CN114214306B - 一种反刍动物瘤胃原虫特异纤维素酶OCCel1A及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种反刍动物瘤胃原虫特异纤维素酶OCCel1A及其应用。本发明利用牛瘤胃原虫Ophryoscolex caudatus基因组数据，经过组装、注释分析及蛋白表达和功能实验，获得了一个瘤胃原虫特异的纤维素酶，命名为OCCel1A。该新型来源的纤维素酶降解底物CMCNa的最适pH为6.0、最适温度为55℃，比活为983U/mg，可以广泛应用于畜禽饲料、生物质能源开发、食品、纺织。

Description

一种反刍动物瘤胃原虫特异纤维素酶OCCel1A及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种反刍动物瘤胃原虫“有尾头毛虫”(Ophryoscolex caudatus,O.caudatus)特异纤维素酶(cellulase,Cel)在毕赤酵母中的分泌表达方法及应用。

背景技术

纤维素是构成植物细胞壁的基本结构物质，其是由β-D-葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的多聚葡萄糖分子。纤维素能够在酸或酶的作用下，使β-1,4-糖苷键遭到破环而产生可发酵的D-葡萄糖。生物质中的纤维素主要存在晶型和非晶型两种形式，晶型纤维素的成分中纤维素占了绝大部分比例，游离的纤维素链形成了非晶型纤维素。自然界中纤维素资源十分丰富，同时农副产品如秸秆中也含有大量的纤维素。目前对富含纤维素的生物质通常仅进行地下填埋处理，造成很大的浪费，故急需探求能够高效降解纤维素的生物酶制剂，以解决人畜争粮、能源危机以及环境污染问题。

Ophryoscolex caudatus为牛瘤胃内发挥重要降解功效的原生生物，可以促进瘤胃中纤维的消化。但目前尚未见到有关反刍动物瘤胃原虫Ophryoscolex caudatus来源的纤维素酶的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种反刍动物瘤胃原虫特异纤维素酶OCCel1A及其应用。该纤维素酶OCCel1A可以用作一种新型来源的酶制剂，并广泛应用于畜禽饲料、生物质能源开发、食品、纺织。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种反刍动物瘤胃原虫特异纤维素酶OCCel1A，该纤维素酶OCCel1A的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

优选的，所述纤维素酶OCCel1A的基因编码序列包括SEQ.ID.NO.5所示的DNA序列，或者所述纤维素酶OCCel1A的基因编码序列选自与SEQ.ID.NO.5所示的DNA序列具有90％以上同源性的来源于反刍动物瘤胃原虫基因组的序列。

优选的，所述反刍动物瘤胃原虫为头尾属(Ophryoscolex)，例如有尾头毛虫(Ophryoscolex caudatus)。

一种表达纤维素酶的重组载体，该重组载体包括上述反刍动物瘤胃原虫特异纤维素酶OCCel1A的编码序列。

一种表达纤维素酶的重组菌株，该重组菌株包括转化有上述重组载体的宿主细胞。

一种制备上述反刍动物瘤胃原虫特异纤维素酶OCCel1A的方法，包括以下步骤：

1)根据所述纤维素酶OCCel1A的基因编码序列构建甲醇诱导型重组载体，将所述重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

2)将重组菌株通过发酵进行重组纤维素酶OCCel1A的诱导表达，得到发酵液；

3)收集发酵液上清，得到重组纤维素酶OCcel1A蛋白样品。

优选的，所述宿主细胞来源于毕赤酵母(Pichia pastoris)，例如毕赤酵母GS115感受态细胞。

优选的，所述重组载体表达的目的基因序列如SEQ.ID.NO.6所示，重组纤维素酶OCcel1A的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

