ES2545161B1 - Polipéptidos con actividad celulasa - Google Patents

Abstract

Polipéptidos con actividad celulasa.#La presente invención se refiere principalmente a un polipéptido con actividad celulasa para su uso en procesos de degradación de biomasa. La invención también se refiere a fragmentos funcionales del polipéptido, así como a los polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos y/o fragmentos.

Description

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DESCRIPCION

Polipeptidos con actividad celulasa CAMPO DE LA INVENCION

La presente invention pertenece al campo de las enzimas con actividad celulasa para la degradation de biomasa, mas concretamente, se refiere a polipeptidos con actividad celulolrtica o a fragmentos funcionales o variantes de los mismos, as^ como a los polinucleotidos que codifican dichos polipeptidos o fragmentos. La presente invencion tambien se relaciona con una construction genica, un vector de expresion y una celula huesped que comprenden dichos polinucleotidos, asi como con un metodo para producir los polipeptidos, variantes o fragmentos de la invencion. Por ultimo, la invencion se relaciona con el uso de los polipeptidos de la invencion, fragmentos funcionales o variantes de los mismos para la degradacion de biomasa, tanto para su aplicacion en procedimientos para la production de azucares fermentables como para la production de bioproductos por transformation quimica de estos azucares, preferiblemente por fermentation microbiana de los mismos. La presente invencion tambien incluye una composition con capacidad de degradar la biomasa que comprende al menos un polipeptido, al menos un fragmento funcional del mismo o al menos una variante del mismo de acuerdo con la presente invencion y al menos algun elemento adicional que favorezca la degradacion de biomasa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Las fracciones fermentables de la biomasa incluyen la celulosa y hemicelulosa. La celulosa consiste en largas cadenas insolubles de glucosa unidas covalentemente mediante enlaces beta-1,4. La hemicelulosa es una fraction heterogenea de biomasa compuesta de xilosa y azucares menores de 5 y 6 carbonos. Aunque es un biopolimero abundante, la celulosa es altamente cristalina, insoluble en agua y muy resistente a la despolimerizacion. La degradacion enzimatica completa de celulosa a glucosa, probablemente la materia prima mas deseable para procesos de fermentacion, se puede conseguir mediante la accion sinergica de 3 clases distintas de enzimas: endoglucanasas que catalizan la endohidrolisis de los enlaces (1,4)-b-D-glicosidicos de la celulosa; las exoglucanasas que llevan a cabo la hidrolisis de enlaces (1,4) en (1,4)-b-D glicanos para liberar celobiosa de los terminos no reductores; y b-glucosidasas que liberan b-D-glucosa de la celobiosa (ver figura 1).

El desarrollo de un proceso economico de conversion de un producto de poco valor como la biomasa a bioetanol u otro tipo de bioproductos via transformacion quimica o fermentacion,

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requiere la optimization de varias etapas clave. En especial, una de gran importancia es la de la production de celulasas. La utilization practica de celulosa mediante hidrolisis con celulasas para producir glucosa requiere grandes cantidades de celulasas para despolimerizar por completo la celulosa. Ademas, la produccion de celulasas y la hidrolisis enzimatica son en proporcion las etapas mas costosas en este proceso.

Todas estas dificultades tecnicas evidencian la necesidad de desarrollar nuevas enzimas que optimicen las tecnologias existentes para la produccion de biofuel y otros bioproductos hacia sistemas mas competitivos, economicos y que produzcan un menor impacto medioambiental al minimizar las emisiones de dioxido de carbono.

El habitat del suelo es un ambiente enormemente diverso. Un gramo de suelo puede contener varios millones de bacterias pertenecientes a mas de 4000 a 7000 especies diferentes. Sin embargo, solo 1% de la flora bacteriana del suelo se puede cultivar bajo condiciones estandar de laboratorio.

La metagenomica que consiste en la extraction, clonado y analisis de la totalidad del material genetico de un habitat determinado, ha emergido para explorar el potencial de la information genetica de microorganismos no cultivables. Las librerias metagenomicas son una herramienta poderosa para el descubrimiento de nuevas actividades biologicas y ya han sido utilizadas con exito para aislar nuevas enzimas hidrolrticas como amilasas, celulasas y xilanasas. Por ejemplo, Ilmberger N. ("Metagenomic cellullases highly tolerant towards the presence of ionic liquids-linking thermostability and halotolerance” Appl. Microbiol. Biotechnol. (2012)95: 135-146) describe la identification y el aislamiento de enzimas con actividad celulasa a partir de librerias metagenomicas construidas a partir de diferentes ambientes en los que la actividad celulasa esta muy presente como, por ejemplo, extractos del gusano Teredo navalis, muestras provenientes de una planta de biogas o heces de elefante.

El rastreo de librerias metagenomicas, que es un paso critico en el aislamiento exitoso de actividades biologicas nuevas y mejoradas, se puede llevar a cabo mediante ensayos de actividad. Las librerias metagenomicas se construyen en vectores de expresion para permitir el aislamiento de actividades biologicas de secuencias genicas enteramente nuevas cuando estas se expresan con exito en un determinado hospedador. Los ensayos cromogenicos de actividad son usados comunmente para la detection de hidrolasas a partir de librerias metagenomicas. La figura 2 representa esquematicamente el proceso de identificacion y

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caracterizacion de actividades enzimaticas mediante la generation de librerias metagenomicas.

Los autores de la presente invention han identificado y aislado a partir de una libreria metagenomica de microorganismos del suelo, un polipeptido que muestra una alta actividad celulasa, especialmente endoglucanasa, y que posee unas caracteristicas funcionales que la hacen muy apropiada para su uso en procesos industriales de degradation de biomasa y production de bioetanol y otros bioproductos de alto valor anadido.

OBJETO DE LA INVENCION

El objeto principal de la invencion es un polipeptido aislado con actividad celulolrtica (en adelante el polipeptido de la invencion) que comprende la secuencia SEQ ID NO1 o que posee un grado de homologia o de identidad de al menos un 80% con la SEQ ID NO1 o que esta codificado por un polinucleotido que hibrida bajo condiciones de baja, media, medio- alta, alta o muy alta astringencia con la secuencia SEQ ID NO 6 que codifica el polipeptido maduro.

Son asimismo un objeto de la invencion, los fragmentos funcionales o las variantes del polipeptido de la invencion.

Otro objeto de la invencion son las secuencias polinucleotidicas que codifican el polipeptido de la invencion o los fragmentos funcionales o las variantes del mismo (en adelante polinucleotido de la invencion).

Otro objeto de la invencion viene representado por una construction genica que comprende la secuencia polinucleotidica antes mencionada operativamente unida a una o mas secuencias de control que dirigen la expresion de polipeptidos en sistemas de expresion.

Logicamente, tambien es objeto de la invencion un vector de expresion que comprende el polinucleotido de la invencion o dicha construccion genica y una celula huesped que comprende dicho vector de expresion y que es capaz de producir el polipeptido de la invencion o los fragmentos funcionales o las variantes de este.

Un objeto adicional de la invencion es un metodo para producir el polipeptido de la invencion que comprende:

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a) Cultivar la celula huesped antes mencionada en las condiciones necesarias para la produccion del polipeptido,

b) Recuperar el polipeptido producido.

Tambien es objeto de la presente invencion una composicion celulolrtica que comprende al menos un polipeptido de acuerdo con la invencion o al menos un fragmento funcional o una variante del mismo y, opcionalmente, al menos un elemento que favorezca o facilite la degradation de biomasa (en adelante composicion de la invencion).

Otro objeto fundamental de la invencion es el uso del polipeptido de la invencion, de los fragmentos funcionales o las variantes del mismo o de la composicion de la invencion para la degradacion de biomasa.

De este objeto general se derivan los siguientes mas particulares.

El primero es un procedimiento para producir azucares fermentables que comprende incubar biomasa con el polipeptido de la invencion, con fragmentos funcionales o variantes del mismo o con la composicion de la invencion.

El segundo objeto que se deriva del uso antes mencionado es un procedimiento para producir un bioproducto a partir de biomasa que comprende:

a) producir azucares fermentables incubando biomasa con el polipeptido de la invencion, con fragmentos funcionales del mismo o con la composicion de la invencion

b) llevar a cabo una transformation quimica de los azucares obtenidos en la etapa a) para obtener al menos un bioproducto,

c) Recuperar el al menos un bioproducto obtenido en la etapa b)

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1: representa la hidrolisis de la celulosa por los tres tipos de celulasas: la endoglucanasa rompe los enlaces no covalentes en la estructura amorfa de la celulosa, la celobiohidrolasa libera celobiosa del final de la cadena y finalmente la celobiosa es hidrolizada por la beta-glucosidasa.

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Figura 2: representa las etapas esenciales de la construction y explotacion de una libreria metagenomica.

Figura 3: representation del clon 98 que contienen el gen celulasa cel98. La figura muestra los diferentes dominios del polipeptido de la invention codificado por cel98. En el extremo N- terminal en la position 1-32 se encuentra la senal de translocation Twin-arginina (Tat). Tambien se representa el dominio celulasa perteneciente a la familia 5 en la posicion 41378. Dentro del dominio celulasa hay un dominio de tipo fibronectina III. Asimismo se encuentran dos dominios de union a carbohidratos de tipo 2 (CBM2) en las posiciones 443570 y 664-780 y un dominio de union a carbohidratos de tipo 6 (CBM6) en la posicion 474630.

Figura 4: representacion de la actividad del polipeptido SEQ ID NO 1 a diferentes temperaturas ensayadas (30°C, 37°C, 45°C, 50°C y 56°C).

Figura 5: representacion de la disminucion de la densidad optica a diferentes temperaturas ensayadas: (A) 30°C, (B) 37°C, (C) 45°C y (D) 50°C. La disminucion de la densidad optica se asocia a la degradation de la carboximetilcelulosa (CMC).

Figura 6: representacion de la disminucion de la densidad optica despues de la incubation de la enzima a: (A) 30°C, (B) 37°C, (C) 40°C y (D) 42°C durante diferentes periodos de tiempo. La disminucion de la densidad optica se asocia a la degradacion de la CMC.

Figura 7: representacion de la actividad del polipeptido SEQ ID NO 1 a diferentes pH ensayados (5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 y 8).

Figura 8: representacion de la disminucion de la densidad optica a diferentes pH ensayados (5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 y 8). La disminucion de la densidad optica se asocia a la degradacion de la CMC.

Figura 9: Visualization de un clon positivo para actividad celulasa despues del rastreo de la libreria metagenomica de bacterias del suelo usando CMC como sustrato y el metodo rojo congo.

Figura 10: En la imagen de la izquierda se observa resaltada la banda correspondiente al vector linearizado empleado en la donation. En la imagen del centro se observan los dos

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pocillos del gel donde se cargo el producto de PCR para obtener el inserto de interes y finalmente en la imagen de la derecha se observan tanto el vector como el inserto antes justo del paso de la ligacion, a fin de poder ver la cantidad de que se dispoma cada uno y poder ajustar asi las proporciones de vector/inserto para la ligacion.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Con el fin de facilitar la comprension y de aclarar el significado de determinados terminos en el contexto de la presente invention se aportan las siguientes definiciones:

“Polipeptido”: es una secuencia de aminoacidos de una longitud de entre aproximadamente 100 y 1000 aminoacidos, preferiblemente entre aproximadamente 200 y 950 y mas preferiblemente entre aproximadamente 340 y 930 aminoacidos, que puede ser producido en un sistema de expresion heterologo o producido sinteticamente. Los aminoacidos que forman el polipeptido pueden estar modificados o no modificados y aunque los aminoacidos que forman el polipeptido son eminentemente aminoacidos proteicos (alanina, arginina, asparagina, aspartato, cistema, fenilalanina, glicina, glutamato, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, serina, tirosina, treonina, triptofano y valina), el polipeptido puede tener algun aminoacido proteico sustituido por alguno no proteico o sintetico.

