CN103562384A - 具有内切葡聚糖酶活性的多肽及其编码多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽、催化域、纤维素结合域和编码所述多肽、催化域或纤维素结合域的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于制备和使用所述多肽、差异或纤维素结合域的方法。

Description

具有内切葡聚糖酶活性的多肽及其编码多核苷酸

对于在联邦资助的研究和开发下完成的发明的权利的声明

该发明是在由能源部授予的合作协议(Cooperative Agreement)DE-FC36-08GO18080下以政府支持完成的。政府在该发明中具有一定权利。

涉及序列表

本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。

发明背景

技术领域

本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的多肽，催化域和纤维素结合域，和编码所述多肽、催化域和纤维素结合域的多核苷酸。本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽、催化域和纤维素结合域的方法。

背景技术

纤维素是单糖葡萄糖通过β-1,4-键共价连接的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其暴露于纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序地释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。

将含木素纤维素原料(lignocellulosic feedstock)转化为乙醇具有以下优势：大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖容易地由酵母发酵成乙醇。

本发明提供了具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸。编码具有内切葡聚糖酶活性的P23YSZ GH7多肽的Talaromyces leycettanus基因的推导的氨基酸序列与来自Neosartorya fischeri的具有内切葡聚糖酶活性的预测的GH7家族蛋白(登录号：SWISSPROT:A1DKY9)的推导的氨基酸序列具有74.2%同一性(排除缺口)。

发明内容

本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；

(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补链；

(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；

(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽在一个或几个位置包含取代、缺失和/或插入的变体；和

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有内切葡聚糖酶活性的片段。

本发明亦涉及分离的多肽，其包含催化域，所述催化域选自下组：

(a)催化域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸19至397具有至少80%序列同一性；

(b)催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸55至1191，或(ii)(i)的全长互补链；

(c)催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的催化域具有至少80%序列同一性；

(d)SEQ ID NO:2的氨基酸19至397在一个或几个位置包含取代、缺失和/或插入的变体；和

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的催化域具有内切葡聚糖酶活性的片段。

本发明亦涉及分离的多肽，其包含纤维素结合域，所述纤维素结合域可操作地连接于催化域，其中所述纤维素结合域选自下组：

(a)纤维素结合域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸444至477具有至少80%序列同一性；

(b)纤维素结合域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸1333至1431，或(ii)(i)的全长互补链；

(c)纤维素结合域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸1333至1431具有至少80%序列同一性；

(d)SEQ ID NO:2的氨基酸444至477在一个或几个位置包含取代、缺失和/或插入的变体；和

(e)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)具有纤维素结合活性的片段。

本发明亦涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞；和产生所述多肽的方法。

本发明亦涉及降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下用酶组合物处理纤维素材料。在一个方面，所述方法还包括回收经降解或转化的纤维素材料。

本发明亦涉及产生发酵产物的方法，其包括：(a)在本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。

本发明亦涉及发酵纤维素材料的方法，其包括用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料在本发明具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化。在一个方面，所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一个方面，所述方法还包括从发酵回收发酵产物。

本发明亦涉及编码信号肽的多核苷酸，所述信号肽包含(comprise)或组成为(consist of)SEQ ID NO:2的氨基酸1至18，其可操作地连接于编码蛋白的基因，其中所述基因对于编码信号肽的多核苷酸是外源的；包含所述多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；和产生蛋白的方法。

定义

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

结合域：术语“纤维素结合域”意指介导酶对纤维素底物的无定形区的结合的酶的区域。纤维素结合域(CBD)通常见于内切葡聚糖酶的N末端或C末端。在一个实施方案中，所述CBD包含SEQ ID NO:2的氨基酸444至477。

催化域：术语“催化域”意指含有酶的催化机构(catalytic machinery)的酶的区域。在一个实施方案中，所述催化域包含SEQ ID NO:2的氨基酸19至397。

cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工包括剪接，然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对编码本发明的成熟多肽的多核苷酸表达是必需的核酸序列。各个调控序列对于编码所述成熟多肽的多核苷酸可以是天然的(即，来自同一基因)或外源的(即，来自不同基因)，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的调控序列可操作地连接。

片段：术语“片段”意指从成熟多肽或催化域域的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如几个)氨基酸的多肽或催化域域；其中所述片段具有内切葡聚糖酶活性。在一个方面，所述片段含有至少379个氨基酸残基(例如SEQ IDNO:2的氨基酸19至397)。

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在65℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞。

分离的：术语“分离的”意指以不在自然界出现的形式或环境存在的物质。分离的物质的非限定性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)任何至少部分地从一种或多种或全部与其天然结合的天然存在的成分移出的物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)任何相对于见于自然界的该物质经人工修饰的物质；或(4)任何通过相对于与其自然结合的其他组分增加该物质的量(例如，编码该物质的基因的多拷贝；比与编码该物质的基因自然结合的启动子更强的启动子的使用)而修饰的物质。分离的物质可在发酵液样品中存在。

低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在50℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面，SignalP(Nielsen等,1997,Protein Engineering10:1-6)预测SEQ IDNO:2的氨基酸1至18是信号肽，据此，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸19至477。在本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有内切葡聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，SignalP(Nielsen等,1997，见上)预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至54编码信号肽，据此，成熟多肽编码序列(包含终止密码子)是SEQ ID NO:1的核苷酸55至1434。

中等严格条件：术语“中等严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在55℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

中等-高严格条件：术语“中等-高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在60℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其经修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包含一个或多个调控序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。

序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选5.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的参数为缺口罚分(gap penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见上文)，优选5.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(例如几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有内切葡聚糖酶活性活性的片段。在一个方面，所述亚序列含有至少1377个核苷酸(例如SEQ ID NO:1的核苷酸55至1431)。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如几个)位置包含改变，即取代、插入和/或缺失的具有内切葡聚糖酶活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指在邻接并紧接着占据某位置的氨基酸之后添加氨基酸。

非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在70℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

非常低严格条件：术语“中等严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的长探针，在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在45℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

纤维素分解活性：术语“纤维素分解活性”意指水解纤维素材料的生物活性。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等,2006,Outlook for cellulase improvement:Screening andselection strategies,Biotechnology Advances24:452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman1号滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman1号滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由国际纯粹与应用化学联合会(International Union of Pureand Applied Chemistry(IUPAC))(Ghose,1987,Measurement of cellulaseactivities,Pure Appl.Chem.59:257-68)确立的。

就本发明而言，纤维素分解活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-20mg纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素在50℃-65℃进行3-7日，与未添加纤维素分解蛋白的对照水解相比较。通常条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸钠pH5，1mM MnSO₄，50-65℃，72小时，通过AMINEX

HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。就本发明而言，内切葡聚糖酶活性通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006,Biotechnology Advances24:452-481)确定的还原端增加来确定。可根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40℃使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。实施例8中所述的测定可用于测量内切葡聚糖酶活性。

本发明的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的内切葡聚糖酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，和至少100%。

纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖，或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystalline cellulosedegradation:New insight into the function of cellobiohydrolases,Trends inBiotechnology15:160-167;Teeri等,1998,Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose?,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。就本发明而言，根据van Tilbeurgh等,1982,FEBS Letters149:152-156；和vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters187:283-288描述的方法在pH5，40℃使用荧光性二糖衍生物4-甲基伞形基-β-D-乳糖苷(4-methylumbelliferyl-β-D-lactoside)确定纤维二糖水解酶活性。

β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucoside glucohydrolase)(E.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，β-葡糖苷酶根据Venturi等,2002,Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomiumthermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemicalproperties,J.Basic Microbiol.42:55-66所述的基本方法确定。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在40℃,pH5，在含有0.01%TWEEN

20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚。

纤维素分解增强活性：术语“纤维素分解增强活性”意指由GH61多肽催化、增强具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的生物活性。就本发明而言，通过测量来自由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS中纤维素，其中总蛋白包含50-99.5%w/w的纤维素分解蛋白，及0.5-50%w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在50-65℃历时1-7日，与用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中纤维素)所进行的对照水解相比。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白质量的3%的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的CELLUCLAST

1.5L(Novozymes A/S,

Denmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源。

具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，更优选至少1.05倍，更优选至少1.10倍，更优选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，和最优选至少20倍。

家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”在本文中定义为根据Henrissat,1991,A classification of glycosyl hydrolases basedon amino-acid sequence similarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat和Bairoch,1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。

木聚糖降解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronyl esterase))。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard,Recent progress in theassays of xylanolytic enzymes,2006,Journal of the Science of Food和Agriculture86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006,Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune,FEBS Letters580(19):4597-4601；Herrmann等,1997,The beta-D-xylosidase of Trichodermareesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase,Biochemical Journal321:375-381。

总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey,等,1992,Interlaboratorytesting of methods for assay of xylanase activity,Journal of Biotechnology23(3):257-270中所述。

就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加来确定的：1ml反应液，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠，pH5，50℃，24小时，如Lever,1972,A new reactionfor colorimetric determination of carbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。

木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性使用桦木木聚糖作为底物确定的。一个单位的木聚糖酶定义为在50℃，pH5，在水解的起始阶段从在含有0.01%0.01%TWEEN20的50mM乙酸钠中作为底物的2g每升的桦木木聚糖每分钟产生1.0微摩尔的还原糖(如Lever,1972,A new reaction for colorimetricdetermination of carbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述作为葡萄糖当量测量)。

β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃，pH5在含有0.01%TWEEN20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚。

乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01%TWEEN^TM20的50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH5,25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。

阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在“天然”底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本发明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH5，25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。

α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase)(EC3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据de Vries,1998,J.Bacteriol.180:243-249确定的。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH5，40℃每分钟释放1微摩尔葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化对α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μl中的每ml的100mM乙酸钠pH5中5mg的中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow,Ireland)在40℃进行30分钟，接着通过AMINEX

HPX-87H柱层析(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析来确定的。

纤维素材料：术语“纤维素材料”可为包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。

纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸以及纸浆和造纸厂残余物(参见，例如，Wiselogel等,1995,于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编),pp.105-118,Taylor&Francis,Washington D.C.;Wyman,1994,Bioresource Technology50:3-16;Lynd,1990,Applied Biochemistry and Biotechnology24/25:695-719;Mosier等,1999,RecentProgress in Bioconversion of Lignocellulosics,于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper主编,Volume65,pp.23-40,Springer-Verlag,New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，纤维素材料是木素纤维素。

在一个方面，纤维素材料是草本材料。在另一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是林业残余物。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。

在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一个方面，纤维素材料是芒草属。另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。

在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cotton linter)。在另一个方面，纤维素材料是无定形的、磷酸处理的纤维素。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。

纤维素材料可以按原样(as is)使用或进行预处理，使用本领域已知的常规方法，如本文所述。在一个优选的方面，纤维素材料被预处理。

预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”意指从玉米秸秆通过用热和稀硫酸处理获得的纤维素材料。

含木聚糖材料：术语“含木聚糖材料”意指任何包含含有β-(1-4)连接的木糖残基骨架的植物细胞壁多糖的材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-吡喃木糖骨架的杂聚物，其由短的糖链分支。它们包含D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚，L-阿拉伯糖和/或多种包含D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖和D-葡萄糖的寡糖。木聚糖类型的多糖可分为均木聚糖(homoxylan)和杂木聚糖(heteroxylan)，后者包括葡糖醛酸木聚糖，(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和复合杂木聚糖。参见，例如Ebringerova等,2005,Adv.Polym.Sci.186:1-67。