上述反刍动物瘤胃原虫特异纤维素酶OCCel1A在制备酶制剂中的应用。

一种酶制剂，该酶制剂包括上述反刍动物瘤胃原虫特异纤维素酶OCCel1A。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过对反刍动物瘤胃原虫O.caudatus基因组数据进行组装、注释分析，发现了一种瘤胃原虫特异的纤维素酶(命名为OCCel1A)基因，并根据基因编码序列建立了通过在宿主菌中分泌表达而制备该纤维素酶的方法。所述纤维素酶不仅酶活力高，而且可以在pH5.0～9.0的范围内维持较高的酶活性(最适温度为55℃)，在畜禽饲料、生物质能源开发、食品、纺织等领域具有一定的应用前景。

本发明根据反刍动物瘤胃原虫O.caudatus特异的纤维素酶(即纤维素酶OCCel1A)的序列构建可以高效的分泌表达该纤维素酶的甲醇诱导型毕赤酵母重组菌株，使纤维素酶OCCel1A的生产具有操作简单、周期短的优点。

附图说明

图1为实施例中重组OCCel1A基因表达产物SDS-PAGE电泳图；其中Marker为蛋白分子量。

图2为重组纤维素酶OCCel1A最适pH测定图。

图3为重组纤维素酶OCCel1A pH稳定性测定图。

图4为重组纤维素酶OCCel1A最适温度测定图。

图5为重组纤维素酶OCCel1A温度稳定性测定图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，以便于本领域技术人员理解本发明，但本发明的保护范围并不局限于此。

(一)试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母表达载体pPIC9K及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类：内切酶购自TaKaRa公司，羧甲基纤维素钠(CMCNa)购自Sigma公司。

3、培养基(相应的固体培养基均加入20g/L琼脂粉)：

(1)BMGY液体培养基(1L)：酵母提取物10g、胰蛋白胨20g及甘油10mL，121℃灭菌15min后于无菌操作台上加入YNB 100mL及500×生物素2mL。

(2)BMMY液体培养基(1L)：酵母提取物10g及胰蛋白胨20g，121℃灭菌15min后于无菌操作台上加入YNB 100mL、500×生物素2mL及甲醇5mL。

(3)YPD液体培养基(1L)：酵母提取物10g、胰蛋白胨20g及葡萄糖20g。

(4)MD固体平板(1L)：琼脂糖20g及葡萄糖20g。

其中，以100mL计，500×生物素含0.02g生物素。

(二)反刍动物瘤胃原虫O.caudatus纤维素酶OCCel1A在毕赤酵母中的分泌表达方法

1、构建毕赤酵母GS115重组菌株

1.1本发明利用反刍动物(包括秦川牛，秦川牛瘤胃内容物于2019年12月采集于陕西杨凌)瘤胃原虫O.caudatus基因组测序数据，对其基因进行组装、注释分析，鉴定得到了一个新的牛瘤胃原虫O.caudatus特异的纤维素酶(命名为OCCel1A)基因。该纤维素酶OCCel1A基因编码的对应氨基酸序列如下所示(即SEQ.ID.NO.1)：

MFKKSIVVIFASILISANCFAISLTTSFDNSKAVKDTKTVKFDSSMKSGTVINEMGFGWNLGNSLDAHTTNGNEGLNSEASWGNPKTTEAMIKKLVSKGFKTIRVPVTWHNHLIDKKYTIDPNWMNRVKTVVDMCLKNGLYVIMNVHHDQADYGVSYGKGYYPRNNQKTESEKFLLNIWSQITLAFNNGYDHHLIFETLNEPRLKGDGHEWYYQAGESNSEECVQVINEYNSLIHTVIRKSGGNNKARFLLFTSGAAAFSYVTSSGFVLPDDTSYNPKHKRILVSVHMYTPYDFAMNGDMSKNYFTQDYKNELEYNFQSLRQKFVNNGYYVVITEMGAVDKANNDQRVAWGSFYVQRARQLGMACVVWDNNQFRTSWDANEKFGLFHRDKLTFEPESLVNAFIQAAKTTLGKF