“Polipetido de la invencion”: es un polipeptido aislado con actividad celulolrtica que comprende la secuencia SEQ ID NO1 o que posee un grado de homologia o de identidad de al menos un 80% con la SEQ ID NO1 o que esta codificado por un polinucleotido que hibrida bajo condiciones de baja, media, medio-alta, alta o muy alta astringencia con la secuencia SEQ ID NO 6 que codifica el polipeptido maduro.

“Actividad celulolitica o celulasa”: hace referencia a la capacidad que tiene el polipetido de la invencion, asi como los fragmentos funcionales o las variantes del mismo de degradar por hidrolisis los enlaces (1,4)-b-D-glicosidicos de la celulosa. La actividad celulolitica o celulasa puede ser endoglucanasa, exoglucanasa, celobiohidrolasa o beta-glucosidasa dependiendo del tipo de sustrato celulosico sobre el que actue el polipeptido. Aunque el polipeptido de la invencion puede mostrar una actividad celulolitica o celulasa variada, su actividad es preferentemente endoglucanasa.

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“Grado de homolog^a”: se refiere a la correspondencia de secuencia que se da entre una determinada cadena polipeptidica con otra. El termino grado de homo^a implica que la longitud del polipeptido frente al de referencia puede ser mayor, menor o igual. Cuando en el contexto de la invencion se menciona, por ejemplo, que un polipeptido tiene un grado de homologia de al menos un 80% con una secuencia determinada significa que este polipeptido puede tener una correspondencia de entre un 100% hasta un 80% con dicha secuencia y que su longitud puede ser mayor, menor o igual al de dicha secuencia.

“Grado de identidad”: se refiere a la correspondencia de secuencia que se da entre una determinada cadena polipeptidica con otra. El termino grado de identidad implica que la longitud del polipeptido siempre es igual frente al de referencia. Cuando en el contexto de la invencion se menciona por ejemplo, que un polipeptido tiene un grado de identidad de al menos un 80% con una secuencia determinada significa que este polipeptido puede tener una correspondencia de secuencia de entre un 100% hasta un 80% con dicha secuencia y la longitud del polipeptido de referencia.

“Fragmento funcional”: se refiere a aquellos fragmentos que se derivan del polipeptido de la invencion y que conservan en mayor o menor medida la actividad celulasa del polipeptido original. El fragmento funcional puede conservar entre el 50% y el 100% de la actividad del polipeptido de la invencion. Tambien se refiere a aquellos fragmentos que conservando la actividad celulasa puedan presentar un perfil de actividad celulasa diferente al del polipeptido original.

“Variante del polipeptido de la invencion”: se refiere a aquellas modificaciones del polipeptido de SEQ ID NO 1 que impliquen sustituciones, deleciones y/o inserciones en una o mas posiciones sin afectar sustancialmente a la actividad del polipeptido. Los cambios de aminoacidos pueden ser de naturaleza menor, esto es sustituciones o inserciones conservativas que no afecten significativamente el plegado y o actividad del polipetido; pequenas deleciones normalmente de 1 a 30 aminoacidos; pequenas extensiones de los extremos amino y carboxiterminal como pequenos peptidos de union de 20-25 residuos o pequenas extensiones que faciliten la purification mediante el cambio de la carga neta u otra funcion, colas de polihistidinas, eprtopos antigenicos o dominios de union. Tambien se contemplan variantes que puedan alterar de manera controlada y dirigida propiedades fisico quimicas del polipeptido. Por ejemplo, estas variantes incluyen cambios de aminoacidos que puedan mejorar la estabilidad termica del polipeptido de la invencion, cambiar su especificidad por el sustrato, su temperatura optima o el pH optimo.

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“Condiciones de muy baja astringencia”: para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud implica prehibridacion e hibridacion a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0.3%, 200 ^g/ml de DNA fragmentado y desnaturalizado de esperma de salmon y 25% de formamida, siguiendo procedimientos estandar de Southern Blot de 12 a 24 horas. El material soporte se limpia finalmente 3 veces cada una 15 minutos usando SSC 2X y SDS al 0.2% a 45° C.

“Condiciones de baja astringencia”: para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud implica prehibridacion e hibridacion a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0.3%, 200 ^g/ml de DNA fragmentado y desnaturalizado de esperma de salmon y 25% de formamida, siguiendo procedimientos estandar de Southern Blot de 12 a 24 horas. El material soporte se limpia finalmente 3 veces cada una 15 minutos usando SSC 2X y SDS al 0.2% a 50° C.

“Condiciones de media astringencia”: para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud implica prehibridacion e hibridacion a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0.3%, 200 ^g/ml de DNA fragmentado y desnaturalizado de esperma de salmon y 35% de formamida, siguiendo procedimientos estandar de Southern Blot de 12 a 24 horas. El material soporte se limpia finalmente 3 veces cada una 15 minutos usando SSC 2X y SDS al 0.2% a 55° C.

“Condiciones de media-alta astringencia”: para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud implica prehibridacion e hibridacion a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0.3%, 200 ^g/ml de DNA fragmentado y desnaturalizado de esperma de salmon y 35% de formamida, siguiendo procedimientos estandar de Southern Blot de 12 a 24 horas. El material soporte se limpia finalmente 3 veces cada una 15 minutos usando SSC 2X y SDS al 0.2% a 60° C.

“Condiciones de alta astringencia”: para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud implica prehibridacion e hibridacion a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0.3%, 200 ^g/ml de DNA fragmentado y desnaturalizado de esperma de salmon y 50% de formamida, siguiendo procedimientos estandar de Southern Blot de 12 a 24 horas. El material soporte se limpia finalmente 3 veces cada una 15 minutos usando SSC 2X y SDS al 0.2% a 65° C.

“Condiciones de muy alta astringencia”: para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud significa prehibridacion e hibridacion a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0.3%, 200 ^g/ml de DNA fragmentado y desnaturalizado de esperma de salmon y 50% de formamida, siguiendo procedimientos estandar de Southern Blot de 12 a 24 horas. El material soporte se limpia finalmente 3 veces cada una 15 minutos usando SSC 2X y SDS al 0.2% a 70° C.

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“Construccion genica”: es una sucesion de information genetica codificada en una secuencia polinucleotidica generalmente de ADN de cadena simple o doble cadena, dispuesta de tal forma que potencialmente permite ejecutar el programa genetico para el cual fue disenada. La construccion genica comprende tanto elementos codificantes como no codificantes como por ejemplo secuencias de control. Normalmente, la construccion genica comprende al menos la secuencia que codifica la protema o polipeptido de interes, asi como una o mas secuencias promotoras de la expresion y al menos una secuencia de terminacion.

“Operativamente unida”: implica que los diferentes elementos de la construccion genica estan dispuestos de tal forma que actuan de manera operativa para ejecutar correctamente el programa genetico para la cual fue disenada dicha construccion genica.

“Sistemas de expresion”: son sistemas uni o pluricelulares que permiten producir protemas recombinantes cuando son transfectados o transformados con vectores apropiados que comprenden el gen recombinante deseado o manipulados geneticamente para incorporar dicho gen en su propio genoma. Los sistemas unicelulares de expresion pueden ser procariotas como por ejemplo bacterias o eucariotas como levaduras, celulas de insecto o incluso cultivos de celulas de mamiferos. Ejemplos de sistemas de expresion pluricelulares son larvas de insectos o plantas modificadas geneticamente. En el contexto de la invention son preferidos los sistemas de expresion unicelulares y mas particularmente bacterias del genero Bacillus, Clostridium, Esherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Streptomyces, Thermoanaerobacterium o Zymomonas o hongos de las especies

Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis sufrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cereales, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Saccharomyces calsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norvensis, Saccharomyces oviformis, Thielavia terrestres, Trametes villosa, Trametes versicolor,

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Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reseii, Trichoderma viride o Yarrowia lipolytica.

“Vector de expresion”: es un sistema de transfeccion o transformation de celulas que permite incorporar una construction genica en una celula y cuya finalidad es la expresion por parte de dicha celula de una protema recombinante. Los tipos de vectores de expresion mas habituales son plasmidos y vectores virales aunque en el contexto de la invention incluye cualquier otro tipo de vectores comunmente usados.

“Celula huesped”: es la celula capaz recibir por transfeccion o transformacion material genetico externo que es capaz de expresar de forma transitoria o estable. El termino celula huesped tambien se refiere no solo a la celula directamente transfectada o transformada sino tambien a toda su progenie.

“Biomasa”: en el contexto de la presente invencion se asimila “biomasa” con “biomasa celulosica” esto es toda materia organica que comprenda material lignocelulosico y que sea susceptible de ser transformada a sus componentes mas elementales (azucares fermentables) mediante un proceso industrial de degradacion con enzimas celulasas. La biomasa puede ser, por ejemplo, la fraction biodegradable de los productos, residuos y restos de origen biologico procedentes de la agricultura (incluyendo sustancias vegetales, tales como residuos de cultivos, y sustancias animales) industrias forestales (tales como recursos madereros) e industrias relacionadas que incluyen pesquerias y acuicultura, asi como la fraccion celulosica biodegradable de los residuos industriales y urbanos, tales como residuos solidos urbanos o residuos de papel. En el contexto de la invencion de manera preferente la biomasa es paja o la fraccion organica de residuos solidos urbanos y de manera aun mas preferente, la biomasa es biomasa vegetal seleccionada a partir de la lista que consiste en: biomasa rica en azucares fermentables, tales como cana de azucar; biomasa de almidon, por ejemplo, granos o paja de trigo; o maiz o paja de maiz o grano de maiz o fibra de maiz; o granos o paja de cebada; o granos o paja de sorgo. La biomasa tambien puede ser, arroz, hierba, ramas, etc.

“Degradation de biomasa”: Es el proceso de transformacion de la biomasa celulosica en sus componentes elementales (azucares fermentables), principalmente glucosa, mediante la accion de celulasas.

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“Azucares o azucares fermentables”: es el producto resultante del proceso de degradation de biomasa y comprende todos aquellos azucares que son susceptibles de ser transformados qtimicamente o fermentados para dar lugar a bioproductos de alto valor anadido. Aunque no es el unico, el principal azucar fermentable es la glucosa.

“Bioproductos”: son los productos de alto valor anadido que pueden obtenerse por transformation qtimica de los azucares o por fermentation de dichos azucares con diferentes microorganismos. Sin pretender ser limitativa, una lista de posibles microorganismos fermentantes es la siguiente: Bacillus thermoglucosidaisus, Clostridium butyricum, Corynebacterium glutamicum, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Geobacillus themoglucosidasius, Klebsiella oxytoca, Lactobacillus sp. Leunoscoc mesenteroides, Thermoanaerobacter BG1L1, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoanaerobacter mathranii, Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum, Zymobacter palmae, Zymomonas mobilis Candida arabinofermentans, Candida boidinii, Candida diddensis, Candida fermentans, Chrysosporium lucknowense, Candida pastoris, Candida shehatae, Candida sonorensis, Candida tropicalis, Hansenula anomala, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bulderi, Saccharomyces barnetti, Saccharomyces exiguus, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces uvarum o Schizosaccharomyces pombe o mezclas de estos. Estos y otros microorganismos pueden proporcionar por fermentacion de diferentes azucares, bioproductos entre los cuales se pueden citar de manera no limitativa los siguientes: alcoholes como etanol, metanol, butanol, hexanol, octanol, decanol, dodecanol, 1,3-butanediol(1,3-diol), 1-alcohol; acidos organicos como acido dtrico, acido acetico, acido itaconico, acido lactico, acido glutamico, acido suctinico, beta-cetoacido, beta-cetoalcohol, beta-hidroxiacido; cetonas como la acetona; gases como hidrogeno o dioxido de carbono; hidrocarburos como alcanos alquenos o alquinos; sustancias nitrogenadas como aminas, amida, nitrocompuestos o nitrilos; haluros; aminoacidos como acido glutamico; antiobioticos como penicilina o tetraciclinas; vitamina como riboflavina, vitamina B12 o betacaroteno; acidos grasos como acido dodecanoico, acidos grasos trans-A2 o acido palmrtico; y otros productos como etileno, glicerol, 1,3- propano-diol, betalactano, cefalosporinas, acidos grasos trans o furano.

