法获得的，按来源主要分为细菌类纤维素酶和真菌类纤维素酶，按生长条件可分为需氧菌和厌氧菌。其中，细菌来源的纤维素酶一般最适pH为中性至偏碱性，且对天然纤维素的水解能力较弱，主要应用于纺织中的水洗整理及洗涤工业中，而难以用于生物燃料的生产；真菌来源的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物，主要用于饲料业，但是由于真菌来源的纤维素酶要形成酶系才能发挥较好的作用，而酶系的成分往往很复杂，而单个成分的酶酶活又较低，因此限制了它在生物能源方面的应用。而且这些纤维素酶主要对于可溶性，纯的纤维素水解能力较高，对于不溶性纤维素的活性很低甚至没有，而对于混有抗营养因子的不溶性纤维素更是无能为力，以目前得到的酶的活力，还无法用于工业化分解纤维素生产生物能源，因此，克隆新型高活性的纤维素酶具有巨大的科研意义和工业意义。

关于β-葡萄糖苷酶基因已有一些专利和文献报道。如：Dion等报道了Thermus thermophilus的β-葡萄糖苷酶基因(glycoconjugate J，16：27-37，1999)；Gonzalez等报道了芽孢菌Bacillus polymyxa的β-葡萄糖苷酶基因(Biochem Biophys Res Commun，194：1359-1364，1993)；Wrightdd等报道了Microbispora bispoera的β-葡萄糖苷酶基因(Appl EnvironMicrobiol，63；3902-3910，1997)；Lieb等报道了Thermotoga mariti的β-葡萄糖苷酶基因(Mol Gen Genet，242：111-115，1994)；Tonouchi等报道了Acetobacter xylinum的β-葡萄糖苷酶基因(美国专利USP6316251，2001年11月31日)。目前国内关于木糖苷酶的专利也很少，仅有南开大学(中国专利号：200710063139.0)和丹麦的丹尼斯科公司(中国专利号：CN96194959.7)两项。而与木糖苷酶的研究报道也仅有曲霉(Aspergillus)β-木糖苷酶的分离纯化及基因克隆。

具有β-葡萄糖苷酶和木糖苷酶双功能活性的酶比较少见，算上早期以生化方式研究的，总共也不到十个蛋白，而将双功能基因克隆出来的，目前国内外仅有三篇文献报道，即Brunner等(Phytochemistry，59(2002)689-696)从马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)中克隆到的β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶，和VROEMEN，S等(MOLECULAR&GENERAL GENETICS，246(1995)，465-477)从Erwinia chrysanthemi中克隆到的萄糖苷酶/木糖苷酶，Derek K等(Biochimica et Biophysica Acta，(1998)78-88)从Agrobacterium tumefaciens中克隆到的Cbg1s。而且从这些酶的性质来看，虽然具有双功能活性，但是木糖苷酶的活性只占葡萄糖苷酶的活性的不到20％，甚至不到10％，因此是以葡萄糖苷酶活性为主导的。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型的β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能糖苷水解酶RuBGX2及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶RuBGX2的方法。

本发明的第三个目的是提供该葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶RuBGX2的应用。

本发明提供了一种新的β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶，该β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶的多肽序列含有SEQ ID NO.2的第18-755位的氨基酸残基序列，简称为RuBGX2。例如，该β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶的多肽序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶的编码基因，其核苷酸编码序列含有SEQ ID NO.1中第52-2265位的DNA序列。例如，其核苷酸编码序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了上述β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶的制备方法，即按照SEQ ID NO.2的第18-755位的氨基酸残基序列人工合成。

本发明还提供了β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶的另一种制备方法：取牦牛的瘤胃内容物，构建瘤胃未培养细菌宏基因组文库；筛选具备β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶活性的阳性克隆；通过构建亚克隆、同源对比方法获得β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶的编码基因；将该编码基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶。

所述的重组表达载体是大肠杆菌表达载体，酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、丝状真菌表达载体、昆虫表达载体或者哺乳动物细胞表达载体中的任意一种。

所述的宿主细胞是Escherichia coliBL21、E.coli JM109、E.coli DH5α、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis、Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920、Lactic acid bacteriaCOCC101、Trichoderma viride，Trichoderma reesei、Aspergillus niger、Bombyxmori、Antharaea eucalypti、CHO或者CHL细胞中的任意一种。

