CN106755011A

CN106755011A - 一种多糖裂解单加氧酶lpmo m2编码基因及其酶与制备方法和应用

Info

Publication number: CN106755011A
Application number: CN201510835327.5A
Authority: CN
Inventors: 尹恒; 张鑫; 赵勇; 王文霞; 谭海东
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2015-11-25
Filing date: 2015-11-25
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明公开了一种来源于稻瘟病菌的多糖裂解单加氧酶LPMO M2编码基因及其制备方法与应用。本发明所涉及的多糖裂解单加氧酶LPMO M2来源于水稻致病菌稻瘟病菌(Magnaporthegrisea 70-15)。本发明还提供了一种制备该新型多糖裂解单加氧酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将该新多糖裂解单加氧酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的多糖裂解单加氧酶LPMO M2可以降解PASC(用磷酸处理过的微晶纤维素)生成纤维寡糖和纤维寡糖酸。本发明提供的多糖裂解单加氧酶LPMO M2可广泛应用于化工、农业、饲料添加和医药等领域，具有较大的生产潜力和经济价值。

Description

一种多糖裂解单加氧酶LPMO M2编码基因及其酶与制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种多糖裂解单加氧酶LPMO M2的基因序列及其制备方法和应用。本发明还提供了该多糖裂解单加氧酶的重组质粒和重组基因工程菌株。本发明的多糖裂解单加氧酶LPMO M2可广泛应用于农业、食品、饲料添加及医药等领域。

背景技术

随着能源需求的增长、储备的减少以及全球温室效应的加剧，寻求可替代化石燃料的可再生能源已亟不可待。除太阳能和风能等洁净能源外，含量丰富的生物质能源成为人们关注的焦点。木质纤维素是自然界中分布极其广泛且数量极多的生物质资源，全球每年纤维素的产量高达约8×10¹³kg，合理地利用这类资源将会对能源危机的缓解具有重大意义。目前高效、环保的利用纤维素等难溶多糖是该类生物质开发和利用的一大瓶颈，纤维素的利用主要通过化学法和酶法，与化学法相比酶法具有设备简单、反应条件温和及环境友好等优点。酶法主要是通过由内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-1,4-D-葡萄糖苷酶组成的酶系降解纤维素。由于传统的纤维素酶系均属于糖苷水解酶家族，它们对于底物结晶区的降解效率较低，且成本较高，这使得传统的纤维素酶系难以满足工业应用的需求，限制了纤维素等生物质的高效利用。

多糖裂解单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases,LPMO)是一类在二价金属离子和还原剂存在的条件下氧化破坏难溶多糖晶体结构的酶。它的出现提高了难溶多糖的降解效率，使得生物质的高效转化成为可能。多糖裂解单加氧酶的来源非常丰富，目前已从细菌(如Streptomyces coelicolorA3(2))、真菌(如Neurosporacrassa OR74A)和病毒(如Anomalacupreaentomopoxvirus CV6M)中发现该类酶的。目前已经报道的LPMO有27个，其中AA9家族有14个，AA10家族有12个，AA11家族有1个；本发明中的多糖裂解单加氧酶LPMO M2来源于稻瘟病菌，是一个新型的LPMO，该酶的克隆表达为后续纤维素的高效降解奠定基础。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型的来源于稻瘟病菌(Magnaporthegrisea 70-15)的多糖裂解单加氧酶LPMO M2及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型多糖裂解单加氧酶LPMO M2的方法。

本发明的第三个目的是提供含有上述的多糖裂解单加氧酶lpmo M2基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的另一个目的是提供新型多糖裂解单加氧酶LPMO M2在纤维素降解中的应用。

本发明所提供的多糖裂解单加氧酶LPMO M2，来源于水稻致病菌稻瘟病菌(Magnaporthgrisea 70-15)，其氨基酸序列具有如下特征中的至少一个：

1)序列表中SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-303或18-303位氨基酸残基序列，其中1-17位为信号肽，18-303位为有活性的多糖裂解单加氧酶LPMO M2的氨基酸序列。

2)将序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-303或18-303位氨基酸残基进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成具有多糖裂解单加氧酶活性不变的氨基酸序列。

本发明还提供了多糖裂解单加氧酶LPMO M2的编码基因(命名为lpmo M2)，具有下述核苷酸序列特征中的至少一个：

1)序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解纤维素的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有多糖裂解单加氧酶活性的核苷酸序列。

本发明的多糖裂解单加氧酶LPMO M2的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的LPMO M2的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

制备重组酶LPMO M2的方法，是将编码基因lpmo M2克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的多糖裂解单加氧酶。

所述的重组表达多糖裂解单加氧酶LPMO M2的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。

用于重组表达的多糖裂解单加氧酶LPMO M2的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lactic acid bacteria COCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride，Trichodermareesei，Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori，Antharaea eucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO，幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。