Polipeptidos con actividad celulasa y fragmentos funcionales de los mismos El aspecto principal de la presente invention se refiere a un polipeptido aislado con actividad celulasa que comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO1 o que posee un grado de homologia o de identidad de al menos un 80% con la SEQ ID NO1 o que esta codificado por

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un polinucleotido que hibrida bajo condiciones de baja, media, media-alta, alta o muy alta astringencia con la secuencia SEQ ID NO 6 que codifica el polipeptido maduro.

En una realization particular de la invention el polipeptido posee un grado de homologia o de identidad de al menos un 85%, preferiblemente de al menos un 90%, mas preferiblemente de al menos un 95% y aun mas preferiblemente de al menos un 99% con la SEQ ID NO 1.

Por ejemplo, un polipeptido que posee un alto grado de homologia (de entorno al 92%) con el polipeptido de SEQ ID NO 1 y representa una realizacion particular de la invencion es el polipeptido con la secuencia SEQ ID NO 2. Esta secuencia posee 927 aminoacidos frente a los 928 de la SEQ ID NO 1. El polipeptido de secuencia SEQ ID NO 2 tiene una actividad celulasa comparable a la del polipeptido de SEQ ID NO 1.

No obstante en una realizacion preferida, el polipeptido de la invencion se corresponde con la secuencia SEQ ID NO 1.

El polipeptido de SEQ ID NO 1 fue identificado y aislado a partir del screening de una metagenoteca de microorganismos del suelo. El polipeptido de SEQ ID NO 1 tiene 928 aminoacidos y posee una actividad celulasa muy marcada. Aunque el perfil de actividad indica que el polipeptido de SEQ ID NO 1 exhibe actividad exoglucanasa y beta- glucosidadasa, la actividad principal del mismo es endoglucanasa.

Los ensayos de actividad sobre el polipeptido de la invencion demuestran que este es activo a un amplio rango de temperaturas que va desde alrededor de 30°C hasta alrededor de 65°C. Preferiblemente, el polipeptido es activo a temperaturas de entre 30°C y 60°C, mas preferiblemente de entre 30°C y 50°C, mas preferiblemente de entre 37°C y 50°C y mas preferiblemente de entre 37°C y 45°C. La temperatura optima de actividad del polipeptido de la invencion se encuentra entre los 45 y 50°C (ver figura 4 y 5).

Asimismo, el polipeptido de la invencion muestra una gran termorresistencia y es capaz de mantener el mismo grado de actividad despues de al menos 5 dias de incubation a 30°C, o despues de 6 dias a 37°C. El grado de actividad se mantiene alto para el polipeptido incubado a 40°C durante dos dias y empieza a decrecer a partir del tercero. Finalmente, con una incubacion a 42°C el polipeptido pierde su actividad a los dos dias. (ver figura 6).

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En cuanto al pH optimo, el polipeptido de la invention trabaja mejor a pH ligeramente acido y es capaz de mantener la mayor parte de su actividad a pH en el rango de 5 a 7, aunque el pH optimo de actividad se encuentra en el rango de 5-6,5 (ver figuras 7 y 8).

El polipeptido de SEQ ID NO 1 posee 928 aminoacidos que comprenden diferentes dominios. En su extremo N-terminal, de la position 1 a la 32 se encuentra el peptido senal con la senal de translocation Twin-arginine. El dominio catalrtico o dominio con la actividad celulasa (perteneciente a la familia 5) se encuentra entre los aminoacidos 41 y 378. El polipeptido de SEQ ID NO 1 muestra tambien diferentes dominios de union a carbohidratos, mas concretamente entre las posiciones 443-570 y 664-780 se encuentran dos dominios de union a carbohidratos de tipo 2 (CBM2) y en la posicion 474-630 un dominio de union a carbohidratos de tipo 6 (CBM 6). La figura 3 es una representation donde se pueden observar los diferentes dominios y su ubicacion en la secuencia del polipeptido de la invencion.

El polipeptido de la invencion tambien contempla variantes del polipeptido de SEQ ID NO 1 que comprenden sustituciones, deleciones y/o inserciones en una o mas posiciones. Los cambios de aminoacidos pueden ser de naturaleza menor, esto es sustituciones o inserciones conservativas que no afecten significativamente el plegado y o actividad del polipeptido; pequenas deleciones normalmente de 1 a 30 aminoacidos; pequenas extensiones de los extremos amino y carboxiterminal como pequenos peptidos de union de 20-25 residuos o pequenas extensiones que faciliten la purification mediante el cambio de la carga neta u otra funcion, colas de polihistidinas, eprtopos antigenicos o dominios de union.

Tambien forman parte de la invencion variantes con cambios del polipeptido de la invencion que puedan alterar de manera controlada y dirigida propiedades fisico quimicas del polipeptido. Por ejemplo, estas variantes incluyen cambios de aminoacidos que puedan mejorar la estabilidad termica del polipeptido de la invencion, cambiar su especificidad por el sustrato, temperatura optima, el pH optimo etc.

Otro aspecto adicional de la invencion son los fragmentos funcionales del polipeptido de la invencion. Asi pues, la invencion no solo se extiende al polipeptido de SEQ ID NO1 o a polipeptidos que posean un grado de homologia o de identidad de al menos un 80% con la SEQ ID NO 1, sino tambien a los fragmentos funcionales de estos, es decir a aquellos fragmentos que mantienen al menos entre el 50% y el 100% de la actividad celulasa del polipeptido de la invencion.

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La actividad celulasa del polipeptido de la invention se encuentra en el dominio catalrtico, entre los aminoacidos 41 y 378, por lo que para que un fragmento del polipeptido de la invencion mantenga la actividad celulasa debe contener al menos este fragmento. Por tanto, los fragmentos funcionales de la presente invencion comprenden al menos los aminoacidos entre las posiciones 41 y 378 de la SEQ ID NO 1.

En una realization particular dichos fragmentos comprenden o consisten en las secuencias SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 o SEQ ID NO 5. Todos estos fragmentos mantienen la actividad celulasa del peptido aunque no tienen por que mantener el mismo perfil de actividad.

Polinucleotidos

Otro aspecto relevante de la invencion, viene representado por la secuencia polinucleotidica que codifica el polipeptido de la invencion o los fragmentos funcionales del mismo.

El polinucleotido puede ser cualquier tipo de acido nucleico de cadena doble o simple como por ejemplo ADN o ARN. Se consideran incluidos en el ambito de la invencion tanto el ADN genomico aislado a partir de clon de la libreria metagenomica y que codifica el polipeptido de SEQ ID NO 1, asi como el cDNA obtenido por transcription reversa de este. Tambien son parte de la invencion los ARNm que codifican el polipeptido de la invencion.

Asimismo, forman parte de la invencion las modificaciones del polinucleotido que codifican las posibles variantes del polipeptido de la invencion descritas en el apartado relativo al polipeptido con actividad celulasa y sus fragmentos funcionales.

En una realizacion particular la secuencia nucleotidica comprende o consiste en una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9 o SEQ ID NO 10.

La SEQ ID NO 6 es la secuencia polinucleotidica que codifica el polipeptido de SEQ ID NO 1. La invencion tambien contempla las secuencias polinucleotidicas que comprendan variaciones en uno o varios nucleotidos pero que no resultan en un cambio de la secuencia polipeptidica que codifica la SEQ ID NO 6.

La SEQ ID NO 7 es la secuencia polinucleotidica que codifica el polipeptido con la secuencia SEQ ID NO2. La invencion tambien contempla las secuencias polinucleotidicas

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que comprendan variaciones en uno o varios nucleotidos pero que no resultan en un cambio de la secuencia polipeptidica que codifica la SEQ ID NO 7.

Las SEQ ID NO 8, 9 y 10 representan la secuencia codificadora de algunos de los fragmentos funcionales preferidos de la invention. La invention tambien contempla las secuencias polinucleotidicas que comprendan variaciones en uno o varios nucleotidos pero que no resultan en un cambio de la secuencia polipeptidica de estos fragmentos.

Construction genica

Otro aspecto adicional de la invencion es una construccion genica que comprende una secuencia polinucleotidica como las mencionadas mas arriba que se encuentra operativamente unida a una o mas secuencias de control que dirigen la expresion de polipeptidos en sistemas de expresion.

Las secuencias de control pueden ser un promotor, un polinucleotido que es reconocido por el sistema de expresion (celula huesped) para la expresion del polipeptido de la invencion. Los promotores contienen secuencias de control transcripcional que median la expresion del polipeptido. El promotor puede ser cualquier polinucleotido que muestre actividad transcripcional en la celula huesped incluyendo promotores mutantes, truncados e hibridos y pueden ser obtenidos de genes que codifican polipeptidos extracelulares o intracelulares ya sean homologos o heterologos a la celula huesped.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcription de los polipeptidos de la invencion en celulas huesped bacterianas pueden ser los promotores obtenidos del gen alfa- amylasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), del gen alfa-amylasa de Bacillus licheniformis (amyL), del gen de la penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP), del gen de la amilasa maltogenica de Bacillus stearothermophilus (amyM), del gen de la levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), de los genes xylA and xylB Bacillus subtilis, del gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), del operon lac de E. coli, del promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), del gen agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA), y del gen beta-lactamase procariotico (Villa- Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), asi como del promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Promotores adicionales se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; y en Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular

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Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York. Ejemplos de promotores tandem se describen en WO 99/43835.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripcion en celulas hospedadoras de hongos filamentosos pueden ser los promotores obtenidos de los genes de la acetamidasa de Aspergillus nidulans acetamidase, de la alfa amilasa neutra de Aspergillus niger, de la alfa amilasa acidoestable de Aspergillus niger, de la glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori glucoamylase (glaA),de la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, de la proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, de la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, de la proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), de la aminoglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), de la lipasas de Rhizomucor miehei, de la proteinasa aspartica de Rhizomucor miehei, de la beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, de la celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, de la celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, de la endoglucanasa I de Trichoderma reesei, de la endoglucanasa II de Trichoderma reesei, de la endoglucanasa III de Trichoderma reesei, de la endoglucanasa V de Trichoderma reesei, de la xilanasa I de Trichoderma reesei, de la xilanasa II de Trichoderma reesei, de la xilanasa III de Trichoderma reesei , de la beta xilosidasa de Trichoderma reesei, y del factor de elongacion de la traduccion de Trichoderma reesei, asi como de promotor NA2-tpi ( un promotor modificado del gen de la alfa amilasa neutra de Aspergillus en la que la secuencia lider no traducida se ha sustituido por una secuencia lider no traducida de un gen de la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus; ejemplos no limitativos incluyen promotores modificados del gen de la alfa amilasa neutra de Aspergillus niger en el que la secuencia lider no traducida se ha sustituido por una secuencia lider no traducida del gen de la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados, e hibridos de los mismos. Otros promotores se describen en US6011147. Otro promotor adecuado es el promotor Pcbh de Myceliophtora termophila.

