WO2015118205A1 - Polipéptidos con actividad polisacárido monooxigenasa y su uso para la producción de azúcares fermentables - Google Patents

Polipéptidos con actividad polisacárido monooxigenasa y su uso para la producción de azúcares fermentables Download PDF

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WO2015118205A1
WO2015118205A1 PCT/ES2015/070079 ES2015070079W WO2015118205A1 WO 2015118205 A1 WO2015118205 A1 WO 2015118205A1 ES 2015070079 W ES2015070079 W ES 2015070079W WO 2015118205 A1 WO2015118205 A1 WO 2015118205A1
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biomass
enzymes
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PCT/ES2015/070079
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Bruno Díez García
Ana GÓMEZ RODRÍGUEZ
Jorge GIL MARTÍNEZ
Noelia VALBUENA CRESPO
Francisco Manuel REYES SOSA
Antonio Javier MORENO PÉREZ
Rafael DUEÑAS SÁNCHEZ
Ana María MUÑOZ GONZÁLEZ
Dolores PÉREZ GÓMEZ
Sandra GAVALDÁ MARTÍN
Lucía MARTÍN PÉREZ
Laura SÁNCHEZ ZAMORANO
Consolación ÁLVAREZ NÚÑEZ
María De Los Ángeles BERMÚDEZ ALCÁNTARA
Laura LEDESMA GARCÍA
Ana Isabel PLATERO GÓMEZ
Pablo GUTIÉRREZ GÓMEZ
Ricardo ARJONA ANTOLÍN
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Abengoa Bioenergia Nuevas Tecnologías, S. A.
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    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the invention relates to the field of bioproducts, more particularly, to enzymes with monooxygenase polysaccharide activity and their use, forming part of enzymatic cocktails, for the production of fermentable sugars from cellulosic biomass during the production processes of bioproducts such as bioethanol
  • Vegetable biomass provides an abundant source of potential energy in the form of carbohydrates that can be used for numerous industrial and agricultural processes and, therefore, is an important renewable source for the generation of fermentable sugars.
  • the fermentation of these sugars can produce commercially valuable end products, such as ethanol also called bioethanol.
  • ethanol also called bioethanol.
  • the efficient conversion of cellulosic biomass into fermentable sugars, such as glucose is a major challenge.
  • the enormous potential energy of the large amounts of carbohydrates that make up plant biomass is not sufficiently used because sugars are part of complex polymers (polysaccharides, such as cellulose and hemicellulose) and, therefore, are not easily accessible for fermentation.
  • cellulose can be pretreated, mechanically, chemically, enzymatically or in other ways, to increase its susceptibility to hydrolysis.
  • a saccharification or hydrolysis stage takes place consisting of an enzymatic process whereby complex carbohydrates (such as starch or cellulose) are hydrolyzed into their monosaccharide components.
  • complex carbohydrates such as starch or cellulose
  • the objective of any saccharification technology is, therefore, to alter or eliminate structural and compositional impediments in order to improve the rate of enzymatic hydrolysis and increase the yields of fermentable sugars obtained from cellulose or hemicellulose (N. Mosier and col., 2005, Bioresource Technology 96, 673-686).
  • a fermentation process is carried out.
  • Cellulases are multienzyme complexes comprising at least three major components, endo ⁇ -glucanase (EC 3.2.1.4), exo ⁇ -glucanase or cellobiohydrolase (EC 3.2.1 .9.1) and ⁇ -glucosidase (EC 3.2.1. 21), and have been shown to act synergistically in the hydrolysis of cellulose (Woodward, J. 1991, Bioresource Technology Vo ⁇ 36, p. 67-75).
  • Microbial cellulases have become focal biocatalysts due to their complex nature and extensive industrial applications (Kuhad R. C. et al., 201 1, Enzyme Research, Article ID 280696).
  • Kuhad R. C. et al. 201 1, Enzyme Research, Article ID 280696.
  • considerable attention has been given to current knowledge about cellulose production and the challenges in cellulase research, especially in the direction of improving the process economy of various industries, in order to obtain cellulases with Greater activity and better properties.
  • glycosyl-hydrolase proteins of family 61 have been known for more than 20 years.
  • the first GH61 described, called CEL1 was isolated from Agar ⁇ cus bisporus in 1992 (Raguz et al., 1992, Gene 1 19: 183-190).
  • CEL1 glycosyl-hydrolase proteins of family 61
  • These GH61 proteins are accessory proteins that contribute to cellulose degradation.
  • Cu-dependent polysaccharide monooxygenases Polysaccharide Monooxygenase; PMOs).
  • PMOs are relatively small proteins with molecular masses typically between 20 and 50 kDa (Baldrian and Valaskova 2008, FEMS Microbiology Reviews 32: 501-521; Harris et al., 2010, Biochemistry 49: 3305- 3316). These proteins require two oxygen molecules to produce the breakage of the product and its oxidation. One of these molecules is derived from water, the other enters the reaction in the form of molecular oxygen, which is necessary for direct oxidation of the substrate.
  • members of this family of enzymes act as Cu monooxygenases that catalyze cellulose rupture by an oxidative mechanism, releasing celodextrins (Langston et al., 201 1, Applied and Environmental Microbiology 77: 7007-7015).
  • the hydrolytic efficiency of a multi-enzymatic complex in the process of saccharification of cellulosic material depends on both the properties of individual enzymes and the proportion of each enzyme present in the complex. Therefore, in the context of biofuel production processes, it is necessary to design enzymatic cocktails with improved individual activities, and with the proportion of each one optimized, whose use during the saccharification or hydrolysis stage of cellulosic biomass leads to an improvement in the performance of said stage by an increase in the amount of fermentable sugars obtained at low enzyme doses. These sugars may later be fermented to produce biofuels, such as bioethanol, so that the efficiency and profitability of the entire biofuel production process would ultimately increase.
  • the present invention provides polypeptides with monooxygenase polysaccharide activity (PMO, also known as glycosyl hydrolases of family 61 or GH61) which have been identified, isolated and characterized from strain C1 of Myceliophthora thermophila.
  • PMO monooxygenase polysaccharide activity
  • these polypeptides have the advantage that they are capable of increasing the saccharification performance of cellulosic biomass, by increasing the amount of fermentable sugars produced at the end of said hydrolytic process, when they are added to the enzymatic cocktails used in biofuel production processes.
  • Said polypeptides are mono-oxygen enzymes of polysaccharides that intervene in the initial phases of the process of decomposition of cellulosic biomass to fermentable sugars, these enzymes being responsible for improving the accessibility of the rest of the enzymatic machinery to the substrate. In this way, they increase the yield of the hydrolysis process by increasing the amount of simple sugars obtained (fundamentally, glucose) and with it, ultimately, the yield of ethanol production from biomass.
  • the inventors of the present invention have identified, in the genome of Myceliophthora thermophila, 21 genes encoding enzymes with PMO activity (the amino acid sequences of these 21 mature enzymes are shown in SEQ ID NO: 43 to SEQ ID NO: 63) .
  • these polypeptides were isolated from the fungus, characterized and added to an enzymatic mixture comprising the main cellulolytic enzymes produced by the C1 strain of Myceliophthora thermophila, in order to evaluate their effect on saccharification performance of pretreated biomass (PCS or pretreated corn stover), showing an increase in the concentration of fermentable sugars (mainly glucose) released in the hydrolytic process compared to an enzymatic cocktail that did not comprise the PMO activity polypeptides of the invention.
  • PCS or pretreated corn stover pretreated biomass
  • the improvement in the performance of the enzymatic mixtures used to produce fermentable sugars from cellulosic material in biofuel production processes, preferably ethanol, is essential to ensure its profitability.
  • the supplementation of the enzymatic cocktail with these enzymes provided by the invention thus contributes to improving the performance of the hydrolytic process where said cocktails are used.
  • a first aspect of the present invention relates to an isolated polypeptide with monooxygenase polysaccharide activity, hereafter referred to as "polypeptide of the invention", which comprises an amino acid sequence that has at least 80% identity with an amino acid sequence. selected from SEQ ID NO: 43 to SEQ ID NO: 63.
  • the polypeptide of the invention can be isolated, preferably from M. thermophila, or recombinantly produced.
  • the polypeptide of the present invention and its variants or derivatives can be synthesized, for example, but not limited to, in vitro. For example, by solid phase peptide synthesis or by recombinant DNA approaches.
  • polypeptide of the invention can be produced recombinantly, not only directly but as a fusion polypeptide together with a heterologous polypeptide, which may contain, for example, but not limited to, a signal sequence or other polypeptide having a protease cleavage site. , for example, but not limited to, at the N-terminal end of the mature protein or polypeptide.
  • the polypeptide of the invention may have variants. These variants refer to limited variations in the amino acid sequence, which allow the maintenance of the functionality of the polypeptide. This means that the reference sequence and the variant sequence are similar as a whole, and identical in many regions. These variations are generated by substitutions, deletions or additions. These substitutions are conserved amino acids.
  • the conserved amino acids are amino acids that have similar side chains and properties in terms of, for example, hydrophobicity or aromaticity.
  • substitutions include, but are not limited to, substitutions between glutamic acid (Glu) and aspartic acid (Asp), between lysine (Lys) and arginine (Arg), between asparagine (Asn) and glutamine (Gln), between serine (Ser) and threonine (Thr), and / or among the amino acids that make up the alanine (Ala), leucine (Leu), valine (Val) and isoleucine (lie) group.
  • Variations can be artificially generated variations, such as by mutagenesis or direct synthesis. These variations do not cause essential modifications in the essential characteristics or properties of the polypeptide. Therefore, peptides or polypeptides whose amino acid sequence is identical or homologous to the sequences described in the present invention are also included within the scope of the present invention.
  • polysaccharide monooxygenase PMO
  • Glycosyl hydrolase of family 61 GH61
  • PMO polysaccharide monooxygenase
  • GH61 Glycosyl hydrolase of family 61
  • a saccharification reaction for example, that in which endoglucanases, beta-glucosidases and cellobiohydrolases are used
  • results in a greater amount (higher yield) of one or more soluble sugars for example, glucose
  • PMO activity can be determined by, for example, indirect oxidative tests that colorimetrically evidence the electron transfer phenomenon using different electron donor and acceptor compounds (Kitt et al., 2012, Biotechnology for Biofuels Vol. 5:79, p. 1 -13 or the one shown in Example 3).
  • biomass efficiency could be measured, for example, by combining the PMO polypeptide with cellulase enzymes in a saccharification reaction and determining if there is an increase in glucose yield compared to the same saccharification reaction carried out in the absence. of said polypeptide.
  • PMOs comprising amino acid sequences that are at least 80% identical to a sequence selected from SEQ ID NO: 43 to SEQ ID NO: 63 can be obtained from a filamentous fungus, such as, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Gibberella, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium.
  • a filamentous fungus such as, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Gibberella, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Sch
  • the PMO is a PMO of Myceliophthora thermophila, Gibberella zeae, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma trichoderma trichoderma trichoderma trichoderma trichoderma trichoderma trichodermacytochiatumumumumum.
  • the polypeptide of the invention comprises an amino acid sequence having at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% , 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 43 to SEQ ID NO: 63.
  • identity refers to the ratio of nucleic acid or amino acid residues that are identical between two nucleic acid or amino acid sequences that are being compared.
  • identity means the ratio of nucleic acid or amino acid residues that are identical between two nucleic acid or amino acid sequences, with respect to the full length of the reference sequence.
  • the degree of identity can be determined using the Clustal method, the Wilbur-Lipman method, the GAG program, which includes GAP, BLAST or BLASTN, EMBOSS Needle and FASTA. Also I know You can use the Smith Waterman algorithm in order to determine the degree of identity between two sequences.
  • sequence comparison typically one of the sequences acts as a reference sequence against which the "problem" sequences are compared.
  • a sequence comparison algorithm is used to determine its identity, the reference sequence and the problem sequence (s) are entered into the program, and the parameters thereof are configured. You can use the program parameters that appear by default or be configured, preferably those parameters will be those that appear by default.
  • the sequence comparison algorithm calculates the percentage of identity between the problem sequence (s) and the reference sequence based on the program parameters.
  • Two examples of algorithms that are useful for determining percent sequence identity are BLAST and BLAST 2.0, described in AltschuI et al. (1997) Nucleic Acids Res 25 (17): 3389-3402 and AltschuI et al. (1990) J.
  • the polypeptide of the invention comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 43 to SEQ ID NO: 63.
  • the polypeptide of the invention comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 43 to SEQ ID NO: 63, are the polypeptides that correspond to the immature pre-proteins or polypeptides of mature PMO enzymes of SEQ ID NO: 43 to SEQ ID NO: 63.
  • pre-proteins comprise a peptide signal located at the N-terminal end of the amino acid sequence of the mature enzyme.
  • These pre-proteins are, for example, but not limited to, SEQ ID NO: 22 to SEQ ID NO: 42.
  • the signal peptide of each of them has been identified and is shown indicated in the respective polypeptide sequences in the list of sequences
  • the polypeptide of the invention consists of an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 43 to SEQ ID NO: 63, said sequences correspond to the following mature polypeptides: PMO-04725 (SEQ ID NO : 43), PMO-06230 (SEQ ID NO: 44), PMO-09768 (SEQ ID NO: 45), PMO- 01470 (SEQ ID NO: 46), PMO-03248 (SEQ ID NO: 47), PMO- 00727 (SEQ ID NO: 48), PMO-10391 (SEQ ID NO: 49), PMO-10824 (SEQ ID NO: 50), PMO-09767 (SEQ ID NO: 51), PMO-03778 (SEQ ID NO: 52), PMO-04750 (SEQ ID NO: 53), PMO-10518 (SEQ ID NO: 54), PMO-05022 (SEQ ID NO: 55), PMO-05366 (SEQ ID NO: 56), PMO- 02839 (SEQ ID NO: 57
  • pre-protein refers to a polypeptide that includes a signal peptide (or leader sequence) at its amino terminal end. Said signal peptide is cleaved from the pre-protein by a peptidase, thus secreting the mature protein. The secreted portion of the polypeptide is called “mature protein” or “secreted protein.”
  • secreted protein is one that directs the polypeptide into the cell towards its secretion pathway.
  • the polypeptides referred to herein as PMO-01470, PMO-04725, PMO-09768 and PMO-06230 were the ones that increased increases in saccharification capacity when they were added, separately or in synergistic combinations , as a supplement to mixtures or enzymatic cocktails produced by M. thermophila (see figures 1, 2, 3 and 27).
  • the polypeptide of the invention consists of an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 or SEQ ID NO: 46.
  • PMO-04725 and PMO-06230 have a synergistic effect in improving hydrolysis efficiency when used in combination in an enzyme cocktail comprising the main cellulolytic enzymes (beta- glucosidase, cellobiohydrolases and endoglucanase) from M. thermophila.
  • Fig. 3 shows that the mixture of both PMOs in said cocktail yields more glucose than the sum of the effect of improving the hydrolysis of both enzymes used separately in the same cocktail. Therefore, in an even more preferred embodiment, the polypeptide of the invention consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44.
  • increase refers to the increase in the yield of a reaction product, for example, of a fermentable sugar, produced when a particular component present during the reaction (such as a PMO polypeptide of the invention) causes a higher production of the product compared to a reaction carried out under the same conditions and with the same substrate but in the absence of the component in question.
  • a particular component present during the reaction such as a PMO polypeptide of the invention
  • polynucleotide of the invention which encodes at least one polypeptide of the invention.
  • polynucleotide of the invention which encodes at least one polypeptide of the invention.
  • isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide of the invention.
  • nucleotide sequence refers to a polymeric form of nucleotides of any length that may or may not be chemical or biochemically modified. They refer, therefore, to any polyiribonucleotide or polydeoxyribonucleotide, both single-stranded and double-stranded.
  • the polynucleotide of the invention can therefore be DNA, RNA, or derivatives of both DNA and RNA, including cDNA.
  • the polynucleotide of the invention can be obtained artificially by conventional cloning and selection methods, or by sequencing.
  • the polynucleotide in addition to the coding sequence, can carry other elements, such as, but not limited to, introns, non-coding sequences at the 5 'or 3' ends, ribosome binding sites, or stabilizing sequences. These polynucleotides can additionally include coding sequences for additional amino acids that may be useful, for example, but not limited, to increase the stability of the peptide generated from it or allow a better purification thereof. Nucleic acid sequences encoding the polypeptides of the invention can, for example, be designed based on the amino acid sequences provided in the present invention.
  • the nucleotide sequences encoding the immature PMO polypeptides described in the present invention preferably consist of: PMO-04725 (SEQ ID NO: 1), PMO-06230 (SEQ ID NO: 2), PMO-09768 (SEQ ID NO: 3), PMO-01470 (SEQ ID NO: 4), PMO-03248 (SEQ ID NO: 5), PMO-00727 (SEQ ID NO: 6), PMO-10391 (SEQ ID NO: 7), PMO-10824 (SEQ ID NO: 8), PMO-09767 (SEQ ID NO: 9), PMO-03778 (SEQ ID NO: 10), PMO-04750 (SEQ ID NO: 1 1), PMO-10518 (SEQ ID NO: 12), PMO-05022 (SEQ ID NO: 13), PMO-05366 (SEQ ID NO: 14), PMO-02839 (SEQ ID NO: 15), PMO-10366 (SEQ ID NO: 16), PMO- 04874 (S
  • the polynucleotide of the invention can be introduced into a gene construct, for example, into a cloning vector or expression vector, to allow its replication or expression.