上述的多糖裂解单加氧酶在纤维素降解中可以应用，包括如下应用中的一种或二种；

1)在断裂纤维素糖苷键，获得纤维寡糖中的应用；

2)在氧化降解木质素等生物质，获得纤维寡糖和纤维寡糖酸中的应用；

所述多糖裂解单加氧酶LPMO M2与纤维素酶系混合后，在协同降解纤维素、制备生物乙醇方面可以应用。

本发明的多糖裂解单加氧酶LPMO M2的基因序列是通过无限制克隆(RF克隆)技术从稻瘟病菌(Magnaporthegrisea 70-15)中克隆得到。该基因编码区长912bp，编码了303个氨基酸，分子量约31.6KDa,属于糖苷水解酶61家族(现称为AA9家族)。大肠杆菌重组表达获得的LPMO M2，在37℃、ph＝6.5的条件下可以氧化降解经过磷酸处理后的微晶纤维素(PASC)。本发明的多糖裂解单加氧酶LPMO M2与同家族已经报道的LPMO进行序列比对，结果发现同源性最高可达45％，且该酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加及医药等领域。

附图说明

图1:多糖裂解单加氧酶lpmo M2基因的电泳检测

各泳道加入的样品分别是：泳道1-BM 5000DNA Marker；泳道2、3-lpmo M2PCR产物

图2:重组多糖裂解单加氧酶LPMO M2表达的聚丙烯酰胺凝胶电泳图

(SDS-PAGE)。各泳道加入的样品分别是：泳道1-E.coli BL21(DE3)/pET22b-lpmo M2诱导前全菌；泳道2-诱导24h全菌；泳道3-渗透休克法处理后的蛋白上清；泳道4：渗透休克法处理后浓缩5倍的蛋白上清；泳道5-预染蛋白分子量标准；图3：LPMO M2降解PASC的产物分析.

具体实施方式

实施例1多糖裂解单加氧酶全长基因克隆

按真菌RNA提取试剂盒(上海生工，SK8659)操作步骤提取稻瘟病菌菌株Magnaporthegrisea 70-15的RNA，按TaKaRa生物公司的cDNA第一链合成试剂盒(Code NO.:6210A)的操作步骤合成cDNA。根据目的基因的核苷酸序列设计引物，上游引物5′-CTGCCCAGCCGGCGATGGCCCACTCGCACATCCCATACATC-3′，下游引物：5′-TTGTTAGCAGCCGGATCTCACCATCTCGGCCCCGGCACAAATG-3′。以合成的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为：98℃预变性3min，98℃变性10s,55℃退火5s,72℃延伸2min,共30个循环，72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，切胶回收目的片段，通过无限制克隆法(RF克隆)将目的基因连接到表达载体pET-22b后测序。

实施例2多糖裂解单加氧酶基因序列分析

测序的结果采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)分析，Vector NTI Suite 8.0软件进行多序列比对，分析其同源性。采用Simple Modular Architecture Research Tool(SMART)在线工具分析序列的结构域。

获得的多糖裂解单加氧酶基因(命名为lpmo M2)编码区长912bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。Lpmo M2编码303个氨基酸和1个终止密码子，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，蛋白质理论分子量为31.6kDa，预测等电点为5.94。SMART分析表明，LPMO M2的氨基酸序列中1-17位为信号肽。LPMO M2的结构域特征与AA9家族成员更为相似，由此表明LPMO M2为AA9家族的一名新成员。用SWISS-MODEL同源建模服务器(http://swissmodel.expasy.org)对多糖裂解单加氧酶LPMO M2的蛋白质三维结构进行同源建模，结果显示构建的LPMO M2结构模型的QMEAN(QMEAN为评价模型质量的分值)较低，说明得到的LPMO M2三维结构模型不可信。SEQ ID NO.1

ATGTTATTCACAGTAGCAGCAGCAACACTCCTTCCCGGCCTGGCCCTCGCCCACTCGCACATCCCATACATCATCATCAACGGCGAGCAGTTCCCAGGCCACGTCCCCAAGACCACCAACAACCCACCCAACATCGTCGGCTGGACGGCCAACAACACCGACGACGGGCCTGTCAACGCGACTCTCTACTCGGACCCCGACATCATCTGCCACCGGGCCGCCACCCCCGCCACCGCCCACGCCCCCGTCCGCGCCGGCGACTCGATCCACATCCAGTGGAACGGCTGGCCGGCCAGCCACGTCGGGCCGGCGCTGACGTACCTCGCGCGATGCGAGGGCGAAGGCGGCTGCGCGGGCGTCGACAAGCAGGCGCTGAGCTTCTTCAAGATCGACGACAGCGCGCCCGCGCTGCTGGACCAGAGCAGCGGCCCGCCGGGCAGGTGGGCCAGCGACGTGGTCATCGCCAACAACAACAGCTGGACCGTGACGGTGCCCAAGGGGACGGCGCCCGGTGCCTACGTGATGCGGCACGAGCTCATCGCGCTGCACTTTGCGGCCCGGAAGGGCGGGGCGCAAAACTACCCGCTCTGCTTGAACTTGTGG GTGCTGGGGCAGGAGGATGGCGCCGAGGGCGCTTCCTGGAGGGCGGGGGCTCTGGGGTACGGCCAGGGCGTGCCTGCCACCGACATGTATCGGAGTGACGACCCGGGGGTGGACATCGACGTCGCGGTGCCGAGGAAGACGTATACCATCCCCGGGCCGACGGTCGTTGGCGGTGCGGCTCCCATCCGGCCGGCAGATCAGACCAAGAGCATTGCGACTGCCTACGGGACGCCTGTGGCGATTGTGAGTGGCACCGCGACGGTGCCCATGCCGATGGGAGTGACATTTGTGCCGGGGCCGAGATGGTGA