在本发明的方法中，可使用任何含有木聚糖的材料。在一个优选的方面，所述含木聚糖材料是木素纤维素。

发明详述

在一个实施方案中，本发明涉及分离的多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性，其具有内切葡聚糖酶活性。在一个方面，所述多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不超过10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。

本发明的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的内切葡聚糖酶的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，和至少100%。

本发明的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位变体；或为其具有内切葡聚糖酶活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸19至477。

在另一个方面，本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补链(Sambrook等,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York)。

SEQ ID NO:1的多核苷酸或其亚序列，以及SEQ ID NO:2的多肽或其片段可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少15，例如至少25，至少35，或至少70个核苷酸。优选地，所述核酸探针是至少100个核苷酸的长度，例如，至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，至少500个核苷酸，至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸，或至少900个核苷酸的长度。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。

可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQID NO:1或其亚序列杂交的克隆或DNA，将所述载体材料用在Sounthern印迹中。

就本发明而言，杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于下述：(i)SEQ ID NO:1，或(ii)SEQID NO:1的成熟多肽编码序列，(iii)其全长互补链，或(iv)它们的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)或其他任何本领域中已知的检测手段检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在一个方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸1至1434、核苷酸55至1434或核苷酸55至1191。在另一个方面，所述核酸探针是编码SEQ IDNO:2的多肽，其成熟多肽，或它们的片段的多核苷酸。在另一个方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:1。

在另一个方面，本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。

在另一个方面，本发明涉及SEQ ID NO:2的成熟多肽在一个或多个(例如几个)位置包含取代、缺失和/或插入的变体。在一个实施方案中，导入SEQID NO:2的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的数量是不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9。氨基酸改变可为性质上较不重要的(of a minornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列段(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

或者，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改善多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且就内切葡聚糖酶测试所得突变分子以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等,1992,Science255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份也能够从与相关多肽的同一性分析来推断。

可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57;Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156;WO 95/17413;或者WO 95/22625所公开的那些，进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等,1991,Biochemistry30:10832-10837;美国专利号5,223,409;WO 92/06204)和区域定向诱变(region-directedmutagenesis)(Derbyshire等,1986,Gene46:145;等,1988,DNA7:127)。

诱变/改组方法可与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的经克隆、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology17:893-896)。编码活性多肽的经诱变的DNA分子可自宿主细胞回收并使用本领域标准方法迅速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

所述多肽可为杂合多肽，其中一个多肽的区域融合于另一个多肽的区域的N端或C端。

所述多肽可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽融合于本发明的多肽的N端或C端。通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们符合读框(in frame)，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建，其中融合物在翻译后产生(Cooper等,1993,EMBO J.12:2575-2583;Dawson等,1994,Science266:776-779)。

融合多肽还可以在两个多肽之间包含切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，释放所述两个多肽。切割位点的实例包括，但不限于，公开于Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等,1995,Biotechnology13:498-503;和Contreras等,1991,Biotechnology9:378-381；Eaton等,1986,Biochem.25:505-512)；Collins-Racie等,1995,Biotechnology13:982-987；Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World4:35-48中的位点。

具有内切葡聚糖酶活性的多肽的来源

本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽可以获得自真菌。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思应为由多核苷酸编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的菌株产生。在一个方面，从给定来源获得的多肽是胞外分泌的。

所述多肽可为真菌多肽。例如，所述多肽可为丝状真菌多肽如踝节菌属(Talaromyces)多肽。

在另一个方面，所述多肽是踝节菌属多肽，例如获得自Talaromycesleycettanus的多肽，例如获得自菌株CBS398.68的多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。

这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)。

可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接获得自自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)的DNA样品鉴定和获得所述多肽。用于直接从天然生境(habitat)分离微生物和DNA的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来得到编码所述多肽的多核苷酸。一旦用探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以使用本领域普通技术人员已知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

催化域

在一个实施方案中，本发明亦涉及催化域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸19至397具有至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。在一个方面，所述催化域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸19至397相差不超过10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。

所述催化域优选包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸19至397或其等位变体；或为其具有内切葡聚糖酶活性的片段。

在另一个实施方案中，本发明亦涉及催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件，或非常高严格条件(如上所定义)下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸55至1191，或(ii)(i)的全长互补链(Sambrook等,1989,见上文)。

在另一个实施方案中，本发明亦涉及催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸55至1191具有至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。

编码催化域的多核苷酸优选包含或组成为SEQ ID NO:1的核苷酸55至1191。

在另一个实施方案中，本发明亦涉及SEQ ID NO:2的氨基酸19至397在一个或多个(例如几个)位置包含取代、缺失和/或插入的催化域变体。在一个方面，导入SEQ ID NO:2的氨基酸19至397的氨基酸取代、缺失和/或插入的数量是不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9。

根据本发明的催化域可进一步包含或融合于纤维素结合域。

结合域

在一个实施方案中，本发明亦涉及纤维素结合域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸444至477具有至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。在一个方面，所述纤维素结合域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸444至477相差不超过10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。

所述纤维素结合域优选包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸444至477或其等位变体；或为其具有纤维素结合活性的片段。

在另一个实施方案中，本发明亦涉及纤维素结合域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件，或非常高严格条件(如上所定义)下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸1333至1431；或(ii)(i)的全长互补链(Sambrook等,1989,见上文)。

在另一个实施方案中，本发明亦涉及纤维素结合域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸1333至1431具有至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。

编码纤维素结合域的多核苷酸优选包含或组成为SEQ ID NO:1的核苷酸1333至1431。

在另一个实施方案中，本发明亦涉及SEQ ID NO:2的氨基酸444至477在一个或多个(例如几个)位置包含取代、缺失和/或插入的纤维素结合域变体。在一个方面，导入SEQ ID NO:2的氨基酸444至477的氨基酸取代、缺失和/或插入的数量是不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9。

在一个实施方案中，根据本发明的结合域可操作地连接于催化域，例如通过接头区。在一个实施方案中，所述接头区包含SEQ ID NO:2的398至443。

可操作地连接于纤维素结合域的催化域可来自水解酶、异构酶、连接酶、裂合酶、氧还酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶(chitinase)、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。编码催化域的多核苷酸可获得自任何原核、真核或其它来源。

多核苷酸

本发明亦涉及编码如本文中所述的本发明的内切葡聚糖酶多肽、催化域或纤维素结合域的分离的多核苷酸。

用于分离或克隆多核苷酸的技术在本领域中是已知的，并包括包括从基因组DNA或cDNA分离，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如，Innis等,1990,PCR:A Guideto Methods and Application,Academic Press,New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription；LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。可以从踝节菌属的菌株，或相关生物体克隆所述多核苷酸，因此，例如可为所述多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。

修饰编码本发明多肽的多核苷酸对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。可以在作为SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列(例如其亚序列)呈现的多核苷酸的基础上构建变体，和/或通过引入如下核苷酸取代：所述取代不导致多肽氨基酸序列的改变，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者通过导入可产生不同的氨基酸序列的核苷酸取代来构建变体。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等,1991,ProteinExpression and Purification2:95-107。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作所述多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

调控序列可为启动子，其由用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的宿主细胞所识别的多核苷酸。启动子含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等,1988,Gene69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the National Academy ofSciences USA75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25)。另外的启动子在″Useful proteins from recombinant bacteria″于Gilbert等,1980,Scientific American,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上文中描述。串联启动子的实例公开于WO 99/43835。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自在曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast8:423-488描述。

调控序列也可以是转录终止子，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。在本发明中，可使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。

对于细菌宿主细胞优选的终止子从如下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。

调控序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定化区，其增加所述基因的表达。

合适的mRNA稳定化区的实例从如下的基因获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等,1995,Journal ofBacteriology177:3465-3471)。

调控序列还可以是合适的前导序列，其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连的信号肽，并指导所述多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews57:109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。

调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码序列。

当信号肽和前肽序列二者均存在时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽的N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。

同样理想的是添加调节序列，其相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸，其可操作地连接于一个或多个调控序列，例如启动子和转录和翻译终止信号。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述多核苷酸的核酸构建体或多核苷酸来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的调控序列可操作地连接以供表达。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

所述载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因。

所述载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可为任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可为非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸可操作地连接于一个或多个指导本发明多肽的产生的调控序列。将包含多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，感受态细胞转化(参见，例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)。

真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,Passmore,和Davenport编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。

酵母宿主细胞可假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238 023，Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474，和Christensen等,1988,Bio/Technology6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume194,pp182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1920。

产生方法

本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是踝节菌属的细胞。在一个更优选的方面，所述细胞是Talaromyces leycettanus细胞。在一个最优选的方面，所述细胞是Talaromyces leycettanus CBS398.68。

本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

所述宿主细胞使用本领域已知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，或实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述具有内切葡聚糖酶活性的多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzyme assay)可用于确定多肽的活性。

多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,Janson和Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。

在另一个方面，不回收多肽，而是使用表达所述多肽的本发明的宿主细胞作为所述多肽的来源。

植物

本发明还涉及分离的植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含本发明的多核苷酸，从而以可回收的量表达和产生所述多肽或域。多肽或域可从植物或植物部分回收。或者，可以按原样(as such)将含有该多肽或域的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。

表达多肽或域的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码多肽或域的一个或多个表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达构建体便利地是包含编码多肽或域的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定植物细胞有用的选择性标记，在所述植物细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。

调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽或域而确定。例如，编码多肽或域的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分如种子或叶。调节序列由例如Tague等,1988,Plant Physiology86:506所述。

对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1或稻肌动蛋白1启动子(Franck等,1980,Cell21:285-294,Christensen等,1992,Plant Mo.Biol.18:675-689；Zhang等,1991,Plant Cell3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等,1994,Plant Mol.Biol.24:863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等,1998,Plant Cell Physiol.39:885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等,1998,J.Plant Physiol.152:708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等,1998,Plant Cell Physiol.39:935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等,1993,PlantPhysiol.102:991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adeninemethyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Mol.Biol.26:85-93)，来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995,Mol.Gen.Genet.248:668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等,1993,Plant Mol.Biol.22:573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现多肽或域在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码多肽或域的多核苷酸之间。例如Xu等,1993,见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等,1990,Science244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology8:535；Shimamoto等,1989,Nature338:274)。

根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(gene transfer)，是一种产生转基因双子叶植物(其综述，参见Hooykas和Schilperoort,1992,PlantMol.Biol.19:15-38)，和用于转化单子叶植物的方法，虽然对于这些植物可使用其他的转化方法。一种产生转基因单子叶植物的方法是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou,1992,Plant J.2:275-281；Shimamoto,1994,Curr.Opin.Biotechnol.5:158-162；Vasil等,1992,Bio/Technology10:667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等,1993,PlantMol.Biol.21:415-428所描述的。其它转化方法包括描述于美国专利号6,395,966和7,151,204中的那些(两者均通过提述以其整体并入本文)。

转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有并入的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

除了直接用本发明的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可通过将具有构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。举例而言，可将编码多肽或域的构建体通过杂交而引入特定植物品种，而根本无需直接转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖从依照本发明经转化的细胞直接再生的植物，还包括此类植物的后代(progeny)。如用于本文，后代可指依照本发明制备的亲本植物任何世代的后裔(offspring)。此种后代可包含依据本发明制备的DNA构建体。杂交导致转基因通过将起始种系供体植物种系交叉授粉而引入植物种系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204。