其中，N端的前21个氨基酸“MFKKSIVVIFASILISANCFA”(即SEQ.ID.NO.2)为其信号肽；其信号肽的碱基序列如SEQ.ID.NO.3所示。

因此，该纤维素酶的成熟蛋白由392个氨基酸组成，理论分子量为44.8KDa，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，基因编码序列如SEQ.ID.NO.5。

根据纤维素酶OCCel1A的氨基酸序列，按照毕赤酵母密码子偏好性，得到去除信号肽的重组瘤胃原虫O.caudatus纤维素酶OCCel1A基因序列(由北京博迈德基因技术有限公司合成，序列设计完成时间为2021年11月)，如SEQ.ID.NO.6所示。由该基因序列编码的瘤胃原虫O.caudatus纤维素酶OCCel1A重组蛋白的氨基酸序列如下所示(即SEQ.ID.NO.4)：

ISLTTSFDNSKAVKDTKTVKFDSSMKSGTVINEMGFGWNLGNSLDAHTTNGNEGLNSEASWGNPKTTEAMIKKLVSKGFKTIRVPVTWHNHLIDKKYTIDPNWMNRVKTVVDMCLKNGLYVIMNVHHDQADYGVSYGKGYYPRNNQKTESEKFLLNIWSQITLAFNNGYDHHLIFETLNEPRLKGDGHEWYYQAGESNSEECVQVINEYNSLIHTVIRKSGGNNKARFLLFTSGAAAFSYVTSSGFVLPDDTSYNPKHKRILVSVHMYTPYDFAMNGDMSKNYFTQDYKNELEYNFQSLRQKFVNNGYYVVITEMGAVDKANNDQRVAWGSFYVQRARQLGMACVVWDNNQFRTSWDANEKFGLFHRDKLTFEPESLVNAFIQAAKTTLGKF。

1.2将编码成熟的瘤胃原虫O.caudatus纤维素酶OCCel1A基因片段经EcoR I和NotI双酶切(合成重组瘤胃原虫O.caudatus纤维素酶OCCel1A基因序列时于序列两端引入相应限制性酶切位点)后，连接于经过同样双酶切的pPIC9K表达载体的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，获得重组质粒pPIC9K-OCCel1A，质粒提取采用天根质粒小提中量试剂盒。

1.3制备毕赤酵母GS115感受态细胞

挑选YPD固体平板上的Pichia pastoris GS115单克隆，接种到3mL YPD液体培养基中，30℃、200rmp摇床培养。菌体生长至OD600～1.0，转接至100mL YPD摇瓶中，30℃、200rmp摇床培养。待菌体生长至OD600～1.0，在4℃下5000rmp离心5min，去除上清，加入200mL冰水，重悬；在4℃下，5000rmp离心5min，去除上清，加入100mL冰水，重悬；在4℃下5000rmp离心5min，去除上清，加入50mL冰水，重悬；在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入4mL冰山梨醇(1M)，重悬；在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入2mL冰山梨醇(1M)，重悬，收集备用。

1.4pPIC9K-OCCel1A转化毕赤酵母GS115

将待转化的pPIC9K-OCCel1A质粒利用Bgl II限制性内切酶进行线性化，电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞；取转化菌液均匀涂于MD固体平板上培养，挑取阳性单克隆，即毕赤酵母GS115重组菌株。

2、发酵培养重组菌株并甲醇诱导重组纤维素酶表达

取毕赤酵母GS115重组菌株，接种于400mL BMGY液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养72h，5000rpm转速离心5分钟收集菌体。然后于200mL BMMY液体培养基中重悬，30℃、200rpm振荡培养进行诱导，期间每隔12h加入1mL甲醇作为诱导物。诱导72h后12000rpm离心10min，收集发酵液上清。

利用SDS-PAGE电泳对发酵液上清中的瘤胃原虫O.caudatus纤维素酶OCCel1A重组蛋白进行鉴定。SDS-PAGE结果表明，出现目标分子量大小的明显蛋白条带，几乎没有其他杂质条带，即通过毕赤酵母GS115重组菌株的分泌表达，可以非常容易的获得瘤胃原虫O.caudatus纤维素酶OCCel1A重组蛋白(图1)。