En celulas de levaduras los promotores utiles se pueden obtener de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), de la galactoquinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), de la alcohol deshidrogenasa/gliceroaldehido-3-fosfatasa desidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), de la triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), de la metalotioneina de Saccharomyces cerevisiae (CUP1), y la 3 fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores utiles para levaduras se describen en Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

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La secuencia de control puede tambien ser un terminador de la transcripcion, que es reconocido por la celula huesped para terminar la transcripcion. El terminador esta operativamente unido al termino 3’ del polinucleotido que codifica el polipeptido. Cualquier terminador que sea funcional en la celula huesped puede usarse en el contexto de la presente invencion.

Algunos terminadores apropiados para celulas huesped bacterianas pueden obtenerse a partir de genes de la proteasa alcalina de Bacillus clausii (aprH), de la alfa amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), y Escherichia coli ribosomal RNA (rrnB).

Algunos terminadores adecuados para celulas huesped de hongos filamentosos se pueden obtener de los genes acetamidasa de Aspergillus nidulans, de la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans anthranilate, de la glucoamilasa de Aspergillus niger, de la alfaglucosidasa de Aspergillus niger, de la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, de la proteasa semejante a tripsina de Fusarium oxysporum, de la beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, de la celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, de la celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, de la endoglucanasa I de Trichoderma reesei, de la endoglucanasa II Trichoderma reesei, de la endoglucanasa III de Trichoderma reesei, de la endoglucanase V de Trichoderma reesei, de la xilanasa I de Trichoderma reesei, de la xilanasa II de Trichoderma reesei, de la xilanasa III de Trichoderma reesei, de la beta-xilosidasa de Trichoderma reesei y del factor de elongacion de traduccion de Trichoderma reesei. Otra secuencia terminadora es la secuencia Tcbh.

Algunos terminadores adecuados para celulas huesped de levaduras se pueden obtener a partir de genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae, del citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) y de la gliceraldehido-3-fofato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores utiles en levaduras se describen en Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

La secuencia control puede ser tambien una region estabilizadora del RNAm posterior al promotor pero anterior a la secuencia codificante de un gen que incremente la expresion del gen. Ejemplos de secuencias estabilizadoras de RNAm se pueden obtener del gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 9425612) del gen SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology Ml: 3465-3471).

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La secuencia de control puede ser tambien una secuencia Kder, una region no traducida del RNAm que es importante en la traduccion por parte de la celula huesped. La secuencia lider esta operativamente unida a la region 5’ terminal del polinucleotido que codifica el polipeptido. Cualquier secuencia lider funcional en la celula huesped puede usarse.

Secuencias lider adecuadas en hongos filamentosos se pueden obtener de los genes de la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

Secuencias lider apropiadas para levaduras se pueden obtener de los genes de la enolasa de Sacharomyces cerevisiae (ENO-1), de la 3-fosfogliceratoquinasa de Saccharomyces cerevisiae, del de factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, y del de la alcohol deshidrogenasa/Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

La secuencia de control tambien puede ser una secuencia de poliadenilacion una secuencia operativamente unida a termino 3’ del polinucleotido y que cuando es transcrito la celula huesped la reconoce como una senal para anadir residuos poliadenosina al mRNA transcrito. Cualquier senal de poliadenilacion funcional en la celula huesped puede ser usada.

Algunas secuencias de poliadenilacion adecuadas para celulas huesped de hongos filamentosos se pueden obtener a partir de los genes de la antranilato sintasas de Aspergillus nidulans, de la glucoamilasa de Aspergillus niger, de la alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, de la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y de la proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum.

Secuencias de poliadenilacion utiles en celulas huesped de levaduras se describen en Guo and Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

La secuencia de control puede ser tambien un peptido senal que codifica un peptido senal unido al extremo N-terminal del polipetido y dirige al polipeptido a las vias secretoras de senalizacion celular. La region 5’ terminal de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante de un peptido senal naturalmente unido en el fragmento de traduccion con el segmento de la secuencia codificante del polipeptido. Alternativamente el termino 5’ de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante de un peptido senal que es ajeno a la secuencia codificante. Una secuencia codificante de un peptido senal

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ajeno puede ser necesario cuando la secuencia codificante no contiene de manera natural una secuencia codificante de un peptido senal. Por otro lado, una secuencia ajena puede estar sencillamente reemplazando una secuencia codificante del peptido secuencia natural con el fin de potenciar la secrecion del polipeptido. No obstante, cualquier secuencia codificante de un peptido senal que dirija el polipeptido expresado por las vias de secrecion celular puede ser usada.

Secuencias codificantes de peptidos senal adecuadas para bacterias pueden obtenerse de los genes de la amilasa maltogenica de Bacillus NCIB 1 1837, de la subtilisina de Bacillus licheniformis, de la beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, de la amilasa de Bacillus stearothermophilus, de las proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) y de la proteasa A de Bacillus subtilis. Otros peptides senal se describen en Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137. Otras secuencias senal apropiadas para su uso en bacterias son las secuencias Twin arginine y las secuencia Sec.

Secuencias codificantes de peptidos senal adecuadas para hongos filamentosos pueden obtenerse de los genes de la amilasa neutra de Aspergillus niger, de la glucoamilasa de Aspergillus niger, de la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, de la celulasa de Humicola insolens, de la endoglucanasa V de Humicola insolens, de la lipasas de Humicola lanuginosa lipase y de la proteinasa aspartica de Rhizomucor miehei.

Peptidos senal para levaduras se pueden obtener de los genes del factor alfa de Sacharomyces cerevisiae y de la invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras secuencias codificantes de peptidos senal se describen en Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

Tambien puede ser deseable anadir secuencias reguladoras que regulen la expresion del polipeptido en funcion al crecimiento de la celula huesped. Ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que causan que la expresion del gen se active o se inactive en respuesta a estimulos quimicos o fisicos, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Secuencias reguladoras sistemas procariotas incluyen los sistemas operadores lac, tac y trp. En levaduras se pueden usar los sistemas ADH2 o GAL1. En hongos filamentosos se pueden usar el promotor glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor TAKA alfa amilasa de Aspergillus oryzae, y el promotor glucoamilasa de Aspergillus oryzae, el promotor celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei el promotor celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei y el promotor Pcbh de Mycelliophthora thermophila.

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Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplification genica. En sistemas eucariotas, estas secuencias reguladoras incluyen las secuencias reguladoras del gen de la dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de la metalotioneina que se amplifican con metales pesados. En estos casos el polinucleotido que codifica el polipeptido estaria operativamente unido a la secuencia reguladora.

El vector de expresion

En otro aspecto la invention tambien se refiere a un vector de expresion que comprende un polinucleotido o una construction genica como los anteriormente descritos.

El vector de expresion comprende el polinucleotido de la invencion, al menos un promotor y senales de termination transcripcionales y traduccionales. Las diferentes secuencias nucleotidicas y de control pueden estar unidas para producir un vector de expresion recombinante que puede incluir uno o mas sitios de restriction para permitir la insertion o sustitucion del polinucleotido que codifica el polipeptido de la invencion en dichos sitios.

Alternativamente, el polinucleotido puede expresarse mediante la insercion del polinucleotido o la construccion genica de la invencion en un vector apropiado para la expresion. Al crear el vector de expresion la secuencia codificante debe estar operativamente unida con las secuencias de control apropiadas para garantizar la expresion. El vector de expresion puede ser cualquier vector (por ejemplo virus o plasmido) que pueda ser sometido a procesos de ADN recombinante y que pueda llevar a cabo la expresion del polinucleotido. La eleccion del vector depende esencialmente de la compatibilidad del vector con la celula huesped en la cual vaya a ser introducido el vector. El vector puede ser un plasmido linear o circular.

El vector puede ser un vector autonomamente replicante, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosomal y cuya replicacion es independiente de la replicacion del cromosoma como, por ejemplo, un plasmido, un elemento extracromosomal, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar su autoreplicacion.

Asimismo, el vector puede ser uno que al ser introducido en la celula huesped se integra en el genoma y se replica junto con el o los cromosomas en los cuales se inserta. Ademas se puede usar un vector unico o plasmido o mas vectores o plasmidos que conjuntamente

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contengan el ADN total que ha de ser introducido en el genoma de la celula huesped o tambien un transposon.

El vector contiene preferiblemente uno o mas marcadores que permiten la selection sencilla de celulas transformadas o transfectadas. Un marcador de seleccion es un gen cuyo producto proporciona resistencia a un producto, un virus, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxotrofos etc.

Ejemplos de marcadores de seleccion adecuados para bacterias son los genes DAL de Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis, o marcadores que confieren resistencia a antibioticos como resistencia a ampicillina, cloranfenicol, kanamicina, neomcina, espectinomicina o tetraciclina.

Marcadores apropiados para levaduras incluyen pero no se limitan a ellos, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3.

Marcadores de seleccion para uso en hongos filamentosos incluyen pero no se limitan a, adeA (fosforibosilaminoimidazol-succinocarboxamida sintasa), adeB (fosforibosil- aminoimidazol sintasa), amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricin acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato decarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa) y equivalentes de los mismos. Los marcadores preferidos para celulas de Aspergillus son los genes amdS y Pyr G de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus. Los marcadores preferidos para celulas de Trichoderma cell son los genes adeA, adeB, amdS, hph, y pyrG. Otros marcadores preferidos son Pyr 4, Pyr 5, CysC y trp.

El vector de la invention debe contener preferiblemente elementos que permitan la integration del vector en el genoma de la celula huesped o la replication autonoma del vector en la celula de manera independiente al genoma. Para la integracion en el genoma el vector puede contener elementos de integracion por recombination homologa o no homologa. Incluso, puede incluir secuencias polinucleotidicas para dirigir la integracion por recombinacion homologa en locus concretos en el(los) cromosoma(s). El elemento integracional puede ser cualquier secuencia homologa a la secuencia diana en el genoma de la celula huesped. Ademas los elementos integracionales pueden ser secuencias codificantes o no codificantes.

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Para la replication autonoma, el vector de la invention puede comprender un origen de replication que le permita al vector autorreplicarse en la celula huesped. El origen de replicacion puede ser cualquier replicador plasmidico que funcione en la celula huesped.

Ejemplos de origenes de replicacion bacterianos son los origenes de replicacion de los plasmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184 que permiten la replicacion en E. coli y pUB1 10, pE194, pTA1060 y [rho][Alpha][Mu][beta][Iota] que permiten la replicacion en Bacillus.

Ejemplos de origenes de replicacion para usar en levaduras son los origenes de replicacion de dos micrones ARS1, ARS4, la combination de ARS1 y CEN3, y la combination de ARS4 y CEN6.

Ejemplos de origenes de replicacion en hongos filamentosos son AMA1 y ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61 -67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 91639175; WO 0024883). WO0024883 describe como se puede conseguir el aislamiento del gen AMA1 y la construction de plasmidos o vectores que lo comprenden.

Se puede insertar mas de una copia del polinucleotido en la celula huesped para incrementar la production del polipeptido de la invencion. El incremento en el numero de copias del polinucleotido se puede conseguir integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la celula huesped.

Celula huesped

Otro aspecto relevante de la invencion se relaciona con una celula huesped que comprende un polinucleotido, una construccion genica o un vector de expresion como los mencionados anteriormente y que expresa el polipeptido de la invencion o un fragmento funcional o una variante del mismo.

La celula huesped puede ser una celula eucariota o una celula procariota.

En una realization particular la celula huesped es una celula procariota que se selecciona preferiblemente del grupo de bacterias de los generos Bacillus, Clostridium, Esherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Streptomyces, Thermoanaerobacterium o Zymomonas.

En otra realizacion particular, la celula huesped es una celula eucariota que se selecciona preferentemente del grupo de hongos de las especies Aspergillus awamori, Aspergillus

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foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis sufrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cereales, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Saccharomyces calsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norvensis, Saccharomyces oviformis, Thielavia terrestres, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reseii, Trichoderma viride o Yarrowia lipolytica.