植物通过回交转化方法生成。举例而言，该植物包括称作回交转化的基因型、种系、近交体(inbred)或杂交体(hybrid)的植物。

可使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景基因渗入(introgression)至另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可用于避免由表型变异导致的错误。进一步，遗传标记可在特定杂交的个体后代中提供有关良种种质相对程度的数据。举例而言，当原本不(otherwise not)具有非农艺学所需的遗传背景但具有所需性状的植物与良种亲本杂交时，可使用遗传标记来选择不仅具有目标性状，还具有相对较大比例所需种质的后代。以此方式，使一种或多种性状基因渗入特定遗传背景所需的世代数得到最小化。

本发明亦涉及产生本发明的多肽或域的方法，其包括：(a)在有助于产生所述多肽或域的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述植物或植物细胞包含编码多肽或域的多核苷酸；和(b)回收所述多肽或域。

组合物

本发明还涉及包含本发明多肽的酶组合物。优选地，所述组合物富集此种多肽。术语“富集”表明组合物的内切葡聚糖酶活性，例如，以至少1.1的富集因数(enrichment factor)增加。

所述组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶成分，例如，单成分组合物。或者，所述组合物可以包含多种酶活性，如一种或多种(几种)选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、GH61多肽、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。优选地，所述酶组合物包含根据本发明的内切葡聚糖酶，和至少一种纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在一个最优选实施方案中，所述组合物包含根据本发明的内切葡聚糖酶，和至少一种纤维二糖水解酶，和β-葡糖苷酶，和具有纤维素分解增强活性的GH61家族多肽。

可以依照本领域内已知的方法制备多肽组合物，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本领域内已知方法使包含于所述组合物中的多肽稳定化。

下面给出了本发明的多肽组合物的优选用途。本发明的多肽组合物的剂量和使用所述组合物的其它条件可基于本领域中已知的方法来确定。

处理纤维素材料的方法

本发明还涉及降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下，用酶组合物处理纤维素材料。在一个优选的方面，所述工艺还包括回收已降解或转化的纤维素材料。

本发明还涉及产生发酵产物的方法，其包括：(a)在本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下，用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。

本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种(几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是在本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化的。在一个优选的方面，纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一个优选地方面，所述方法还包括从发酵回收发酵产物。

本发明的方法可以用于将纤维素材料糖化成可发酵糖，并且将可发酵糖转化成很多有用的物质，例如燃料、饮用乙醇和/或发酵产物(例如酸、醇、酮、气体等)。从纤维素材料产生期望的发酵产物通常涉及预处理、酶水解(糖化)和发酵。

根据本发明的纤维素材料的处理可以使用本领域的常规方法完成。此外，本发明的方法能使用经配置以依照发明操作的任何常规生物质加工设备进行。

水解(糖化)和发酵，分别或同时，包括但不限于，分离的水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、分离的水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，和直接微生物转化(DMC)。SHF使用分离的处理步骤以首先将纤维素材料酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖，纤维二糖，纤维三糖和戊糖，然后将可发酵糖发酵成为乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶水解和糖变为乙醇的发酵在一个步骤中组合(Philippidis,G.P.,1996,Cellulose bioconversion technology,于Handbook onBioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan和Himmel,1999,Enzymes,energy and the environment:A strategic perspective on the U.S.Department of Energy’s research and development activities for bioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同时糖化和水解步骤之外，还涉及单独的水解步骤，所述步骤可以在同一个反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度，即，高温酶法糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个(几个)步骤中组合了所有三个过程(酶产生、水解和发酵)，其中使用相同的生物体产生用于将纤维素材料转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶(Lynd等,2002,Microbial cellulose utilization:Fundamentals and biotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)。在本文可以理解的是，任何本领域中已知的方法，包括预处理、酶水解(糖化)、发酵，或它们的组合，可用于实施本发明的方法。

常规设备包括补料批式搅拌反应器、批式搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器和/或连续活塞流柱式反应器(Corazza等,2003,Optimal controlin fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis,Acta Scientiarum.Technology25:33-38;Gusakov和Sinitsyn,1985,Kinetics of the enzymatic hydrolysis ofcellulose:1.A mathematical model for a batch reactor process,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反应器(Ryu和Lee,1983,Bioconversion of wastecellulose by using an attrition bioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov等,1996,Enhancement ofenzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensivestirring induced by electromagnetic field,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反应器类型包括：流化床、升流层(upflow blanket)、固定化和用于水解和/或发酵的挤出机型的反应器。

预处理。在本发明的方法的实施中，可以使用本领域已知的任何预处理过程破坏植物细胞壁的纤维素材料组分(Chandra等,2007,Substratepretreatment:The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics?Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93;Galbe和Zacchi,2007,Pretreatment oflignocellulosic materials for efficient bioethanol production,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65;Hendriks和Zeeman,2009,Pretreatments to enhance thedigestibility of lignocellulosic biomass,Bioresource Technol.100:10-18;Mosier等,2005,Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosicbiomass,Bioresource Technol.96:673-686;Taherzadeh和Karimi,2008,Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production:A review,Int.J.of Mol.Sci.9:1621-1651;Yang和Wyman,2008,Pretreatment:the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol,Biofuels Bioproducts andBiorefining-Biofpr.2:26-40)。

纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、预浸泡、润湿、洗涤或调理(conditioning)。

常规的预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理和生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO₂、超临界H₂O、臭氧和γ辐射预处理。

可以在水解和/或发酵之前预处理纤维素材料。预处理优选在水解前进行。或者，预处理可以与酶水解同时进行以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身使一些生物质转化成可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。

蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素和纤维素，使酶可接触纤维素和其它级分，例如，半纤维素。将纤维素材料经过或通过反应容器，其中注入蒸汽以增加温度至需要的温度和压力，并且在其中保持期望的反应时间。蒸汽预处理优选在140-250℃，更优选在160-200℃，和最优选在170-190℃进行，其中最优的温度范围依赖于任何化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间优选1-15分钟，更优选3-12分钟，和最优选4-10分钟，其中最优的停留时间依赖于温度范围和任何化学催化剂的添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，使纤维素材料在预处理过程中通常仅仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的物质的爆炸放料(explosive discharge)组合，这称为蒸汽爆炸，即，快速闪变至大气压和物质的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray,1996,BioresourceTechnology855:1-33;Galbe和Zacchi,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628;美国专利申请No.20020164730)。在蒸汽预处理过程中，切割半纤维素乙酰基团，并且得到的酸自催化半纤维素部分水解成为单糖和寡糖。去除木质素仅至有限的程度。

通常在蒸汽预处理之前添加催化剂如H₂SO₄或SO₂(通常0.3至3%w/w)，其减少时间和温度，增加回收，并改善酶水解(Ballesteros等,2006,Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508;Varga等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523;Sassner等,2006,Enzyme Microb.Technol.39:756-762)。

化学预处理：术语“化学处理”指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学处理。合适的化学预处理工艺的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子性液体和有机溶剂预处理。

在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(通常是H₂SO₄)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray,1996,supra;Schell等,2004,BioresourceTechnol.91:179-188;Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。

还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱预处理包括，但不限于，石灰预处理、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。

用碳酸钙、氢氧化钠或氨，在85-150℃的低温进行石灰预处理，停留时间从1小时到几天(Wyman等,2005,Bioresource Technol.96:1959-1966;Mosier等,2005,Bioresource Technol.96:673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900和WO 2006/110901公开了使用氨的预处理方法。

湿法氧化是热预处理，通常在180-200℃进行5-15分钟，加入氧化剂如过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen,1998,Bioresource Technol.64:139-151;Palonen等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17;Varga等,2004,Biotechnol.Bioeng.88:567-574;Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。预处理以优选1-40%干物质，更优选2-30%干物质，和最优选5-20%干物质进行，并且由于加入碱如碳酸钠，初始pH常常会增加。

湿法氧化预处理方法的修改方法，称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)，能够处理高达30%的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中，在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO 2006/032282)。

氨纤维爆炸(AFEX)涉及在温和温度如90-100℃和高压如17-20bar，用液体或气体氨将纤维素材料处理5-10分钟，其中干物质含量可以高达60%(Gollapalli等,2002,Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35;Chundawat等,2007,Biotechnol.Bioeng.96:219-231;Alizadeh等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141;Teymouri等,2005,Bioresource Technol.96:2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素的解聚和半纤维素的部分水解。木质素-糖复合物受切割。

有机溶剂预处理通过用含水乙醇(40-60%乙醇)在160-200℃提取30-60分钟而将纤维素材料去木质素化(Pan等,2005,Biotechnol.Bioeng.90:473-481;Pan等,2006,Biotechnol.Bioeng.94:851-861;Kurabi等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。经常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，去除大部分半纤维素。

合适的预处理方法的其他实例如Schell等,2003,Appl.Biochem andBiotechn.105-108:69-85,和Mosier等,2005,Bioresource Technology96:673-686,和美国公开申请号2002/0164730所述。

在一个方面，化学预处理优选作为酸处理，并且更优选作为连续稀酸和/或弱酸处理进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。弱酸(mild acid)处理在优选1-5，更优选1-4，和最优选1-3的pH范围进行。在一个方面，酸浓度在优选0.01至20wt%酸，更优选0.05至10wt%酸，更优选0.1至2wt%酸，和最优选0.2至2.0wt%酸的范围。将酸与纤维素材料接触，并在优选160-220℃，更优选165-195℃范围的温度保持数秒至数分钟，例如1秒至60分钟的时间。

在另一个方面，预处理作为氨纤维爆炸步骤(AFEX预处理步骤)进行。

在另一个方面，预处理发生在含水浆料中。在优选的方面，在预处理过程中纤维素材料以优选10-80wt%，更优选20-70wt%，和最优选30-60wt%，如约50wt%的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或者使用本领域任何已知的方法洗涤，例如，用水洗涤。

机械预处理：术语“机械预处理”指各种类型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。

物理预处理：术语“物理预处理”指任何促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的预处理。例如，物理预处理可包括辐射(例如微波辐射)，汽蒸/蒸汽爆炸，水热解，及其组合。

物理预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在一个方面，高压指优选约300至约600psi，更优选约350至约550psi，和最优选约400至约500psi的范围，如大约450psi的压力。在另一个方面，高温指约100至约300℃，更优选约140至约235℃范围的温度。在一个优选的方面，机械预处理在利用如上所定义的高温和高压的蒸汽枪水解器系统(例如来自Sunds DefibratorAB,Sweden的Sunds Hydrolyzer)的分批过程中进行。

组合的物理和化学预处理：纤维素材料可进行物理和化学预处理两者。例如，所述预处理步骤可涉及稀酸或乳酸处理和高温和/或高压处理。所述物理和化学预处理可视需要顺序进行或同时进行。亦可包括机械预处理。

因此，在一个优选的方面，对纤维素材料进行机械、化学或物理预处理，或者它们的任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

生物预处理：术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment of biomass,于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212;Ghosh和Singh,1993,Physicochemical andbiological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333;McMillan,J.D.,1994,Pretreating lignocellulosicbiomass:a review,于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production,Himmel,M.E.,Baker,J.O.,和Overend,R.P.,编,ACS Symposium Series566,American Chemical Society,Washington,DC,第15章;Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources,于Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.,编,Springer-Verlag BerlinHeidelberg,Germany,65:207-241;Olsson和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentation oflignocellulosic hydrolysates for ethanol production,Enz.Microb.Tech.18:312-331;和Vallander和Eriksson,1990,Production of ethanol from lignocellulosic materials:State of the art,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。