3、纤维素酶OCcel1A重组蛋白(重组纤维素酶OCCel1A)的活性分析

采用DNS法检测酶活力，具体步骤如下：在pH6.0、55℃条件下，包括900μL 1.5％的底物CMCNa和100μL适当稀释发酵液上清的反应体系于水浴锅反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活力单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖(由纤维素酶降解CMCNa而生成)所需要的酶量。

结果表明，重组纤维素酶OCCel1A的比活为983U/mg。根据测定的酶活力，重组纤维素酶OCCel1A的表达量可表示为144.8U/mL。

(三)反刍动物瘤胃原虫O.caudatus纤维素酶OCcel1A重组蛋白的性质测定

3.1重组纤维素酶OCCel1A的最适pH和pH稳定性的测定

重组纤维素酶OCCel1A在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH，具体步骤如下：底物CMCNa用不同pH的缓冲液(包括0.1mol/L的甘氨酸-盐酸缓冲液、0.2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、0.1mol/L Tris-盐酸缓冲液、0.1mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)溶解，然后于55℃下进行酶活力测定。

结果如图2所示，可知重组纤维素酶OCCel1A的最适pH为6.0，在pH5.0～6.5范围内有80％以上的相对酶活性。

随后测定了该重组纤维素酶OCCel1A的pH稳定性，具体步骤如下：将使用不同pH缓冲液适当稀释的发酵液上清置于37℃处理60min，而后在pH6.0缓冲液体系、55℃下测定酶活力。

结果如图3所示，可知该重组纤维素酶OCCel1A在pH 5.0～9.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在70％左右，说明此酶在中性和偏碱性范围内也具有较好的pH稳定性。

3.2重组纤维素酶OCCel1A的最适温度及热稳定性测定

测定最适温度的具体步骤如下：将适当稀释的发酵液上清置于pH6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液底物缓冲液体系中，于不同温度下进行酶活力检测。

热稳定性测定的具体步骤如下：发酵液上清在不同温度下处理不同时间，而后于55℃下进行酶活力测定。

最适温度测定结果(图4)表明，重组纤维素酶OCCel1A最适温度为55℃。热稳定性测定结果表明(图5)，重组纤维素酶OCCel1A有良好的热稳定性，在50℃下温育1h，能保持90％以上的酶活性。

(四)反刍动物瘤胃原虫O.caudatus纤维素酶OCcel1A应用实例

以上获得的发酵液上清含有具有较高酶活性的纤维素酶OCcel1A重组蛋白，可以通过制成纤维素酶OCcel1A制剂，应用于饲料工业以提高畜禽生产性能、提升饲料利用率，以及降低饲料成本和提高经济效益。

<110> 西北农林科技大学；中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种反刍动物瘤胃原虫特异纤维素酶OCCel1A及其应用