Cualquier medio comunmente conocido para introducir material genetico en celulas huesped como transformation de protoplastos, transformation de celulas competentes,

electroporation o conjugation puede ser usado para transformar o transfectar las celulas huesped.

Metodo de production del polipeptido de la invention

Otro aspecto importante de la invencion es el metodo para producir un polipeptido con actividad celulolrtica de la invencion que comprende:

a) Cultivar una celula huesped como la mencionada anteriormente en las condiciones necesarias para la produccion del polipeptido,

b) Recuperar el polipeptido producido.

La etapa a) relativa al cultivo de las celulas huesped se lleva a cabo en un medio nutritivo adecuado para la celula para producir el polipeptido. Los medios nutritivos adecuados para el cultivo estan disponibles comercialmente o pueden ser preparados de acuerdo con protocolos bien conocidos por un experto en la materia.

El cultivo se puede llevar a cabo a escala de laboratorio o a escala industrial en fermentadores industriales mediante metodos comunmente conocidos por el experto en la materia. El proceso industrial puede llevarse a cabo en continuo o discontinuo.

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En una realization preferida el cultivo de la etapa a) se lleva a cabo a nivel industrial en fermentadores industriales bajo condiciones controladas (temperatura, pH, nutrientes etc.). Ademas preferentemente el proceso se lleva a cabo en continuo.

El polipeptido se puede recuperar mediante cualquier metodo conocido y convencional. Por ejemplo, el polipeptido de la invention se puede recuperar del medio mediante coleccion, centrifugation, filtration, extraction, evaporation o precipitation. Asimismo, una vez recuperado el polipeptido de la invencion puede ser purificado si fuera necesario por procesos comunmente conocidos por un experto en la materia.

No obstante, en una realizacion preferida de la invencion, la recuperation comprende la hidrolisis de las celulas huesped para liberar al medio todo el contenido celular incluido el polipeptido de la invencion y el trasvase de la corriente con el sobrenadante, en el cual se encuentra el polipeptido de la invencion, directamente al lugar o fermentador donde se llevara a cabo el proceso de digestion o degradacion de la biomasa.

Composition celulolitica

Otro aspecto de la invencion es una composicion celulolitica que comprende al menos un polipeptido de acuerdo con la invencion o al menos un fragmento funcional o una variante del mismo y, opcionalmente, al menos un elemento que favorezca o facilite la degradation de biomasa.

La composicion de la invencion comprende como elemento esencial de la misma al menos un polipeptido de acuerdo con la invencion o al menos un fragmento funcional o una variante del mismo, asi como los elementos esenciales para que este ejerza correctamente su funcion celulolitica. Estos elementos son basicamente un tampon adecuado (preferiblemente un tampon citrato-fosfato, 50 mM, pH 5) y un medio electrolrticamente adecuado para mantener al maximo la funcionalidad del polipeptido de la invencion o de sus fragmentos funcionales o variantes.

La composicion de la invencion normalmente se presenta en forma liquida aunque puede presentarse en forma solida reconstituible.

De manera opcional aunque preferida, la composicion comprende al menos un elemento adicional que favorece o facilita la degradacion de biomasa. Dicho elemento que favorece o facilita la degradacion de biomasa puede ser cualquier agente quimico, fisico o biologico que ayude en la degradacion completa del material lignocelulosico de la biomasa.

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En una realization preferida la composition comprende como elemento que facilita la degradation de la biomasa una o mas enzimas seleccionadas de entre endoglucanasas, exoglucanasas, celobiohidrolasas, beta-glucosidasas, glicosil-hidrolasas, hemicelulasas, xylanasas, enzimas lignolrticas o mezclas de las mismas.

Uso del polipeptido

Otro aspecto general de la invention se refiere al uso del polipeptido de la invention, de un fragmento funcional o una variante del mismo o de la composicion celulolrtica de la invencion de para la degradacion de biomasa.

Este aspecto general del uso del polipeptido de la invencion, de un fragmento funcional o de una variante del mismo o de la composicion celulolrtica de la invencion para la degradacion de biomasa esta encuadrado dentro del campo de la invencion que es la production industrial de bioproductos.

En este sentido, un aspecto particular de la invencion se refiere a un procedimiento para producir azucares fermentables que comprende incubar biomasa con el polipeptido de la invencion, con un fragmento o variante del mismo o con la composicion celulolrtica de la invencion.

Estos azucares fermentables obtenidos se encuentran en el sobrenadante obtenido tras la incubation. Dado que la presente invencion esta enfocada principalmente en el campo de la produccion de bioproductos normalmente la corriente con los azucares fermentables se redirige directamente desde el tanque donde se lleva a cabo la digestion hidrolrtica de la biomasa a donde se da la transformation quimica de este sustrato preferiblemente por fermentacion microbiana.

Esto no quita que en una realizacion particular los azucares fermentables pueden opcionalmente ser recuperados tras la incubacion y ser procesados y purificados para otros usos diferentes. La recuperation de los azucares en este caso se podria llevar a cabo por cualquier metodo adecuado para tal fin como por ejemplo centrifugation, filtration o deposicion por gravedad.

Otro aspecto particular, relacionado con el anterior, es el procedimiento para producir un bioproducto a partir de biomasa. Este aspecto esta relacionado con el anterior ya que

implica, en primer lugar, llevar a cabo el procedimiento antes mencionado de degradar la

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biomasa hacia azucares fermentables mediante la incubacion de biomasa con el polipeptido de la invention, con un fragmento o variante del mismo o con la composition celulolrtica de la invencion.

Asi pues, otro aspecto particular se relaciona con un procedimiento para producir un bioproducto a partir de biomasa que comprende:

a) producir azucares fermentables de acuerdo con el procedimiento anteriormente descrito,

b) llevar a cabo una transformation quimica de los azucares obtenidos en la etapa a) para producir al menos un bioproducto,

c) Recuperar el al menos un bioproducto obtenido en la etapa b).

La transformacion quimica de los azucares puede ser un proceso termoquimico para producir bioproductos, como por ejemplo someterlos a un proceso de isomerization y posterior deshidratacion e hidrogenacion.

No obstante, en una realization particular y preferida de la invencion dicha transformacion comprende la fermentation microbiana de los azucares con microorganismos fermentantes.

Tanto en el procedimiento para producir azucares fermentables, como en el procedimiento para producir bioproductos, antes de llevar a cabo la etapa de incubacion de la biomasa con el polipeptido de la invencion, con un fragmento o una variante del mismo o con la composicion celulolrtica de la invencion se puede, opcionalmente, llevar a cabo un pretratamiento de la biomasa celulosica con el fin de facilitar el proceso de digestion posterior. El pretratamiento puede consistir en la disruption de los componentes de la pared celular de las celulas vegetales de la biomasa (Chandra et al., 2007, Substrate pretreatment: The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics? Adv. Biochem. Engin. /Biotechnol. 108: 67-93; Galbe and Zacchi, 2007, Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production, Adv. Biochem. Engin. /Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks and Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 96: 673-686; Taherzadeh and Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review, Int. J. of Mol. Sci. 9: 1621-1651 ; Yang and Wyman, 2008, Pretreatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr. 2: 26-40).

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La biomasa celulosica puede asimismo ser sometida tambien a una reduction del tamano de particula, a banos y lavados y/o condicionamiento antes del pretratamiento opcional.

Los pretratamientos convencionales de la biomasa celulosica incluyen pero no se limitan a pretratamiento con calor, pretratamiento con acido diluido, pretratamiento con agua caliente, pretratamiento alcalino, pretratamiento con cal, oxidation en mojado, explosion en mojado AFEX, pretratamiento organosolv y pretratamiento biologico. Otro pretratamientos adicionales incluyen percolation amonica, ultrasonidos, electroporation, microondas, CO2 supercritico, H2O supercritico, ozono, liquido ionico o pretratamiento por irradiation gamma.

La etapa de incubation de la biomasa celulosica (pretratada o no) con el polipeptido de la invention, con un fragmento funcional o variante del mismo o con la composition celulolrtica de la invencion comprende la hidrolisis del material celulosico y/o hemicelulosico hacia azucares fermentables como glucosa, celobiosa, xilosa, xilulosa, arabinosa, manosa, galactosa y/o oligosacaridos solubles.

La hidrolisis enzimatica se lleva a cabo preferiblemente en un medio acuoso apropiado y en condiciones que puede determinar facilmente un experto en la materia.

En una realization preferida la hidrolisis se lleva a cabo a un pH entre 5 y 7, preferiblemente entre 5 y 6.5 y a una temperatura de entre 30°C y 55°C preferiblemente entre 37°C y 50°C.

La hidrolisis puede hacerse en un proceso discontinuo o continuo donde la biomasa se anade gradualmente a la solution de hidrolisis que comprende el polipeptido de la invencion, un fragmento funcional o una variante del mismo o la composicion celulolrtica de la invencion.

La production de azucares fermentables se lleva a cabo generalmente en tanques o reactores con agitation que controlan las condiciones de pH, temperatura y la mezcla de los componentes de reaccion. Los tiempos de reaccion pueden ser determinados por un experto en la materia aunque pueden durar hasta 200 horas, pero preferiblemente la etapa de produccion de los azucares fermentables se lleva a cabo entre 12 y 120 horas.

La etapa posterior, esto es la etapa b) comprende llevar a cabo una transformation quimica de los azucares obtenidos en la etapa anterior siendo esta transformacion quimica mediada de una manera preferentemente con al menos un microorganismo fermentante. Para ello la corriente resultante de la etapa a) (hidrolisis enzimatica) se lleva directamente al tanque donde se dara la fermentation bajo condiciones controladas.

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La eleccion del o de los microorganismos fermentantes dependera del tipo de bioproducto que se desee producir. En una realization particular de la invention el al menos un microorganismo fermentante se selecciona entre bacterias como Bacillus

thermoglucosidaisus, Clostridium butyricum, Corynebacterium glutamicum, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Geobacillus themoglucosidasius, Klebsiella oxytoca, Lactobacillus sp. Leunoscoc mesenteroides, Thermoanaerobacter BG1L1, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoanaerobacter mathranii, Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum, Zymobacter palmae, Zymomonas mobilis u hongos como Candida arabinofermentans, Candida boidinii, Candida diddensis, Candida fermentans, Chrysosporium lucknowense, Candida pastoris, Candida shehatae, Candida sonorensis, Candida tropicalis, Hansenula anomala, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bulderi, Saccharomyces barnetti, Saccharomyces exiguus, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces uvarum o Schizosaccharomyces pombe o una combination de alguno de estos microorganismos.

Las condiciones para llevar a cabo la fermentation dependeran principalmente del tipo de microorganismo fermentante. Normalmente, las condiciones se adaptaran a las condiciones optimas en las que el microorganismo en cuestion lleve a cabo el proceso de fermentacion. Aunque no hay unas condiciones fijas, tipicamente el tiempo de fermentacion varia entre 24 y 96 horas, la temperatura entre 26°C y 60°C, preferentemente entre 32°C y 50°C y el pH entre 3 y 8, preferentemente entre 4 y 5, entre 4 y 6 o entre 4 y 7.

La cantidad de inoculo del microorganismo fermentante tambien dependera igualmente del tipo de microorganismo aunque tipicamente el microorganismo fermentante se puede aplicar en cantidades de entre 105 y 1012 celulas/ml de caldo de cultivo.