  • said vector is an appropriate vector for the expression and purification of the polypeptide of the invention.
  • another aspect of the invention relates to a gene construct comprising at least one of the polynucleotides of the invention, hereafter referred to as the "gene construct of the invention".
  • the term "gene construct" as used herein refers to a nucleic acid molecule, both single stranded and double stranded, that is isolated from a naturally occurring gene or that is modified to contain nucleic acid segments in a manner That could not exist in nature.
  • nucleic acid construct or “gene construct” is synonymous with the term “expression cassette” when the nucleic acid construct contains the control sequences required for the expression of the polynucleotide of the invention.
  • the genetic construction of the invention may further comprise one or more control or regulatory sequences of gene expression, such as promoter sequences, leader sequences, transcription terminator sequences, polyadenylation sequences, signal sequences, etc.
  • control sequences includes all components that are necessary or advantageous for the expression of the polynucleotide of the present invention. Each control sequence may be of the same or different origin as the polynucleotide of the invention.
  • control sequences include, but are not limited to, a leader sequence, a polyadenylation sequence, a propeptide sequence, a promoter, a signal peptide sequence, and a transcription terminator sequence.
  • the control sequences include a signal peptide sequence, and more preferably also a promoter, and transcription and translation termination signals.
  • Control sequences with linkers can also be provided in order to introduce specific restriction sites that facilitate the binding of the control sequences with the coding region of the polypeptide of the invention.
  • Appropriate control sequences for the expression of a polynucleotide in eukaryotic cells are known in the state of the art.
  • promoter refers to a nucleotide sequence, generally “upstream” or “upstream” of the transcription start point, which is capable of initiating transcription in a cell. This term includes, for example, but not limited to, constitutive promoters, specific cell-type promoters and inducible or repressible promoters. In general, control sequences depend on the origin of the host cell.
  • the gene construct of the invention is an expression vector.
  • An "expression vector” is a linear or circular DNA molecule that comprises at least one polynucleotide of the invention, and that is operably linked to additional nucleotides that are provided for expression.
  • Said vector comprising the polynucleotide of the invention can be introduced into a host cell such that the vector is maintained as a chromosomal integrant or as a self-replicating extrachromosomal vector.
  • the term "operably linked” refers to a configuration in which a control sequence is placed in a suitable position with respect to the polynucleotide coding sequence of the invention, such that the control sequence directs the expression of said polynucleotide.
  • the coding sequence is located in the vector such that it is operably linked to the control sequences suitable for its expression.
  • the expression vectors referred to in the present invention comprise the polynucleotide of the invention, a promoter, and transcription and translation termination signals.
  • the various nucleic acids and control sequences described herein can be linked together to produce a recombinant expression vector that can include one or more convenient restriction sites to allow insertion or replacement of the polypeptide of the invention at said sites.
  • the expression vector to which the present invention relates can be any vector (for example, a plasmid or virus) that can conveniently be subjected to a recombinant DNA process and can produce expression of the polynucleotide of the invention.
  • the choice of the vector will normally depend on the compatibility of the vector with the host cell into which it is to be introduced.
  • the expression vector may be a plasmid, a cosmid, a phage, a virus, an artificial bacterial chromosome (BAC), an artificial yeast chromosome (YAC), or the like.
  • the vectors can be closed linear or circular plasmids.
  • the vector can be an autonomously replicating vector, that is, a vector that exists as an extrachromosomal entity, whose replication is independent of chromosomal replication, for example, a plasmid, an extrachromosomal element, a minichromosome, or an artificial chromosome.
  • the vector may contain any means to ensure self-replication.
  • the vector may be one that, when introduced into the host cell, is integrated into the genome and replicated together with the chromosome (s) in which it has been integrated.
  • a single vector or plasmid or two or more vectors or plasmids that together contain the total DNA to be introduced into the genome of the host cell, or a transposon can be used.
  • the vectors used in the present invention preferably contain one or more selectable markers that allow easy selection of transformed, transfected, transduced cells, or the like.
  • a selectable marker is a gene whose product provides resistance to biocides or viruses, resistance to heavy metals, prototrophy to auxotrophs and the like.
  • Selectable markers for use in a filamentous fungus host cell include, but are not limited to, amdS (acetamidase), argB (ornithine carbamoyltransferase), bar (phosphinothricin acetyltransferase), hph (hygromycin phosphotransferase), niaD (nitrate reductase), pyrG (orotidine-5'-phosphate decarboxylase), pyr5, pyr4, cysC (sulfate adenyltransferase), and trpC (anthranilate synthase), as well as their equivalents.
  • amdS acetamidase
  • argB ornithine carbamoyltransferase
  • bar phosphinothricin acetyltransferase
  • hph hygromycin phosphotransferase
  • niaD nit
  • the vectors referred to in the present invention preferably contain an element (s) that allows the integration of the vector into the genome of the host cell or the autonomous replication of the vector in the cell regardless of the genome.
  • the vector may be based on the sequence of the polynucleotide of the invention or on any other element of the vector for integration into the genome by homologous or non-homologous recombination.
  • the vector may contain additional nucleotide sequences to direct integration by homologous recombination into the genome of the host cell at a precise location (s) of the chromosome (s).
  • the vector may further comprise an origin of replication that allows the vector to replicate autonomously in the host cell in question.
  • the origin of replication can be any plasmid replicator that mediates autonomous replication that works in a cell.
  • the term "origin of replication" or "plasmid replicator” is defined herein as a nucleotide sequence that allows a plasmid or vector to replicate in vivo. Examples of useful origins of replication in a filamentous fungus cell are AMA1 and ANS1. More than one copy of the polynucleotide of the present invention can be inserted into the host cell to increase the production of the gene product (s).
  • An increase in the copy number of the polynucleotide can be obtained by integrating at least one additional copy of the sequence into the genome of the host cell or including with the polynucleotide an amplifiable selectable marker gene, where the cells containing the amplified copies of the marker gene Selectable, and therefore, additional copies of the polynucleotide, can be selected by culturing the cells in the presence of the appropriate selection agent.
  • the gene construct of the invention comprises a polynucleotide encoding the polypeptide consisting of SEQ ID NO: 43 and another polynucleotide encoding the polypeptide consisting of SEQ ID NO: 44.
  • the gene construction of the The invention can be introduced into a host cell competent to carry out the expression of the polypeptide of the invention. Therefore, another aspect of the invention relates to a host cell comprising the gene construct of the invention, "host cell of the invention".
  • the "host cell”, as used herein, includes any type of cell that is susceptible to transformation, transfection, transduction, and the like, with the gene construct of the invention.
  • the host cell can be eukaryotic, such as a mammalian, insect, plant or fungus cell.
  • the host cell is a filamentous fungus cell.
  • Filamentous fungi are generally characterized by having a mycelial wall composed of chitin, cellulose, glucan, chitosan, morning, and other complex polysaccharides.
  • the host cell of the filamentous fungus is a cell of Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Neceliocathoraxorix, Neo-thioraxorix, Neo-thioraptor, Myceliophthoraximraix, Neo-thioraxorix, Neo-thioraxorix, Neo-thioraxorix, Neo-thioraxorix, Neo-thioraphyloraxorum Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, or Trichoderma.
  • the filamentous fungus host cell is a cell of Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger or Aspergillus oryzae.
  • the filamentous fungus host cell is a cell of Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium ptudoarine Fusarium, Fusarium pseudogramine, Fusarium ptusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, or Fusarium venenatum.
  • the filamentous fungus host cell is a Bjerkandera adusta cell, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufausus, Ceriporiopsus corusorusus, Ceriporiopsus corusorusus, Ceriporiopsus corusorususus, Ceriporiopsus corusorusus, Ceriporiopsus corusorususus zeae, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terres
  • the host cell of the invention is strain C1 of Myceliophthora thermophila.
  • strain C1 of Myceliophthora thermophila is equivalent to Chrysosporium lucknowense.
  • the host cell of the invention therefore comprises at least one polynucleotide of the invention recombinantly introduced by the genetic construction of the invention.
  • polynucleotides can encode the mature polypeptide or a pre-protein consisting of a signal peptide bound to the mature enzyme that will have to be further processed in order to produce the mature PMO enzyme.
  • the host cell of the invention expresses at least one of the PMO polypeptides of the invention, or any combination thereof, so that they are functional, and is capable of secreting them to the extracellular medium.
  • the term "functional” means that the expressed enzyme (s) retains its ability to oxidize cellulose. This activity can be measured by any suitable procedure known in the state of the art to evaluate the activity of PMO, preferably by means of the procedure described below in the examples of the present invention.
  • the term "expression” includes any stage involved in the production of the polypeptide of the invention that includes, but is not limited to, transcription, post-transcriptional modification, translation, post-translational modification, and secretion.
  • the host cell of the invention is Myceliophthora thermophila, preferably M. thermophila strain C1
  • said cell overexpresses at least one of the PMO polypeptides of the invention, since by understanding the gene construct of the invention, it contains more copies of the polynucleotide of the invention. invention of which comprises the genome of the non-transformed cell.
  • PMO overexpression is understood as the expression of the PMO polypeptide of the invention above the levels of expression of said polypeptide in the same cell not transformed with the gene construct of the invention.
  • polypeptide of the invention can be carried out in the host cell of the invention by means of any method known in the art, such as the transformation of a suitable host cell with at least one polynucleotide of the invention, or the construction genetics of the invention, and the culture of the transformed host cell under conditions that induce the expression of said polynucleotide in order to obtain the secreted enzyme.
  • the host cell can be cultured in a suitable nutrient medium, solid or liquid, for the production of PMO, using methods well known in the art.
  • the cell can be cultured by flask culture with agitation, and small-scale or large-scale fermentation (which includes continuous, batch or batch fermentation, batch or fed-batch, or solid-state fermentation) carried out in a laboratory or industrial bioreactor in a suitable medium and under conditions that allow to express and / or isolate the PMO.
  • the cultivation takes place in a suitable nutrient medium comprising carbon and nitrogen sources and inorganic salts, using methods known in the art. If PMO is secreted in the nutrient medium, it can be recovered directly from the medium.
  • the expressed PMO can be detected using methods known in the art specific for polypeptides. These detection procedures may include the use of specific antibodies, the formation of an enzyme product, or the disappearance of an enzyme substrate.
  • the resulting PMO can be recovered using methods known in the art.
  • PMO can be recovered from the nutrient medium by Conventional procedures that include, but are not limited to, centrifugation, filtration, extraction, spray drying, evaporation, or precipitation.
  • the PMO's produced in the present invention can be purified by a variety of procedures known in the art that include, but are not limited to, chromatography (e.g., ion exchange, affinity, hydrophobic, chromato-focalization, and size exclusion), electrophoretic procedures. (for example, preparative isoelectric focusing), differential solubility (for example, precipitation in ammonium sulfate), SDS-PAGE, or extraction, in order to obtain a substantially pure PMO that can be included in an enzymatic composition together with other enzymes cellulolytic
  • the host cell of the invention may express at least one of the polypeptides of the invention, or any combination thereof, for example, but not limited to, polypeptides consisting of SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44. Likewise. , said cell can in turn express one or more other cellulolytic enzymes, native or recombinant.
  • composition of the invention Another aspect of the invention relates to an enzyme composition comprising at least one of the polypeptides of the invention, hereafter referred to as "composition of the invention".
  • This composition of the invention may further comprise other enzymatic activities, such as aminopeptidase, amylase, carbohydrase, carboxypeptidase, catalase, cellulase, such as endoglucanases, beta-glucosidases and / or cellobiohydrolases; chitinase, cutinase, cyclodextrin glucosyltransferase, deoxyribonuclease, esterase, alpha-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamylase, alpha-glucosidase, haloperoxidase, invertase, lacasa, lipase, mannosidase, oxidase, reductase, enzyme pect
  • the additional enzyme (s) can be produced, for example, by a microorganism belonging to the genus Aspergillus, such as Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans , Aspergillus niger, or Aspergillus oryzae; Fusarium, such as Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium reticulatum, Fusarium rose, Fusar ⁇ um sambucinum, Fusarium sarcochroum
  • the composition of the invention further comprises other cellulolytic enzymes.
  • cellulolytic enzymes also known as “cellulases” refers to a class of enzymes capable of hydrolyzing cellulose ( ⁇ -1, 4
  • cellulolytic enzymes are, but are not limited to, endoglucanases, beta-glucosidases, cellobiohydrolases, polysaccharide monooxygenases (other than those described in the present invention), beta-xylosidases, endoxyglucanases or endoxylanases.
  • these cellulolytic enzymes are selected from the list consisting of endoglucanases, beta-glucosidases, cellobiohydrolases, polysaccharide monooxygenases, beta-xylosidases, endoxylanases, endoxyglucanases, or any combination thereof.
  • These cellulolytic enzymes may be derived from the host cell of the invention or from other microorganisms producing cellulolytic enzymes other than the host cell of the invention. They can also be produced naturally or recombinantly.
  • the composition of the invention comprises a polypeptide of the invention consisting of the amino acid sequence SEQ ID NO: 43 and a polypeptide of the invention consisting of the amino acid sequence SEQ ID NO: 44.
  • the composition of the invention comprises at least one polypeptide of the invention, more preferably the polypeptide consisting of SEQ ID NO: 43 and the polypeptide consisting of SEQ ID NO: 44, and other cellulolytic enzymes derived from the cell host of the invention.
  • the composition of the invention is an enzymatic mixture expressed by the host cell of the invention.
  • the composition of the invention is an enzymatic mixture obtained by the host cell of the invention, preferably M. thermophila of strain C1.
  • the term “endoglucanase” or "EG” refers to a group of cellulase enzymes classified as EC 3.2.1 .4.
  • cellobiohydrolase refers to a protein that catalyzes the hydrolysis of cellulose to cellobiose through an exoglucanase activity, sequentially releasing cellobiose molecules from the reducing or non-reducing ends of cellulose or cellooligosaccharides.
  • beta-glucosidase refers to an enzyme that catalyzes the hydrolysis of a sugar dimer, including, but not limited to cellobiose, with the release of a corresponding, used sugar monomer, but without limitation, for the synthesis of ethanol.
  • the beta-glucosidase enzyme acts on the ⁇ 1-> 4 bridges that bind to two substituted glucose or glucose molecules (i.e. cellobiose disaccharide). It is an exocellulase with specificity for a variety of beta-D-glycoside substrates. It catalyzes the hydrolysis of non-reducing terminal residues in beta-D-glycosides with glucose release.
  • endoxylanase refers to an enzyme that catalyzes the endohydrolysis of 1,4-beta-D-xylosidic bonds in xylanes.
  • ⁇ -xylosidase refers to a protein that hydrolyzes 1,4-D-D-xylo-oligomers short to xylose.
  • endoxiloglucanase refers to a specific xyloglycan enzyme, capable of catalyzing the solubilization of xyloglycan in oligosaccharides but which does not show substantial cellulolytic activity.
  • the composition of the invention comprises at least one of the polypeptides of the invention, more preferably the polypeptide consisting of SEQ ID NO: 43 and the polypeptide consisting of SEQ ID NO: 44, and a mixture cellulolytic consisting of: endoglucanase, beta-glucosidase, cellobiohydrolase I and cellobiohydrolase II. More preferably, these cellulolytic enzymes come from M. thermophila.
  • the composition of the invention can be prepared according to the procedures known in the art and can be in liquid form or a dry composition. For example, the composition may be in the form of a granulate or a microgranulate.
  • the enzymes to be included in the composition can be stabilized according to the procedures known in the art.
  • the host cell of the invention expresses at least one PMO polypeptide of the invention, which is capable of oxidizing cellulose when secreted to the extracellular medium.
  • This host cell is capable of secreting this enzyme (s) to the medium together with other cellulolytic enzyme / s produced naturally or recombinantly, thus being useful for optimizing the hydrolysis stage of the biomass in fermentable sugars.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the host cell of the invention, of at least one polypeptide of the invention, or of the composition of the invention, for the degradation of cellulosic biomass.
  • biomass means the biodegradable fraction of products, residues and remains of biological origin from agriculture (including plant substances, such as crop residues, and animal substances), forestry industries (such as timber resources) and related industries which include fisheries and aquaculture, as well as the biodegradable fraction of industrial and urban waste, such as urban solid waste or paper waste.
  • the biomass is straw or the organic fraction of urban solid waste.
  • the biomass is plant biomass, more preferably selected from the list consisting of: biomass rich in fermentable sugars, such as sugar cane; starch biomass, for example, grains or wheat straw; or corn or corn straw or corn grain or corn fiber; or grains or barley straw; or grains or sorghum straw.
  • Biomass can also be rice, grass, branches, etc.
  • the polypeptide of the invention can be used in the production of monosaccharides, disaccharides and polysaccharides as chemical or fermentation raw materials, from biomass for the production of ethanol, butanol, plastics, alkanes, alkenes, or other products or intermediates.
  • the host cell of the present invention can be used as a source of the polypeptide of the invention, and other cellulolytic enzymes, in a process of fermentation with biomass.
  • the predominant polysaccharide in the primary cell wall of plant biomass is cellulose, the second most abundant is hemicellulose, and the third, depending on the biomass in question, may be pectin.
  • the secondary cell wall also contains polysaccharides and is reinforced by polymeric lignin covalently crosslinked with hemicellulose.