糖化。在水解(也称作糖化)步骤中，将例如经预处理的纤维素材料水解以将纤维素以及或者也将半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由酶组合物以酶法在本发明具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下进行。组合物可进一步包含一种或多种(几种)半纤维素分解或木聚糖降解酶。组合物的酶还可以顺序加入。

酶水解优选在容易由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境中进行。在一个优选的方面，水解在适于酶的活性，即对于酶最佳的条件下进行。水解可以以补料分批或连续的过程进行，其中将经预处理的纤维素材料(底物)逐渐补入，例如，含酶的水解溶液中。

糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可持续长达200小时，但是通常进行优选约12至约96小时，更优选约16至约72小时，和最优选约24至约48小时。温度在优选约25℃至约70℃，更优选约30℃至约65℃，和最优选约40℃至60℃的范围，特别是约50℃。pH在优选约3至约8，更优选约3.5至约7，和最优选约4至约6的范围，特别是约pH5.0。干固体含量在优选约5至约50wt%，更优选约10至约40wt%，和最优选约20至约30wt%的范围。

酶组合物优选包含具有纤维素分解活性和/或木聚糖降解活性的酶。在一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(几种)纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(几种)木聚糖降解酶。在一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(几种)纤维素分解酶和一种或多种(几种)木聚糖降解酶。

所述一种或多种(几种)纤维素分解酶优选选自下组：内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。所述一种或多种(几种)木聚糖降解酶选自下组：木聚糖酶，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，木糖苷酶，和葡糖醛酸糖苷酶。

在另一个方面，所述酶组合物进一步或甚至进一步包含具有纤维素分解增强活性的多肽(参见，例如WO 2005/074647，WO 2005/074656，和WO2007/089290)。在另一个方面，所述酶组合物可进一步或甚至进一步包含一种或多种(几种)其它酶活性以改善含纤维素材料的降解。优选的其它酶为半纤维素酶(例如α-D-葡糖醛酸糖苷酶，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，内切甘露聚糖酶，β-甘露糖苷酶，α-半乳糖苷酶，内切-α-L-阿拉伯聚糖酶，β-半乳糖苷酶)，糖酯酶(例如乙酰木聚糖酯酶，乙酰甘露聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，香豆酸酯酶，葡糖醛酸酯酶(glucuronoyl esterases))，果胶酶，蛋白酶，木质素分解酶(例如漆酶，锰过氧化物酶，木质素过氧化物酶，H₂O₂产生酶，氧还酶)，棒曲霉素，膨胀素，或其混合物。在本发明的方法中，所述其它酶可在发酵之前或之中，例如在糖化过程中或在发酵微生物的繁殖过程中或之后添加。

所述酶组合物的一种或多种(几种)组分可为野生型蛋白、重组蛋白或野生型蛋白和重组蛋白的组合。例如，一种或多种(几种)组分可为细胞的天然蛋白，其用作宿主细胞以重组表达酶组合物的一种或多种(几种)其他组分。酶组合物的一种或多种(几种)组分可作为单组分产生，然后将其组合以形成酶组合物。所述酶组合物可为多组分和单组分蛋白制备物的组合。

用于本发明方法中的酶可为任何适于在本文中所述的工艺中使用的形式，例如去除或未去除细胞的粗发酵液，具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液，半纯化或纯化的酶制备物，或宿主细胞，作为酶的来源。所述酶组合物可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酶制备物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。

具有纤维素分解增强活性的多肽和酶的最优量取决于几种因素，包括但不限于组分纤维素分解酶的混合物，纤维素底物，纤维素底物的浓度，纤维素底物的预处理，温度，时间，pH和发酵生物的包含(例如用于同时糖化和发酵的酵母)。

在一个优选的方面，纤维素分解酶对纤维素材料的有效量为约0.5至50mg，优选约0.5至约40mg，更优选约0.5至约25mg，更优选约0.75至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优选约0.5至约10mg，且最优选约2.5至约10mg每g纤维素材料。

在另一个优选的方面，具有内切葡聚糖酶活性的多肽对纤维素材料的有效量为约0.01至约50.0mg，优选约0.01至约40mg，更优选约0.01至约30mg，更优选约0.01至约20mg，更优选约0.01至约10mg，更优选约0.01至约5mg，更优选约0.025至约1.5mg，更优选约0.05至约1.25mg，更优选约0.075至约1.25mg，更优选约0.1至约1.25mg，甚至更优选约0.15至约1.25mg，且最优选约0.25至约1.0mg每g纤维素材料。

在另一个优选的方面，具有内切葡聚糖酶活性的多肽对纤维素分解酶的有效量为约0.005至约1.0g，优选约0.01至约1.0g，更优选约0.15至约0.75g，更优选约0.15至约0.5g，更优选约0.1至约0.5g，甚至更优选约0.1至约0.5g，且最优选约0.05至0.2g每g纤维素分解酶。

酶可源自或获得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物或哺乳动物来源。术语“获得”在本文中意指该酶可从天然产生该酶作为天然酶的生物分离。术语“获得”在本文中还意指该酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重组产生，其中经重组产生的酶对于宿主生物是天然的或异源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或多个(几个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶，其为天然氨基酸序列的片段和/或突变体或通过本领域已知的氨基酸改组方法产生的酶。天然酶的含义中涵盖的是天然变体，而外来酶的含义中涵盖的是重组(如通过定位诱变或重排)获得的变体。

具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解酶活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解酶活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解酶活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解酶活性的似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解酶活性的不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。

具有酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽，其具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解酶活性；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽，其具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解酶活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解酶活性的卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解酶活性的解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielaviaachromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)或褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)多肽。

还可以使用具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。

所述酶组合物的一种或多种(例如几种)组分可以是重组组分，亦即，通过克隆编码所述单组分的DNA序列并随后用该DNA序列转化细胞并在宿主中表达(参见，例如，WO91/17243和WO91/17244)而产生。所述宿主优选是异源宿主(酶对宿主是异源的)，但该宿主在一定条件下也可以是同源宿主(酶对宿主是天然的)。单组分纤维素分解蛋白还可以通过从发酵液中纯化这样的蛋白来制备。

适用于本发明的商业的纤维素分解酶制备物的实例包括，例如，CELLIC^TMCtec(Novozymes A/S)、CELLUCLAST^TM(Novozymes A/S)、NOVOZYM^TM188(Novozymes A/S)、CELLUZYME^TM(Novozymes A/S)、CEREFLO^TM(Novozymes A/S)和ULTRAFLO^TM(Novozymes A/S)，ACCELERASE^TM(Genencor Int.)、LAMINEX^TM(Genencor Int.)、SPEZYME^TMCP(Genencor Int.)，ROHAMENT^TM7069W(

 GmbH)，FIBREZYME

LDI(Dyadic International,Inc.)、FIBREZYMELBR(Dyadic International,Inc.)或VISCOSTAR

150L(Dyadic International,Inc.)。纤维素酶以固体的约0.001到约5.0wt%，更优选固体的0.025到约4.0wt%，且最优选固体的约0.005到约2.0wt%的有效量添加。纤维素酶以固体的约0.001至约5.0wt%，更优选固体的约0.025至约4.0wt%，且最优选固体的约0.005至约2.0wt%的有效量添加。

可以作为其它内切葡聚糖酶用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO 93/15186;美国专利5,275,944；WO 96/02551；美国专利号5,536,655，WO 00/70031，WO 05/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(WO 05/093050)；和Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO05/093050)。

可以作为其它内切葡聚糖酶用于本发明的方法的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等,1986,Gene45:253-263；GENBANK^TM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等,1988,Gene63:11-22；GENBANK^TM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等,1988,Appl.Environ.Microbiol.64:555-563；GENBANK^TM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等,1994,MolecularMicrobiology13:219-228；GENBANK^TM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等,1990,Nucleic Acids Research18:5884)；川地曲霉(Aspergilluskawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等,1995,Current Genetics27:435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等,1990,Gene90:9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号L29381)；灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号AB003107)；Melanocarpusalbomyces内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉CBS117.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basidiomycete)CBS495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7F内切葡聚糖酶；Cladorrhinumfoecundissimum ATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133内切葡聚糖酶。

可用于本发明的方法的纤维二糖水解酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉纤维二糖水解酶I；里氏木霉纤维二糖水解酶II；特异腐质霉纤维二糖水解酶I、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II、土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶I以及嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II。

可用于本发明的方法的β-葡糖苷酶的实例包括但不仅限于米曲霉β-葡糖苷酶；烟曲霉β-葡糖苷酶；巴西青霉(Penicillium brasilianum)IBT20888β-葡糖苷酶；黑曲霉β-葡糖苷酶；以及棘孢曲霉β-葡糖苷酶。

具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可根据WO 2002/095014获得。具有β-葡糖苷酶活性的烟曲霉多肽可根据WO 2005/047499获得。具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可根据WO 2007/019442获得。具有β-葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可根据Dan等,2000,J.Biol.Chem.275:4973-4980获得。具有β-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可根据Kawaguchi等,1996,Gene173:287-288获得。

所述β-葡糖苷酶可为融合蛋白。在一个方面，所述β-葡糖苷酶是米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白，其根据WO2008/057637获得。

其它可用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶使用根据Henrissat,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities,Biochem.J.280:309-316和Henrissat和Bairoch,1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem.J.316:695-696的分类公开于许多糖基水解酶家族中。

其它可用于本发明的纤维素分解酶描述于EP 495,257、EP 531,315、EP531,372、WO 89/09259、WO 94/07998、WO 95/24471、WO 96/11262、WO96/29397、WO 96/034108、WO 97/14804、WO 98/08940、WO 98/012307、WO 98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 98/028411、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025846、WO 99/025847、WO 99/031255、WO2000/009707、WO 2002/050245、WO 2002/0076792、WO 2002/101078、WO2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO2004/048592、WO 2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/117432、WO 2007/071818、WO2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、美国专利No.4,435,307、美国专利No.5,457,046、美国专利No.5,648,263、美国专利No.5,686,593、美国专利No.5,691,178、美国专利No.5,763,254以及美国专利No.5,776,757。

在本发明的方法中，可使用具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。

可用于本发明的方法中的具有纤维素分解增强活性的多肽的实例包括但不限于，来自土生梭孢霉的具有纤维素分解增强活性的多肽(WO2005/074647)；来自橙橘嗜热子囊菌的具有纤维素分解增强活性的多肽(WO2005/074656)；来自里氏木霉的具有纤维素分解增强活性的多肽(WO2007/089290)；和来自嗜热毁丝霉的具有纤维素分解增强活性的多肽(WO2009/085935;WO 2009/085859;WO 2009/085864;WO 2009/085868)。

在一个方面，所述一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶包含商业的半纤维素分解酶制备物。适用于本发明的商业性半纤维素分解酶制备物的实例包括，例如SHEARZYME^TM(Novozymes A/S)、CELLIC^TMHTec(NovozymesA/S)、VISCOZYME

(Novozymes A/S)、ULTRAFLO

(Novozymes A/S)、PULPZYMEHC(Novozymes A/S)、MULTIFECT

Xylanase(Genencor)、ECOPULP

TX-200A(AB Enzymes)、HSP6000Xylanase(DSM)、DEPOL^TM333P(Biocatalysts Limit,Wales,UK)、DEPOL^TM740L.(Biocatalysts Limit,Wales,UK)和DEPOL^TM762P(Biocatalysts Limit,Wales,UK)。