β-葡萄糖苷酶的活性筛选可以采用显色底物对硝基苯葡萄糖苷(pNPG：p-nitrophenyl-β-glucopyranside)作为底物。

本发明还提供了葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶RuBGX2的应用，即将其用于纤维素降解。

本发明所提供的葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶RuBGX2，来源于牦牛瘤胃未培养微生物，其氨基酸残基序列包括：

1)序列表中的SEQ ID NO.2的氨基端的第1-755或18-755位氨基酸残基序列；其中1-18位为信号肽，19-755位为有活性的酶基因片段。

2)将序列表中的SEQ ID NO.2的氨基端的第1-755或19-755位氨基酸残基序列经过一个或若干个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有beta葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能活性的蛋白质。

3)与序列表中的SEQ ID NO.2的氨基酸序列的同源性达到90％及以上的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO.2由755个氨基酸残基组成。N端第98-317位氨基酸残基为糖基水解酶家族3的结构域(glycosyl hydrolase 3 domauin)，N端第383-642位氨基酸残基为糖基水解酶家族3C的结构域(glycosyl hydrolase 3C terminal domain)。

本发明还提供了葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶RuBGX2的编码基因(rubgx2)，其核苷酸序列包括：

1)序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO.2蛋白质序列的多核苷酸序列；

基于SEQ ID NO.2序列进行保守性变异得到的多肽，也可能产生具备葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶活性的多肽，因此与内切葡聚糖酶氨基酸序列相比，被性质相似或相近的、多至10个氨基酸残基替换而形成多肽也可能具有相同功能。本发明也包括这些保守性变异多肽的核苷酸编码序列。

含有本发明涉及到的葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶RuBGX2的编码基因的表达载体、重组菌或转基因细胞系均属于本发明的保护范围。本发明的RuBGX2核苷酸编码序列也可以根据预测的RuBGX2核苷酸编码序列人工合成获得。

本发明提供的葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能酶RuBGX2的制备方法是将含有本发明涉及的RuBGX2酶基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，重组表达得到RuBGX2葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能酶。这些重组表达载体和基因工程菌株或细胞株可以采用本领域常规的技术手段和操作方法制备。

所述表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母菌表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、丝状真菌表达载体、昆虫表达载体、哺乳动物细胞表达载体等。

重组表达葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能酶RuBGX2的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌(如Escherichia coliBL21、E.coli JM109、E.coli DH5α等)、酵母菌(如Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌(如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920等)、乳酸菌(如Lactic acidbacteria COCC101等)，丝状真菌(如Trichodermaviride，Trichoderma reesei，Aspergillus niger等)、昆虫细胞(如Bombyxmori，Antharaea eucalypti)，哺乳动物细胞(如CHO，CHL等)等。其中，CHO是中国仓鼠卵巢细胞，CHL是中国仓鼠肺细胞。

本发明通过构建中国牦牛瘤胃宏基因组cosmid文库和亚克隆文库，并对文库进行功能筛选的方法，克隆到了一个新的β-1，4-葡萄糖苷酶RuBGX2。该基因编码区长2268bp，编码755aa的蛋白，属于纤维素酶家族3。在大肠杆菌中重组表达获得该双功能酶；酶学特性分析发现此酶的最适反应温度40℃，最适反应pH4.8。它对对硝基苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-glucopyranside)、对硝基苯基-β-D-木糖苷(p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside)、邻硝基苯基-β-半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-galactoside)、纤维二糖及三糖等底物均具有水解能力，其中对对硝基苯葡萄糖苷和对硝基苯木糖苷的活性相对较高，分别为26IU/mg和5.6IU/mg，但是对α-型构型的糖苷底物没有活性，因此是β葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能酶。RuBGX2可在基因工程菌株中大量重组表达来制备，可用于木质纤维素中的纤维素、半纤维素的降解及饲料添加等其他工业过程，在制备生物燃料、饲料添加剂等多方面有广泛的应用。

本发明的RuBGX2葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能酶，在最适温度和最适pH下检测酶活，结果表明重组RuBGX2对pNPG的比活为26IU/mg蛋白，对pNPX也有较高活性，约5.6IU/mg蛋白。本发明的双功能酶也具有较高比例的木糖苷酶活性，具有更广阔的工业应用前景。