  • Cellulose is a homopolymer of anhydrocellose and is thus a linear beta- (1-4) -D-glucan, while hemicellulose includes a variety of compounds, such as xylans, xyloglucans, arabinoxylans, and mannans in complex branched structures With a range of substituents.
  • cellulose is found in plant tissue primarily as an insoluble crystalline matrix of parallel glucan chains. Hemicelluloses normally bind by hydrogen bonds to cellulose, as well as to other hemicelluloses, which helps stabilize the cell wall matrix.
  • the polypeptides of the invention can be used together with the rest of cellulolytic enzymes to degrade the cellulose component of the biomass substrate.
  • the degradation or hydrolysis of the biomass to fermentable sugars a process also known as “saccharification", by means of the polypeptide of the invention, the host cell of the invention or the composition of the invention, can be followed by a fermentation process in the that the fermentable sugars obtained are used in order to finally obtain a bioproduct such as bioethanol.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of at least one polypeptide of the invention, of the host cell of the invention or of the composition of the invention, for the degradation of biomass in a process. of production of a bioproduct.
  • bioproduct refers to those materials, chemicals and energy derived from renewable biological resources.
  • these bioproducts are, but are not limited to, hydrocarbon compounds in their different forms, such as aliphatic compounds (saturated, unsaturated, cyclic) or aromatic, such as alkanes, alkenes, alkynes, cyclic forms of these compounds or aromatic hydrocarbons; oxygenated substances such as alcohols (such as ethanol, butanol, sorbitol), ethers, aldehydes, ketones or carboxylic acids; nitrogenous substances such as amines, amides, nitro compounds or nitriles; halogenated substances such as halides; organic acids (such as lactic acid, acrylic acid, acetic acid, succinic acid, glutamic acid, citric acid or propionic acid).
  • bioproducts also includes any combination of the compounds described above, compounds additionally derived from the compounds described above by any type of physical, chemical or biological treatment, polymers of the compounds described above, compounds described above substituted by any group or element functional in one more of its bound and branched forms of the compounds described above.
  • Ethanol can be produced by enzymatic degradation of biomass and the conversion of released saccharides into ethanol. This type of ethanol is often called bioethanol. It can be used as a fuel additive or extender in mixtures of less than 1% up to 100% (a fuel substitute).
  • the bioproduct is biofuel.
  • biofuel refers to a hydrocarbon, or one of its mixtures, which can be used as fuel and is obtained using fermentable biomass as a starting material.
  • biofuels include, but are not limited to, ethanol or bioethanol, butanol or biobutanol and biodiesel.
  • the biofuel is bioethanol.
  • bioethanol refers to an alcohol prepared by fermentation, from fermentable biomass such as carbohydrates produced in sugar or starch crops such as corn or sugarcane.
  • first process of the invention a process for producing fermentable sugars, referred to herein as "first process of the invention", comprising:
  • step (b) recover the fermentable sugars obtained after the incubation of step (a).
  • a biomass pretreatment process is required to increase the access of enzymes to their substrates and consequent effective hydrolysis.
  • Pretreatment uses various techniques, including, but not limited to chemical treatment (e.g., explosion of the fiber with ammonium or exposure to a solvent), physical treatment (e.g., steam explosion at elevated temperatures), mechanical treatment (for example, crushing or grinding), biological treatment, or any combination thereof, to alter the structure of cellulosic biomass and make cellulose more accessible.
  • fermentable sugar refers to simple sugars (monosaccharides, disaccharides and short oligosaccharides), such as glucose, xylose, arabinose, galactose, mainous, rhamnose, sucrose or fructose, among others.
  • a fermentable sugar is any that can use or ferment a microorganism.
  • Another aspect of the present invention relates to a process for producing a bioproduct from cellulosic biomass, hereinafter referred to as "second process of the invention", comprising:
  • step (b) ferment the fermentable sugars obtained after the incubation step of step (a) with at least one fermenting microorganism, and c) recovering the bioproduct obtained after the fermentation of step (b).
  • fermenter or fermentation refers to a process of biological transformation produced by the activity of some microorganisms in which sugars such as glucose, fructose, and sucrose are converted into ethanol.
  • the microorganisms used in this way are fermenting microorganisms that have fermentation capacity, such as yeasts of the Saccharomyces, Pichia or Kluyveromyces genera, preferably Saccharomyces cerevisiae, both natural and genetically modified strains for the conversion of pentoses.
  • the term "recovery" as used herein refers to the collection of fermentable sugars obtained after the incubation of step (a) of the first process of the invention or of the bioproduct obtained after fermentation. of step (b) of the second process of the invention. Recovery can be performed by any procedure known in the art, including mechanics or manuals.
  • the first and / or second process of the invention preferably comprises a pretreatment process before step (a).
  • a pretreatment process will result in the cellulosic material components being more accessible for later stages or more digestible by enzymes after treatment in the absence of hydrolysis.
  • the pretreatment can be a chemical, physical, mechanical or biological pretreatment, or any mixture thereof.
  • the biomass preferably pretreated biomass
  • the solids content during hydrolysis may be, but not limited to, between 10-30% of the total weight, preferably between 15-25% of the total weight, more preferably between 18-22% of the total weight.
  • Hydrolysis is carried out as a process in which the biomass, preferably pretreated biomass, is incubated with at least one polypeptide of the invention, with the host cell of the invention or with the composition of the invention and thus form the hydrolysis solution.
  • said hydrolysis is carried out at a temperature between 25 ° C and 60 ° C, preferably between 40 ° C and 60 ° C, specifically around 50 ° C.
  • the process is preferably performed at a pH in the range of 4-6, preferably pH 4.5-5.5, especially around pH 5.2.
  • the hydrolysis is carried out in a time between 12 and 144 hours, preferably between 16 and 120 hours, more preferably between 24 and 96 hours, even more preferably between 32 and 72 hours.
  • Hydrolysis (step (a)) and fermentation (step (b) of the second method of the invention) can be carried out simultaneously (SSF process) or sequentially (SHF process).
  • hydrolyzed, and preferably pretreated, biomass is fermented by at least one fermenting microorganism capable of fermenting fermentable sugars, such as glucose, xylose, mannose and galactose directly or indirectly in the desired fermentation product.
  • the fermentation is preferably carried out in a time between 8 and 96 hours, preferably between 12 and 72, more preferably between 24 and 48 hours.
  • the fermentation is carried out at a temperature between 20 ° C and 40 ° C, preferably from 26 ° C to 34 ° C, in particular around 32 ° C.
  • the pH is from 3 to 6 units, preferably from 4 to 5.
  • a yeast of the Saccharomyces cerevisiae species is preferred for ethanolic fermentation, preferably strains that are resistant to high levels of ethanol, up to, for example, 5 or 7% in vol. of ethanol or more, such as 10-15% in vol. of ethanol
  • the bioproduct is biofuel, more preferably bioethanol.
  • the yields of the complete enzyme mixture produced by M. thermophila (Complete cocktail, CC), the mixture of purified enzymes (endoglucanase, cellobiohydrolase I, cellobiohydrolase II and Betaglucosidase) called the minimum cocktail (CM), and said minimum cocktail supplemented with the enzyme PMO-06230.
  • CM minimum cocktail
  • Dosages were made in mg of protein per g of cellulose or glucan.
  • the analytical methods for the determination of glucose, cellulose and protein are described in Example 6.
  • CM minimum cocktail
  • PMO-04725, PMO-06230 and a mixture of both were compared. Dosages were made in mg of protein per g of cellulose or glucan. Analytical methods for the determination of glucose, cellulose and protein are described in Example 6. Figure 4. Expression vector pBASE5-K4.
  • the vector carries Pcbhl as promoter sequence, Tcbhl as termination sequence and pyr4 as a selection marker in fungi.
  • the propagation in E. coli was selected by kanamycin resistance.
  • ⁇ / del and EcoR ⁇ or EcoRV were the restriction sites chosen to clone the PMOs.
  • FIG 5. Plasmid for overexpression of PMO-01470.
  • Figure 6. Plasmid for overexpression of PMO-03248.
  • Figure 7. Plasmid for overexpression of PMO-00727.
  • Figure 8. Plasmid for overexpression of PMO-09768.
  • Figure 9. Plasmid for overexpression of PMO-10391.
  • FIG 18. Plasmid for overexpression of PMO-02839. Figure 19. Plasmid for overexpression of PMO-04725. Figure 20. Plasmid for overexpression of PMO-10366. Figure 21. Plasmid for overexpression of PMO-04874. Figure 22. Plasmid for overexpression of PMO-08101.
  • FIG. 23 Plasmid for overexpression of PMO-00657.
  • FIG 24 Plasmid for overexpression of PMO-04859.
  • Figure 25 Plasmid for overexpression of PMO-03723.
  • FIG. 26 Separation and identification of the main cellulases and PMOs of the invention by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE, 7.5%).
  • the yields of the complete enzyme mixture (striped bars) produced by M. thermophila (CC) and the mixture of purified enzymes (endoglucanase, cellobiohydrolase I, cellobiohydrolase II and betaglucosidase) called the minimum cocktail (CM) represented by the empty bars were compared ; both with and without supplementation with 2 mg protein / g glucan from different purified PMOs.
  • the analytical methods for the determination of glucose, cellulose and protein are described in Example 6.
  • Example 1 Comparative functional evaluation of the mixture of purified enzymes (minimum cocktail) and the complete enzyme mixture (complete cocktail) produced by M. thermophila.
  • the enzymatic mixture produced by M. thermophila (complete cocktail) was obtained according to the protocol described by Verdoes et al., 2007, (Ind. Biotechnol. 3 (1)) and Visser et al., 201 1, (Ind. Biotechnol ., 7 (3)), using the development of an industrial enzyme production platform based on the organism M. thermophila C1 by Dyadic Netherlands.
  • This enzymatic mixture or complete cocktail (CC) was used as a source for the purification of the different enzymes that, mixed in the same original proportion, constituted the so-called minimum cocktail (CM).
  • an endoglucanase enzyme (4-Beta-D-glucan 4-glucanhydrolase, EC 3.2.1.4), two cellobiohydrolase or exo-Beta-Glucanase enzymes (EC 3.2. 1 .9.1) and a Beta-glucosidase enzyme (EC 3.2.1 .21).
  • These enzymes act synergistically in cellulose hydrolysis, being primarily responsible for the release of glucose in the biomass hydrolysis process (Ekperigin, MM, 2007, African Journal of Biotechnology, 6).
  • thermophila the mixture of purified cellulases (minimum cocktail), and this same minimum cocktail supplemented with purified PMO enzyme.
  • the results obtained are shown in Figure 1.
  • the PMO enzyme used was identified by mass spectrometry as PMO-06230 (SEQ ID NO: 44) of M. thermophila.
  • Example 1 Based on the results of Example 1, it was decided to overexpress all the genes coding for possible monooxygenase polysaccharide (PMOs) of the M. thermophila genome for evaluation in the improvement of cellulolytic mixtures.
  • PMOs monooxygenase polysaccharide
  • the identification of possible sequences coding for PMOs was carried out by searching for proteins with conserved regions of the monooxygenase polysaccharide type, commonly referred to as family glycosyl hydrolases 61. In this way, 21 sequences were identified in the genome of M. thermophila. Table 1 shows the identification numbering corresponding to each nucleotide and protein sequence.
  • Example 3 Overexpression of the coding sequences for polysaccharide monooxyqenases in M. thermophila.
  • each of them was amplified by PCR using genomic DNA of M. thermophila C1 as a template.
  • the length of the nucleotide sequence (in base pairs, bp), as well as the predicted molecular weight of the corresponding pre-protein and mature protein (in KDa) are shown in Table 2.
  • Oligonucleotides used to amplify each of the genes encoding PMOs In the direct oligonucleotides is the sitio / del cleavage site and in the reverse the EcoR ⁇ or EcoRV site.
  • the amplification was performed using iProof High-Fidelity DNA Polymerase (BioRad) by a denaturation cycle at 98 ° C for 30 seconds followed by 35 98 ° C cycles for 10 seconds, 59 ° C for 40 seconds, 72 ° C for 30 seconds and a final cycle of 72 ° C for 10 minutes.
  • the amplified DNA fragments were digested with the restriction enzymes ⁇ / del and EcoR ⁇ in all cases except in the case of PMO-03248 which was digested with ⁇ / del and EcoRV.
  • Each of the DNA fragments was cloned into the expression vector pBASE5K4 previously digested with the same restriction enzymes as the corresponding DNA fragment.
  • the expression vector pBASE5K4 contains the promoter sequence of the cellobiohydrolase 1 (Pcbhl) gene, which corresponds to a region of 1796 bp upstream of the cellobiohydrolase 1 gene (cbhl, NCBI Accession number XP_003660789.1) of M. thermophila C1.
  • the expression vector pBASE5K4 also contains the terminator sequence of the M. thermophila C1 cbhl gene (Tcbhl, which corresponds to a region of 1014 bp downstream of cbhl) and the pyr4 gene as a selection marker (NBCI Access Number XP_003666633 .1) from the same strain.
  • the pyr4 gene encodes an orotidine-5-phosphate decarboxylase and its expression allows the complementation of uridine auxotrophy in the corresponding auxotrophic M. thermophila C1 host strain (pyr4-).
  • the expression vector pBASE5K4 is shown in Figure 4.
  • the vector and inserts were ligated and the union products were transformed into electro-competent cells of Escherichia coli XLI Blue MRF following the protocol provided by the manufacturer (Stratagene).
  • the recombinant plasmids obtained are shown in Figures 5 to 25.
  • Plasmids containing each of the coding sequences for PMOs under the Pcbhl and pyr4 promoter as a selection marker were transformed into M. thermophila C1 (Verdoes et al., 2007, Ind. Biotechnol. 3 (1)), strain Host previously used in other high performance selections in M. thermophila.
  • the DNA was introduced into the host strain using a protoplast transformation procedure (US7399627B2).
  • the host strain is auxotrophic ⁇ pyr4) so the transformants were plated on agar plates without uridine supplementation. After 5 days of incubation at 35 ° C the resulting prototrophic transformants (expressing the pyr4 gene) were analyzed.
  • the host strain used as a receptor produces a complete enzyme cocktail that contains, among others, cellobiohydrolase, endoglucanase and beta-glucosidase activity.
  • the objective of the selection was to identify the PMO activities produced within the complete enzyme cocktail generated by M. thermophila C1 that improved glucose release performance using biomass as a substrate. Therefore the Transformant testing was based on the production of the cocktail of each of the transformants and their evaluation in terms of glucose release from plant biomass.
  • the transformants obtained were inoculated in 96-well microtiter plates (MTP) to carry out their evaluation by fermentation and subsequent biomass hydrolysis (US7794962B2).
  • MTP 96-well microtiter plates
  • US7794962B2B2B2B2B2 For the glucose release test from biomass, it was previously processed as adaptation to the test in MTPs.
  • the biomass was suspended at a final concentration of 100 g / l in 0.1 M sodium citrate buffer pH 5.0 with 0.052% sodium azide.
  • the enzymatic mixture produced by M. thermophila was obtained according to the protocol described by Verdoes et al., 2007, (Ind. Biotechnol. 3 (1)) and Visser et al., 201 1, Ind. Biotechnol., 7 (3 ), using the industrial enzyme production platform based on the organism M. thermophila C1.
  • This enzymatic mixture was the source of purification of the main cellulases, Cellobiohydrolases (Cbh), endoglunase (Eg) and Beta-Glucosidase (Bgl) and all polysaccharide oxygenases (PMOs) that were functionally evaluated.
  • the PMOs were purified using a sequential chromatographic process.
  • the original sample (enzymatic mixture produced according to the above description) was subjected to a pre-treatment process, consisting of a centrifugation at 16000 rpm for 40 min. at 5 ° C. The pellet was discarded and the supernatant was filtered with sterile 0.45 ⁇ nylon filters (VWR).
  • the resulting sample was desalted in fractions of 15 mL, using a HiPrep Desalting Sephadex G-25 column (GE Helthcare) desalting column, using 100 mM Tris-HCI buffer equilibration buffer, pH 7.0 at a rate of 10 mL min flow "1.
  • Fractions for purification of the different PMOs were selected for their size, looking for proteins with a molecular mass of less than 50 kDa (Table 2).
  • the fractions selected from the first chromatographic step were subjected to a second step using a hydrophobic chromatography.
  • the samples were conditioned with (NH 4 ) 2 S0 4 1 M, filtered using sterile 0.45 ⁇ filters (VWR) and applied on a HiLoad 26/10 Phenyl-Sepharose High Performance column equilibrated with 100 mM Phosphate-sodium buffer, pH 7.0, 1 M (NH 4 ) 2 S0.
  • fractions were concentrated using 10 kDa vivaspin ultracentrifugation and concentration columns (Amicon) and applied in one or several rounds through the HiLoad 26/600 Superdex 75 pg molecular exclusion column, using 100 mM equilibration buffer sodium phosphate, pH 7.0. This purification procedure allowed the different PMOs to be isolated with a degree of purity greater than 90%.
  • a group of fractions was selected, desalted using the HiPrep Desalting Sephadex G-25 column (GE Helthcare) desalting column, as a 100 mM Tris equilibration buffer -HCI buffer, pH 7.0 and a flow rate of 10 ml_ min "1.
  • This new sample was passed through the ion exchange column HiLoad 26/10 Q- Sepharose HP column (GE Helthcare), using as a balancing buffer 100 mM Tris-HCI, pH 7.0, as elution buffer 100 mM Tris-HCI buffer, pH 7.0, 1 M NaCI and a flow rate of 4 ml_ min "1 .