可用于本发明方法的木聚糖酶的实例包括但不限于棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790;WO 94/21785)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)木聚糖酶(WO 2006/078256)和土生梭孢霉(Thielavia terrestris)NRRL8126木聚糖酶(WO 2009/079210)。

可用于本发明方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于里氏木霉β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458),埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)(SwissProt登录号Q8X212)和粗糙脉孢菌(SwissProt登录号Q7SOW4)。

可用于本发明方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)乙酰木聚糖酯酶(WO 2005/001036)、粗糙脉孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登录号q7s259)、土生梭孢霉NRRL8126乙酰木聚糖酯酶(WO2009/042846)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q2GWX4)、细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登录号AAB82124)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q0UHJ1)和特异腐质霉DSM1800乙酰木聚糖酯酶(WO2009/073709)。

可用于本发明方法的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于特异腐质霉DSM1800阿魏酸酯酶(WO 2009/076122)、粗糙脉孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登录号Q9HGR3)和费希新萨托菌(Neosartorya fischer)阿魏酸酯酶(UniProt登录号A1D9T4)。

可用于本发明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于特异腐质霉DSM1800阿拉伯呋喃糖苷酶(WO 2009/073383)和黑曲霉(Aspergillus niger)阿拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登录号AAR94170)。

可用于本发明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于棒曲霉(Aspergillus clavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号alcc12)、里氏木霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q99024)、埃默森踝节菌α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号Q8X211)、黑曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(Aspergillus terreus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q0CJP9)和烟曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q4WW45)。

用于本发明方法的酶和蛋白可通过在含有合适碳源和氮源和无机盐的营养培养基上，使用本领域已知方法(参见，例如Bennett,J.W.和LaSure,L.(编),More Gene Manipulations in Fungi,Academic Press,CA,1991)发酵上述指出的微生物菌株来产生。合适的培养基可从供应商获得，或可根据已公开组成制备(例如美国典型培养物保藏中心的目录)。适于生长和酶产生的温度范围和其他条件在本领域是已知的(参见，例如Bailey,J.E.和Ollis,D.F.,BiochemicalEngineering Fundamentals,McGraw-Hill Book Company,NY,1986)。

所述发酵可以是任何其结果为酶表达或分离的培养细胞的方法。因此，发酵可以理解为包括在合适的培养基中并在允许所述酶得以表达或分离的条件下进行的摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中的小-或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)。通过上述方法产生的所得的酶可从发酵培养基回收并通过常规方法纯化。

发酵。可通过一种或多种(几种)能将糖直接或间接发酵成所需发酵产物的发酵微生物发酵自经水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳产品)、皮革业和烟草业的发酵方法。发酵条件依赖于期望的发酵产物和发酵生物体，并且能由本领域的技术人员容易地确定。

在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖，通过发酵生物体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和发酵可以是单独或同时的。

在实施本发明的发酵步骤中可以使用任何合适的经水解的纤维素材料。通常根据所需发酵产品(即，要从发酵获得的物质)和使用的方法来选择所述材料，如本领域中所公知的。

术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及同时糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。

“发酵微生物”指适用于合意的发酵方法以产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是C₆和/或C₅发酵生物体，或它们的组合。C₆和C₅发酵生物体均在本领域公知。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所需的发酵产品。

可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等,2006,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。

能发酵C₆糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种，优选酿酒酵母。

能发酵C₅糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的C5发酵酵母包括毕赤酵母属，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS5773；假丝酵母属，优选博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、芸薹假丝酵母(Candida brassicae)、休哈塔假丝酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、假热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。

其它发酵生物体包括发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)的菌株；克鲁维酵母属，如脆壁克鲁维酵母的菌株；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)的菌株；和大肠杆菌，特别是已经经过遗传修饰而改进乙醇产量的大肠杆菌菌株。

在一个优选的方面，酵母是酵母属菌种。在一个更优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个优选的方面，酵母是假丝酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个优选的方面，酵母是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在另一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversion technology,于Handbook on Bioethanol:Production andUtilization,Wyman,C.E.编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。

能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌和热纤维梭菌(Philippidis,1996,见上文)。

在一个优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在更优选的方面，细菌是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面，细菌是热纤维梭菌。

商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如ETHANOL RED^TM酵母(可从Red Star/Lesaffre,USA获得)、FALI^TM(可从Fleischmann’s Yeast,Burns PhilpFood Inc.,USA获得)、SUPERSTART^TM和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可从Ethanol Technology,WI,USA获得)、BIOFERM^TMAFT和XR(可从NABC-NorthAmerican Bioproducts Corporation,GA,USA获得)、GERT STRAND^TM(可从GertStrand AB,Sweden获得)和FERMIOL^TM(可从DSM Specialties获得)。

在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。

通过将异源基因克隆入多种发酵微生物已经构建了能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho,1993,Cloning and improving theexpression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147;Ho等,1998,Genetically engineeredSaccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859;Kotter和Ciriacy,1993,Xylose fermentation bySaccharomyces cerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783;Walfridsson等,1995,Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing theTKL1and TAL1genes encoding the pentose phosphate pathway enzymestransketolase and transaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190;Kuyper等,2004,Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficientanaerobic xylose fermentation:a proof of principle,FEMS Yeast Research4:655-664;Beall等,1991,Parametric studies of ethanol production from xylose andother sugars by recombinant Escherichia coli,Biotech.Bioeng.38:296-303;Ingram等,1998,Metabolic engineering of bacteria for ethanol production,Biotechnol.Bioeng.58:204-214;Zhang等,1995,Metabolic engineering of apentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis,Science267:240-243;Deanda等,1996,Development of an arabinose-fermenting Zymomonasmobilis strain by metabolic pathway engineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470;WO 2003/062430,木糖异构酶)。

在一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是克鲁维酵母属菌种。

本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。

通常向降解的木素纤维素或水解物加入发酵微生物，且发酵进行约8至约96小时，如约24至约60小时。温度通常为约26℃至约60℃，特别是约32℃或50℃，并且在约pH3至约pH8，如约pH4-5、6或7。

在一个优选的方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，且发酵进行约12至约96小时，如通常24-60小时。在一个优选的方面，温度优选为约20℃至约60℃，更优选约25℃至约50℃，并且最优选约32℃至约50℃，特别是约32℃或50℃，并且pH通常为约pH3至约pH7，优选约pH4-7。然而，一些发酵生物体例如细菌，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以约10⁵-10¹²，优选约10⁷-10¹⁰，特别是约2x10⁸个活细胞计数每ml发酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可以在例如“TheAlcohol Textbook”(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall编,NottinghamUniversity Press,United Kingdom1999)中找到，其通过提述并入本文。

对于乙醇生产，在发酵后蒸馏发酵的浆料以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；饮料乙醇，即，可饮用的中性酒，或工业乙醇。

发酵刺激剂可以与本文所述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵工艺，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore等,Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by avitamin feeding strategy during fed-batch process,Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。

发酵产物：发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可为，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、丁醇，乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)，和气体(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)和一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。

在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”包括包含一个或多个羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerin)。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerol)。在另一个更优选的方面，所述醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanolproduction from renewable resources,于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.编,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241;Silveira和Jonas,2002,The biotechnological productionof sorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408;Nigam和Singh,1995,Processes for fermentative production of xylitol–a sugar substitute,ProcessBiochemistry30(2):117-124;Ezeji等,2003,Production of acetone,butanol andethanol by Clostridium beijerinckii BA101and in situ recovery by gas stripping,World Journal of Microbiology and Biotechnology19(6):595-603。

在另一个优选的方面，发酵产物是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen和Lee,1997,Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid productionfrom cellulosic biomass,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435-448。

在另一个优选的方面，发酵产物是酮。应理解的是术语“酮”涵盖包含一个或多个酮部分的物质。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如Qureshi和Blaschek，2003，见上文。

在另一个优选的方面，发酵产物是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard和Margaritis,2004,Empirical modeling of batchfermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and other microbialbiopolymers,Biotechnology and Bioengineering87(4):501-515。

在另一个优选的方面，发酵产物是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H₂。在另一个更优选的方面，所述气体是CO₂。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如Kataoka,N.,A.Miya和K.Kiriyama,1997,Studies on hydrogen production bycontinuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria,WaterScience and Technology36(6-7):41-47；以及Gunaseelan,1997,Biomass andBioenergy,Vol.13(1-2),pp.83-114,1997,Anaerobic digestion of biomass formethane production:A review。

回收可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基回收发酵产物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或萃取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料分离并纯化醇。可以获得纯度高达约96vol%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。

信号肽

本发明还涉及编码信号肽的分离的多核苷酸，所述信号肽包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸1至18。本发明还涉及编码信号肽和前肽的分离的多核苷酸，所述信号肽和前肽包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸1至18。所述多核苷酸可进一步包含编码蛋白的基因，其可操作地连接于信号肽和/或前肽。所述蛋白优选对于所述信号肽和/或是外源的。在一个方面，编码信号肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸1至54。

本发明还涉及包含此种多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及用于产生蛋白质的方法，包括：(a)培养包含此种多核苷酸的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

所述蛋白质对于宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在本文的意思不是指特定长度的编码产物，并且因此涵盖肽、寡肽和多肽。术语“蛋白质”还涵盖经组合以形成编码产物的两种以上多肽。所述蛋白质还包括杂合多肽和融合多肽。

优选蛋白质是激素、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报告蛋白(reporter)。例如，所述蛋白质可为水解酶、异构酶、连接酶、裂合酶(lyase)、氧化还原酶或转移酶，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。

基因可以从任何原核、真核或其它来源获得。

本发明由下述实施例进一步描述，其不应视为对本发明范围的限制。

优选实施方案的列表

实施方案1.一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性；

(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件，或高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补链；

(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性；

(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽在一个或几个位置包含取代、缺失和/或插入的变体；和

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有内切葡聚糖酶活性的片段。

实施方案2.实施方案1的多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。

实施方案3.实施方案1或2的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件，或高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQID NO:1的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补链。

实施方案4.实施方案1-3任一项的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。

实施方案5.实施方案1-4任一项的多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:2的成熟多肽。

实施方案6.实施方案5的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸19至477。

实施方案7.一种分离的多肽，其包含选自下组的催化域：

(a)催化域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸19至397具有至少80%序列同一性；

(b)催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸55至1191，或(ii)(i)的全长互补链；

(c)催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的催化域具有至少80%序列同一性；

(d)SEQ ID NO:2的氨基酸19至397在一个或几个位置包含取代、缺失和/或插入的变体；和

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的催化域具有内切葡聚糖酶活性的片段。

实施方案8.实施方案7的多肽，其还包含纤维素结合域。

实施方案9.一种分离的多肽，其包含纤维素结合域，所述纤维素结合域可操作地连接于催化域，其中所述结合域选自下组：

(a)纤维素结合域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸444至477具有至少80%序列同一性；

(b)纤维素结合域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸1333至1431，或(ii)(i)的全长互补链；

(c)纤维素结合域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸1333至1431具有至少80%序列同一性；

(d)SEQ ID NO:2的氨基酸444至477在一个或几个位置包含取代、缺失和/或插入的变体；和

(e)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)具有纤维素结合活性的片段。

实施方案10.实施方案9的多肽，其中所述催化域获得自水解酶、异构酶、连接酶、裂合酶、氧还酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶(chitinase)、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。