由于天然的纤维素是包括纤维素、半纤维素、木质素等多组份在内的混合物，要把天然的纤维素原料降解为可以发酵生产生物燃料的单糖，势必需要多种酶的共同作用，而水解酶的种类太多也会增加生产成本，因此，本发明的β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能的糖苷水解酶RuBGX2既能降低纤维素降解体系的复杂性，又能降低生产成本，而且是一种比较稀有的双功能酶，具有很大的工业前景和价值。利用本发明的RuBGX2双功能酶降解木质纤维，能够减少添加酶的种类，简化酶解工艺。

附图说明

图1：重组RuBGX2表达、纯化的蛋白SDS-PAGE电泳图。各泳道加入的样品分别是：泳道1：150mmol的咪唑洗脱收集液，上样量10ul，泳道2：300mmol的咪唑洗脱收集液，上样量10ul，泳道3：组分同泳道1，上样量2ul；M：蛋白marker，条带自上至下大小为94kD，67kD，43kD，30kD，20.1kD。

图2：重组葡萄糖苷/木糖苷酶RuBGX2的最适反应温度。

图3：重组葡萄糖苷/木糖苷酶RuBGX2的最适反应pH值。

图4，重组葡萄糖苷/木糖苷酶RuBGX2的耐温性曲线。

图5，重组葡萄糖苷/木糖苷酶RuBGX2的圆二色曲线。纵坐标为椭圆率(elipticity)，波长218mm，拟合采用doseresp fit。

图6：RuBGX2降解纤维二糖及MU-纤维二糖的TLC分析图。其中，1：葡萄糖；2：纤维二糖；3：纤维二糖+RuBGX2；4：MU-纤维二糖；5：MU-纤维二糖+RuBGX2。

具体实施方式

实施例1中国牦牛瘤胃微生物宏基因组DNA文库的构建

于西宁市的一个屠宰场采集2头中国青海牦牛的瘤胃内容物，使用3层纱布过滤，滤液经离心收集瘤胃微生物菌体，冻存于-80℃待用。取100-200ul菌体样品，1ml PBS洗2～3次，加入650uL DNA抽提缓冲液(Tris-HCl，100mMpH8.0；Na₂EDTA 100mM pH8.0；Na₃PO₄Buffer 100mM pH8.0；NaCl 1.5M；CTAB 1％；pH8.0)，混匀后，置-80℃中，然后放置在65℃水浴中融化，重复三次；冷却后加入3-4μL溶菌酶(100mg/L)于摇床中水平振荡(37℃，225rpm)约30min；加入2-3μL蛋白酶K(20mg/mL)后继续振荡约30min；加入50-70uL SDS(20％)，混匀后，65℃保温1-2h，每隔10～20min上下颠倒离心管混匀；12，000rpm室温离心10min，收集上清液，加入400-500ul的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次；氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次后加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置15-20min后，12000rpm离心15min；沉淀用70％乙醇漂洗，干燥后用60-100μL TE(pH8.0)溶解，加入1μLRNAase去除RNA。抽提的瘤胃宏基因组大小在30～40kb左右，符合构建宏基因组cosmid文库要求。

构建瘤胃未培养细菌宏基因组文库的方法参照Epi centre公司pWEB::TNC Cosmid Cloning Kit试剂盒产品说明书。抽提的宏基因组DNA经End-Repair Enzyme Mix末端补平，和试剂盒中的去磷酸化载体pWEB::TNC连接，连接产物用MaxPlax^TM Lambda Packaging Extracts包装后、侵染宿主菌E.coli EP I100，侵染产物涂平板，37℃培养12～16h长出菌落，即为该批样品的宏基因组文库。

β-葡萄糖苷酶的活性筛选采用显色底物对硝基苯葡萄糖苷(pNPG：p-nitrophenyl-β-glucopyranside)作为底物。将宏基因组文库在96孔板中扩增培养后，冻融法破细胞，加入30ul 1.25mM pNPG，缓冲液为50mM pH4.8的柠檬酸溶液，37℃反应30分钟后加入40ul 1M Na₂CO₃，变为黄颜色即为具有β-葡萄糖苷酶活性的阳性克隆。含有RuBGX2基因的cosmid克隆16C12即是以此法在该文库中筛到的。