  • a set of non-retained column fractions were concentrated and applied to a HiLoad 26/600 Superdex 75 pg molecular exclusion column using 100 mM Phosphate sodium equilibration buffer, pH 7.0.
  • thermophila cellulases subsequently used for the formulation of the minimum cocktail, enzymatic mixture on which the functional characterization of the different PMOs was carried out by a hydrolysis process enzymatic on ground biomass.
  • the main cellulolytic enzymes that is, Cellobiohydrolases (Cbh), Endo-Glucanase (Eg) and Beta-Glucosidase (Bgl)
  • Cbh Cellobiohydrolases
  • Eg Endo-Glucanase
  • Beta-Glucosidase Bgl
  • the Bgl activity was determined using p-Nitrofenyl-Beta-D-Glucopyranoside (pNGP, Sigma) as a substrate, following the appearance of the p-nitrophenol product at 410 nm.
  • a unit of enzymatic activity is defined as the amount of enzyme that is capable of hydrolyzing 1 ⁇ p-nitrophenol per minute.
  • the Cbh activity of the different cellobiohydrolases, Cbhl and Cbhll (both contain cellulose binding domains) was measured as the production capacity of cellobiose using crystalline cellulose substrate (Avicel).
  • the reaction mixture (1 mL final volume) contained 100 ⁇ sodium acetate buffer (pH 5.0), 10 mg Avicel and the appropriate amount of purified enzyme, and was incubated at 50 ° C for 120 min.
  • the amount of cellobiose produced during this reaction was determined by HPLC (Agilent Technologies, 1200 Series) using a refractive index detector (RID) and an Aminex HPX-87 H column.
  • One unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that is capable of producing 1 ⁇ of cellobiose per minute.
  • Endoglucanase activity was determined using azo-carboxymethyl cellulose (Azo-CMC, S-ACMC, Megazyme).
  • the enzymatic method used was an adaptation of the procedure described by the substrate supplier, in which the test conditions were adjusted to those of enzymatic hydrolysis (pH 5.5 and 50 ° C).
  • Endoxylanase activity was determined using wheat arabinoxylan, "azo-wheat arabionoxylan" (Azo-WAX Megazyme). Again, the enzymatic method used was an adaptation of the procedure described by the substrate supplier, in which the test conditions were adjusted to those of enzymatic hydrolysis (pH 5.5 and 50 ° C).
  • the total protein content of the samples with purified enzymes was determined by the BCA method (The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit). All purified enzymes were identified by mass spectrometry (MALDI-TOF) and sequencing.
  • Example 5 Determination of oxyqenase activity for the detection of PMOs.
  • a method of determination of oxygenase activity was based on the ability to reduce artificial oxygen acceptors of external electrons such as cytochrome C.
  • the oxidized and reduced cytochrome C have different absorption coefficients at 550 nm, so its reduction can be measured along the time as an increase in the signal at this wavelength.
  • cytochrome C reductase assay For the cytochrome C reductase assay, a reaction mixture (0.5 ml_ final volume) containing 50 ⁇ of cytochrome C, 100 ⁇ cellobiose, 0.6 nmol cellobiose dehydrogenase CDH1 of Myceliophthora thermophila, and an appropriate amount was performed of purified enzyme; everything was prepared in 100 mM sodium phosphate buffer pH 7.0. The reaction was followed spectrophotometrically at 550 nm at room temperature for 1 min. 21000 mM "1 cm " 1 was used as the extinction coefficient to calculate the cytochrome C reductase activity units. Table 4 shows the oxygenase activity values determined by this method for some of the purified PMOs.
  • Example 6 Functional characterization of the different PMOs in the enzymatic hydrolysis process.
  • pretreated corn bagasse (or PCS) biomass was used as a substrate for enzymatic hydrolysis.
  • Pretreatment was performed using a steam explosion system described by Nguyen et al., 1998, Appl. Biochem Biotechnol 70-72, and its compositional analysis was carried out according to the procedures described by NREL in "Standard Biomass Analytical Procedures" (http://www.nrel.gov/biomass/analytical_procedures.htmL).

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Abstract

La invención se refiere a polipéptidos con actividad polisacárido monooxigenasa, a una célula hospedadora que los expresa, preferiblemente una célula de Myceliophthora thermophila, a una composición enzimática que comprende al menos uno de dichos polipéptidos, preferiblemente junto con otras enzimas celulolíticas, al uso de esta célula hospedadora, de al menos uno de los polipéptidos con actividad polisacárido monooxigenasa o de la composición enzimática para la degradación de biomasa celulósica y a un procedimiento para producir bioproductos, preferiblemente bioetanol, que comprende el uso de dicha célula hospedadora, de al menos uno de los polipéptidos de la invención o de la composición enzimática de la invención.

Description

POLIPÉPTIDOS CON ACTIVIDAD POLISACÁRIDO MONOOXIGENASA Y SU USO PARA LA PRODUCCIÓN DE AZÚCARES FERMENTABLES
DESCRIPCIÓN
La invención se refiere al campo de los bioproductos, más particularmente, a las enzimas con actividad polisacárido monooxigenasa y a su uso, formando parte de cócteles enzimáticos, para la producción de azúcares fermentables a partir de biomasa celulósica durante los procesos de producción de bioproductos tales como bioetanol.
TÉCNICA ANTERIOR
La biomasa vegetal proporciona una fuente abundante de energía potencial en forma de carbohidratos que pueden utilizarse para numerosos procesos industriales y agrícolas y, por lo tanto, es una importante fuente renovable para la generación de azúcares fermentables. La fermentación de estos azúcares puede producir productos finales comercialmente valiosos, tales como el etanol también denominado bioetanol. Aunque la fermentación de los azúcares a etanol es relativamente directa, la conversión eficiente de biomasa celulósica en azúcares fermentables, tales como la glucosa, supone un mayor desafío. La enorme energía potencial de las grandes cantidades de hidratos de carbono que integran la biomasa vegetal no está suficientemente utilizada porque los azúcares forman parte de polímeros complejos (polisacáridos, tales como celulosa y hemicelulosa) y, por tanto, no se encuentran fácilmente accesibles para la fermentación. Así, la celulosa se puede tratar previamente, de forma mecánica, química, enzimática o de otros modos, para aumentar su susceptibilidad a la hidrólisis. Después de este proceso de pretratamiento, tiene lugar una etapa de sacarificación o hidrólisis consistente en un proceso enzimático por el que los hidratos de carbono complejos (como almidón o celulosa) se hidrolizan en sus componentes monosacáridos. El objetivo de cualquier tecnología de sacarificación es, por tanto, alterar o eliminar los impedimentos estructurales y de composición con el fin de mejorar la tasa de hidrólisis enzimática y aumentar los rendimientos de azúcares fermentables obtenidos a partir de celulosa o hemicelulosa (N. Mosier y col., 2005, Bioresource Technology 96, 673-686). Después de esta etapa de sacarificación se realiza un proceso de fermentación. Por lo tanto, cuanto mayor es la cantidad de azúcares complejos que permanecen al final del proceso hidrolítico, menor es el rendimiento de la producción de etanol al final del proceso de fermentación. Así, un área de investigación dirigida a disminuir los costes y mejorar el rendimiento de los procesos de producción de biocombustible está centrada en la mejora de la eficacia técnica de las enzimas hidrolíticas, o en general en la mejora de la eficacia de los cócteles enzimáticos empleados para generar azúcares fermentables a partir de la biomasa.
Se ha demostrado que las enzimas individuales son únicamente capaces de digerir parcialmente la celulosa y la hemicelulosa y, por lo tanto, se requiere la acción concertada de diferentes clases de enzimas para completar su conversión en azúcares monoméricos. Se requieren muchas más enzimas para digerir la hemicelulosa hasta azúcares monoméricos que la celulosa, incluyendo enzimas con actividad xilanasa, beta-xilosidasa, arabinofuranosidasa, mananasa, galactosidasa y glucuronidasa. También pueden estar involucradas otras enzimas sin actividad glicosil hidrolasa, tales como acetil xilano esterasa y ácido ferúlico esterasa. Por ello, la hidrólisis enzimática de los polisacáridos para su conversión en azúcares solubles y, por último, en monómeros tales como xilosa, glucosa y otras pentosas y hexosas, se cataliza mediante varias enzimas que en conjunto se denominan "celulasas". Las celulasas son complejos multienzimáticos que comprenden, al menos, tres componentes principales, endo^-glucanasa (EC 3.2.1.4), exo^-glucanasa o celobiohidrolasa (EC 3.2.1 .9.1 ) y β-glucosidasa (EC 3.2.1 .21 ), y se ha demostrado que actúan de forma sinérgica en la hidrólisis de la celulosa (Woodward, J. 1991 , Bioresource Technology Vo\ 36, pág. 67-75).
Las celulasas microbianas se han convertido en biocatalizadores focales debido a su naturaleza compleja y a sus extensas aplicaciones industriales (Kuhad R. C. y col., 201 1 , Enzyme Research, Article ID 280696). Hoy en día se ha prestado una considerable atención a los conocimientos actuales sobre la producción de celulasas y los retos en la investigación sobre celulasas, especialmente en la dirección de la mejora de la economía del proceso de varias industrias, con el fin de obtener celulasas con mayor actividad y mejores propiedades.
Por otro lado, las proteínas glicosil-hidrolasas de la familia 61 (GH61 ) se conocen desde hace más de 20 años. La primera GH61 descrita, denominada CEL1 , fue aislada de Agarícus bisporus en 1992 (Raguz y col., 1992, Gene 1 19: 183-190). Estas proteínas GH61 son proteínas accesorias que contribuyen a la degradación de la celulosa. El hecho de que estas enzimas actúen por oxidación directa de la celulosa, en lugar de por su hidrólisis, ha llevado a su denominación actual: monooxigenasas de polisacáridos dependientes de Cu (Polysaccharide Monooxygenase; PMOs). En comparación con otras enzimas celulolíticas, las PMOs son proteínas relativamente pequeñas con masas moleculares típicamente de entre 20 y 50 kDa (Baldrian y Valaskova 2008, FEMS Microbiology Reviews 32: 501-521 ; Harris y col., 2010, Biochemistry 49: 3305-3316). Estas proteínas requieren dos moléculas de oxígeno para producir la rotura del producto y su oxidación. Una de estas moléculas deriva del agua, la otra entra en la reacción en forma de oxígeno molecular, el cual es necesario para la oxidación directa del sustrato. Por tanto, los miembros de esta familia de enzimas actúan como monooxigenasas de Cu que catalizan la rotura de la celulosa mediante un mecanismo oxidativo, liberando celodextrinas (Langston y col., 201 1 , Applied and Environmental Microbiology 77: 7007-7015).
La eficiencia hidrolítica de un complejo multi-enzimático en el proceso de sacarificación del material celulósico depende tanto de las propiedades de las enzimas individuales como de la proporción de cada enzima presente en el complejo. Por tanto, en el contexto de los procesos de producción de biocombustibles, es necesario el diseño de cócteles enzimáticos con actividades individuales mejoradas, y con la proporción de cada una optimizada, cuyo empleo durante la etapa de sacarificación o hidrólisis de la biomasa celulósica conduzca a una mejora en el rendimiento de dicha etapa mediante un incremento en la cantidad de azúcares fermentables obtenidos a bajas dosis de enzima. Estos azúcares podrán ser posteriormente fermentados para producir biocombustibles, tales como bioetanol, por lo que se incrementaría en último término la eficiencia y la rentabilidad de todo el proceso de producción de biocombustibles.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona polipéptidos con actividad polisacárido monooxigenasa (PMO, también conocidos como glicosil-hidrolasas de la familia 61 o GH61 ) los cuales han sido identificados, aislados y caracterizados a partir de la cepa C1 de Myceliophthora thermophila. Como muestran los ejemplos de la presente invención, estos polipéptidos presentan la ventaja de que son capaces de incrementar el rendimiento de sacarificación de biomasa celulósica, mediante un incremento en la cantidad de azúcares fermentables producidos al final de dicho proceso hidrolítico, cuando son añadidos a los cócteles enzimáticos empleados en los procesos de producción de biocombustibles. Dichos polipéptidos son enzimas monooxigenasas de polisacáridos que intervienen en las fases iniciales del proceso de descomposición de biomasa celulósica hasta azúcares fermentables, siendo estas enzimas las responsables de mejorar la accesibilidad del resto de la maquinaria enzimática al sustrato. De esta forma, aumentan el rendimiento del proceso de hidrólisis incrementando la cantidad de azúcares simples obtenidos (fundamentalmente, glucosa) y con ello, en último término, el rendimiento de la producción de etanol a partir de biomasa.
Los inventores de la presente invención han identificado, en el genoma de Myceliophthora thermophila, 21 genes que codifican enzimas con actividad PMO (las secuencias de aminoácidos de estas 21 enzimas maduras se muestran en las SEQ ID NO: 43 a SEQ ID NO: 63). Como se puede ver en los ejemplos, estos polipétidos fueron aislados a partir del hongo, caracterizados y añadidos a una mezcla enzimática comprendiendo las principales enzimas celulolíticas producidas por la cepa C1 de Myceliophthora thermophila, con el fin de evaluar su efecto sobre el rendimiento de sacarificación de biomasa pretratada (PCS o pretreated corn stover), comprobándose un aumento en la concentración de azúcares fermentables (principalmente glucosa) liberados en el proceso hidrolítico en comparación con un cóctel enzimático que no comprendía los polipéptidos con actividad PMO de la invención. La mejora en el rendimiento de las mezclas enzimáticas utilizadas para producir azúcares fermentables a partir de material celulósico en procesos de producción de biocombustibles, preferiblemente etanol, es fundamental para asegurar la rentabilidad del mismo. La suplementación del cóctel enzimático con estas enzimas proporcionadas por la invención contribuye, por tanto, a mejorar el rendimiento del proceso hidrolítico donde se emplean dichos cócteles.
Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un polipéptido aislado con actividad polisacárido monooxigenasa, de ahora en adelante "polipéptido de la invención", que comprende una secuencia aminoacídica que presenta al menos un 80% de identidad con una secuencia aminoacídica seleccionada de entre la SEQ ID NO: 43 a la SEQ ID NO: 63. El polipéptido de la invención puede ser aislado, preferiblemente de M. thermophila, o producido recombinantemente. El polipéptido de la presente invención y sus variantes o derivados pueden ser sintetizados, por ejemplo, aunque sin limitarnos, in vitro. Por ejemplo, mediante la síntesis de péptidos en fase sólida o mediante aproximaciones de ADN recombinante. El polipéptido de la invención puede producirse recombinantemente, no sólo directamente sino como un polipéptido de fusión junto con un polipéptido heterólogo, el cual puede contener, por ejemplo aunque sin limitarnos, una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte por una proteasa, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en el extremo N-terminal de la proteína madura o del polipéptido.
El polipéptido de la invención puede presentar variantes. Estas variantes se refieren a variaciones limitadas en la secuencia aminoacídica, que permiten el mantenimiento de la funcionalidad del polipéptido. Esto quiere decir que la secuencia de referencia y la secuencia de la variante son similares en conjunto, e idénticas en muchas regiones. Estas variaciones se generan por sustituciones, deleciones o adiciones. Dichas sustituciones son por aminoácidos conservados. Los aminoácidos conservados son aminoácidos que tienen cadenas laterales y propiedades similares en cuanto a, por ejemplo, hidrofobicidad o aromaticidad. Estas sustituciones incluyen, aunque sin limitarse, sustituciones entre ácido glutámico (Glu) y ácido aspártico (Asp), entre lisina (Lys) y arginina (Arg), entre asparagina (Asn) y glutamina (Gln), entre serina (Ser) y treonina (Thr), y/o entre los aminoácidos que componen el grupo alanina (Ala), leucina (Leu), valina (Val) e isoleucina (lie). Las variaciones pueden ser variaciones generadas artificialmente como, por ejemplo, mediante mutagénesis o síntesis directa. Estas variaciones no provocan modificaciones esenciales en las características o propiedades esenciales del polipéptido. Por ello, dentro del alcance de la presente invención también se incluyen los péptidos o polipéptidos cuya secuencia de aminoácidos sea idéntica u homologa a las secuencias descritas en la presente invención.
El término "polisacárido monooxigenasa", "PMO", "Glicosil-hidrolasa de la familia 61 " o "GH61 " se refiere a una enzima que presenta actividad GH61 o PMO, la cual al ser incluida en una reacción de sacarificación (por ejemplo, aquella en la que se emplean endoglucanasas, beta-glucosidasas y celobiohidrolasas) resulta en una mayor cantidad (mayor rendimiento) de uno o más azúcares solubles (por ejemplo, glucosa) en comparación con la reacción de sacarificación llevada a cabo bajo las mismas condiciones pero en ausencia de la proteína GH61. La actividad PMO puede determinarse mediante, por ejemplo, ensayos oxidativos indirectos que evidencian colorimétricamente el fenómeno de transferencia de electrones utilizando distintos compuestos donadores y aceptores de electrones (Kitt et al., 2012, Biotechnology for Biofuels Vol. 5:79, pág. 1-13 o el mostrado en el Ejemplo 3). Por otro lado, la eficiencia sobre biomasa se podría medir, por ejemplo, combinando el polipéptido PMO con enzimas celulasas en una reacción de sacarificación y determinando si existe un incremento en el rendimiento de glucosa comparado con la misma reacción de sacarificación llevada a cabo en ausencia de dicho polipéptido.