实施方案11.一种组合物，其包含实施方案1-10任一项的多肽。

实施方案12.实施方案11的组合物，其进一步包含纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

实施方案13.一种降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在实施方案1-8任一项的具有内切葡聚糖酶活性的多肽存在下用酶组合物处理所述纤维素材料。

实施方案14.实施方案13的方法，其中所述纤维素材料被预处理。

实施方案15.实施方案13或14的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶或过氧化物酶。

实施方案16.实施方案15的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

实施方案17.实施方案15的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。

实施方案18.实施方案13-17任一项的方法，还包括回收经降解的纤维素材料。

实施方案19.实施方案18的方法，其中所述经降解的纤维素材料是糖。

实施方案20.实施方案19的方法，其中所述糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。

实施方案21.一种产生发酵产物的方法，其包括：

(a)在实施方案1-8任一项的具有内切葡聚糖酶活性的多肽存在下，用酶组合物糖化纤维素材料；

(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和

(c)从发酵回收发酵产物。

实施方案22.实施方案21的方法，其中所述纤维素材料经过预处理。

实施方案23.实施方案21或22的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶或过氧化物酶。

实施方案24.实施方案23的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

实施方案25.实施方案23的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。

实施方案26.实施方案21-25中任一项的方法，其中步骤(a)和(b)在同时糖化和发酵中同时进行。

实施方案27.实施方案21-26中任一项的方法，其中发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。

实施方案28.一种发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是在实施方案1-8中任一项的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化的。

实施方案29.实施方案28的方法，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。

实施方案30.实施方案29的方法，还包括从所述发酵回收发酵产物。

实施方案31.实施方案28-30任一项的方法，其中纤维素材料在糖化之前经过预处理。

实施方案32.实施方案28-31任一项的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶或过氧化物酶。

实施方案33.实施方案32的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

实施方案34.实施方案32的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。

实施方案35.实施方案29-34中任一项的方法，其中发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。

实施方案36.一种分离的多核苷酸，其编码实施方案1-10任一项的多肽。

实施方案37.一种核酸构建体或表达载体，其包含实施方案36的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导所述多肽在表达宿主中的产生。

实施方案38.一种重组宿主细胞，其包含实施方案36的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导多肽的产生。

实施方案39.一种产生实施方案1-10中任一项的多肽的方法，其包括：

(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和

(b)回收所述多肽。

实施方案40.一种产生具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，其包括：

(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养实施方案38的宿主细胞；和

(b)回收所述多肽。

实施方案41.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其用编码实施方案1-10任一项的多肽的多核苷酸转化。

实施方案42.一种产生具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，其包括：

(a)在有助于所述多肽的产生的条件下培养实施方案41的转基因植物或植物细胞；和

(b)回收所述多肽。

实施方案43.一种分离的信号肽，所述信号肽包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸1至18。

实施方案44.一种编码信号肽的分离的多核苷酸，所述信号肽包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸1至18。

实施方案45.一种核酸构建体或表达载体，其包含编码蛋白的基因，所述基因可操作地连接于实施方案44的多核苷酸，其中所述基因对于编码信号肽的多核苷酸是外源的。

实施方案46.一种重组宿主细胞，其包含编码蛋白的基因，所述基因可操作地连接于实施方案44的多核苷酸，其中所述基因对于编码信号肽的多核苷酸是外源的。

实施方案47.一种产生蛋白的方法，其包括：

(a)在有助于所述蛋白的产生的条件下培养重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码蛋白的基因，所述基因可操作地连接于实施方案44的多核苷酸，其中所述基因对于编码信号肽的多核苷酸是外源的；和

(b)回收所述蛋白。

实施例

材料

用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级别的商品。

菌株

将Talaromyces leycettanus菌株CBS398.68用作具有内切葡聚糖酶活性的多肽的来源。将米曲霉MT3568菌株用于表达编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽的Talaromyces leycettanus基因。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355(WO2002/40694)的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物，其中通过破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因而恢复了pyrG营养缺陷。

培养基和溶液

YP+2%葡萄糖培养基包含1%酵母提取物，2%蛋白胨和2%葡萄糖。

PDA琼脂平板包含马铃薯浸出物(马铃薯浸出物如下所述制备：将300g的切片(经洗涤但未经削皮)的马铃薯在水中煮沸30分钟，然后将汤液(broth)倾出或通过干酪包布(cheesecloth)排干。然后添加蒸馏水直至悬液的总体积为一升，接着添加20g的右旋糖和20g的琼脂粉。将培养基通过蒸汽灭菌在15psi灭菌15分钟(Bacteriological Analytical Manual,8th Edition,Revision A,1998)。

LB平板包含10g的细菌用胰蛋白胨(Bacto-Tryptone)，5g的酵母提取物，10g的氯化钠，15g的细菌用琼脂(Bacto Agar)，和去离子水加至1升。将培养基通过蒸汽灭菌在15psi灭菌15分钟(Bacteriological Analytical Manual,8thEdition,Revision A,1998)。

COVE蔗糖平板包含342g蔗糖(Sigma S-9378)，20g琼脂粉，20ml COVE盐溶液(26g MgSO₄.7H₂O，26g KCL，26g KH₂PO₄，50ml Cove微量金属溶液)和去离子水加至1升)，和去离子水加至1升。将培养基通过蒸汽灭菌在15psi灭菌15分钟(Bacteriological Analytical Manual,8th Edition,Revision A,1998)。将培养基冷却至60℃并添加10mM乙酰胺，15mM CsCl，Triton X-100(50μl/500ml))。

Cove微量金属溶液包含0.04g Na₂B₄O₇.10H₂O，0.4g CuSO₄.5H₂O，1.2gFeSO₄.7H₂O，0.7g MnSO₄.H₂O，0.8g Na₂MoO₄.2H₂O，10g ZnSO₄.7H₂O，和去离子水加至1升。

Dap-4C培养基包含20g右旋糖，10g麦芽糖，11g MgSO₄.7H₂O，1gKH₂PO₄，2g柠檬酸，5.2g K₃PO₄.H₂O，0.5g酵母提取物(Difco)，1ml Dowfax63N10(Dow Chemical Company)，0.5ml KU6微量金属溶液，2.5g CaCO₃，和去离子水加至1升。将培养基通过蒸汽灭菌在15psi灭菌15分钟(Bacteriological Analytical Manual,8th Edition,Revision A,1998)。在使用之前，向Dap-4C培养基添加3.5ml灭菌的50%(NH₄)₂HPO₄和5ml灭菌的20%乳酸每150ml培养基。

KU6微量金属溶液包含0.13g NiCl₂，2.5g CuSO₄.5H₂O，13.9gFeSO₄.7H₂O，8.45g MnSO₄.H₂O，6.8g ZnCl₂，3g柠檬酸，和去离子水加至1升。

实施例1：关于Talaromyces leycettanus菌株CBS398.68的DNA序列信息的来源

基因组序列信息在中国北京市的Beijing Genome Institute(BGI)通过Illumina DNA测序从由Talaromyces leycettanus菌株CBS398.68分离的基因组DNA生成。基因组的初步装配(preliminary assembly)使用Pedant-Pro^TMSequence Analysis Suite(Biomax Informatics AG，Martinsried，Germany)进行分析。将由该软件构建的基因模型用作供在基因组中检测GH7同源物的起始点。使用多种已知的GH7蛋白序列作为指导，手动构建了更加准确的基因模型。

实施例2：Talaromyces leycettanus菌株CBS398.68基因组DNA提取

为了生成用于PCR扩增的基因组DNA，将Talaromyces leycettanus菌株CBS398.68在PDA琼脂平板上通过在26℃生长7日来进行繁殖。用从PDA平板收获的孢子接种带隔板的烧瓶中的25ml的YP+2%葡萄糖培养基，并在30℃在85rpm搅拌下温育72小时。

根据修饰的DNeasy Plant Maxi kit规程(Qiagen Danmark，Copenhagen，Denmark)分离基因组DNA。将来自上述培养物的真菌材料通过在14,000xg离心2分钟来收获。去除上清，并将0.5g的沉淀与石英砂冷冻于液氮，并在经预冷冻的研钵中磨制至细微粉末。将粉末转移至15ml离心管，并添加5ml缓冲液AP1(预热至65℃)和10μl RNA酶A储液(100mg/ml)，接着进行剧烈的涡旋。在65℃定期翻转试管的条件下温育10分钟之后，将1.8ml缓冲液AP2在轻柔混合下添加至裂解液，接着在冰上温育10分钟。然后将裂解液在室温在3000xg离心5分钟，并将上清倾入置于50ml收集管的QIAshreddermaxi旋转柱中。接着，在室温在3000xg离心5分钟。将流过物转移入新的50ml试管，并添加1.5倍体积的缓冲液AP3/E，接着进行涡旋。将15ml的样品转移入置于50ml收集管中的DNeasy Maxi旋转柱，并在室温在3000xg离心5分钟。将流过物弃去，并将12ml缓冲液AW添加至置于50ml收集管中的DNeasy Maxi旋转柱，并在室温在3000xg离心10分钟。在弃去流过物之后，重复离心以弃去剩余的乙醇。将DNeasy Maxi旋转柱转移至新的50ml试管，并添加0.5ml缓冲液AE(预热至70℃)。在室温温育5分钟之后，将样品通过在室温在3000xg离心5分钟来洗脱。再用0.5ml AE缓冲液重复洗脱，并合并洗脱物。用UV分光光度计在260nm测量收获的DNA的浓度。

实施例3：含有编码具有内切葡聚糖酶活性的家族GH7多肽的Talaromyces leycettanus菌株CBS398.68基因组序列的米曲霉表达载体的构建

设计了下示的两个合成的寡核苷酸引物以从实施例2中制备的基因组DNA来PCR扩增Talaromyces leycettanus菌株CBS398.68P23YSZ基因。使用IN-FUSION^TM克隆试剂盒(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)以将片段直接克隆入表达载体pDau109(WO 2005/042735)。

F-P23YSZ

5’-ACACAACTGGGGATCCACC

-3’(SEQID NO:3)

R-P23YSZ

5’-CCCTCTAGATCTCGAG

-3’(SEQ IDNO:4)

粗体字母代表基因序列。下划线序列同源于pDau109的插入位点。

使用MJ Research PTC-200DNA引擎(engine)进行PCR反应。使用Phusion

高保真PCR试剂盒(Finnzymes Oy，Espoo，Finland)进行PCR扩增。PCR反应包含5μl的5X HF缓冲液(Finnzymes Oy，Espoo，Finland)，各0.5μl的dNTP(10mM)，0.5μl的PhusionDNA聚合酶(0.2单位/μl)(Finnzymes Oy，Espoo，Finland)，1μl的引物F-P23YSZ(5μM)，1μl的引物R-P23YSZ(5μM)，0.5μl的Talaromyces leycettanus基因组DNA(100ng/μl)，和16.5μl的去离子水，总体积为25μl。PCR条件为：1个循环，在95℃进行2分钟；35个循环，每个在98℃进行10秒，60℃进行30秒，和72℃进行2分钟；和1个循环，在72℃进行10分钟。然后将样品保持在12℃，直至从PCR机器移出。

反应产物通过使用40mM Tris碱，20mM乙酸钠，1mM EDTA二钠盐(TAE)缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳来分离，其中将1513bp的产物条带从凝胶切出，并使用illustra GFX