实施例2瘤胃微生物来源的RuBGX2基因的克隆及其序列分析

采用亚克隆的方法将16C12葡萄糖苷酶/木糖苷酶基因克隆至pGEM11z载体上：将筛选到的阳性克隆16C12的cosmid质粒用Sau3A I部分酶切为2-5kb片段，连接入经BamHI酶切并去磷的pGEM11z载体中，转化DH5a，以实施例1中描述的方法对亚克隆文库进行功能筛选，得到的亚克隆以T7和SP6通用引物测序，通过同源比对确定该β-1，4-葡萄糖苷酶基因的编码区序列，其基因核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，并命名为RuBGX2。

RuBGX2基因cds编码755个氨基酸，ORF序列如SEQ ID NO 2所示，理论分子量为82.4kD。用SMART分析结构域，显示N端开始18个氨基酸是信号肽序列，第98-317位氨基酸为糖基水解酶家族3的催化功能域(glycosylhydrolase family 3 domain)，第383-642位是糖基水解酶家族3C端功能域(glycosyl hydrolase family 3 C domain)。通过NCBI的blastp分析，RuBGX2与Parabacteroides distasonis的β-glucosidase的同源性最高，氨基酸序列identity为48％，说明RuBGX2是一个新型的β-葡萄糖苷酶基因。

实施例3RuBGX2基因在大肠杆菌中的重组表达

为了将RuBGX2基因cds序列克隆入大肠杆菌表达载体pET-21a进行重组表达，设计了一对引物：其中正向引物序列为RuBGX2F：AATGAATTCATGAAAGCAATCCTTACAACC，反向引物为RuBGX2R：TATAAGCTTTAGCGTCACAGTCACGTTC，下划线标注的是限制性内酶序列。通过PCR反应扩增出RuBGX2基因片段，经过胶回收后用EcoR I和HindIII双酶切，回收片段后，与同样是EcoR I和HindIII双酶切的pET-21a载体连接，连接产物转化大肠杆菌Top10菌株，得到的转化子利用上述引物进行煮菌PCR鉴定，将含有2.3kb扩增片段的转化子检测酶活和测序鉴定，将正确的转化子命名为Top10/pET21a-rubgx2。随后提取该转化子的质粒，转化大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)进行重组表达。该重组表达的思路也同样适用于其他各种通用表达载体和表达菌株。表达后的蛋白经破壁后，使用Ni-NTA柱进行纯化，纯化的蛋白SDS-PAGE电泳图如图1所示。

实施例4RuBGX2的酶学活性分析

以对硝基苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物测定该酶的活性，以每分钟催化pNPG生成1umol对硝基苯酚(p-nitrophenol)定义为一个酶活单位(IU)。为测定RuBGX2酶的最适反应条件，以pNPG为底物，在不同温度(25℃-60℃)下检测其相对活性，结果显示RuBGX2的最适反应温度为40℃(如图2)。在最适温度下，测定最适pH，所用的缓冲液范围为：pH 3.5-6.5为50mmol柠檬酸缓冲液，pH 6.5-8为50mmol磷酸钠缓冲液，pH 7.0-9.0为50mM Tris·HCl缓冲液，结果显示RuBGX2的最适反应pH为4.8(如图3)。

为测定RuBGX2的比活，在最适温度和最适pH下检测酶活，结果表明重组RuBGX2对pNPG的比活为26IU/mg蛋白。

为检测RuBGX2的底物特异性，还使用了下列的底物：p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside(对硝基苯基-beta-D-木糖苷)，p-nitrophenyl-α-glucopyranside(对硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷)，o-nitrophenyl-β-galactoside(邻硝基苯基-β-半乳糖苷)；4-Methylumbelliferyl-α-galactoside(4-甲基伞形酮α-半乳糖苷)，分析RuBGX2对这些底物的水解能力。结果表明，RuBGX2对α-型构型的糖苷底物没有活性，但RuBGX2对β构型的底物具有一定的广谱性，除了对pNPG有活性外，对pNPX也有较高活性，约5.6IU/mg蛋白，同时对o-nitrophenyl-β-galactoside也有活性，但活性较低。