Se pueden obtener PMOs que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos un 80% idénticas a una secuencia seleccionada de entre la SEQ ID NO: 43 a la SEQ ID NO: 63 a partir de un hongo filamentoso, tal como, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Gibberella, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma o Myceliophthora. En una realización más preferida, la PMO es una PMO de Myceliophthora thermophila, Gibberella zeae, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.
En una realización más preferida, el polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad con una secuencia aminoacídica seleccionada de entre la SEQ ID NO: 43 a la SEQ ID NO: 63.
El término "identidad" o "porcentaje de identidad" se refiere a la relación de residuos de ácidos nucleicos o aminoácidos que son idénticos entre dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos que se están comparando. Preferiblemente, se entiende por "identidad" la relación de residuos de ácidos nucleicos o aminoácidos que son idénticos entre dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos, con respecto a la longitud completa de la secuencia de referencia. Se puede determinar el grado de identidad mediante el método de Clustal, el método de Wilbur-Lipman, el programa GAG, que incluye GAP, BLAST o BLASTN, EMBOSS Needle y FASTA. Además, se puede utilizar el algoritmo de Smith Waterman con el fin de determinar el grado de identidad entre dos secuencias.
Para la comparación de secuencias, típicamente una de las secuencias actúa como secuencia de referencia con la cual se comparan las secuencias "problema". Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias para determinar su identidad, la secuencia de referencia y la/s secuencia/s problema se introducen en el programa, y se configuran los parámetros del mismo. Se pueden usar los parámetros del programa que aparecen por defecto o bien ser configurados, preferiblemente dichos parámetros serán los que aparecen por defecto. Así, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad entre la/s secuencia/s problema y la secuencia de referencia en base a los parámetros del programa. Dos ejemplos de algoritmos que son útiles para determinar el porcentaje de identidad de secuencia son BLAST y BLAST 2.0, descritos en AltschuI et al. (1997) Nucleic Acids Res 25(17):3389-3402 y AltschuI et al. (1990) J. Mol Biol 215(3)-403-410, respectivamente. Preferiblemente, el grado de identidad al que se refiere la presente invención se calcula mediante BLAST. El software para llevar a cabo el análisis BLAST se encuentra disponible públicamente en el National Center for Biotechnology Information (NCBI). En una realización más preferida, el polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre la SEQ ID NO: 43 a la SEQ ID NO: 63. Ejemplos del polipéptido de la invención que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre la SEQ ID NO: 43 a la SEQ ID NO: 63, son los polipéptidos que corresponden a las pre-proteínas o polipéptidos inmaduros de las enzimas PMO maduras de SEQ ID NO: 43 a SEQ ID NO: 63. Estas pre-proteínas comprenden un péptido señal situado en el extremo N-terminal de la secuencia aminoacídica de la enzima madura. Estas pre-proteínas son, por ejemplo, aunque sin limitarnos, las SEQ ID NO: 22 a SEQ ID NO: 42. El péptido señal de cada una de ellas ha sido identificado y se muestra señalado en las respectivas secuencias polipeptídicas en el listado de secuencias.
En una realización aún más preferida, el polipéptido de la invención consiste en una secuencia aminoacídica seleccionada de entre la SEQ ID NO: 43 a la SEQ ID NO: 63, dichas secuencias corresponden a los siguientes polipéptidos maduros: PMO-04725 (SEQ ID NO: 43), PMO-06230 (SEQ ID NO: 44), PMO-09768 (SEQ ID NO: 45), PMO- 01470 (SEQ ID NO: 46), PMO-03248 (SEQ ID NO: 47), PMO-00727 (SEQ ID NO: 48), PMO-10391 (SEQ ID NO: 49), PMO-10824 (SEQ ID NO: 50), PMO-09767 (SEQ ID NO: 51 ), PMO-03778 (SEQ ID NO: 52), PMO-04750 (SEQ ID NO: 53), PMO-10518 (SEQ ID NO: 54), PMO-05022 (SEQ ID NO: 55), PMO-05366 (SEQ ID NO: 56), PMO- 02839 (SEQ ID NO: 57), PMO-10366 (SEQ ID NO: 58), PMO-04874 (SEQ ID NO: 59), PMO-08101 (SEQ ID NO: 60), PMO-00657 (SEQ ID NO: 61 ), PMO-04859 (SEQ ID NO: 62) y PMO-03723 (SEQ ID NO: 63).
El término "pre-proteína" se refiere a un polipéptido que incluye un péptido señal (o secuencia líder) en su extremo amino terminal. Dicho péptido señal es escindido de la pre-proteína por una peptidasa, secretándose así la proteína madura. La porción secretada del polipéptido se denomina "proteína madura" o "proteína secretada". El "péptido señal" es aquel que dirige al polipéptido dentro de la célula hacia su vía de secreción.
Como muestran los ejemplos de la presente invención, los polipéptidos denominados aquí como PMO-01470, PMO-04725, PMO-09768 y PMO-06230 fueron los que mayores incrementos en la capacidad de sacarificación proporcionaron cuando se añadieron, por separado o en combinaciones sinérgicas, como suplemento a mezclas o cócteles enzimáticos producidos por M. thermophila (ver figuras 1 , 2, 3 y 27). Destaca por ejemplo el aumento en la capacidad de sacarificación producido por el polipéptido PMO-06230, responsable de un incremento de más del 10% en la capacidad de producción de glucosa a partir de biomasa celulósica por parte del cóctel enzimático producido por M. thermophila (Fig. 2 y 27); y por el polipéptido PMO- 09768, responsable de un incremento de más del 10% en la capacidad de producción de glucosa a partir de biomasa celulósica por parte de un cóctel enzimático producido por M. thermophila o de un cóctel enzimático comprendiendo las principales enzimas celulolíticas (beta-glucosidasa, celobiohidrolasas y endoglucanasa) de M. thermophila (Fig. 27). Por ello, en una realización más preferida, el polipéptido de la invención consiste en una secuencia aminoacídica seleccionada de entre la SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 46.
Además, como se muestra en los ejemplos de la presente invención, las PMO-04725 y PMO-06230 presentan un efecto sinérgico en la mejora de la eficiencia de hidrólisis cuando son usadas en combinación en un cóctel enzimático comprendiendo las principales enzimas celulolíticas (beta-glucosidasa, celobiohidrolasas y endoglucanasa) de M. thermophila. Concretamente, la Fig. 3 muestra que la mezcla de ambas PMOs en dicho cóctel rinde más glucosa que la suma del efecto de mejora de la hidrólisis de ambas enzimas empleadas por separado en el mismo cóctel. Por ello, en una realización aún más preferida, el polipéptido de la invención consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44.
El término "incremento" o "aumento" tal y como se emplea en la presente invención se refiere al incremento en el rendimiento de un producto de reacción, por ejemplo, de un azúcar fermentable, producido cuando un componente particular presente durante la reacción (tal como un polipéptido PMO de la invención) causa una mayor producción del producto en comparación con una reacción llevada a cabo bajo las mismas condiciones y con el mismo sustrato pero en ausencia del componente en cuestión.
Debido a la degeneración del código genético, en el cual diversos tripletes de nucleótidos dan lugar a un mismo aminoácido, existen diversas secuencias de nucleótidos que dan lugar a una misma secuencia aminoacídica. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido aislado, de ahora en adelante "polinucleótido de la invención", que codifica al menos un polipéptido de la invención. Otro aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica complementaria al polinucleótido de la invención.
Los términos "secuencia nucleotídica", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico", "oligonucleótido" y "polinucleótido" se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud que pueden estar o no, química o bioquímicamente modificados. Se refieren, por tanto, a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, tanto de cadena sencilla como de doble hebra. El polinucleótido de la invención puede ser, por tanto, ADN, ARN, o derivados tanto de ADN como de ARN, incluyendo ADNc. El polinucleótido de la invención puede obtenerse de manera artificial mediante métodos de clonación y selección convencionales, o mediante secuenciación. El polinucleótido, adicionalmente a la secuencia codificante, puede llevar otros elementos, como por ejemplo aunque sin limitarse, intrones, secuencias no codificantes en los extremos 5' o 3', sitios de unión a ribosomas, o secuencias estabilizadoras. Estos polinucleótidos adicionalmente pueden incluir secuencias codificantes para aminoácidos adicionales que puedan ser útiles, por ejemplo, aunque sin limitarse, para aumentar la estabilidad del péptido generado a partir de él o permitir una mejor purificación del mismo. Las secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de la invención pueden, por ejemplo, diseñarse en base a las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente invención. Las secuencias nucleotídicas codificantes para los polipéptidos PMO inmaduros descritos en la presente invención consisten, preferiblemente, en: PMO-04725 (SEQ ID NO: 1 ), PMO-06230 (SEQ ID NO: 2), PMO- 09768 (SEQ ID NO: 3), PMO-01470 (SEQ ID NO: 4), PMO-03248 (SEQ ID NO: 5), PMO-00727 (SEQ ID NO: 6), PMO-10391 (SEQ ID NO: 7), PMO-10824 (SEQ ID NO: 8), PMO-09767 (SEQ ID NO: 9), PMO-03778 (SEQ ID NO: 10), PMO-04750 (SEQ ID NO: 1 1 ), PMO-10518 (SEQ ID NO: 12), PMO-05022 (SEQ ID NO: 13), PMO-05366 (SEQ ID NO: 14), PMO-02839 (SEQ ID NO: 15), PMO-10366 (SEQ ID NO: 16), PMO- 04874 (SEQ ID NO: 17), PMO-08101 (SEQ ID NO: 18), PMO-00657 (SEQ ID NO: 19), PMO-04859 (SEQ ID NO: 20) y PMO-03723 (SEQ ID NO: 21 ). La secuencia nucleotídica que codifica para el péptido señal de cada una de las PMOs inmaduras ha sido identificada y se muestra señalada en las respectivas secuencias del listado de secuencias.
El polinucleótido de la invención puede introducirse en una construcción génica, por ejemplo, en un vector de clonación o vector de expresión, para permitir su replicación o su expresión. Preferiblemente, dicho vector es un vector apropiado para la expresión y purificación del polipéptido de la invención. Por todo ello, otro aspecto de la invención se refiere a una construcción génica que comprende al menos uno de los polinucleótidos de la invención, de ahora en adelante "construcción génica de la invención". El término "construcción génica" tal como se usa aquí se refiere a una molécula de ácido nucleico, tanto monocatenaria como bicatenaria, que está aislada de un gen que se produce de forma natural o que está modificada para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que no podría existir en la naturaleza. El término "construcción de ácido nucleico" o "construcción génica" es sinónimo del término "cásete de expresión" cuando la construcción de ácido nucleico contiene las secuencias control requeridas para la expresión del polinucleótido de la invención. Por tanto, la construcción genética de la invención puede comprender además una o más secuencias control o reguladoras de la expresión génica, tales como secuencias promotoras, secuencias líder, secuencias terminadoras de la transcripción, secuencias de poliadenilación, secuencias señal, etc. El término "secuencias control" incluye todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión del polinucleótido de la presente invención. Cada secuencia control puede ser del mismo o distinto origen que el polinucleótido de la invención. Dichas secuencias control incluyen, pero no se limitan a, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia propeptídica, un promotor, una secuencia del péptido señal, y una secuencia terminadora de la transcripción. Como mínimo, las secuencias control incluyen una secuencia del péptido señal, y más preferiblemente también un promotor, y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Se pueden proporcionar también secuencias control con enlazadores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que facilitan la unión de las secuencias control con la región codificante del polipéptido de la invención. Secuencias de control apropiadas para la expresión de un polinucleótido en células eucariotas son conocidas en el estado de la técnica. Como se usa aquí, el término "promotor" hace referencia a una secuencia nucleotídica, generalmente "aguas arriba" o "upstream" del punto de inicio de la transcripción, que es capaz de iniciar la transcripción en una célula. Este término incluye, por ejemplo, pero sin limitarse, promotores constitutivos, promotores específicos de tipo celular y promotores inducibles o reprimibles. En general, las secuencias de control dependen del origen de la célula hospedadora.
En una realización preferida, la construcción génica de la invención es un vector de expresión. Un "vector de expresión" es una molécula de ADN lineal o circular que comprende al menos un polinucleótido de la invención, y que se une de manera operativa a nucleótidos adicionales que se proporcionan para su expresión. Dicho vector que comprende el polinucleótido de la invención, se puede introducir en una célula hospedadora de tal manera que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autoreplicante. El término "unido operativamente" se refiere a una configuración en la que una secuencia control se coloca en una posición adecuada con respecto a la secuencia codificante del polinucleótido de la invención, de tal manera que la secuencia control dirige la expresión de dicho polinucleótido. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de tal manera que ésta se une operativamente a las secuencias control adecuadas para su expresión. Por tanto, los vectores de expresión a los que se hace referencia en la presente invención comprenden el polinucleótido de la invención, un promotor, y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Los diversos ácidos nucleicos y las secuencias control descritas aquí pueden unirse entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o la sustitución del polipéptido de la invención en dichos sitios.
El vector de expresión al que se refiere la presente invención puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que se puede someter de forma conveniente a un procedimiento de ADN recombinante y puede producir la expresión del polinucleótido de la invención. La elección del vector dependerá normalmente de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que se va a introducir el mismo. El vector de expresión puede ser un plásmido, un cósmido, un fago, un virus, un cromosoma artificial de bacteria (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), o similares.
Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados. El vector puede ser un vector replicante de forma autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integra en el genoma y se replica junto con el(los) cromosoma(s) en el(los) que se ha integrado. Además, se puede usar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que contienen conjuntamente el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula hospedadora, o un transposón. Los vectores utilizados en la presente invención contienen preferiblemente uno o más marcadores seleccionares que permiten una fácil selección de las células transformadas, transfectadas, transducidas, o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o a virus, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares. Los marcadores seleccionares para uso en una célula hospedadora de hongo filamentoso incluyen, pero no se limitan a, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricin acetiltransferasa), hph (higromicin fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato decarboxilasa), pyr5, pyr4, cysC (sulfato adeniltransferasa), y trpC (antranilato sintasa), así como sus equivalentes. Los vectores a los que se refiere la presente invención contienen preferiblemente un(os) elemento(s) que permite(n) la integración del vector en el genoma de la célula hospedadora o la replicación autónoma del vector en la célula independientemente del genoma. Para la integración en el genoma de la célula hospedadora, el vector puede basarse en la secuencia del polinucleótido de la invención o en cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homologa o no homologa. De forma alternativa, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homologa en el genoma de la célula hospedadora en una(s) localización(es) precisa(s) del(los) cromosoma(s).
Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permita al vector replicarse de forma autónoma en la célula hospedadora en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plasmídico que medie en la replicación autónoma que funcione en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador plasmídico" se define aquí como una secuencia de nucleótidos que permite a un plásmido o vector replicarse in vivo. Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de hongo filamentoso son AMA1 y ANS1. Se puede insertar más de una copia del polinucleótido de la presente invención en la célula hospedadora para aumentar la producción del/los producto/s génico/s. Se puede obtener un aumento en el número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedadora o incluyendo con el polinucleótido un gen marcador seleccionable amplificable, donde las células que contienen las copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por tanto, copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar cultivando las células en presencia del agente de selección adecuado.
Los procedimientos utilizados para unir los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinante referidos en la presente invención son bien conocidos por los expertos en la técnica. En una realización más preferida, la construcción génica de la invención comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 43 y otro polinucleótido que codifica el polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 44. La construcción génica de la invención se puede introducir en una célula hospedadora competente para llevar a cabo la expresión del polipéptido de la invención. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere a una célula hospedadora que comprende la construcción génica de la invención, "célula hospedadora de la invención". La "célula hospedadora", tal como se usa aquí, incluye cualquier tipo de célula que es susceptible de transformación, transfección, transducción, y similares, con la construcción génica de la invención. La célula hospedadora puede ser eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta u hongo. En una realización preferida, la célula hospedadora es una célula de hongo filamentoso. Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por presentar una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, mañano, y otros polisacáridos complejos. En una realización más preferida, la célula hospedadora del hongo filamentoso es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma. En una realización más preferida, la célula hospedadora de hongo filamentoso es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otra realización más preferida, la célula hospedadora de hongo filamentoso es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum. En otra realización más preferida, la célula hospedadora de hongo filamentoso es una célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Gibberella zeae, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride. En una realización aún más preferida, la célula hospedadora de la invención es cualquier cepa de la especie Myceliophthora thermophila. En una realización aún más preferida, la célula hospedadora de la invención es la cepa C1 de Myceliophthora thermophila. Se entenderá que para las especies anteriormente mencionadas, la invención abarca los estados perfecto e imperfecto, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, los anamorfos, con respecto al nombre de la especie por el cual son conocidos. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes adecuados. Por ejemplo, Myceliophthora thermophila es equivalente a Chrysosporium lucknowense.
La célula hospedadora de la invención comprende, por tanto, al menos un polinucleótido de la invención introducido recombinantemente mediante la construcción genética de la invención. Dichos polinucleótidos pueden codificar el polipéptido maduro o una pre-proteína que consiste en un péptido señal unido a la enzima madura que tendrá que procesarse posteriormente con el fin de producir la enzima PMO madura.