PCRDNA和凝胶纯化试剂盒(GE Healthcare LifeSciences，Brondby，Denmark)根据生产商的指示纯化。然后使用IN-FUSION^TM克隆试剂盒将片段克隆入经Bam HI和Xho I消化的pDau109，得到质粒pP23YSZ。将P23YSZ克隆入Bam HI-Xho I消化的pDau109，使得Talaromycesleycettanus P23YSZ基因的转录处于NA2-tpi双重启动子的调控下。NA2-tpi是经修饰的来自编码黑曲霉中性α-淀粉酶的基因的启动子，其中不翻译的前导序列被来自编码构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的不翻译的前导序列替代。

根据IN-FUSION^TM克隆试剂盒的指示进行克隆规程，生成P23YSZ GH7构建体。将经处理的质粒和插入物根据生产商的实验方案转化入One Shot

TOP10F′化学致感受态的(Chemically Competent)大肠杆菌细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，并铺板于补充有0.1mg/ml的氨苄青霉素的LB平板上。在37℃温育过夜之后，发现菌落在LB平板上氨苄青霉素的选择下生长。将四个经P23YSZ GH7构建体转化的菌落在补充有0.1mg/ml的氨苄青霉素的LB培养基中培养，并用QIAprep Spin小提试剂盒(Miniprep Kit)(QIAGENInc.，Valencia，CA，USA)根据生产商的指示分离质粒。

将分离的质粒用载体引物和P23YSZ基因特异性质粒进行测序以确定不含PCR错误的代表性质粒表达克隆。

实施例4：编码具有内切葡聚糖酶活性的P23YSZ GH7多肽的Talaromyces leycettanus CBS398.68基因组序列的表征

Talaromyces leycettanus CBS398.68P23YSY GH7基因组克隆的DNA测序用Applied Biosystems Model3700自动化DNA测序仪使用版本3.1BIG-DYE^TM终止子化学(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA，USA)和引物巡查策略来进行。仔细检查核苷酸序列的品质，并在PHRED/PHRAP软件(University of Washington，Seattle，WA，USA)的协助下将所有序列相互比较。获得的序列与来自BIG的序列相同。

Talaromyces leycettanus P23YSZ基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。编码序列为1434bp，包含终止密码子。编码的预测蛋白为477个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering10:1-6)，预测了一个18个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有459个氨基酸，具有48kDa的预测分子量和4.16的等电点pH。

氨基酸序列的比较性逐对全局比对使用Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)以缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62矩阵进行。比对显示编码具有内切葡聚糖酶活性的P23YSZ GH7多肽的Talaromyces leycettanus基因的推导的氨基酸序列与来自Neosartorya fischeri、具有内切葡聚糖酶活性的预测的GH7家族蛋白(登录号SWISSPROT:A1DKY9)的推导的氨基酸序列具有74.2%同一性(排除缺口)。

实施例5：Talaromyces leycettanus GH7内切葡聚糖酶P23YSZ的表达

将表达质粒pP23YSZ转化入米曲霉MT3568。米曲霉MT3568是JaL355(WO 2002/40694)的AMDS(乙酰胺酶)破坏的衍生物，其中在米曲霉乙酰胺酶(AMDS)基因的敲除过程中恢复了pyrG营养缺陷。MT3568原生质体根据欧洲专利EP0238023第14至15页(其通过提述并入本文)的方法制备。

将转化体在COVE蔗糖选择平板上通过单个分生孢子进行纯化，然后使它们在PDA平板上形成孢子。根据在30℃、YP+2%葡萄糖培养基中的1ml96深孔静态培养的培养上清分析转化体的Talaromyces leycettanus GH7多肽的生成。E-Page8%SDS-PAGE48孔凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)上通过考马斯染色验证了表达。选择一个转化体进行进一步研究，并将其命名为米曲霉90.3。

为了更大规模的生产，将米曲霉90.3孢子铺板于PDA平板，并在37℃温育5日。将汇合的孢子平板用5ml的0.01%TWEEN

20洗涤两次以最大化收集的孢子的数量。然后使用孢子悬液接种二十五个含有100ml的Dap-4C培养基的500ml烧瓶。将培养物在30℃在100rpm的恒定振荡下温育。在接种之后第四日，通过经由瓶顶(bottle top)的MF75Supor MachV0.2μm PES过滤器(Thermos Fisher Scientific，Roskilde，Denmark)过滤来收集培养液。来自该转化体的新鲜培养液产生了一条大约70kDa的GH7蛋白的条带。通过肽测序验证了该条带作为Talaromyces leycettanus GH7多肽的身份。

实施例6：用于产生Talaromyces leycettanus GH7内切葡聚糖酶P23YSZ的替代方法

基于鉴定为SEQ ID NO:1的核苷酸序列，可从多个供应商如Gene Art(GENEART AG BioPark，Josef-Engert-Str.11，93053，Regensburg，Germany)或DNA2.0(DNA2.0，1430O′Brien Drive，Suite E，Menlo Park，CA94025，USA)获得合成基因。可以设计所述合成基因以纳入其它DNA序列如限制性位点或同源重组区，以便于克隆入表达载体。

使用上述的两个合成寡核苷酸引物F-P23YSZ和F-P23YSZ，可使用简单的PCR反应从SEQ ID NO:1的合成基因扩增全长开读框。然后可将基因克隆入表达载体，例如如上所述的表达载体，并在宿主细胞中表达，例如在如上所述的米曲霉中表达。

实施例7：Talaromyces leycettanus GH7内切葡聚糖酶P23YSZ的纯化

将米曲霉表达菌株90.3的1000ml培养液调整至pH7.0并在0.22μm PES过滤器(Thermo Fisher Scientific，Roskilde，Denmark)上过滤。接着，向滤过物添加1.8M硫酸铵。将滤过物加载于用1.8M硫酸铵pH7.0，25mM HEPESpH7.0平衡的Phenyl Sepharose^TM6Fast Flow柱(高取代)(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)(柱体积为60mL)。在加载之后，将用3个柱体积的1.0M硫酸铵洗涤柱子，接着用5个柱体积的25mM HEPES pH7.0以15ml/min的流速将蛋白洗脱。收集10mL的级分，并通过SDS-PAGE分析。将级分汇集并施加到在25mM HEPES pH7.0中平衡的SOURCE^TM15Q(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)柱。将级分施加到在25mM HEPES pH7.0(柱体积60mL)中平衡的SOURCE^TM15Q(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)柱上。在加载之后，用三个柱体积的平衡缓冲液洗涤柱子，并以20个柱体积从0至500mM氯化钠的线性梯度洗脱结合的蛋白。收集10ml的级分，并通过SDS-PAGE分析，并汇集含有蛋白的级分至148ml的终体积。蛋白浓度通过A280/A260吸光度来确定。

实施例8：内切葡聚糖酶测定

对于浓缩物通过如下所述的微滴定板测定法来测定内切葡聚糖酶活性。在0.1M乙酸钠pH5.5缓冲液中在搅拌下制备0.2%AZCL-HE-纤维素酶(Megazyme International Ireland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow,Ireland)的溶液。将溶液在搅拌下分配至微滴定板(200μl至每孔)。然后添加20μl的酶样品，并在EPPENDORF

THERMOMIXER

(Eppendorf AG,Hamburg,Germany)中在50℃和650rpm温育20分钟。使用变性的酶样品(在100℃煮沸20分钟)作为空白。在温育之后，将着色的溶液通过在4℃在3000rpm离心5分钟从固体底物分离。将150μl的上清样品转移至微滴定板，并在595nm使用SPECTRAMAX

M2多模式酶标仪(Molecular Devices,Beijing,China测量吸光度。

实施例9：预处理的玉米秸秆水解测定

将玉米秸秆在U.S.Department of Energy National Renewable EnergyLaboratory(美国能源部国家可再生能源实验室)(NREL)使用1.4wt%硫酸在165℃和107psi预处理8分钟。预处理的玉米秸秆(PCS)中的不溶于水的固体含有56.5%纤维素，4.6%半纤维素和28.4%木质素。通过两阶段硫酸水解，接着通过使用NREL标准分析程序(Standard Analytical Procedure)#002的高效液相色谱分析糖来测定纤维素和半纤维素。在用硫酸水解纤维素和半纤维素级分之后使用NREL标准分析程序(Standard Analytical Procedure)#003以重量分析法来测定木质素。

未经磨制、未经洗涤的PCS(全浆料PCS)如下制备：藉由添加10M NaOH与充分混合将PCS的pH调整至5.0，然后在120℃蒸汽灭菌20分钟。全浆料PCS的干重是29%。PCS以未经洗涤或经水洗涤的形式使用。经磨制、未经洗涤的PCS(干重32.35%)通过在Cosmos ICMG40湿式多用途研磨机(EssEmm Corporation，Tamil Nadu，India)中磨制全浆料PCS来制备。以相同方式制备经磨制、洗涤的PCS(干重32.35%)，然后反复用去离子水洗涤并倾去上清级分。

PCS的水解使用2.2ml深孔板(Axygen，Union City，CA，USA)在1.0ml的总反应体积中进行。水解用50mg的不溶性PCS固体/ml含1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液，以及不同蛋白加载量的多种酶组合物(表示为mg蛋白每克纤维素)来进行。制备酶组合物，然后以50μl至200μl范围的体积同时添加至所有孔，至每个反应中1ml的终体积。然后使用ALPS-300^TM平板热密封器(Abgene，Epsom，United Kingdom)密封平板，充分混合，并在特定温度温育72小时。所有报道的反应均是重复三次进行的。

在水解之后，使用0.45μm MULTISCREEN96孔过滤板(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤样品，然后如下所述分析滤过物的糖含量。当不立即使用时，将经过滤的等分试样冷冻于-20℃。稀释于0.005M H₂SO₄的样品的糖浓度使用4.6x250mm AMINEX

HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)通过在65℃用0.05%w/w苯甲酸-0.005M H₂SO₄以0.6ml每分钟的流速洗脱，和通过从由纯糖样品校正的折光率检测(CHEMSTATION

AGILENT

1100HPLC，Agilent Technologies，SantaClara，CA，USA)所得的葡萄糖、纤维二糖和木糖信号的积分的定量来进行测量。使用所得的葡萄糖和纤维二糖当量对于每个反应计算纤维素转化的百分比。

分别测量葡萄糖、纤维二糖和木糖。根据合适的稀释因子调整测得的糖浓度。根据零时点未洗涤的PCS中相应的背景糖浓度调整测得的糖浓度，来确定来自未洗涤的PCS的酶法产生的糖的净浓度。所有HPLC数据处理使用MICROSOFT EXCEL^TM软件(Microsoft，Richland，WA，USA)进行。

使用下式计算纤维素转化为葡萄糖的程度：%转化=(葡萄糖浓度/限制消化中的葡萄糖浓度)x100。为了计算%转化，基于纤维素酶对照(100mg的里氏木霉纤维素酶每克纤维素)设定100%转化点，将所有值除以该数值然后乘以100。将三次重复数据点取平均值，并计算标准偏差。

实施例10：酶组合物的制备

烟曲霉GH7A纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:5[DNA序列]和SEQ IDNO:6[推导的氨基酸序列])如WO 2011/057140中所述在米曲霉中重组制备。将烟曲霉GH7A纤维二糖水解酶I的过滤的培养液使用配有10kDa聚醚砜膜(Pall Filtron，Northborough，MA，USA)的切向流浓缩器(Pall Filtron，Northborough，MA，USA)浓缩并用20mM Tris-HCl pH8.0缓冲液交换。烟曲霉GH7A纤维二糖水解酶I的经脱盐的培养液在20mM Tris-HCl pH8中的Q SEPHAROSE^TM离子交换层析柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA))上以0至1M NaCl线性梯度进行纯化。收集级分，并基于8-16%CRITERION