<160> 6

<210> 1

<211> 413

<212> PRT

<213> O.caudatus

<400> 1

Met Phe Lys Lys Ser Ile Val Val Ile Phe Ala Ser Ile Leu Ile Ser

1 5 10 15

Ala Asn Cys Phe Ala Ile Ser Leu Thr Thr Ser Phe Asp Asn Ser Lys

20 25 30

Ala Val Lys Asp Thr Lys Thr Val Lys Phe Asp Ser Ser Met Lys Ser

35 40 45

Gly Thr Val Ile Asn Glu Met Gly Phe Gly Trp Asn Leu Gly Asn Ser

50 55 60

Leu Asp Ala His Thr Thr Asn Gly Asn Glu Gly Leu Asn Ser Glu Ala

65 70 75 80

Ser Trp Gly Asn Pro Lys Thr Thr Glu Ala Met Ile Lys Lys Leu Val

85 90 95

Ser Lys Gly Phe Lys Thr Ile Arg Val Pro Val Thr Trp His Asn His

100 105 110

Leu Ile Asp Lys Lys Tyr Thr Ile Asp Pro Asn Trp Met Asn Arg Val

115 120 125

Lys Thr Val Val Asp Met Cys Leu Lys Asn Gly Leu Tyr Val Ile Met

130 135 140

Asn Val His His Asp Gln Ala Asp Tyr Gly Val Ser Tyr Gly Lys Gly

145 150 155 160

Tyr Tyr Pro Arg Asn Asn Gln Lys Thr Glu Ser Glu Lys Phe Leu Leu

165 170 175

Asn Ile Trp Ser Gln Ile Thr Leu Ala Phe Asn Asn Gly Tyr Asp His

180 185 190

His Leu Ile Phe Glu Thr Leu Asn Glu Pro Arg Leu Lys Gly Asp Gly

195 200 205

His Glu Trp Tyr Tyr Gln Ala Gly Glu Ser Asn Ser Glu Glu Cys Val

210 215 220

Gln Val Ile Asn Glu Tyr Asn Ser Leu Ile His Thr Val Ile Arg Lys

225 230 235 240

Ser Gly Gly Asn Asn Lys Ala Arg Phe Leu Leu Phe Thr Ser Gly Ala

245 250 255

Ala Ala Phe Ser Tyr Val Thr Ser Ser Gly Phe Val Leu Pro Asp Asp

260 265 270

Thr Ser Tyr Asn Pro Lys His Lys Arg Ile Leu Val Ser Val His Met

275 280 285

Tyr Thr Pro Tyr Asp Phe Ala Met Asn Gly Asp Met Ser Lys Asn Tyr

290 295 300

Phe Thr Gln Asp Tyr Lys Asn Glu Leu Glu Tyr Asn Phe Gln Ser Leu

305 310 315 320

Arg Gln Lys Phe Val Asn Asn Gly Tyr Tyr Val Val Ile Thr Glu Met

325 330 335

Gly Ala Val Asp Lys Ala Asn Asn Asp Gln Arg Val Ala Trp Gly Ser

340 345 350

Phe Tyr Val Gln Arg Ala Arg Gln Leu Gly Met Ala Cys Val Val Trp

355 360 365

Asp Asn Asn Gln Phe Arg Thr Ser Trp Asp Ala Asn Glu Lys Phe Gly

370 375 380

Leu Phe His Arg Asp Lys Leu Thr Phe Glu Pro Glu Ser Leu Val Asn

385 390 395 400

Ala Phe Ile Gln Ala Ala Lys Thr Thr Leu Gly Lys Phe

405 410

<200> 2

<200> 21

<202> PRT

<203> O.caudatus

<400> 2

Met Phe Lys Lys Ser Ile Val Val Ile Phe Ala Ser Ile Leu Ile Ser

1 5 10 15

Ala Asn Cys Phe Ala

20

<200> 3

<200> 63

<202>DNA

<203> O.caudatus

<400> 3

atgttcaaaa aaagcatagt agttatcttt gcttcaatat taatctcagc aaattgcttt 60

gca 63

<200> 4

<200> 392

<202> PRT

<203> O.caudatus

<400> 4

Ile Ser Leu Thr Thr Ser Phe Asp Asn Ser Lys Ala Val Lys Asp Thr

1 5 10 15

Lys Thr Val Lys Phe Asp Ser Ser Met Lys Ser Gly Thr Val Ile Asn

20 25 30

Glu Met Gly Phe Gly Trp Asn Leu Gly Asn Ser Leu Asp Ala His Thr

35 40 45

Thr Asn Gly Asn Glu Gly Leu Asn Ser Glu Ala Ser Trp Gly Asn Pro

50 55 60

Lys Thr Thr Glu Ala Met Ile Lys Lys Leu Val Ser Lys Gly Phe Lys

65 70 75 80

Thr Ile Arg Val Pro Val Thr Trp His Asn His Leu Ile Asp Lys Lys

85 90 95

Tyr Thr Ile Asp Pro Asn Trp Met Asn Arg Val Lys Thr Val Val Asp

100 105 110

Met Cys Leu Lys Asn Gly Leu Tyr Val Ile Met Asn Val His His Asp

115 120 125

Gln Ala Asp Tyr Gly Val Ser Tyr Gly Lys Gly Tyr Tyr Pro Arg Asn

130 135 140

Asn Gln Lys Thr Glu Ser Glu Lys Phe Leu Leu Asn Ile Trp Ser Gln

145 150 155 160

Ile Thr Leu Ala Phe Asn Asn Gly Tyr Asp His His Leu Ile Phe Glu

165 170 175

Thr Leu Asn Glu Pro Arg Leu Lys Gly Asp Gly His Glu Trp Tyr Tyr

180 185 190

Gln Ala Gly Glu Ser Asn Ser Glu Glu Cys Val Gln Val Ile Asn Glu

195 200 205

Tyr Asn Ser Leu Ile His Thr Val Ile Arg Lys Ser Gly Gly Asn Asn

210 215 220

Lys Ala Arg Phe Leu Leu Phe Thr Ser Gly Ala Ala Ala Phe Ser Tyr

225 230 235 240

Val Thr Ser Ser Gly Phe Val Leu Pro Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Pro