La célula hospedadora de la invención expresa al menos uno de los polipéptidos PMO de la invención, o cualquier combinación de los mismos, de manera que éstos son funcionales, y es capaz de secretarlos al medio extracelular. El término "funcional" significa que la/s enzima/s expresada/s retiene/n su capacidad de oxidar la celulosa. Esta actividad puede medirse por medio de cualquier procedimiento adecuado conocido en el estado de la técnica para evaluar la actividad de PMO, preferiblemente por medio del procedimiento descrito a continuación en los ejemplos de la presente invención.
El término "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción del polipéptido de la invención que incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación post-transcripcional, traducción, modificación post-traduccional, y secreción. Cuando la célula hospedadora de la invención es Myceliophthora thermophila, preferiblemente M. thermophila cepa C1 , dicha célula sobreexpresa al menos uno de los polipéptidos PMO de la invención, ya que al comprender la construcción génica de la invención, contiene más copias del polinucleótido de la invención de las que comprende el genoma de la célula no transformada. Se entiende por "sobreexpresión de PMO" la expresión del polipéptido PMO de la invención por encima de los niveles de expresión de dicho polipéptido en la misma célula no transformada con la construcción génica de la invención. Se puede llevar a cabo la expresión del polipéptido de la invención en la célula hospedadora de la invención por medio de cualquier procedimiento conocido en la técnica, tal como la transformación de una célula hospedadora adecuada con al menos un polinucleótido de la invención, o la construcción genética de la invención, y el cultivo de la célula hospedadora transformada en condiciones que induzcan la expresión de dicho polinucleótido con el fin de obtener la enzima secretada.
Se puede cultivar la célula hospedadora en un medio nutritivo adecuado, sólido o líquido, para la producción del PMO, utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar mediante cultivo en matraz con agitación, y fermentación a pequeña escala o a gran escala (que incluye las fermentaciones continua, discontinua o batch, de alimentación discontinua o fed- batch, o en estado sólido) llevada a cabo en un biorreactor de laboratorio o industrial en un medio adecuado y en condiciones que permitan expresar y/o aislar la PMO. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando los procedimientos conocidos en la técnica. Si se secreta la PMO en el medio nutritivo, ésta se puede recuperar directamente del medio.
La PMO expresada se puede detectar utilizando procedimientos conocidos en la técnica específicos para polipéptidos. Estos procedimientos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto de la enzima, o la desaparición de un sustrato de la enzima.
La PMO resultante se puede recuperar utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la PMO se puede recuperar a partir del medio nutritivo mediante procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, centrifugación, filtración, extracción, secado mediante pulverización, evaporación, o precipitación.
Las PMO's producidas en la presente invención se pueden purificar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrófoba, cromatofocalización, y exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, focalización isoeléctrica preparativa), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación en sulfato de amonio), SDS-PAGE, o extracción, con el fin de obtener una PMO sustancialmente pura que se pueda incluir en una composición enzimática junto con otras enzimas celulolíticas.
La célula hospedadora de la invención puede expresar al menos uno de los polipéptidos de la invención, o cualquier combinación de los mismos, por ejemplo aunque sin limitarnos, los polipéptidos que consisten en la SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44. Asimismo, dicha célula puede expresar a su vez una o varias de otras enzimas celulolíticas, nativas o recombinantes.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición enzimática que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención, denominada a partir de ahora "composición de la invención". Esta composición de la invención puede comprender además otras actividades enzimáticas, tales como aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, tales como endoglucanasas, beta- glucosidasas y/o celobiohidrolasas; quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glucosiltransferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta- galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, reductasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, proteasa, ribonucleasa, transglutaminasa, o xilanasa, o cualquiera de sus combinaciones. La(s) enzima(s) adicional(es) se puede(n) producir, por ejemplo, mediante un microorganismo que pertenece al género Aspergillus, tal como Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, o Aspergillus oryzae; Fusarium, tal como Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusaríum sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum; Gibberella, tal como Gibberella zeae; Humicola, tal como Humicola insolens o Humicola lanuginosa; Trichoderma, tal como Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride; o Myceliophthora, tal como Myceliophthora thermophila.
En una realización preferida, la composición de la invención comprende además otras enzimas celulolíticas. El término "enzimas celulolíticas" también conocido como "celulasas", se refiere a una clase de enzimas capaces de hidrolizar la celulosa (enlaces de β-1 ,4 |Ιυο3ηο o β-D-glucosídicos) o la hemicelulosa a oligosacáridos más cortos, celobiosa y/o glucosa. Ejemplos de enzimas celulolíticas son, pero no se limitan a, endoglucanasas, beta-glucosidasas, celobiohidrolasas, polisacárido monooxigenasas (otras distintas a las descritas en la presente invención), beta- xilosidasas, endoxiloglucanasas o endoxilanasas. De esta manera, en una realización más preferida, estas enzimas celulolíticas se seleccionan a partir de la lista que consiste en endoglucanasas, beta-glucosidasas, celobiohidrolasas, polisacárido monooxigenasas, beta-xilosidasas, endoxilanasas, endoxiloglucanasas, o cualquiera de sus combinaciones. Estas enzimas celulolíticas pueden derivar de la célula hospedadora de la invención o de otros microorganismos productores de enzimas celulolíticas diferentes de la célula hospedadora de la invención. Igualmente, se pueden producir de forma natural o recombinante.
En una realización preferida, la composición de la invención comprende un polipéptido de la invención que consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 43 y un polipéptido de la invención que consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 44.
Preferiblemente, la composición de la invención comprende al menos un polipéptido de la invención, más preferiblemente el polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 43 y el polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 44, y otras enzimas celulolíticas derivadas de la célula hospedadora de la invención. En una realización aún más preferida, la composición de la invención es una mezcla enzimática expresada por la célula hospedadora de la invención. En una realización aún más preferida, la composición de la invención es una mezcla enzimática obtenida mediante la célula hospedadora de la invención, preferiblemente M. thermophila de la cepa C1 . El término "endoglucanasa" o "EG" se refiere a un grupo de enzimas celulasas clasificado como E.C. 3.2.1 .4. Estas enzimas hidrolizan los enlaces β-1 ,4 glucosídicos internos de la celulosa. El término "celobiohidrolasa" se refiere a una proteína que cataliza la hidrólisis de la celulosa a celobiosa mediante una actividad exoglucanasa, liberando secuencialmente moléculas de celobiosa desde los extremos reductores o no reductores de la celulosa o los celooligosacáridos. El término "beta-glucosidasa", tal como se usa aquí, se refiere a una enzima que cataliza la hidrólisis de un dímero de azúcar, incluyendo, pero sin limitarse a celobiosa, con la liberación de un monómero de azúcar correspondiente, utilizada, pero sin limitarse, para la síntesis de etanol. La enzima beta-glucosidasa actúa sobre los puentes β1->4 que unen a dos moléculas de glucosa o glucosa sustituida (es decir, el disacárido celobiosa). Es una exocelulasa con especificidad por una variedad de sustratos de beta-D-glucósido. Cataliza la hidrólisis de residuos no reductores terminales en beta-D-glucósidos con liberación de glucosa.
El término "endoxilanasa" se refiere a una enzima que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1 ,4-beta-D-xilosídicos en xilanos.
El término "β-xilosidasa" se refiere a una proteína que hidroliza 1 ,4^-D-xilooligómeros cortos hasta xilosa. El término "endoxiloglucanasa" se refiere a una enzima específica de xiloglucano, capaz de catalizar la solubilización de xiloglucano en oligosacáridos pero que no muestra una actividad celulolítica sustancial.
En otra realización preferida, la composición de la invención comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención, más preferiblemente el polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 43 y el polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 44, y una mezcla celulolítica que consiste en: endoglucanasa, beta-glucosidasa, celobiohidrolasa I y celobiohidrolasa II. Más preferiblemente, estas enzimas celulolíticas proceden de M. thermophila. La composición de la invención se puede preparar de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica y puede estar en forma líquida o de una composición seca. Por ejemplo, la composición puede estar en la forma de un granulado o un microgranulado. Las enzimas que se van a incluir en la composición pueden estabilizarse de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica.
Tal como se ha indicado anteriormente, la célula hospedadora de la invención expresa al menos un polipéptido PMO de la invención, el cual es capaz de oxidar celulosa cuando se secreta al medio extracelular. Esta célula hospedadora es capaz de secretar esta/s enzima/s al medio junto con otra/s enzima/s celulolítica/s producida/s de forma natural o recombinante, siendo de esta manera útil para la optimización de la etapa de hidrólisis de la biomasa en azúcares fermentables.
Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de la célula hospedadora de la invención, de al menos un polipéptido de la invención, o de la composición de la invención, para la degradación de biomasa celulósica.
El término "biomasa" significa la fracción biodegradable de los productos, residuos y restos de origen biológico procedentes de la agricultura (incluyendo sustancias vegetales, tales como residuos de cultivos, y sustancias animales), industrias forestales (tales como recursos madereros) e industrias relacionadas que incluyen pesquerías y acuicultura, así como la fracción biodegradable de los residuos industriales y urbanos, tales como residuos sólidos urbanos o residuos de papel. En una realización preferida, la biomasa es paja o la fracción orgánica de residuos sólidos urbanos. En una realización más preferida, la biomasa es biomasa vegetal, más preferiblemente seleccionada a partir de la lista que consiste en: biomasa rica en azúcares fermentables, tales como caña de azúcar; biomasa de almidón, por ejemplo, granos o paja de trigo; o maíz o paja de maíz o grano de maíz o fibra de maíz; o granos o paja de cebada; o granos o paja de sorgo. La biomasa también puede ser, arroz, hierba, ramas, etc.
El polipéptido de la invención, así como la célula hospedadora o la composición de la presente invención, se pueden utilizar en la producción de monosacáridos, disacáridos y polisacáridos como materias primas químicas o de la fermentación, a partir de biomasa para la producción de etanol, butanol, plásticos, alcanos, alquenos, u otros productos o intermedios. La célula hospedadora de la presente invención se puede utilizar como una fuente del polipéptido de la invención, y otras enzimas celulolíticas, en un proceso de fermentación con la biomasa. El polisacárido predominante en la pared celular primaria de la biomasa vegetal es celulosa, el segundo más abundante es hemicelulosa, y el tercero, dependiendo de la biomasa de que se trate, puede ser pectina. La pared celular secundaria, producida después de que la célula haya detenido su crecimiento, contiene también polisacáridos y está reforzada mediante lignina polimérica covalentemente entrecruzada con hemicelulosa. La celulosa es un homopolímero de anhidrocelobiosa y de esta manera es un beta-(1-4)-D-glucano lineal, mientras que la hemicelulosa incluye una variedad de compuestos, tales como xilanos, xiloglucanos, arabinoxilanos, y mananos en estructuras ramificadas complejas con una gama de sustituyentes. Aunque generalmente polimorfa, la celulosa se encuentra en el tejido vegetal principalmente como una matriz insoluble cristalina de cadenas paralelas de glucano. Las hemicelulosas se unen normalmente mediante enlaces de hidrógeno a la celulosa, así como a otras hemicelulosas, lo que ayuda a estabilizar la matriz de la pared celular. Los polipéptidos de la invención pueden utilizarse junto con el resto de enzimas celulolíticas para degradar el componente de celulosa del sustrato de la biomasa.
La degradación o hidrólisis de la biomasa a azúcares fermentables, proceso conocido también como "sacarificación", por medio del polipéptido de la invención, la célula hospedadora de la invención o la composición de la invención, puede ir seguida de un proceso de fermentación en el que los azúcares fermentables obtenidos se utilizan con el fin de obtener finalmente un bioproducto tal como bioetanol.
De esta manera, otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de al menos un polipéptido de la invención, de la célula hospedadora de la invención o de la composición de la invención, para la degradación de la biomasa en un proceso de producción de un bioproducto.
El término "bioproducto" o "productos biobasados" se refiere a aquellos materiales, productos químicos y energía derivados de recursos biológicos renovables. Ejemplos de estos bioproductos son, pero no se limitan a, compuestos de hidrocarburo en sus diferentes formas, tales como compuestos alifáticos (saturados, insaturados, cíclicos) o aromáticos, como alcanos, alquenos, alquinos, formas cíclicas de estos compuestos o hidrocarburos aromáticos; sustancias oxigenadas como alcoholes (tales como etanol, butanol, sorbitol), éteres, aldehidos, cetonas o ácidos carboxílicos; sustancias nitrogenadas como aminas, amidas, nitrocompuestos o nitrilos; sustancias halogenadas como haluros; ácidos orgánicos (tales como ácido láctico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido glutámico, ácido cítrico o ácido propiónico). El término "bioproductos" incluye también cualquier combinación de los compuestos descritos anteriormente, compuestos derivados adicionalmente de los compuestos descritos anteriormente mediante cualquier tipo de tratamiento físico, químico o biológico, polímeros de los compuestos descritos anteriormente, compuestos descritos anteriormente sustituidos por cualquier grupo o elemento funcional en una más de sus formas unidas y ramificadas de los compuestos descritos anteriormente.
Se puede producir etanol mediante la degradación enzimática de la biomasa y la conversión de los sacáridos liberados en etanol. Este tipo de etanol se denomina a menudo bioetanol. Se puede usar como un aditivo de combustible o extensor en mezclas de menos del 1 % hasta un 100% (un sustituto del combustible).
En una realización más preferida, el bioproducto es biocombustible. El término "biocombustible", tal como se usa aquí, se refiere a un hidrocarburo, o a una de sus mezclas, que se puede utilizar como combustible y se obtiene utilizando la biomasa fermentable como material de partida. Ejemplos de biocombustibles incluyen, pero no se limitan a, etanol o bioetanol, butanol o biobutanol y biodiesel. En una realización más preferida, el biocombustible es bioetanol.
El término "bioetanol" se refiere a un alcohol preparado mediante fermentación, a partir de biomasa fermentable tal como los hidratos de carbono producidos en cultivos de azúcar o de almidón tales como maíz o caña de azúcar. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir azúcares fermentables, denominado aquí "primer procedimiento de la invención", que comprende:
a) incubar biomasa celulósica, preferiblemente biomasa pretratada, con la composición de la invención, y
b) recuperar los azúcares fermentables obtenidos después de la incubación de la etapa (a). Frecuentemente se requiere un procedimiento de pretratamiento de la biomasa para aumentar el acceso de las enzimas a sus sustratos y la hidrólisis eficaz consiguiente. El pretratamiento utiliza diversas técnicas, que incluyen, pero no se limitan a tratamiento químico (por ejemplo, explosión de la fibra con amonio o exposición a un solvente), tratamiento físico (por ejemplo, explosión con vapor a elevadas temperaturas), tratamiento mecánico (por ejemplo, trituración o molienda), tratamiento biológico, o cualquiera de sus combinaciones, para alterar la estructura de la biomasa celulósica y volver la celulosa más accesible. El término "azúcar fermentable" tal como se usa aquí, se refiere a azúcares sencillos (monosacáridos, disacáridos y oligosacáridos cortos), tales como glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, mañosa, ramnosa, sacarosa o fructosa, entre otros. Un azúcar fermentable es cualquiera que pueda utilizar o fermentar un microorganismo. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un bioproducto a partir de biomasa celulósica, denominado a partir de ahora "segundo procedimiento de la invención", que comprende:
a) incubar biomasa celulósica, preferiblemente biomasa pretratada, con la composición de la invención,
b) fermentar los azúcares fermentables obtenidos después de la etapa de incubación del paso (a) con al menos un microorganismo fermentador, y c) recuperar el bioproducto obtenido después de la fermentación de la etapa (b). El término "fermentador o fermentación" tal como se usa aquí, se refiere a un proceso de transformación biológica producido por la actividad de algunos microorganismos en los que los azúcares tales como glucosa, fructosa, y sacarosa se convierten en etanol. Los microorganismos usados de este modo son microorganismos fermentadores que tienen capacidad de fermentación, tales como levaduras de los géneros Saccharomyces, Pichia o Kluyveromyces, preferiblemente Saccharomyces cerevisiae, tanto estirpes naturales como modificadas genéticamente para la conversión de pentosas.
El término "recuperación" tal como se usa aquí, se refiere a la recogida de azúcares fermentables obtenidos después de la incubación de la etapa (a) del primer procedimiento de la invención o del bioproducto obtenido después de la fermentación de la etapa (b) del segundo procedimiento de la invención. Se puede realizar la recuperación mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo los mecánicos o los manuales. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo procedimiento de la invención comprende, preferiblemente, un proceso de pretratamiento antes de la etapa (a). En general, un proceso de pretratamiento dará como resultado que los componentes del material celulósico sean más accesibles para las etapas posteriores o sean más digeribles por las enzimas tras el tratamiento en ausencia de hidrólisis. El pretratamiento puede ser un pretratamiento químico, físico, mecánico o biológico, o cualquier mezcla de los mismos.