En funcion de los microorganismos utilizados se obtendran diferentes bioproductos ya que cada microorganismo tiene un metabolismo caracteristico y propio. En este sentido un experto en la materia seleccionara el microorganismo mas conveniente en funcion del bioproducto que desee obtener. Sin pretender ser una lista limitativa algunos de los bioproductos que se pueden obtener mediante el procedimiento aqu descrito incluyen alcoholes como etanol, metanol, butanol, hexanol, octanol, decanol, dodecanol, 1,3- butanediol(1,3-diol), 1-alcohol; acidos organicos como acido dtrico, acido acetico, acido itaconico, acido lactico, acido glutamico, acido suctinico, beta-cetoacido, beta-cetoalcohol,

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beta-hidroxiacido; cetonas como la acetona; gases como hidrogeno o dioxido de carbono; hidrocarburos como alcanos, alquenos o alquinos; sustancias nitrogenadas como aminas, amida, nitrocompuestos o nitrilos; haluros; aminoacidos como acido glutamico; antiobioticos como penicilina o tetraciclinas; vitamina como riboflavina, vitamina B12 o betacaroteno; acidos grasos como acido dodecanoico, acidos grasos trans-A2 o acido palmrtico; y otros productos como etileno, glicerol, 1,3-propano-diol, betalactano, cefalosporinas, acidos grasos trans o furano.

En una realization preferida el bioproducto es un alcohol preferiblemente etanol.

La etapa c) del procedimiento de production de bioproductos comprende la recuperation del mismo. El o los productos de fermentation pueden recuperarse del medio de fermentation mediante cualquier metodo conocido incluyendo pero sin limitarse a cromatografia, procesos electroforeticos, solubilidad diferencial, destilacion o extraction. Por ejemplo, el alcohol se separa del caldo de fermentacion por metodos convencionales de destilacion.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Construccion de la libreria metagenomica e identificacion de los clones de interes a partir de la misma

Construccion de la libreria metagenomica

Se construyo una libreria metagenomica a partir de bacterias del suelo en un fosmido pMPO579 (Terron-Gonzalez et al., 2013 Sci. Rep. 3: 1107). La libreria metagenomica se construyo de acuerdo con el protocolo del kit CopyControl™ Fosmid Library Production (Epicentre), con alguna modification como se describe en Terron-Gonzalez et al. 2013. La libreria comprende aproximadamente 7,4 Gigabases distribuidas entre aproximadamente 185,000 clones diferentes, con un tamano medio de aproximadamente 40 kb, y se mantiene en la cepa EPI300-T1R

Identificacion de clones que confieren actividad celulasa

Se transfirio la libreria metagenomica por cruce triparental (Figurski and Helinski, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1648-1652) a la cepa MPO554, con DH5a/pRK2013 como cepa helper. En presencia de salicilato, la cepa MPO554 produce NahR (el activador del promoter psal) y la protema N antiterminante del fago lambda, permitiendo la expresion del promotor psal localizado en el fosmido y la antitermination transcripcional (Terron-Gonzalez

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et al., 2013 Sci. Rep. 3: 1107). Los cruces conjugativos se llevaron a cabo en LB-agar sin selection por antibiotico durante toda la noche a 37°C. Las mezclas de cruces se sembraron en placas con LB-agar suplementadas con los antibioticos necesarios para la seleccion de transconjugantes, arabinosa para incrementar el numero de copias del fosmido, salicilato para incrementar los niveles de transcription y 1% carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato para el rastreo. Las placas se incubaron a 30°C durante 48 h.

Se llevo a cabo un rastreo tipico de celulasas usando platos de agar con CMC con tincion Rojo Congo (Teather and Wood, 1982 Appl. And Environ. Microbiol. 43:777-780). Este metodo tiene el problema de que las colonias se despegan debido a que las placas se inundan durante la tincion, haciendo dificil la identification de clones positivos. Para solventar este problema, se hizo una modification del metodo que consistio en la inmovilizacion de las colonias con una capa de cobertura de agar antes de la tincion. Despues, cada plato se inundo con una solution de Rojo Congo al 1% durante 30 minutos y despues NaCl 1M durante 30 minutos. Los clones positivos mostraban un halo claro alrededor de la colonia debido a la falta de tincion por hidrolisis de la CMC por las celulasas secretadas. La Figura 9 muestra una de las placas con un clon con actividad celulasa.

Se hizo el screening de alrededor de 550,000 clones, de tal forma que la probabilidad de que se analizaran todos los clones de la libreria fue de 95%. Todos los clones positivos se analizaron mediante digestion con enzimas de restriction, detectandose un total de 8 fosmidos diferentes con actividad celulasa (8 clones con distinto patron de restriccion).

Identificacion de los genes de interes

Cada fosmido se secuencio por completo y las secuencias se compararon con aquellas de bases de datos usando los programas Blastx y Blastn (Altschul et al., 1997 Nucleic Acid Res. 25:3389-3402). Se identificaron ORFs potencialmente involucrados en la actividad celulasa.

Ejemplo 2: Construction del vector y expresion de Cel98 en E.coli DH5a

La secuencia del CLON98 identificado en el rastreo fue analizada mediante el programa ORF Finder para buscar pautas de lectura abiertas y posibles genes que se transcriban y se detecto asi “cel98”, una secuencia de ADN de 1787 pb (SEQ ID NO 6) que es la secuencia polinucleotidica que codifica el polipeptido de la invention que se denomino Cel98 y que posee la secuencia SEQ ID NO 1.

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Se procedio al estudio y analisis del gen cel98 mediante el programa motifscan (
http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif scan). El fragmento identificado muestra en su extremo amino-terminal, de la posicion 1-32, una senal de translocacion Twin-arginine (tat). Tambien se observa el dominio celulasa (perteneciente a la familia 5) en la posicion 41-378. En las posiciones 443-570 y 644-780 se encuentran dos dominios de union a carbohidratos de tipo 2 (CBM2) y en la posicion 474-630 un dominio de union a carbohidratos de tipo 6 (CBM6) (ver figura 3).

El vector elegido para subclonar el gen de cel98 fue el pET23b. Dicho vector contiene un gen de resistencia a ampicilina, el promotor T7, el inicio de transcripcion de T7, una secuencia His-tag (en el extremo C-t) y el polilinker (multicloning site). Incluye asi tambien la secuencia de termination T7 y los origenes pBR322 y f1.

Para subclonar el fragmento de interes se siguio el siguiente procedimiento:

Diseno de los cebadores para amplificar el fragmento de interes (cel98)

Se procedio a disenar cebadores empleando la secuencia de dicho gen y se decidio insertar en los cebadores senales de reconocimiento de dos enzimas de restriction diferentes para que la insertion del gen fuera dirigida (Ndel y Xhol) ya que estas no cortaban dentro de la secuencia del gen y tan solo cortaban una vez cada una en el vector, de forma que este podia abrirse para insertar cel98.

Los cebadores empleados fueron los siguientes:

- Directo: CAATCATATGAGGACCCACATGAAAACG (Tm=62°C) (SEQ ID NO 11)

- Reverso: GAATCTCGAGCTTGGTGACGGTGAAAGCC (Tm=60°C) (SEQ ID NO 12)

Preparacion de los cultivos de la cepa que contiene el vector pMPO135 y el fragmento de interes

Se prepararon cultivos en medio liquido Luria-Bertani (LB) suplementados con ampicilina (100 ^g/mL). Para el cultivo del vector, la cepa DH5a de E. coli (se selecciono una colonia de la placa) se inoculo en 5 ml de LB suplementado con ampicilina (el vector tiene resistencia a este antibiotico) y para el cultivo del inserto se selecciono una colonia de UPO98 (E. coli MP0554 con el inserto cel98) en 3 ml de LB con cloranfenicol (el fosmido donde esta construida la metagenoteca tiene resistencia a cloranfenicol) y arabinosa para aumentar la expresion (promotor inducible por arabinosa).

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Extraction del DNA plasmidico (vector) y cuantificacion de ADN por Nano-Drop.

Para la extraccion del ADN plasmidico se empleo el kit "Nucleo Spin Plasmid (Macherey- Nagel)”. Para cuantificar el ADN extraido se empleo el equipo Nano-drop ND-1000. As^ las cantidades de ADN obtenidas fueron de 88,5 ng/jl para el vector y 354,5 ng/jl para el fosmido que contiene el gen de interes.

Digestion del vector

Se emplearon para ello 2,5 jg de plasmido. La reaction se llevo a cabo en un volumen final de 35 jl.

Se necesito, en orden de adicion al tubo:

1. Agua desionizada: 1 jl (hasta completar el volumen final)

2. Tampon H (Roche) (10X): 3,5 |jl

3. ADN (vector purificado): 28 jl

4. Enzimas para la digestion (Ndel (Fermentas) y Xhol (Roche)): 1,25 jl de cada enzima La reaccion se dejo incubando a 37°C durante dos horas y media.

Gel de agarosa (0,8%) para comprobar que las bandas del vector linearizado son las correctas.

El vector empleado posee unas 4,5 Kb. Al cortar con las enzimas de restriction se libero un fragmento de 0,9 Kb, quedando un vector de 3,6 Kb linearizado al visualizarse en gel.

El gel se corrio durante 20 minutos a 135V y posteriormente se tino durante 20 minutos en bromuro de etidio para visualizar las bandas.

PCR del fragmento de interes

Empleando los cebadores previamente descritos se procedio a la amplification por PCR del fragmento de interes “cel98” siguiendo el siguiente programa:

1°. 5 minutos a 94°C para desnaturalizar las cadenas de ADN 2°. 35 ciclos:

- 94°C durante 30 segundos para desnaturalizar.

- 56°C durante 30 segundos.

- 72°C durante 5 minutos y medio para que se extienda la polimerasa. Este tiempo depende del tamano del fragmento que se deba copiar. Se debe poner 2 minutos por Kb a amplificar, y como el inserto de interes era de 2,787 Kb, se configuro para 5’ 30’’.

3°. 5 minutos a 72°C

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La PCR se hizo por duplicado. Se puso tambien un control negativo (sin DNA para amplificar, sustituyendo su volumen por agua desionizada).

Por cada reaccion se pusieron 50 ^l de volumen final:

- ADN molde. Se emplearon 10-40 ng de DNA. Como teniamos a UPO98 a 354,5 ng/^l, se diluyo 20 veces y de dicha dilucion se tomo 1 ^l de ADN y se adiciono en 19 ^l de agua desionizada, y de este ultimo stock se puso 2 ^l para la PCR.

- cebador directo (10^M) (SEQ ID NO 11): 1 ^l

- cebador reverso (10^M) (SEQID NO 12): 1 ^l

- dNTPs (2,5 mM): 4 |jl

- polimerasa (2,5 U/^l): 0,5 ^l

- tampon (10X): 5 ^l

-Agua desionizada: lo que falte hasta 50 ^l de volumen final Gel de agarosa para comprobacion de la PCR

Se corrio un gel pequeno al 0,8% de agarosa para visualizar el producto amplificado de PCR. Una vez corrido el gel durante 20 min a 135V se tino 20 minutos en bromuro de etidio.

Purificacion del producto de PCR por seleccion de banda en gel de agarosa.

Como la PCR no salio completamente limpia, la forma de purificar el fragmento de interes fue por seleccion de la banda correspondiente al inserto en un gel de agarosa (0,8%). El vector cortado tambien se cargo en el mismo gel para coger la banda correspondiente al vector linearizado de ahi.

El gel se corrio a 100V durante una hora y posteriormente se tino 30 minutos en bromuro de etidio. Las bandas correspondientes al vector linearizado (3,6 Kb) y al fragmento de interes (2,7 Kb) se cortaron del gel con una cuchilla y se conservaron en tubos a -20°C.

Purificacion de bandas del vector e inserto

Se empleo el kit para purificacion de los fragmentos de gel (vector e inserto): ILLUSTRA GFX PCR DNA AND GEL BAND PURIFICATION KIT (GE HEALTHCARE).