245 250 255

Lys His Lys Arg Ile Leu Val Ser Val His Met Tyr Thr Pro Tyr Asp

260 265 270

Phe Ala Met Asn Gly Asp Met Ser Lys Asn Tyr Phe Thr Gln Asp Tyr

275 280 285

Lys Asn Glu Leu Glu Tyr Asn Phe Gln Ser Leu Arg Gln Lys Phe Val

290 295 300

Asn Asn Gly Tyr Tyr Val Val Ile Thr Glu Met Gly Ala Val Asp Lys

305 310 315 320

Ala Asn Asn Asp Gln Arg Val Ala Trp Gly Ser Phe Tyr Val Gln Arg

325 330 335

Ala Arg Gln Leu Gly Met Ala Cys Val Val Trp Asp Asn Asn Gln Phe

340 345 350

Arg Thr Ser Trp Asp Ala Asn Glu Lys Phe Gly Leu Phe His Arg Asp

355 360 365

Lys Leu Thr Phe Glu Pro Glu Ser Leu Val Asn Ala Phe Ile Gln Ala

370 375 380

Ala Lys Thr Thr Leu Gly Lys Phe

385 390

<200> 5

<200> 1179

<202> DNA

<203> O.caudatus

<400> 5

attagcttaa caacatcttt tgacaatagt aaagctgtaa aagatacaaa aacagtaaaa 60

tttgatagtt caatgaaatc aggaacagta atcaatgaaa tgggatttgg ttggaattta 120

ggaaactctt tagatgcaca tactacaaat ggtaatgaag gcttgaattc agaagcaagt 180

tggggaaatc caaaaactac tgaagcaatg ataaaaaaat tagtcagcaa aggtttcaaa 240

acaatcagag tcccagtaac ttggcacaac catttaatag ataaaaaata tactattgat 300

ccaaattgga tgaatagagt aaaaacagta gtagatatgt gccttaaaaa tggtctttat 360

gtaattatga atgttcatca tgatcaagct gattatggtg tttcttatgg aaaaggatat 420

tatccaagaa ataatcaaaa aactgaatca gaaaaatttt tacttaatat atggagtcaa 480

attactttag cttttaataa tggatatgat catcacttaa tttttgaaac acttaatgaa 540

cctagattaa aaggagatgg tcatgaatgg tactatcaag ctggtgaatc aaattcagaa 600

gaatgtgtcc aagttatcaa tgaatataat tcattaattc atacagtaat aagaaaatct 660

ggaggaaata ataaagctag atttttatta tttacttcag gagctgctgc ttttagttat 720

gttacttcaa gtggatttgt tttacctgat gatacttcat acaatccaaa acacaaaaga 780

attcttgtta gtgttcatat gtatactcca tatgattttg ctatgaatgg agatatgagc 840

aaaaactatt tcactcaaga ttataaaaat gaattagaat ataatttcca atctttaaga 900

caaaaatttg ttaataatgg atattatgta gttattacag aaatgggagc tgtagacaaa 960

gcaaataatg atcaaagagt tgcatggggt tctttctatg ttcaaagagc tagacaactt 1020

ggaatggctt gtgttgtttg ggataataac caatttagaa ctagttggga cgctaatgaa 1080

aaattcggac ttttccatag agataaatta acttttgaac ctgaatcatt agttaatgct 1140

tttattcaag ctgctaaaac aactttaggt aaattttaa 1179

<200> 6

<200> 1179

<202> DNA

<203> 人工序列