Antes (es decir en la etapa (a)) y/o simultáneamente con la fermentación de la etapa (b) del segundo método de la invención, la biomasa, preferiblemente biomasa pretratada, se hidroliza para degradar la celulosa y la hemicelulosa en azúcares y/o oligosacáridos. El contenido en sólidos durante la hidrólisis puede estar, pero sin limitación, comprendido entre el 10-30% del peso total, preferiblemente entre el 15- 25% del peso total, más preferiblemente entre el 18-22% del peso total. La hidrólisis se realiza como un proceso en el que la biomasa, preferiblemente biomasa pretratada, se incuba con al menos un polipéptido de la invención, con la célula hospedadora de la invención o con la composición de la invención y forman así la solución de hidrólisis. El tiempo de proceso adecuado, la temperatura y las condiciones de pH pueden determinarse fácilmente por un experto en la técnica. Preferiblemente, dicha hidrólisis se realiza a una temperatura entre 25 °C y 60 °C, preferiblemente entre 40 °C y 60 °C, específicamente alrededor de 50 °C. El proceso se realiza preferiblemente a un pH en el intervalo de 4-6, preferiblemente pH 4,5-5,5, especialmente alrededor de pH 5,2. Preferiblemente, la hidrólisis se realiza en un tiempo comprendido entre 12 y 144 horas, preferiblemente entre 16 y 120 horas, más preferiblemente entre 24 y 96 horas, incluso más preferiblemente entre 32 y 72 horas.
La hidrólisis (etapa (a)) y la fermentación (etapa (b) del segundo método de la invención) pueden realizarse simultáneamente (proceso SSF) o secuencialmente (proceso SHF). De acuerdo con la invención, la biomasa hidrolizada, y preferiblemente pretratada, se fermenta por al menos un microorganismo fermentador capaz de fermentar azúcares fermentables, tales como glucosa, xilosa, mañosa y galactosa directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado. La fermentación se lleva a cabo prefenblemente en un tiempo comprendido entre 8 y 96 horas, preferiblemente entre 12 y 72, más preferiblemente entre 24 y 48 horas. En otra realización preferida, la fermentación se realiza a una temperatura entre 20 °C y 40 °C, preferiblemente de 26 °C a 34 °C, en particular alrededor de 32 °C. En otra realización preferida, el pH es de 3 a 6 unidades, preferiblemente de 4 a 5. Se prefiere para la fermentación etanólica una levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae, preferiblemente cepas que sean resistentes a altos niveles de etanol, hasta, por ejemplo, el 5 o el 7% en vol. de etanol o más, tal como el 10-15% en vol. de etanol. En una realización preferida del segundo procedimiento de la invención, el bioproducto es biocombustible, más preferiblemente bioetanol.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Producción de glucosa en proceso de hidrólisis de biomasa llevado a cabo por distintas mezclas enzimáticas.
Se compararon los rendimientos de la mezcla enzimática completa producida por M. thermophila (Cóctel completo, CC), la mezcla de enzimas purificadas (endoglucanasa, celobiohidrolasa I, celobiohidrolasa II y Betaglucosidasa) denominada cóctel mínimo (CM), y dicho cóctel mínimo suplementado con la enzima PMO-06230. Las dosificaciones se realizaron en mg de proteína por g de celulosa o glucano. Los métodos analíticos para la determinación de glucosa, celulosa y proteína se describen en el Ejemplo 6.
Figura 2. Suplementación del cóctel completo producido por M. thermophila con distintas cantidades de PMO-06230.
Se compararon los rendimientos de la mezcla enzimática completa producida por M. thermophila (CC) y de ésta suplementada con distintas dosis de la enzima purificada PMO-06230. Los controles de dosis de cóctel completo permiten la comparación del rendimiento del cóctel completo y éste suplementado a una misma dosis. Las condiciones experimentales en las que hubo adición de enzima PMO-06230 se indican en la figura con barras con trama. Las dosificaciones se realizaron en mg de proteína por g de celulosa o glucano. Los métodos analíticos para la determinación de glucosa, celulosa y proteína, se describen en el Ejemplo 6.
Figura 3. Efecto sinérgico entre diferentes polisacárido monooxigenasas.
Se compararon los rendimientos de la mezcla de enzimas purificadas (endoglucanasa, celobiohidrolasa I, celobiohidrolasa II y betaglucosidasa) denominada cóctel mínimo (CM) y de dicho cóctel mínimo suplementado con las enzimas PMO-04725, PMO- 06230 y una mezcla de ambas. Las dosificaciones se realizaron en mg de proteína por g de celulosa o glucano. Los métodos analíticos para la determinación de glucosa, celulosa y proteína se describen en el Ejemplo 6. Figura 4. Vector de expresión pBASE5-K4.
El vector porta Pcbhl como secuencia promotora, Tcbhl como secuencia de terminación y pyr4 como marcador de selección en hongos. La propagación en E. coli se seleccionó mediante resistencia a kanamicina. Λ/del y EcoR\ o EcoRV fueron los sitios de restricción escogidos para clonar las PMOs.
Figura 5. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-01470. Figura 6. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-03248. Figura 7. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-00727. Figura 8. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-09768. Figura 9. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-10391.
Figura 10. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-10824. Figura 11. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-09767. Figura 12. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-03778. Figura 13. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-06230. Figura 14. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-04750. Figura 15. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-10518. Figura 16. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-05022. Figura 17. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-05366.
Figura 18. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-02839. Figura 19. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-04725. Figura 20. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-10366. Figura 21. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-04874. Figura 22. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-08101.
Figura 23. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-00657.
Figura 24. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-04859. Figura 25. Plásmido para la sobreexpresión de PMO-03723.
Figura 26. Separación e identificación de las principales celulasas y PMOs de la invención mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE, 7,5%).
A. Principales celulasas producidas por M. thermophila. Carril 1 : Marcador de peso molecular; Carril 2: cóctel completo; Carril 3: cóctel mínimo de celulasas purificadas de M. thermophila. B. Monooxigenasas de polisacáridos purificadas (PMOs). Carril 1 : Marcador de peso molecular; Carril 2: PMO-04725; Carril 3: PMO-06230; Carril 4: PMO-09768; Carril 5: PMO-01470; Carril 6: PMO-04750. Figura 27. Efecto en sacarificación sobre biomasa molida de la suplementación del cóctel mínimo y del cóctel completo de M. thermophila con las diferentes PMO.
Se compararon los rendimientos de la mezcla enzimática completa (barras rayadas) producida por M. thermophila (CC) y de la mezcla de enzimas purificadas (endoglucanasa, celobiohidrolasa I, celobiohidrolasa II y betaglucosidasa) denominada cóctel mínimo (CM) representado por las barras vacías; ambas con y sin suplementación con 2 mg proteina/g glucano de distintas PMO purificadas. Los métodos analíticos para la determinación de glucosa, celulosa y proteína, se describen en el Ejemplo 6.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Evaluación funcional comparativa de la mezcla de enzimas purificadas (cóctel mínimo) y la mezcla enzimática completa (cóctel completo) producida por M. thermophila.
La mezcla enzimática producida por M. thermophila (cóctel completo) fue obtenida de acuerdo al protocolo descrito por Verdoes et al., 2007, (Ind. Biotechnol. 3 (1 )) y Visser et al., 201 1 , (Ind. Biotechnol., 7 (3)), usando para ello el desarrollo de una plataforma industrial de producción de enzimas basada en el organismo M. thermophila C1 por Dyadic Netherlands. Esta mezcla enzimática o cóctel completo (CC) fue utilizado como fuente para la purificación de las distintas enzimas que, mezcladas en la misma proporción original, constituyeron el denominado cóctel mínimo (CM). De este modo, siguiendo el protocolo posteriormente descrito en el Ejemplo 4, se purificó una enzima endoglucanasa (4-Beta-D-glucano 4-glucanohidrolasa, EC 3.2.1.4), dos enzimas celobiohidrolasa o exo-Beta-Glucanasa (EC 3.2.1 .9.1 ) y una enzima Beta-glucosidasa (EC 3.2.1 .21 ). Estas enzimas actúan de forma sinérgica en la hidrólisis de la celulosa, siendo las principales responsables de la liberación de glucosa en el proceso de hidrólisis de biomasa (Ekperigin, M.M., 2007, African Journal of Biotechnology, 6). Sin embargo, recientes trabajos han demostrado la implicación de otras enzimas auxiliares no hidrolíticas en la producción de glucosa desde materiales lignocelulósicos, destacando entre ellas las enzimas líticas monooxigenasas de polisacáridos (PMOs), anteriormente denominadas GH61 (Zifcakova et al., 2012, Fungal Ecology, 5). En la presente invención, estas enzimas han sido identificadas en el genoma de M. thermophila (ver Ejemplo 2), purificadas y evaluadas en el proceso de hidrólisis de biomasa descrito posteriormente en el Ejemplo 6. Este mismo procedimiento de evaluación en hidrólisis de biomasa molida fue utilizado para comparar el rendimiento del cóctel completo de enzimas producido por M. thermophila, la mezcla de celulasas purificadas (cóctel mínimo), y este mismo cóctel mínimo suplementado con enzima PMO purificada. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 1 . La enzima PMO utilizada fue identificada por espectrometría de masas como PMO-06230 (SEQ ID NO: 44) de M. thermophila.
La suplementación de 8,64 mg/g de cóctel mínimo con 2 mg/g de PMO-06230 logró una producción de glucosa comparable a la de 10 mg/g de cóctel completo. Este resultado puso de manifiesto la implicación de estas enzimas oxigenasas en la producción eficiente de glucosa por hidrólisis de material celulósico.
Más aún, la suplementación del cóctel completo con esta enzima PMO-06230 dio lugar a aumentos muy significativos en la producción de glucosa en ensayos de hidrólisis de biomasa. Ello se refleja en la Figura 2, en la que se compara la producción de glucosa por el cóctel completo a distintas dosis y este mismo cóctel suplementado con cantidades crecientes de PMO-06230.
Por tanto, la suplementación de la mezcla de enzimas producida por M. thermophila con enzima purificada PMO da lugar a un rendimiento significativamente mayor en la hidrólisis de biomasa. Por ejemplo, 10 mg/g de cóctel completo suplementados con 4 mg/g de PMO-06230 produce aproximadamente un incremento del 17% en la liberación de glucosa comparado con 14 mg/g de cóctel completo, en el proceso de hidrólisis de biomasa molida descrito en el Ejemplo 6 (Fig. 2).
Además como se muestra en la Figura 3, estas enzimas tienen actividades complementarias y sinérgicas. Los controles sin la adición de PMO y de dosis con la adición de cada una de las enzimas por separado permiten concluir que la mezcla de ambas PMO rinde más glucosa (30 g/kg) que la suma de ambas enzimas por separado (23g/kg; 10 g/kg para la PMO-04725 y 13 g/kg para la PMO-06230) alcanzando el valor de la mezcla enzimática completa producida por M. thermophila (CC). Estos resultados ponen de manifiesto la indiscutible función de estas enzimas PMO en la hidrólisis de biomasa y su aplicación en la mejora de las mezclas enzimáticas actualmente disponibles. Ejemplo 2. Identificación de secuencias codificantes para polisacárido monooxiqenasas en M. thermophila.
En base a los resultados del Ejemplo 1 se decidió sobreexpresar la totalidad de los genes codificantes de posibles polisacárido monooxigenasas (PMOs) del genoma de M. thermophila para su evaluación en la mejora de las mezclas celulolíticas. La identificación de posibles secuencias codificantes de PMOs se llevó a cabo mediante búsqueda de proteínas con regiones conservadas del tipo polisacárido monooxigenasas, comúnmente denominadas glicosil-hidrolasas de la familia 61 . De esta forma se identificaron 21 secuencias en el genoma de M. thermophila. En la Tabla 1 se muestra la numeración identificativa correspondiente a cada secuencia de nucleótidos y proteínas.
Tabla 1. Identificación de las secuencias de ADN o proteína correspondiente a cada una de las PMOs localizadas en el genoma de M. thermophila C1 .
Acido Secuencia proteica de la Secuencia proteica de la
Denominación nucleico enzima inmadura enzima madura
SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO
PMO-04725 1 22 43
PMO-06230 2 23 44
PMO-09768 3 24 45
PMO-01470 4 25 46
PMO-03248 5 26 47
PMO-00727 6 27 48
PMO-10391 7 28 49
PMO-10824 8 29 50
PMO-09767 9 30 51
PMO-03778 10 31 52
PMO-04750 1 1 32 53
PMO-10518 12 33 54
PMO-05022 13 34 55
PMO-05366 14 35 56
PMO-02839 15 36 57
PMO-10366 16 37 58
PMO-04874 17 38 59
PMO-08101 18 39 60 PMO-00657 19 40 61
PMO-04859 20 41 62
PMO-03723 21 42 63
Ejemplo 3. Sobreexpresion de las secuencias codificantes para polisacárido monooxiqenasas en M. thermophila.
Para llevar a cabo la sobreexpresion de las 21 secuencias identificadas en el ejemplo 2 se amplificó cada una de ellas mediante PCR utilizando ADN genómico de M. thermophila C1 como molde. La longitud de la secuencia de nucleótidos (en pares de bases, pb), así como el peso molecular predicho de la pre-proteína y la proteína madura (en KDa) correspondientes se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Longitud de la secuencia de ADN y tamaños moleculares predichos de pre- proteínas y proteínas maduras de cada una de las PMOs.
Longitud de la Peso molecular de Peso molecular de la
Enzima secuencia de la pre-proteína proteína madura nucleótidos (pb) (KDa) (KDa)
PMO-04725 924 26,9 25,1
PMO-06230 1316 32,2 30,5
PMO-09768 749 24,4 22,7
PMO-01470 1449 31 ,5 29,7
PMO-03248 1085 24,0 22,0
PMO-00727 1008 21 ,5 19,9
PMO-10391 938 24,1 22,5
PMO-10824 926 24,1 22,5
PMO-09767 1029 24,2 22,6
PMO-03778 1034 25,5 23,6
PMO-04750 902 24,8 23,4
PMO-10518 847 24,3 23,0
PMO-05022 1241 31 ,4 29,9
PMO-05366 815 26,0 24,0
PMO-02839 1320 23,7 21 ,8
PMO-10366 1 149 28,4 26,1
PMO-04874 1029 34,9 33,0
PMO-08101 1023 35,3 33,2
PMO-00657 1017 35,2 32,9 PMO-04859 737 26,5 24,5
PMO-03723 1395 46,8 44,5
Cada secuencia genómica codificante para PMOs se amplificó utilizando los oligonucleótidos indicados en la Tabla 3.
Tabla 3. Oligonucleótidos utilizados para amplificar cada uno de los genes codificantes de PMOs. En los oligonucleótidos directos se encuentra el sitio de corte Λ/del y en los reversos el sitio EcoR\ o EcoRV.
Oligonucleótido directo Oligonucleótido reverso
Gen
SEQ ID NO SEQ ID NO
PMO-04725 64 65
PMO-06230 66 67
PMO-09768 68 69
PMO-01470 70 71
PMO-03248 72 73
PMO-00727 74 75
PMO-10391 76 77
PMO-10824 78 79
PMO-09767 80 81
PMO-03778 82 83
PMO-04750 84 85
PMO-10518 86 87
PMO-05022 88 89
PMO-05366 90 91
PMO-02839 92 93
PMO-10366 94 95
PMO-04874 96 97
PMO-08101 98 99
PMO-00657 100 101
PMO-04859 102 103
PMO-03723 104 105
La amplificación se realizó utilizando ADN Polimerasa iProof High-Fidelity (BioRad) mediante un ciclo de desnaturalización a 98° C durante 30 segundos seguido de 35 ciclos de 98° C durante 10 segundos, 59°C durante 40 segundos, 72° C durante 30 segundos y un ciclo final de 72° C durante 10 minutos. Los fragmentos de ADN amplificados se digirieron con las enzimas de restricción Λ/del y EcoR\ en todos los casos salvo en el caso de la PMO-03248 que se digirió con Λ/del y EcoRV. Cada uno de los fragmentos de ADN fue clonado en el vector de expresión pBASE5K4 previamente digerido con las mismas enzimas de restricción que el fragmento de ADN correspondiente. El vector de expresión pBASE5K4 contiene la secuencia promotora del gen de la celobiohidrolasa 1 (Pcbhl), que se corresponde con una región de 1796 pb aguas arriba del gen de la celobiohidrolasa 1 (cbhl, NCBI Número de acceso XP_003660789.1 ) de M. thermophila C1 . El vector de expresión pBASE5K4 contiene también la secuencia terminadora del gen de la cbhl de M. thermophila C1 (Tcbhl, que corresponde con una región de 1014 pb aguas abajo de cbhl) y el gen pyr4 como marcador de selección (NBCI Número de acceso XP_003666633.1 ) procedente de la misma cepa. El gen pyr4 codifica una orotidina-5-fosfato-descarboxilasa y su expresión permite la complementación de la auxotrofía de la uridina en la cepa hospedadora M. thermophila C1 auxotrófica correspondiente (pyr4-). En la Figura 4 se muestra el vector de expresión pBASE5K4. El vector y los insertos fueron ligados y los productos de la unión se transformaron en células electro-competentes de Escherichia coli XLI Blue MRF siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante (Stratagene). Los plásmidos recombinantes obtenidos se muestran en las Figuras 5 a 25.
Los plásmidos que contenían cada una de las secuencias codificantes para PMOs bajo el promotor Pcbhl y pyr4 como marcador de selección, se transformaron en M. thermophila C1 (Verdoes y col., 2007, Ind. Biotechnol. 3 (1 )), la cepa hospedadora utilizada anteriormente en otras selecciones de alto rendimiento en M. thermophila. El ADN se introdujo en la cepa hospedadora utilizando un procedimiento de transformación de protoplastos (US7399627B2). La cepa hospedadora es auxotrófica {pyr4) por lo que los transformantes se plaquearon en placas de agar sin suplemento de uridina. Después de 5 días de incubación a 35° C se analizaron los transformantes prototróficos resultantes (que expresan el gen pyr4). La cepa hospedadora utilizada como receptora produce un cóctel enzimático completo que contiene, entre otras, actividad celobiohidrolasa, endoglucanasa y beta-glucosidasa.