实施例5RuBGX2的耐热性分析

将纯化的RuBGX2稀释於最适pH的缓冲液中，分别置于40℃，45℃，50℃，55℃，分别保温10、20、30、40、50、60min，其中55℃加一组温育5min，以置于4℃不温育的稀释酶液为对照(100％)酶活，测试残余活性，结果如图4所示，在40℃，45℃温浴1h后酶活基本不变，在50℃中开始缓慢丧失活性，在55℃中迅速丧失活性。同时，用园二色仪测定RuBGX2在20℃-80℃的CD值，选取218nm处的OD值处理数据，所得图形如图5所示，计算得它的Tm值为50℃。

实施例6金属离子及单糖对RuBGX2活性的影响

在pH4.8，40℃条件下，测定二价金属阳离子及单糖对RuBGX2水解pNPG的影响。反应体系为：100uL 1.25mmol pNPG，5mmol的金属离子或单糖，0.4uL的酶液，37℃反应3分钟后加入2倍体积的1M Na₂CO₃的中止反应，405nm分光光度法测定产物pNP生成量，结果如表1所示，其中的数字表示在加入所示浓度的金属离子或单糖后的相对活性，不加任何二价金属阳离子和单糖时的酶活性作为对照，并定为100％，结果显示适当浓度的金属离子如Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺可以提高RuBGX2的酶活性约10％，葡萄糖对RuBGX2的葡萄糖苷酶活性有较明显的抑制效应，在5mM时能抑制75.5％的活性，木糖等其他单糖对RuBGX2的葡萄糖苷酶活性影响并不太明显，显示葡萄糖对RuBGX2的葡萄糖苷酶活性的抑制是源于底物抑制效应。

表一：金属离子及单糖对RuBGX2活性的影响

实施例7RuBGX2水解寡糖的TLC分析

RuBGX2的β-1-4-葡萄糖苷酶的性质分析利用纤维二糖和4-甲基伞形酮β-D-1，4-纤维二糖为底物，用薄层层析(TLC)分析产物。薄层层析使用烟台江友硅胶开发有限公司HSGF254型号的硅胶板，展层剂为正丁醇∶乙酸∶水(2∶1∶1)；展开时间1.5小时*2，显色方法：碘熏。结果如图6所示，RuBGX2能够降解二糖底物纤维二糖及三糖底物MU-纤维二糖产生葡萄糖。

序列表

<210>1

<211>2265

<212>DNA

<213>牦牛瘤胃微生物

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2265)