<400> 6

atctctttga ctacttcttt cgataactct aaggctgtta aagatactaa aactgttaag 60

ttcgactctt ctatgaaatc tggtactgtt attaacgaaa tgggttttgg ttggaacttg 120

ggtaattctt tggatgctca tactactaat ggtaatgaag gtttgaatag tgaagcttct 180

tggggtaacc ctaagactac tgaagctatg attaagaaat tggtttctaa gggtttcaag 240

actattagag ttcctgttac ttggcataac catttgattg ataagaagta taccatcgat 300

ccaaactgga tgaacagagt taaaactgtt gttgatatgt gtttgaagaa cggtttgtac 360

gttattatga acgttcatca tgatcaagct gattatggtg tttcttatgg taagggttat 420

tatcctagaa acaaccaaaa gactgaatct gaaaagttct tgttgaacat ttggtctcaa 480

attactttgg cttttaacaa cggttatgat catcatttga tctttgaaac tctgaacgaa 540

cctagattga agggtgatgg tcatgaatgg tactatcaag ctggtgaatc taactctgaa 600

gaatgtgttc aagttattaa cgagtataac tctttgatcc atactgttat tagaaagtct 660

ggtggtaaca ataaagctag atttttgttg ttcacctctg gtgctgctgc tttctcttat 720

gttacttctt ctggttttgt tttgccagat gatacttctt ataacccaaa acataagaga 780

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aaaaactact tcactcaaga ttacaagaac gaattggaat ataacttcca atctttgaga 900

caaaagttcg ttaacaacgg ttactatgtt gttattactg aaatgggtgc tgttgataag 960

gctaacaatg atcaaagagt tgcttggggt tctttctatg ttcaaagagc tagacaattg 1020

ggtatggctt gtgttgtttg ggataataac caatttagaa cttcttggga tgctaacgaa 1080

aagttcggtt tgttccatag agataagttg acttttgaac ctgaatcttt ggttaatgct 1140

tttattcaag ctgctaaaac tactttgggt aaattttaa 1179

Claims (8)

1.一种反刍动物瘤胃原虫特异纤维素酶OCCel1A，其特征在于：该纤维素酶OCCel1A的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

2.一种表达纤维素酶的重组载体，其特征在于：该重组载体包括如权利要求1所述的反刍动物瘤胃原虫特异纤维素酶OCCel1A的编码序列。

3.一种表达纤维素酶的重组菌株，其特征在于：该重组菌株包括转化有如权利要求2所述的重组载体的宿主细胞。

4.一种制备权利要求1所述的反刍动物瘤胃原虫特异纤维素酶OCCel1A的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)根据所述纤维素酶OCCel1A的编码序列构建重组载体，将重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

2)将重组菌株通过发酵进行重组纤维素酶OCCel1A的诱导表达，得到发酵液；

3)收集发酵液上清，得到重组纤维素酶OCcel1A蛋白样品。

5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞来源于毕赤酵母（Pichia pastoris）。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述重组载体表达的目的基因序列如SEQ.ID.NO.6所示。

7.一种如权利要求1的反刍动物瘤胃原虫特异纤维素酶OCCel1A在制备酶制剂中的应用。

8.一种酶制剂，其特征在于：该酶制剂包括如权利要求1的反刍动物瘤胃原虫特异纤维素酶OCCel1A。

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