El objetivo de la selección era identificar las actividades PMO producidas dentro del cóctel enzimático completo generado por M. thermophila C1 que mejorasen el rendimiento de liberación de glucosa usando biomasa como sustrato. Por tanto, el ensayo de los transformantes se basó en la producción del cóctel de cada uno de los transformantes y su evaluación en términos de liberación de glucosa a partir de biomasa vegetal. Los transformantes obtenidos se inocularon en placas de microtitulación de 96 pocilios (MTP) para llevar a cabo su evaluación por fermentación y posterior hidrólisis de biomasa (US7794962B2). Para el ensayo de liberación de glucosa a partir de biomasa, ésta se procesó previamente como adaptación al ensayo en MTPs. La biomasa se suspendió a una concentración final de 100 g/l en tampón citrato sódico 0,1 M pH 5,0 con 0,052% de azida sódica. Tras la suspensión se mezcló en un agitador magnético durante 30 minutos, se ajustó el pH a 5,0 y se mantuvo en agitación otros 30 minutos adicionales. La agitación se mantuvo durante la dispensación de la suspensión de biomasa en las microplacas para el ensayo. Se evaluó la actividad PMO y mejora del rendimiento de sacarificación a partir de 25 μΙ de los sobrenadantes de cultivo de cada transformante con 75 μΙ de biomasa (preparada como se ha descrito previamente) durante 72h a 50°C y 850 rpm en un incubador orbital de 3mm de órbita de giro. Las placas se sellaron con láminas adhesivas de aluminio para evitar la evaporación. Transcurridas las 72h, la mezcla de sacarificación de las MTPs se transfirió a MTPs con filtro y se centrifugaron 1 min a 1800xg y 4°C. La cantidad de glucosa liberada se midió mediante ensayo GOPOD (K-Gluc, Megazyme) siguiendo las especificaciones del fabricante.
Ejemplo 4. Purificación de Monooxiqenasas de Polisacáridos (PMOs) y celulasas de M. thermophila.
La mezcla enzimática producida por M. thermophila fue obtenida de acuerdo al protocolo descrito por Verdoes et al., 2007, (Ind. Biotechnol. 3 (1 )) y Visser et al., 201 1 , Ind. Biotechnol., 7 (3), usando para ello la plataforma industrial de producción de enzimas basada en el organismo M. thermophila C1 . Esta mezcla enzimática fue la fuente de purificación de las celulasas principales, Celobiohidrolasas (Cbh), endoglunasa (Eg) y Beta-Glucosidasa (Bgl) y de todas las oxigenasas de polisacáridos (PMOs) que fueron evaluadas funcionalmente.
Las PMOs fueron purificadas utilizando un proceso cromatográfico secuencial. La muestra original (mezcla enzimática producida según la anterior descripción) se sometió a un proceso de pre-tratamiento, consistente en una centrifugación a 16000 rpm durante 40 min. a 5 °C. El pellet se desechó y el sobrenadante fue filtrado con filtros de nylon estériles de 0,45 μιη (VWR). La muestra resultante se desaló en fracciones de 15 mL, utilizando para ello una columna de desalting HiPrep Desalting Sephadex G-25 column (GE Helthcare), usando como tampón de equilibrado 100 mM Tris-HCI buffer, pH 7,0 y a una velocidad de flujo de 10 mL min"1. Con este proceso de desalado, además de reducir el contenido salino, se eliminaron en gran porcentaje los pigmentos de la muestra, pérdida que facilita el posterior proceso de purificación de las diferentes enzimas. Con esta muestra desalada se inició el proceso de purificación de las diferentes PMOs. En primer lugar se realizó una cromatografía de intercambio iónico utilizando para ello la columna HiLoad 26/10 Q-Sepharose HP column (GE Helthcare), usando como tampón de equilibrado 100 mM Tris-HCI buffer, pH 7,0, como tampón de elución 100 mM Tris-HCI buffer, pH 7,0, 1 M NaCI y una velocidad de flujo de 4 mL min"1. La elución de la muestra se realizó mediante la aplicación de un gradiente salino 0-30% NaCI. Las fracciones para la purificación de las diferentes PMOs se seleccionaron por su tamaño, buscando proteínas con una masa molecular inferior a 50 kDa (Tabla 2). Las fracciones seleccionadas del primer paso cromatográfico se sometieron a un segundo paso utilizando para ello una cromatografía hidrofóbica. Las muestras fueron acondicionadas con (NH4)2S04 1 M, filtradas utilizando filtros estériles de 0,45 μιη (VWR) y aplicadas sobre una columna HiLoad 26/10 Phenyl-Sepharose High Performance equilibrada con tampón 100 mM Fosfato-sódico, pH 7,0, 1 M (NH4)2S0 . Tras la aplicación de la muestra la columna fue lavada con el tampón de equilibrado y las diferentes proteínas retenidas eluidas aplicando un gradiente salino 100-0% (NH4)2S0 . La cromatografía se siguió en todo momento mediante la realización de geles de poliacrilamida (12%). Las fracciones que contenían muestras con proteínas de tamaños comprendidos entre 20-45 kDa se ensayaron con los métodos enzimáticos descritos más adelante para medir actividad endoglucanasa, celobiohidrolasa o Beta-Glucosidasa para excluir las fracciones que contuvieran estas enzimas. Posteriormente, las fracciones se concentraron utilizando columnas de ultracentrifugación y concentración vivaspin de 10 kDa (Amicon) y se aplicaron en una o varias rondas a través de la columna de exclusión molecular HiLoad 26/600 Superdex 75 pg, utilizando como tampón de equilibrado 100 mM fosfato sódico, pH 7,0. Este procedimiento de purificación permitió aislar con un grado de pureza superior al 90% las diferentes PMOs. Para la purificación de la PMO-04750 tras el paso por la columna hidrofóbica, un grupo de fracciones fue seleccionado, desalado utilizando para ello la columna de desalting HiPrep Desalting Sephadex G-25 column (GE Helthcare), como tampón de equilibrado 100 mM Tris-HCI buffer, pH 7,0 y una velocidad de flujo de 10 ml_ min"1. Esta nueva muestra se pasó por la columna de intercambio iónico HiLoad 26/10 Q- Sepharose HP column (GE Helthcare), utilizando como tampón de equilibrado 100 mM Tris-HCI, pH 7,0, como tampón de elución 100 mM Tris-HCI buffer, pH 7,0, 1 M NaCI y una velocidad de flujo de 4 ml_ min"1. Un conjunto de fracciones no retenidas en columna se concentraron y aplicaron a una columna de exclusión molecular HiLoad 26/600 Superdex 75 pg utilizando como tampón de equilibrado 100 mM Fosfato- sódico, pH 7,0.
Un procedimiento de purificación análogo al anterior fue aplicado para la purificación de las principales celulasas de M. thermophila posteriormente utilizadas para la formulación del cóctel mínimo, mezcla enzimática sobre la que se llevó a cabo la caracterización funcional de las diferentes PMOs mediante un proceso de hidrólisis enzimática sobre biomasa molida. Para la purificación de las principales enzimas celulolíticas, esto es, Celobiohidrolasas (Cbh), Endo-Glucanasa (Eg) y Beta- Glucosidasa (Bgl), se siguió la actividad enzimática de cada una de ellas en las distintas fracciones obtenidas. Adicionalmente todas fueron identificadas por espectrometría de masas. Todas las actividades fueron determinadas en las condiciones de proceso de hidrólisis enzimática (pH 5,5 y 50 °C). La actividad Bgl fue determinada utilizando como sustrato p-Nitrofenyl-Beta-D-Glucopiranósido (pNGP, Sigma), siguiendo la aparición del producto p-nitrofenol a 410 nm. La mezcla de reacción (1 mL de volumen final) contenía 100 μιηοΙ de tampón acetato sódico (pH 5.0), 100 μg pNGP (0,33 μιηοΙ) y una cantidad apropiada de enzima purificada. Esta mezcla se incubó a 50 °C durante 10 min. La cantidad de p-nitrofenol liberado fue medido a A410 (e 410= 15,2 mM"1 cm"1) después de parar la reacción con 100 μg de carbonato sódico. Se define una unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que es capaz de hidrolizar 1 μιηοΙ p-nitrofenol por minuto. La actividad Cbh de las diferentes celobiohidrolasas, Cbhl y Cbhll (ambas contienen dominios de unión a celulosa) fue medida como la capacidad de producción de celobiosa utilizando como sustrato celulosa cristalina (Avicel). La mezcla de reacción (1 mL de volumen final) contenía 100 μιηοΙ de tampón acetato sódico (pH 5,0), 10 mg Avicel y la cantidad adecuada de enzima purificada, y fue incubada a 50 °C durante 120 min. La cantidad de celobiosa producida durante esta reacción se determinó mediante HPLC (Agilent Technologies, 1200 Series) utilizando un detector de índice de refracción (RID) y una columna Aminex HPX-87 H. Una unidad de actividad enzimática fue definida como la cantidad de enzima que es capaz de producir 1 μιηοΙ de celobiosa por minuto. La actividad endoglucanasa fue determinada utilizando azo-carboximetil-celulosa (Azo- CMC, S-ACMC, Megazyme). El método enzimático utilizado fue una adaptación del procedimiento descrito por el proveedor del sustrato, en el cual se ajustaron las condiciones del ensayo a las de hidrólisis enzimática (pH 5,5 y 50 °C). La actividad endoxilanasa fue determinada utilizando arabinoxilano de trigo, "azo-wheat arabionoxylan" (Azo-WAX Megazyme). De nuevo, el método enzimático utilizado fue una adaptación del procedimiento descrito por el proveedor del sustrato, en el cual se ajustaron las condiciones del ensayo a las de hidrólisis enzimática (pH 5,5 y 50 °C).
El contenido de proteína total de las muestras con enzimas purificadas se determinó mediante el método BCA (The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit). Todas las enzimas purificadas fueron identificadas mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF) y secuenciación.
Las principales enzimas purificadas de M. thermophila (Bgl, Cbhl, Cbhll y Eg) fueron mezcladas en las proporciones en las que se encuentran en el cóctel completo para el denominado cóctel mínimo. Una comparación entre los cócteles completo y mínimo se muestra en la Figura 26 A, donde se aprecia que ambas muestras contienen la misma cantidad de proteína total (20 μg) y son aplicadas sobre un gel de poliacrilamida del 7.5% (SDS-PAGE). Las diferentes PMOs purificadas (8-10 μg) fueron aplicadas en el mismo tipo de geles (Figura 26 B). Las diferencias de movilidad electroforética con la masa molecular predicha (Tabla 2) se deben a que las enzimas extracelulares fúngicas son objeto de glicosilación (adición post-traduccional de N-glicanos y O- glicanos), siendo ésta la modificación post-traduccional más frecuente en este tipo de proteínas (Deshpande et al., 2008, Glycobiology 18 (8)), lo cual altera significativamente su masa molecular. Estos análisis indicaron que la pureza electroforética de las muestras era adecuada para los estudios en los que fueron utilizadas.
Ejemplo 5. Determinación de actividad oxiqenasa para la detección de PMOs. Para la detección y carecterización de las enzimas oxigenasas de polisacáridos purificadas se procedió a la puesta a punto de un método de determinación de actividad oxigenasa. Dicho método estuvo basado en la capacidad de reducción de las oxigenasas de aceptores de electrones externos artificiales como el citocromo C. El citocromo C oxidado y reducido tienen distintos coeficientes de absorción a 550 nm, por lo que su reducción puede ser medida a lo largo del tiempo como un incremento de la señal a esta longitud de onda.
Para el ensayo citocromo C reductasa se realizó una mezcla de reacción (0,5 ml_ de volumen final) que contenía 50 μιηοΙ de citocromo C, 100 μιηοΙ de celobiosa, 0,6 nmol de celobiosa deshidrogenasa CDH1 de Myceliophthora thermophila, y una cantidad apropiada de enzima purificada; todo fue preparado en tampón fosfato sódico 100 mM pH 7,0. La reacción se siguió espectrofotométricamente a 550 nm a temperatura ambiente durante 1 min. Como coeficiente de extinción para calcular las unidades de actividad citocromo C reductasa se empleó 21000 mM"1 cm"1. En la Tabla 4 se muestran los valores de actividad oxigenasa determinados mediante este método para algunas de las PMOs purificadas.
Tabla 4. Actividad citocromo C reductasa específica de distintas PMO purificadas.
Enzima (PMO) Actividad (U/g)
PMO-04725 12,8
PMO-06230 10,0
PMO-01470 13,7
PMO-09768 14,4
Ejemplo 6. Caracterización funcional de las diferentes PMOs en el proceso de hidrólisis enzimática. Como sustrato para la hidrólisis enzimática se empleó biomasa pretratada de bagazo de maíz ("pretreated corn stover", o PCS). El pretratamiento se realizó mediante un sistema de explosión de vapor descrito por Nguyen et al., 1998, Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72, y su análisis composicional se efectuó de acuerdo los procedimientos descritos por NREL en "Standard Biomass Analytical Procedures" (http://www.nrel.gov/biomass/analytical_procedures.htmL). En este análisis se obtuvo como resultado que la representación del xilano y la xilosa en la biomasa era del 4,06% y 1 1 ,1 1 % (p/p de peso seco) respectivamente, y la de glucano y glucosa el 12,24% y el 3,61 % (p/p de peso seco) respectivamente. Con objeto de su uso en la hidrólisis y la ayuda de la homogeneización de la mezcla, la biomasa fue previamente neutralizada ajustándose a un pH de 5,5, liofilizada, molida y tamizada con malla de 200 μιη.
Para el proceso de hidrólisis enzimática se usaron tubos de 10 mi con 3 g de la mezcla de reacción compuesta por: 631 ,6 μg de biomasa molida al 95% (p/p en peso seco), 8,64 mg proteína por g de glucano del cóctel mínimo purificado según lo descrito anteriormente, 2 mg proteína/g glucano de la PMO purificada correspondiente y el volumen de agua necesario para ajustar la reacción a una proporción del 20% (p/p) de sólidos totales. Los tubos con la mezcla se incubaron en posición horizontal durante 72 h a 50 °C con una agitación de 150 rpm en un incubador orbital de 25 mm de diámetro (Infors HT). Una vez realizado el proceso, el contenido de glucosa en las muestras resultantes del hidrolizado (slurry) se analizó con el método GOPOD (K- GLUC Kit, Megazyme).
El efecto de las PMOs purificadas en el rendimiento de la hidrólisis enzimática se estudió, por tanto, añadiéndolas a la mezcla de 4 enzimas purificadas (Bgl, Cbhl, Cbhll y Eg), o cóctel mínimo (CM), o al cóctel enzimático producido por M. thermophila o cóctel completo (CC). Los resultados obtenidos con una serie de enzimas PMOs seleccionadas se muestran en la Figura 27, donde se puede apreciar que la adición al cóctel mínimo o al cóctel completo de todas las PMOs analizadas supuso un incremento en la capacidad de sacarificación con respecto al control, esto es, a la producción de glucosa por la mezcla de las celulasas o cóctel mínimo y por el cóctel completo. Los resultados con la PMO-01470, PMO-06230 y PMO-09768 fueron especialmente significativos, siendo responsables de un incremento de un -50% en la liberación de glucosa de biomasa molida con respecto al valor control del cóctel mínimo y cóctel completo.

Claims

REIVINDICACIONES
Construcción génica que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 43, y otro polinucleótido que codifica el polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 44.
Construcción génica según la reivindicación 1 , donde dicha construcción génica es un vector de expresión.
Célula hospedadora que comprende la construcción génica según cualquiera las reivindicaciones 1 ó 2.
Célula hospedadora según la reivindicación 3, donde la célula hospedadora es Myceliophthora thermophila C1.
Composición enzimática que comprende un polipéptido que consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 43 y otro polipéptido que consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 44 y, preferiblemente, otra enzima celulolítica seleccionada de la lista que consiste en: endoglucanasa, beta-glucosidasa, celobiohidrolasa, beta-xilosidasa, endoxilanasa, endoxiloglucanasa, polisacárido monooxigenasa o cualquier combinación de las mismas.
6. Composición enzimática según la reivindicación 5, donde dicha composición es una mezcla enzimática expresada por la célula según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4.
7. Uso de la célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, para la degradación de biomasa celulósica.
8. Uso según la reivindicación 7, donde la degradación de biomasa celulósica tiene lugar en un proceso de producción de un bioproducto.
9. Uso según la reivindicación 8, donde el bioproducto es un biocombustible. 10. Uso según la reivindicación 9, donde el biocombustible es bioetanol.
1 1. Procedimiento para producir azúcares fermentables que comprende los siguientes pasos:
a) incubar biomasa celulósica con la composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, y
b) recuperar los azúcares fermentables obtenidos después de la incubación del paso (a).
12. Procedimiento para producir un bioproducto a partir de biomasa celulósica que comprende los siguientes pasos:
a) incubar biomasa celulósica con la composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6,
b) fermentar los azúcares fermentables obtenidos después de la incubación del paso (a) con al menos un microorganismo fermentador, y
c) recuperar el bioproducto obtenido después de la fermentación del paso (b).
13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, donde el bioproducto es un biocombustible.
14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, donde el biocombustible es bioetanol.
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