En el ultimo paso del protocolo a seguir del kit, se eluyo el vector en 15 ^l para que estuviera lo mas concentrado posible ya que este era su ultimo paso de purificacion antes de la ligacion. El inserto se eluyo en 19 ^l.

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Digestion extremos del inserto

Las enzimas que se emplearon para la digestion de los extremos del inserto fueron las mismas que para digerir el vector (Ndel y Xhol). El volumen total de la reaccion fueron 20 jl. El buffer que se usara sera el tampon H (igual que para cortar el vector) y las enzimas seran tambien Ndel y Xhol. En esta ocasion se tiene menos ADN que en el caso del vector y por eso se necesita mucha menos enzima de restriction. Para 20 jl de reaccion se emplearon:

-Tampon H (X10): 2 |jl -Ndel (Fermentas): 0,5 jl -Xhol (Roche): 0,5 jl

-ADN: 17 jl de los 19 jl recuperados tras la purification de la banda de gel.

La digestion se dejo 2 horas y media a 37°C.

Comprobacion de la cantidad de ADN del vector y del inserto antes de proceder con la reaccion de ligacion

Se purifico el inserto de interes tras la reaccion de digestion para liberarlo de las enzimas y tampon empleando el kit de GE HEALTHCARE de nuevo (protocolo de limpieza tras una reaccion enzimatica). Se preparo un gel de agarosa (0,8%) y se cargo un microlitro tanto de vector como de inserto para observar que cantidad de ADN se tenia y saber que proportion de vector y de inserto poner en la reaccion de ligacion. En la figura 10 se observa el gel donde se pude comprobar las bandas con el ADN tanto del vector como del inserto.

Ligacion

El volumen final seran 10 jl:

- Vector: 1 jl

- Inserto: 6 jl

- Ligasa: 1 jl

- Tampon de ligasa (5X): 2 jl

Se puso un control de la religacion, una reaccion de ligacion conteniendo solo vector (sin inserto) para ver si el vector era capaz de religarse consigo mismo. Para ello se puso la misma cantidad de vector, pero en vez de inserto, se adiciono agua desionizada en su lugar.

Una vez preparadas las reacciones, se incubaron a 16°C durante 16 horas.

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Transformacion (con celulas ya competentes, por choque termico)

Las celulas competentes son E. coli DH5a. Los 10 ^l de reaccion de ligacion se introducen en un tubo conteniendo 100 ^l de celulas ya competentes. El proceso se llevo a cabo tanto para la ligacion como para la religacion:

1) Se mantuvo en hielo el ADN + celulas durante 30 minutos.

3) Se dio un choque termico a 42°C durante exactamente 45 segundos.

4) Se retransfirieron los tubos a hielo durante 5 minutos.

5) Se adiciono 1 ml de LB y se dejo incubar a 37°C durante 1 hora y 30 minutos (sin adicionar antibioticos)

6) Se sembro en placa con antibiotico (ampicilina 100 ^g/ml) y se dejaron incubando a 37°C las placas hasta el dia siguiente. Las celulas DH5a transformadas son resistentes a ampicilina (100) por el vector que contienen.

Seleccion de los transformantes

Para seleccionar una colonia transformante del total de colonias que crecieron en la placa tras la transformacion en DH5a se hizo una PCR de comprobacion de colonias. Para ello se hizo uso de dos cebadores que amplificaran un fragmento que contuviese parte del vector y parte del inserto, para asegurarnos que dicha colonia poseia el vector conteniendo este el inserto y que no era resistente a ampicilina por contener en su interior un vector religado sin inserto. Los cebadores empleados fueron el T7 forward (amplifica parte del vector) y el UPO98intrev (amplifica dentro del inserto):

T7 fw: GTAATACGACTCACTATAGGGC (Tm=56) (SEQ ID NO 13)

UPO98intrev: TCTGGCTGACCGTGTAGG (Tm=58) (SEQ ID NO 14)

El fragmento esperado para amplificar era de 1,3 Kb. El programa disenado fue el siguiente:

1°. 5 minutos a 94°C para desnaturalizar las cadenas de ADN 2°. 35 ciclos:

- 94°C durante 30 segundos para desnaturalizar.

- 52°C durante 30 segundos.

- 72°C durante 5 minutos y medio para que se extienda la polimerasa. Este tiempo depende del tamano del fragmento que se deba copiar. En este caso, para amplificar 1,3 Kb, se configuro para 1’ 30’’.

3°. 5 minutos a 72°C

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Los tubos de reaction de PCR, para cada posible colonia transformante que se analizo por PCR se compuso de (para un volumen final de 25 jl):

- Cebador T7 forward (10jM): 0,5 jl

- Cebador UPO98intrv (10jM): 0,5 jl

- dNTP’s (10 mM): 0,5 jl

- Tampon (10X): 2,5 jl

- Mg2+ (25 mM): 1,5 jl

- Polimerasa: 0,2 jl

- Agua desionizada: 19,3 jl

El ADN molde se adiciono tocando la colonia que se deseaba comprobar e inoculando con esta el tubo de PCR. De esa misma colonia se toco e hizo una raya en una placa de agar LB con ampicilina (100 jl/mL), de forma que en caso de resultar positivo el transformante, se tuviera biomasa suficiente para inocular caldo de cultivo y poder crecer dicho transformante. En la PCR de candidatos se puso tambien un control positivo, es decir, un tubo que contema el ADN con el que se transformo a DH5a, y en el cual se debe ver amplification del fragmento de 1,3 Kb.

Tras finalizar la PCR, se cargaron 5 jl de cada tubo de reaccion (28 candidatos) en un gel de agarosa al 0,8% y se corrio durante 20 minutos a 135V. Posteriormente se tino con bromuro de etidio durante 20 minutos y se comprobo que candidatos teman el inserto de interes.

Se escogio dos candidatos (se denominaron candidato 1 y 6) y de la raya que previamente se habia sembrado de cada uno de ellos se puso un inoculo (medio LB suplementado con ampicilina a 100 jl/mL) y se llevo a cabo la extraction de ADN de ambos candidatos para poder realizar un analisis por visualization de bandas tras digestion con enzimas de restriction. Asi, se digirieron los dos candidatos con Ndel y Xhol (enzimas previamente utilizadas en el clonaje) y tambien, en una reaccion a parte, con BamHI (tiene una unica diana, por lo que la construction se lineariza. El corte con esta enzima permitio ver si se tenia un inserto o mas de uno dentro de un vector segun la longitud de la banda linearizada visualizada en gel).

Se empleo 10 jl de la extraccion de ADN de cada candidato, para un volumen final de 20 jl:

- Agua desionizada: 7 jl

- Tampon H (10X): 2 |jl

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- ADN: 10 ^l de la extraction de ADN (66 ng/ ^l y 46,4 ng/ ^l para los candidatos 1 y 6 respectivamente)

- Ndel y Xho/BamHII: 0,5 ^l de cada una

Para la digestion con Ndel y XhoI se incubo 2 horas y media a 37°C y para BamHI una hora.

Tras correr en gel y visualizar las bandas correspondientes se comprobo que ambos candidatos poseian el inserto, por lo que se escogio uno de ellos y se envio a secuenciar para asegurar que no habia ninguna mutation en la secuencia. Una vez se hubo comprobado esto, se congelo el subclon que contetia a cel98 a -80°C (se denomino pMPO1380).

Ejemplo 3: Production de Cel98 (SEQ ID NO 1)

Transformacion de la cepa de E.coli NCM631/piz227 con el subclon pMPO1380 Se preparo un inoculo de NCM631/piz227 (cepa que se quiere transformar) el dia previo a la transformacion y se hizo una extraccion de ADN del subclon pMPO1380 (subclon que contiene el ADN plasmidico que se quiere introducir en la NCM631/piz227). El inoculo de la NCM631/piz227 se hizo en medio LB suplementado con cloranfenicol (100 ^l/mL), ya que dicha cepa contiene resistencia a cloranfenicol en el plasmido piz227 (dicho plasmido permite que la bacteria E.coli NCM631 permanezca en niveles basales de expresion, reprimiendo la misma. Cuando es adicionado isopropil-p-D-1-tiogalactopiranosido o IPTG, se activa entonces la superproduccion en la bacteria).

Para la transformacion se diluyo el inoculo de NCM631/piz227 hasta 0,1 de densidad optica en medio LB (sin antibioticos). Se incubo a 37°C hasta DO (600 A) de 0,35 (fase exponencial temprana). Una vez llego a dicha densidad optica se repartio en alicuotas de 1 mL y se dejo enfriar en hielo 5 minutos. Se centrifugo 30 segundos y se elimino el sobrenadante. Se resuspendio suavemente en 75 ^l de LB frio y se mantuvo en hielo 5 minutos. Se anadio 75 ^l de TSS 2X y se mezclo suavemente. Se mantuvo posteriormente en hielo 5 minutos. Tras esto, se procedio a anadir el DNA (1-5 ^l, de forma que se anada a una concentration de 100 ng/^L). Se produjo entonces el choque termico, poniendo las muestras durante 45 segundos en un bano con agua a 42°C. Las muestras fueron retransferidas luego a hielo. Se anadio a cada muestra 1 mL de LB (sin antibioticos) y se incubaron a 37°C (1 hora). Tras pasar ese tiempo, se sembro cada muestra en placas con agar-LB (y antibiotico adecuado

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como forma de selection, ampicilina y cloranfenicol a 100 ^l/mL). Se dejo incubar las placas toda la noche a 37°C.

Las colonias transformantes se visualizaron al dia siguiente (aquellas capaces de crecer en la placa, puesto que tienen un gen de resistencia a cloranfenicol en el vector piz227 y ademas un gen de resistencia a ampicilina procedente del vector del clon pMPO1380 con el que se le ha transformado).

Induccion de la expresion de Cel98 en la cepa NCM631/piz227

Una colonia fue seleccionada y se inoculo con ella medio LB suplementado con ampicilina y cloranfenicol (100 ^l/mL para cada uno de ellos).

Al dia siguiente se diluyo el cultivo a 0,1 (600 A) de densidad optica (LB con antibioticos ampicilina y cloranfenicol a 100 ^l/mL para cada uno de ellos) y se dejo crecer a 37°C hasta que alcanzo 0,3 (600 A) unidades de densidad optica. En dicho momento, el matraz con el cultivo se puso a 26°C para atemperarse y reducir la velocidad de crecimiento del cultivo antes de anadir el inductor IPTG. Aproximadamente, a los 15 minutos, se llego a la densidad optica de 0,35 (600 A) y se adiciono IPTG (0,05 mM). Se dejo incubar durante 10-12 horas a 26°C.

Tras la incubation se recogio el sobrenadante producido centrifugando las celulas a 5000 rpm durante 15 minutos y filtrando el sobrenadante con filtros de 0,22^, aplicando vado.

El sobrenadante se distribuyo en alicuotas de 5 mL que se conservaron a -80°C.

Ejemplo 4: caracterizacion de la actividad enzimatica de Cel98 (SEQ ID NO 1)

Se procedio a caracterizar la actividad de la enzima Cel98 con caracteristicas de enzima celulasa. Para ello se empleo el ensayo de rojo congo (Haft et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2012 Apr; 94(1):223-9.). El rojo congo interacciona con la carboximetil celulosa dando un color rojo, de forma que la actividad enzimatica por degradation de la CMC se puede visualizar por la disminucion de la intensidad de dicho color rojo, mediante medidas de densidad optica a 580 nm.