<223>

<400>1

atg aaa gca atc ctt aca acc ggg gcg ctt ctc tgc gcg atg acg gca 48

Met Lys Ala Ile Leu Thr Thr Gly Ala Leu Leu Cys Ala Met Thr Ala

1 5 10 15

ttc gcg cag gtg ccc cag ctc aac cgc aac aat atc gac gaa gtc ctg 96

Phe Ala Gln Val Pro Gln Leu Asn Arg Asn Asn Ile Asp Glu Val Leu

20 25 30

aaa gcg atg acg ctg gag gag aag atc acc ctc gtt gtc ggc gcc aac 144

Lys Ala Met Thr Leu Glu Glu Lys Ile Thr Leu Val Val Gly Ala Asn

35 40 45

cgc tat gtg gga gat gaa aac ggt ccc ggg ccc gcg ccc ggg atg ccg 192

Arg Tyr Val Gly Asp Glu Asn Gly Pro Gly Pro Ala Pro Gly Met Pro

50 55 60

gag cgc aag tcg gtg gat atg agc ggc ctt gtc gag cag ccc aag agc 240

Glu Arg Lys Ser Val Asp Met Ser Gly Leu Val Glu Gln Pro Lys Ser

65 70 75 80

gac ggc gtg acc gcc ttc tcc agc ggc cgc gtg aag ggc gcc gcc ggc 288

Asp Gly Val Thr Ala Phe Ser Ser Gly Arg Val Lys Gly Ala Ala Gly

85 90 95

gac gtc gtg ccc gtg gag cgg ctg ggc atc acc acg atg gtc ctt gcc 336

Asp Val Val Pro Val Glu Arg Leu Gly Ile Thr Thr Met Val Leu Ala

100 105 110

gac ggt cct gcc ggc ctg cgc atc gat gct gtc cgc ccg ggg gat gac 384

Asp Gly Pro Ala Gly Leu Arg Ile Asp Ala Val Arg Pro Gly Asp Asp

115 120 125

aac acc tac ttt tgc acc gct ttc ccc atc ggg tcg ctc ctg tcg gcg 432

Asn Thr Tyr Phe Cys Thr Ala Phe Pro Ile Gly Ser Leu Leu Ser Ala

130 135 140

tcg tgg gat acc gga ctc gtc gag cgc gtg acg gcc gcg atg ggc aac 480

Ser Trp Asp Thr Gly Leu Val Glu Arg Val Thr Ala Ala Met Gly Asn

145 150 155 160

gag gtg ctg gaa tat ggc gcc gac gtg ctc ctc gcc ccc gcc atg aac 528

Glu Val Leu Glu Tyr Gly Ala Asp Val Leu Leu Ala Pro Ala Met Asn

165 170 175

atc cac cgc aac ccg ctg tgc gga cgc aac ttc gag tat tac agc gag 576

Ile His Arg Asn Pro Leu Cys Gly Arg Asn Phe Glu Tyr Tyr Ser Glu

180 185 190

gac ccg ctg ctt gcg gga aag atc gcc gcc gct tat gtc cgg ggc gtc 624

Asp Pro Leu Leu Ala Gly Lys Ile Ala Ala Ala Tyr Val Arg Gly Val

195 200 205

cag ggc aac ggc gtc ggc acg tcc gtg aag cac ttc gcc gcc aac agc 672

Gln Gly Asn Gly Val Gly Thr Ser Val Lys His Phe Ala Ala Asn Ser

210 215 220

cag gag acc ctg cgc aac ggc cag aac gcc tcc gtc agc gag cgc gcc 720

Gln Glu Thr Leu Arg Asn Gly Gln Asn Ala Ser Val Ser Glu Arg Ala

225 230 235 240

ctg cgc gag atc tat ctc aag ggc ttc gaa atc gtc gtg aag gag gcc 768

Leu Arg Glu Ile Tyr Leu Lys Gly Phe Glu Ile Val Val Lys Glu Ala

245 250 255

cag ccc tgg acc atc atg tct tcc tac aac aag atc aac ggc gtg ctg 816

Gln Pro Trp Thr Ile Met Ser Ser Tyr Asn Lys Ile Asn Gly Val Leu

260 265 270

tct tcg gag aac cgc tgg ctc ctg acg gac gtc ctc cgc gga gaa tgg 864

Ser Ser Glu Asn Arg Trp Leu Leu Thr Asp Val Leu Arg Gly Glu Trp

275 280 285

ggc ttc aag ggc ttc gtg atg acc gac tgg tgg gcc gag gag aac ggc 912

Gly Phe Lys Gly Phe Val Met Thr Asp Trp Trp Ala Glu Glu Asn Gly

290 295 300

gcc cgc cag atc gcg gcc ggc aac gac atg ctg atg ccg ggc acg ccc 960

Ala Arg Gln Ile Ala Ala Gly Asn Asp Met Leu Met Pro Gly Thr Pro

305 310 315 320

cac cag tat gat gac atc ctt gac gcc gtg cag agc ggc cgc ctg gac 1008

His Gln Tyr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Val Gln Ser Gly Arg Leu Asp

325 330 335

atc cgt ttc ctg gac gac tgt gtc cgc cgc atc ctc cag gtg atg gtg 1056

Ile Arg Phe Leu Asp Asp Cys Val Arg Arg Ile Leu Gln Val Met Val

340 345 350

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Glu Ser Pro Thr Phe Lys Arg Tyr Ala Tyr Ser Asn Lys Pro Asp Leu

355 360 365

gcc gcc cac gcc cag gtt acg cgt gag gcc gcc gcc cag gga atg gtc 1152

Ala Ala His Ala Gln Val Thr Arg Glu Ala Ala Ala Gln Gly Met Val

370 375 380

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Leu Leu Lys Asn Glu Ser Ala Leu Pro Leu Val Arg Lys Ser Lys Val