SEQ ID NO.2

MLFTVAAATLLPGLALAHSHIPYIIINGEQFPGHVPKTTNNPPNIVGWTANNTDDGPVNATLYSDPDIICHRAATPATAHAPVRAGDSIHIQWNGWPASHVGPALTYLARCEGEGGCAGVDKQALSFFKIDDSAPALLDQSSGPPGRWASDVVIANNNSWTVTVPKGTAPGAYVMRHELIALHFAARKGGAQNYPLCLNLWVLGQEDGAEGASWRAGALGYGQGVPATDMYRSDDPGVDIDVAVPRKTYTIPGPTVVGGAAPIRPADQTKSIATAYGTPVAIVSGTATVPMPMGVTFVPGPRW

实施例3lpmo M2基因在大肠杆菌中的重组表达

以稻瘟病菌cDNA的基因组DNA为模板，利用设计的上游引物(5′-CTGCCCAGCCGGCGATGGCCCACTCGCACATCCCATACATC-3′)和下游引物(5′-TTGTTAGCAGCCGGATCTCACCATCTCGGCCCCGGCACAAATG-3′)扩增编码多糖裂解单加氧酶的成熟蛋白的基因序列(不包括信号肽基因)。PCR扩增产物和表达载体pET22b(美国Novagen公司)通过无限制克隆法(RF克隆)连接，将连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养12-16h，挑取单克隆用上下游引物进行菌落PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；将单克隆接入含有100μg/mL氨苄西林的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；将质粒；接着将该重组质粒送去华大基因(北京)测序，结果表明，在pET-22b的pelB信号肽和his标签之间插入SEQ ID NO 1所示的lpmo M2基因，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pET22b-lpmo M2。

将pET22b-lpmo M2转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，然后按照该公司提供的操作步骤进行多糖裂解单加氧酶LPMO M2的诱导表达。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测多糖裂解单加氧酶的表达情况，结果如图2所示，多糖裂解单加氧酶在IPTG诱导下有明显的表达。

实施例4多糖裂解单加氧酶LPMO M2氧化降解PASC的产物分析

取5mgPASC，加入多糖裂解单加氧酶LPMO M2(1μM)、维生素C(1mM)和CuSO₄(1mM)，37℃反应48h后终止反应，离心除去不溶底物，去上清，用savage法按savage试剂：反应产物＝1：4的比例振荡并离心除去产物中蛋白质后用MALDI-TOF检测产物。

如图3所示产物主要为DP＝5-10的寡糖以及DP＝6-9的糖酸，因此该酶可以被用于寡糖和糖酸的制备，并且可以与纤维素酶系协同降解纤维素提高纤维素降解效率，为纤维素的降解提供新的视角。

Claims

1.一种多糖裂解单加氧酶LPMO M2编码基因其特征在于：具有下列特征中的至少一个：

1)序列表中SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-303或第18-303位氨基酸残基序列；

2)对序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有多糖裂解单加氧酶活性的氨基酸序列。

2.一种权利要求1所述多糖裂解单加氧酶编码基因lpmo M2，其核苷酸序列具有具有如下特征中的至少一个：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有多糖裂解单加氧酶活性的核苷酸序列；

4)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解纤维素的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

3.如权利要求1所述的多糖裂解单加氧酶的制备方法，其特征在于：是将多糖裂解单加氧酶LPMO M2编码基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的多糖裂解单加氧酶；

上述多糖裂解单加氧酶LPMO M2编码基因具有下列特征中的至少一种：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列，

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列，

3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有多糖裂解单加氧酶活性的酶的核苷酸序列；

所述的重组表达多糖裂解单加氧酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。

4.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于：用于重组表达多糖裂解单加氧酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lactic acid bacteria COCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride，Trichodermareesei，Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori，Antharaea eucalypti等)，哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO，幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)中的一种。

5.一种权利要求1所述的多糖裂解单加氧酶的应用，其特征在于：该酶对纤维素类底物PASC有氧化降解活性。

6.一种权利要求1所述的多糖裂解单加氧酶在纤维素降解中的应用，其特征在于：包括如下应用中的一种或二种；

1)在断裂纤维素糖苷键，获得纤维寡糖中的应用；

2)在氧化降解木质素等生物质，获得纤维寡糖和纤维寡糖酸中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述多糖裂解单加氧酶LPMO M2与纤维素酶系混合后，在协同降解纤维素、制备生物乙醇方面的应用。