En este ensayo se incubaron alicuotas de sobrenadante (diluido 10 veces) a las cuales se adiciono como sustrato carboximetil celulosa (CMC) a una concentration final de 0,05%. Las temperaturas de incubacion dependieron de la caracteristica que se deseara evaluar de la enzima. A cada tiempo deseado se tomo una muestra de 875 ^l de la reaction

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(sobrenadante con CMC) y se adiciono NaOH (a una concentration final de 40 mM) 8,8 ^l a cada tubo para parar la reaction enzimatica. Posteriormente se adiciono 25 ^l de rojo congo (a una concentracion final de 0,25 mg/mL) y por ultimo 100 ^l de NaCl (a concentracion final de 0,5 M). Se mezclo bien con todo el volumen invirtiendo el tubo y se incubo 30 minutos a temperatura ambiente. Se registraron las densidades opticas a 580 nm.

Ensayos de temperatura optima

Los ensayos fueron llevados a cabo tal y como se describe previamente, incubando en cada caso el sobrenadante con la CMC a la temperatura que se desea testar. De esta forma se ensayaron 300C-370C-450C-500C y 56°C.

Los resultados de estos ensayos se pueden observar en las figuras 4 y 5.

La figura 4 demuestra que el polipeptido de SEQ ID NO 1 es activo a temperaturas que van desde 30°C a 56°C. Tambien se puede observar en esta figura que la temperatura optima se encuentra entre los 45 y los 50°C. Aunque la enzima todavia mantiene actividad a los 56°C se observa que esta empieza a decrecer.

La figura 5 muestra la capacidad de degradation de Cel98 a 30°C, 37°C, 45°C y 50°C. Se puede observar que entre 37°C y 50°C la enzima es capaz de degradar practicamente el 100% de la CMC en 35 minutos (ver figuras 5 B a D). Aunque a 30°C no se consiguen resultados comparables a los de las otras temperaturas la degradacion de CMC a esta temperatura es tambien muy importante (ver figura 5A).

Termorresistencia

La termorresistencia del enzima fue calculada tras la incubation del sobrenadante a la temperatura de 30°C, 37°C, 40°C y 42°C durante diferentes tiempos (dias en su mayoria). Se tomaron muestras cada dia del sobrenadante incubado y se procedio a realizar un ensayo de rojo congo con cada muestra tomada, para observar la actividad enzimatica.

Los resultados se pueden observar en las figuras 6 A a D.

En la figura 6 se puede observar la degradacion de CMC llevada a cabo por el polipeptido de la invention despues de su incubacion a 30°C durante hasta 5 dias es comparable a la de la enzima control (t=0) (ver figura 6A). Tambien se observa claramente que la enzima deja de ser activa a partir del septimo dia de incubacion a 37°C (ver figura 6B). Al incubarse

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a 40°C se observa que la enzima va perdiendo actividad a los 3 dias y deja de ser activa por completo al 4 d^a (ver figura 6C). A 42°C la enzima deja de ser activa a partir de los dos dias (ver figura 6D).

pH optimo

Los ensayos para detector el pH optimo de actividad del enzima fueron llevados a cabo diluyendo en estos casos 1/10 el sobrenadante en diferentes tampones (desde pH 5 a pH 8). Se realizaron ensayos de rojo congo con cada tampon y se registraron los datos de DO a 580 nm.

pH 5: tampon citrato

pH 5,5-6: tampon 2-(N-morfolino) acido etanosulfonico (MES) pH 6,5-7: tampon piperazin-N,N'-bis(2-acido etanosulfonico) (PIPES) pH 7,5-8: tampon 2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (TRIZMA)

Los resultados se pueden observar en las figuras 7y 8.

La figura 7 demuestra que Cel98 trabaja mejor a un pH ligeramente acido (pH 5) y que es capaz de mantener la mayor parte de su actividad a pH en el rango de 5 a 7. A pH 7 Cel 98 mantiene aproximadamente el 50% de su actividad, mientras que entre 5.5 y 6.5 mantiene aproximadamente el 75% de su actividad.

La figura 8 muestra claramente el mejor efecto de degradation de CMC de la enzima pH 5. Cel98 trabaja tambien bien entre 5.5 y 7, preferiblemente entre 5.5 y 6.5. A los pH de 7.5 y 8 Cel98 claramente produce un efecto degradacion de la CMC muy inferior al de pH inferiores.

Ejemplo 5: production de bioetanol a partir biomasa celulosica pretratada mediante el uso de Cel98 o una composition celulolltica que comprende Cel98

Se utilizo paja de maiz como sustrato para la hidrolisis enzimatica. Pueden llevarse a cabo pre-tratamientos tales como hidrotermolisis controlada por pH, irradiation, tratamientos acidos-alcalinos, solventes organicos, pretratamientos de filtrado con amonio, oxidation humeda, etc. En este caso se llevo a cabo el pretratamiento con acido caliente diluido.

Se llevo a cabo una reaction de hidrolisis con un coctel enzimatico control durante 48 horas. Se partio de una concentration de polisacarido preferiblemente superior al 50% del peso seco del material que lo contiene (preferiblemente, pero no limitado a 25-150 mg/mL) y un

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coctel enzimatico control con un contenido de Cel98 que puede variar entre 0,001-1,0 mg/mL, 0,01-0,1 mg/mL o 0,05-0,5 mg/mL testada junto con otras enzimas en un coctel enzimatico (Bgl, Cbh1, Cbh2, Eg).

Esta fase de hidrolisis inicial se llevo a cabo en matraces de 2 L, en medio buffer fosfato- citrato (50 mM) a pH 5 durante 48 horas a 40°C (preferiblemente entre 37-42°C).

Se estudio de este modo el efecto de Cel 98 y se pudo apreciar que la adicion al coctel mmimo de la enzima Cel 98 analizada supuso un incremento en la capacidad de sacarificacion con respecto al control de un 15-30%.

La glucosa producida se determino empleando el kit "D-Glucose (GOPOD Format) Assay Kit” de Megazyme.

Claims (24)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un polipeptido aislado con actividad celulasa que comprende la secuencia SEQ ID NO1 o que posee un grado de homologia o identidad de al menos un 80% con la SEQ ID NO1 o que esta codificado por un polinucleotido que hibrida bajo condiciones de baja, media, media-alta, alta o muy alta astringencia con la secuencia SEQ ID NO 6 que codifica el polipeptido maduro.
2. 2. Un polipeptido de acuerdo con la reivindicacion 1 que posee un grado de homologia o identidad de al menos un 85%, preferiblemente de al menos un 90%, mas preferiblemente de al menos un 95% y aun mas preferiblemente de al menos un 99%.
3. 3. Un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es activo a temperaturas de entre 30 y 65°C.
4. 4. Un fragmento funcional o una variante de un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
5. 5. Un fragmento de acuerdo con la reivindicacion 4 que comprende al menos los aminoacidos 41 a 378 de la SEQ ID NO 1.
6. 6. Un fragmento de acuerdo con la reivindicacion 4 o 5 seleccionado entre SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 o SEQ ID NO 5.
7. 7. Una secuencia polinucleotidica que codifica un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un fragmento o una variante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
8. 8. Un secuencia polinucleotidica de acuerdo con la reivindicacion 7 cuya se secuencia se selecciona de entre SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9 o SEQ ID NO 10.
9. 9. Una construccion genica que comprende una secuencia polinucleotidica de acuerdo con la reivindicacion 7 u 8 operativamente unida a una o mas secuencias de control que dirigen la expresion de polipeptidos en sistemas de expresion.
10. 10. Un vector de expresion que comprende una construccion genica de acuerdo con la reivindicacion 9.

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11. 11. Una celula huesped que comprende una construction genica de acuerdo con la reivindicacion 9 o un vector de acuerdo con la reivindicacion 10 y que expresa el polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un fragmento o una variante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-6.
12. 12. Una celula huesped de acuerdo con la reivindicacion 11 donde la celula es un organismo unicelular procariota o eucariota.
13. 13. Una celula huesped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12 donde la celula procariota se selecciona del grupo de bacterias de los generos Bacillus, Clostridium, Esherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Streptomyces, Thermoanaerobacterium o Zymomonas y la celula eucariota se selecciona del grupo de hongos de las especies Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis sufrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cereales, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Saccharomyces calsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norvensis, Saccharomyces oviformis, Thielavia terrestres, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reseii, Trichoderma viride o Yarrowia lipolytica..
14. 14. Un metodo para producir un polipeptido con actividad celulolrtica que comprende:

    a) Cultivar una celula huesped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en las condiciones necesarias para la production del polipeptido,

    b) Recuperar el polipeptido producido.
15. 15. Una composition celulolrtica que comprende al menos un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y/o al menos un fragmento o una variante de

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    acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 y, opcionalmente, al menos un elemento que favorezca o facilite la degradation de biomasa.
16. 16. Una composition de acuerdo con la reivindicacion 15 que comprende al menos un elemento adicional que se selecciona de entre una o mas endoglucanasas, exoglucanasas, celebiohidrolasas, beta-glucosidasas, glicosil-hidrolasas, hemicelulasas, xylanasas, enzimas ligninolrticas o mezclas de las mismas.
17. 17. Uso del polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, del fragmento o de la variante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 o de la composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16 para la degradacion de biomasa.
18. 18. Uso de acuerdo con la reivindicacion 17 donde la degradacion de biomasa se lleva a cabo en un procedimiento para la production de bioproductos.
19. 19. Un procedimiento para producir azucares fermentables que comprende incubar biomasa con el polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, con el fragmento o una variante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 o con la composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16.
20. 20. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 19 que comprende recuperar los azucares obtenidos despues de la incubacion con el polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, con el fragmento o una variante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 o con la composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16.
21. 21. Un procedimiento para producir un bioproducto a partir de biomasa que comprende:

    a) producir azucares fermentables de acuerdo con el procedimiento de la reivindicacion 19,

    b) llevar a cabo una transformation quimica de los azucares obtenidos en la etapa a) para producir al menos un bioproducto,

    c) Recuperar el al menos un bioproducto obtenido en la etapa b).
22. 22. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 21 donde la transformacion de los azucares comprende la fermentation con al menos un microorganismo fermentante.

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23. 23. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 22 donde el al menos un microorganismo fermentante se selecciona entre bacterias como Bacillus thermoglucosidaisus, Clostridium butyricum, Corynebacterium glutamicum, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Geobacillus themoglucosidasius, Klebsiella oxytoca, Lactobacillus sp. Leunoscoc mesenteroides, Thermoanaerobacter BG1L1, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoanaerobacter mathranii, Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum, Zymobacter palmae, Zymomonas mobilis u hongos como Candida arabinofermentans, Candida boidinii, Candida diddensis, Candida fermentans, Chrysosporium lucknowense, Candida pastoris, Candida shehatae, Candida sonorensis, Candida tropicalis, Hansenula anomala, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bulderi, Saccharomyces barnetti, Saccharomyces exiguus, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces uvarum o Schizosaccharomyces pombe o una combination de alguno de estos microorganismos.
24. 24. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23 donde el bioproducto obtenido se selecciona entre alcoholes como etanol, metanol, butanol, hexanol, octanol, decanol, dodecanol, 1,3-butanediol(1,3-diol), 1-alcohol; acidos organicos como acido dtrico, acido acetico, acido itaconico, acido lactico, acido glutamico, acido suctinico, beta-cetoacido, beta-cetoalcohol, beta-hidroxiacido; cetonas como la acetona; gases como hidrogeno o dioxido de carbono; hidrocarburos como alcanos, alquenos o alquinos; sustancias nitrogenadas como aminas, amida, nitrocompuestos o nitrilos; haluros; aminoacidos como acido glutamico; antibioticos como penicilina o tetraciclinas; vitamina como riboflavina, vitamina B12 o betacaroteno; acidos grasos como acido dodecanoico, acidos grasos trans-A2 o acido palmrtico; y otros productos como etileno, glicerol, 1,3- propano-diol, betalactano, cefalosporinas, acidos grasos trans o furano.