385 390 395 400

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Ala Leu Phe Gly Val Pro Ser Tyr Asp Thr Met Val Gly Gly Ser Gly

405 410 415

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Ser Gly Tyr Val Asn Arg Ala Tyr Lys Val Thr Val Asp Ala Gly Leu

420 425 430

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Glu Ala Ala Gly Phe Arg Leu Asp Lys Gln Leu Ala Glu Ser Tyr Arg

435 440 445

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Asp Tyr Val Lys His Glu Lys Ala Lys Gln Pro Ala Glu Tyr Phe Trp

450 455 460

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Ile Ile Pro Thr Val Gln Glu Thr Leu Ile Ser Arg Glu Val Ala Gln

465 470 475 480

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Ala Ala Ala Lys Arg Asn Glu Val Cys Val Tyr Ser Ile Gly Arg Met

485 490 495

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Ala Gly Glu Gly Gly Asp Arg Thr Leu Thr Pro Gly Asp Trp Tyr Leu

500 505 510

tcg gag acc gaa cag gcc aac atc gac ctg ctc tgc gag act ttc cac 1584

Ser Glu Thr Glu Gln Ala Asn Ile Asp Leu Leu Cys Glu Thr Phe His

515 520 525

aag gcc ggc aag aag gtg att gtc ctg ctg aac atg ggc aac atc gtg 1632

Lys Ala Gly Lys Lys Val Ile Val Leu Leu Asn Met Gly Asn Ile Val

530 535 540

gac atg ggc tgg agc gac cag ccg gat gcg atc ctc cat acc tgg atg 1680

Asp Met Gly Trp Ser Asp Gln Pro Asp Ala Ile Leu His Thr Trp Met

545 550 555 560

gac ggg cag gag gcc ggc aac agc gtg gcc gac atc ctc gcc ggc aag 1728

Asp Gly Gln Glu Ala Gly Asn Ser Val Ala Asp Ile Leu Ala Gly Lys

565 570 575

gtg tcc cct tcg ggc aag ctg ccg atg acg atc gcg aaa agc tat gag 1776

Val Ser Pro Ser Gly Lys Leu Pro Met Thr Ile Ala Lys Ser Tyr Glu

580 585 590

gat tat tcc tcc gcc aaa gac ttc ccg atg tcc aac ggc aat ccc ggc 1824

Asp Tyr Ser Ser Ala Lys Asp Phe Pro Met Ser Asn Gly Asn Pro Gly

595 600 605

gat gtc aac tat gat gaa gac atc ttc gtc gga tac cgc cac ttc gac 1872

Asp Val Asn Tyr Asp Glu Asp Ile Phe Val Gly Tyr Arg His Phe Asp

610 615 620

cgc cat ccc gag acg atc ctg tat cct ttc ggc ttt ggc ctg agc tac 1920

Arg His Pro Glu Thr Ile Leu Tyr Pro Phe Gly Phe Gly Leu Ser Tyr

625 630 635 640

acg gat ttc gcg tat tcc gac ctg aag gcc gaa cgc gag ggt gac gag 1968

Thr Asp Phe Ala Tyr Ser Asp Leu Lys Ala Glu Arg Glu Gly Asp Glu

645 650 655

ctg aaa atc agc gtg aag gtg acg aac acc ggc aag cgc ccc ggc cgc 2016

Leu Lys Ile Ser Val Lys Val Thr Asn Thr Gly Lys Arg Pro Gly Arg

660 665 670

gag gcc gtg cag att tat gtg gga gct ccg gca gga aat gcc gtg aaa 2064

Glu Ala Val Gln Ile Tyr Val Gly Ala Pro Ala Gly Asn Ala Val Lys

675 680 685

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Pro Val Lys Glu Leu Arg Ala Phe Gly Lys Thr Ser Glu Leu Lys Pro

690 695 700

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Gly Ala Ser Glu Val Leu Thr Met Thr Val Lys Leu Ala Asp Leu Arg

705 710 715 720

tgg ttc gac gct tat gag cag gcg tgg aaa ctc gac gcg ggc gaa tat 2208

Trp Phe Asp Ala Tyr Glu Gln Ala Trp Lys Leu Asp Ala Gly Glu Tyr

725 730 735

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ValIle Ser Ala Ala Ala Ser Ser Arg Asp Ile Arg Gln Asn Val Thr

740 745 750

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Val Thr Leu

755

<210>2

<211>755

<212>PRT

<213>牦牛瘤胃微生物

<400>2

Met Lys Ala Ile Leu Thr Thr Gly Ala Leu Leu Cys Ala Met Thr Ala

1 5 10 15

Phe Ala Gln Val Pro Gln Leu Asn Arg Asn Ash Ile Asp Glu Val Leu

20 25 30

Lys Ala Met Thr Leu Glu Glu Lys Ile Thr Leu Val Val Gly Ala Asn

35 40 45

Arg Tyr Val Gly Asp Glu Asn Gly Pro Gly Pro Ala Pro Gly Met Pro

50 55 60

Glu Arg Lys Ser Val Asp Met Ser Gly Leu Val Glu Gln Pro Lys Ser

65 70 75 80

Asp Gly Val Thr Ala Phe Ser Ser Gly Arg Val Lys Gly Ala Ala Gly

85 90 95

Asp Val Val Pro Val Glu Arg Leu Gly Ile Thr Thr Met Val Leu Ala

100 105 110

Asp Gly Pro Ala Gly Leu Arg Ile Asp Ala Val Arg Pro Gly Asp Asp

115 120 125

Asn Thr Tyr Phe Cys Thr Ala Phe Pro Ile Gly Ser Leu Leu Ser Ala

130 135 140

Ser Trp Asp Thr Gly Leu Val Glu Arg Val Thr Ala Ala Met Gly Asn

145 150 155 160

Glu Val Leu Glu Tyr Gly Ala Asp Val Leu Leu Ala Pro Ala Met Asn

165 170 175

Ile His Arg Asn Pro Leu Cys Gly Arg Asn Phe Glu Tyr Tyr Ser Glu

180 185 190

Asp Pro Leu Leu Ala Gly Lys Ile Ala Ala Ala Tyr Val Arg Gly Val

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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485 490 495

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515 520 525

Lys Ala Gly Lys Lys Val Ile Val Leu Leu Asn Met Gly Asn Ile Val

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580 585 590

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Leu Lys Ile Ser Val Lys Val Thr Asn Thr Gly Lys Arg Pro Gly Arg

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Pro Val Lys Glu Leu Arg Ala Phe Gly Lys Thr Ser Glu Leu Lys Pro

690 695 700

Gly Ala Ser Glu Val Leu Thr Met Thr Val Lys Leu Ala Asp Leu Arg

705 710 715 720

Trp Phe Asp Ala Tyr Glu Gln Ala Trp Lys Leu Asp Ala Gly Glu Tyr

725 730 735

Val Ile Ser Ala Ala Ala Ser Ser Arg Asp Ile Arg Gln Asn Val Thr

740 745 750

Val Thr Leu

755

Claims

1.一种β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶，其特征在于，该β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶的多肽序列含有SEQ ID NO.2的第18-755位的氨基酸残基序列。

2.如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶，其特征在于，该β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶的多肽序列如SEQ IDNO.2所示。

3.如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶的编码基因，其特征在于，其核苷酸编码序列含有SEQ ID NO.1中第52-2265位的DNA序列。

4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸编码序列如SEQ ID NO.1所示。

5.权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶的制备方法，其特征在于，按照SEQ ID NO.2的第18-755位的氨基酸序列人工合成即可。

6.权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶的制备方法，其特征在于，取牦牛的瘤胃内容物，构建瘤胃未培养细菌宏基因组文库；筛选具备β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶活性的阳性克隆；通过构建亚克隆、同源对比方法获得β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶的编码基因；将该编码基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的重组表达载体是大肠杆菌表达载体，酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、丝状真菌表达载体、昆虫表达载体或者哺乳动物细胞表达载体中的任意一种。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞是Escherichia coliBL21、E.coli JM109、E.coli DH5α、Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyces lactis、Bacillus subtilisR25、Bacillus subtilis 9920、Lactic acidbacteria COCC101、Trichodermaviride，Trichoderma reesei、Aspergillus niger、Bombyx mori、Antharaeaeucalypti、CHO或者CHL细胞中的任意一种。

9.权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素酶的应用，其特征在于，将其用于纤维素降解。