免染型(Stain-free)SDS-PAGE(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)汇集含有纤维二糖水解酶I纤维素酶的级分。

烟曲霉NN055679纤维二糖水解酶II的制备。烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO:7[DNA序列]和SEQ ID NO:8[推导的氨基酸序列])在米曲霉中如WO 2011/057140中所述重组制备。将烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II经过滤的培养液使用400ml SEPHADEX^TM G-25柱(GE Healthcare，UnitedKingdom)根据生产商的指示将缓冲液交换为20mM Tris pH8.0。汇集级分，并将其调整为1.2M硫酸钠-20mM Tris pH8.0。将经平衡的蛋白加载于在含1.2M硫酸铵的20mM Tris pH8.0中平衡的PHENYL SEPHAROSE^TM6FastFlow柱(高取代)(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)之上，并用不含硫酸铵的20mM Tris pH8.0洗脱结合的蛋白。汇集级分。

具有纤维素分解增强活性的青霉属物种(emersonii)GH61A多肽的制备。所述青霉属物种(emersonii)GH61A多肽(SEQ ID NO:9[DNA序列]和SEQ IDNO:10[推导的氨基酸序列])根据WO 2011/041397重组制备。所述青霉属物种(emersonii)GH61A多肽基因根据WO 2011/041397纯化。

烟曲霉NN055679GH10木聚糖酶的制备。烟曲霉GH10木聚糖酶(xyn3)(SEQ ID NO:11[DNA序列]和SEQ ID NO:12[推导的氨基酸序列])根据WO2006/078256使用米曲霉BECh2(WO 2000/39322)作为宿主来重组制备。将烟曲霉NN055679GH10木聚糖酶(xyn3)的经过滤的培养液脱盐，并使用HIPREP

26/10脱盐柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)根据生产商的指示将缓冲液交换为50mM乙酸钠pH5.0。

烟曲霉NN055679Cel3Aβ-葡糖苷酶的制备。(SEQ ID NO:13[DNA序列]和SEQ ID NO:14[推导的氨基酸序列])根据WO2005/047499使用米曲霉作为宿主来重组制备。将过滤的培养液用20%乙酸钠调整至pH8.0，这使得溶液浑浊。为了去除浑浊，将溶液离心(20000x g，20分钟)，并将上清通过0.2μm过滤单元(Nalgene，Rochester，NY，USA)过滤。将滤过物用去离子水稀释以达到与50mM Tris/HCl，pH8.0相同的电导率。将经调整的酶溶液施加到在50mM Tris-HCl，pH8.0中平衡的Q SEPHAROSE^TMFast Flow柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)上，并用0至500mM氯化钠的线性梯度洗脱。汇集级分，并用1%(w/v)活性炭处理以去除β-葡糖苷酶汇集物的颜色。将上清经由0.2μm过滤单元(Nalgene，Rochester，NY，USA)过滤来去除活性炭。将滤过物用20%乙酸调整至pH5.0，并用去离子水稀释10倍。将经调整的滤过物施加到在10mM琥珀酸pH5.0中平衡的SP SEPHAROSE^TMFastFlow柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)上，并用0至500mM氯化钠的线性梯度洗脱。

烟曲霉NN051616GH3β-木糖苷酶的制备。烟曲霉NN051616GH3β-木糖苷酶(SEQ ID NO:15[DNA序列]和SEQ ID NO:16[推导的氨基酸序列])如WO 2011/057140中所述在米曲霉中重组制备。将烟曲霉NN051616GH3β-木糖苷酶的过滤的培养液使用HIPREP

26/10脱盐柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)根据生产商的指示脱盐并将缓冲液交换为50mM乙酸钠pH5.0。

每个上述的单组分的蛋白浓度使用Microplate BCA^TM蛋白质测定试剂盒(Thermo Fischer Scientific，Waltham，MA，USA)来确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。用如上所述制备的每种单组分如下所述组成酶组合物：37%烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I，25%烟曲霉Cel6A纤维二糖水解酶II，15%具有纤维素分解增强活性的Penicillium emersonii GH61A多肽，5%烟曲霉GH10木聚糖酶，5%烟曲霉β-葡糖苷酶，和3%烟曲霉β-木糖苷酶。该酶组合物在本文中命名为“不含内切葡聚糖酶的酶组合物”。

实施例11：里氏木霉内切葡聚糖酶II的制备

里氏木霉GH5内切葡聚糖酶II的制备。里氏木霉GH5内切葡聚糖酶II(SEQ ID NO:17[DNA序列]和SEQ ID NO:18[推导的氨基酸序列])根据WO2011/057140使用米曲霉作为宿主来重组制备。将里氏木霉GH5内切葡聚糖酶II的经过滤的培养液脱盐并使用切向流(10K膜，Pall Filtron，Northborough，MA，USA)根据生产商的指示将缓冲液交换为20mM Tris pH8.0。

实施例12：Talaromyces leycettanus家族GH7内切葡聚糖酶I(P23YSZ)在50-65℃酶组合物对经磨制、未经洗涤的PCS的水解中的作用

将Talaromyces leycettanus家族GH7内切葡聚糖酶(P23YSZ)I在不含内切葡聚糖酶的酶组合物中在50℃，55℃，60℃，和65℃使用经磨制、未经洗涤的PCS作为底物进行评估。将不含内切葡聚糖酶的酶组合物(实施例10)以2.7mg总蛋白每g纤维素添加至PCS水解反应，并将水解结果与对于添加或不添加GH7内切葡聚糖酶(3.0mg蛋白每g纤维素)的类似酶组合物的结果进行比较。

测定如实施例9中所述进行。用经磨制、未经洗涤的PCS(5%不溶性固形物)的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应进行一式三次，并涉及在水解开始时的单次混合。

如下表1中所示，包含Talaromyces leycettanus家族GH7内切葡聚糖酶I(P23YSZ)的酶组合物与不含内切葡聚糖酶的酶组合物(2.7mg蛋白/g纤维素和3.0mg蛋白/纤维素)相比，在50℃，55℃，60℃，和65℃的性能显著更优(因为在50℃，55℃，60℃，和65℃，对于Talaromyces leycettanus家族GH7内切葡聚糖酶(P23YSZ)，纤维素至葡萄糖的转化程度要高于不含内切葡聚糖酶的酶组合物)。下表1中的结果，显示含有Talaromyces leycettanus家族GH7内切葡聚糖酶(P23YSZ)的酶组合物在60℃和65℃性能几乎与含有里氏木霉家族GH5内切葡聚糖酶II的酶组合物相同(因为对于Talaromyces leycettanus家族GH7内切葡聚糖酶I(P23YSZ)，在60℃和65℃，纤维素至葡萄糖转化的程度几乎与含有里氏木霉家族GH5内切葡聚糖酶II的酶组合物相同)

表1

实施例13：两种内切葡聚糖酶对经磨制、洗涤的PCS在50至65℃的评估

在50℃，55℃，60℃，和65℃使用经磨制、洗涤的PCS作为底物，将两种内切葡聚糖酶以1mg蛋白每g纤维素与1mg蛋白每g纤维素的烟曲霉家族GH3β-葡糖苷酶一同进行评估。测试了下述内切葡聚糖酶：Talaromycesleycettanus家族GH7内切葡聚糖酶I(P23YSZ)和里氏木霉家族GH5内切葡聚糖酶II。

测定如实施例9中所述进行。用经磨制、洗涤的PCS(5%不溶性固形物)的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应进行一式三次，并涉及在水解开始时的单次混合。

示于下表2的结果说明，在50℃，55℃，60℃，和65℃，Talaromycesleycettanus家族GH7内切葡聚糖酶I(P23YSZ)与里氏木霉家族GH5内切葡聚糖酶II相比具有显著更高的纤维素至葡萄糖转化。

表2

本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围内，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面包含于本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。

Claims (24)

1.一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性；

(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件，或高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补链；

(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性；

(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽在一个或几个位置包含取代、缺失和/或插入的变体；和

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有内切葡聚糖酶活性的片段。

2.权利要求1的多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。

3.权利要求1或2的多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:2，或SEQ IDNO:2的成熟多肽。

4.权利要求3的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸19至477。

5.一种分离的多肽，其包含选自下组的催化域：

(a)催化域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸19至397具有至少80%序列同一性；

(b)催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸55至1191，或(ii)(i)的全长互补链；

(c)催化域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的催化域具有至少80%序列同一性；

(d)SEQ ID NO:2的氨基酸19至397在一个或几个位置包含取代、缺失和/或插入的变体；和

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的催化域具有内切葡聚糖酶活性的片段。

6.权利要求5的多肽，其还包含纤维素结合域。

7.一种分离的多肽，其包含纤维素结合域，所述纤维素结合域可操作地连接于催化域，其中所述结合域选自下组：

(a)纤维素结合域，其与SEQ ID NO:2的氨基酸444至477具有至少80%序列同一性；

(b)纤维素结合域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的核苷酸1333至1431，或(ii)(i)的全长互补链；

(c)纤维素结合域，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸1333至1431具有至少80%序列同一性；

(d)SEQ ID NO:2的氨基酸444至477在一个或几个位置包含取代、缺失和/或插入的变体；和

(e)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)具有纤维素结合活性的片段。

8.一种组合物，其包含权利要求1-7任一项的多肽。

9.一种降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在权利要求1-7任一项的具有内切葡聚糖酶活性的多肽存在下用酶组合物处理所述纤维素材料。

10.权利要求9的方法，其中所述纤维素材料经过预处理。

11.权利要求9或10的方法，还包括回收经降解的纤维素材料。

12.权利要求11的方法，其中所述经降解的纤维素材料是糖。

13.一种产生发酵产物的方法，其包括：

(a)在权利要求1-7任一项的具有内切葡聚糖酶活性的多肽存在下，用酶组合物糖化纤维素材料；

(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和

(c)从发酵回收发酵产物。

14.权利要求13的方法，其中步骤(a)和(b)在同时糖化和发酵中同时进行。

15.权利要求13或14的方法，其中发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。

16.一种发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是在权利要求1-7中任一项的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化的。

17.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-7任一项的多肽。

18.一种核酸构建体或表达载体，其包含权利要求17的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导所述多肽在表达宿主中的产生。

19.一种重组宿主细胞，其包含权利要求17的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导多肽的产生。

20.一种产生具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，其包括：

(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养权利要求19的宿主细胞；和

(b)回收所述多肽。

21.一种编码信号肽的分离的多核苷酸，所述信号肽包含或组成为SEQID NO:2的氨基酸1至18。

22.一种核酸构建体或表达载体，其包含编码蛋白的基因，所述基因可操作地连接于权利要求21的多核苷酸，其中所述基因对于编码信号肽的多核苷酸是外源的。

23.一种重组宿主细胞，其包含编码蛋白的基因，所述基因可操作地连接于权利要求21的多核苷酸，其中所述基因对于编码信号肽的多核苷酸是外源的。

24.一种产生蛋白的方法，其包括：

(a)在有助于所述蛋白的产生的条件下培养重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码蛋白的基因，所述基因可操作地连接于权利要求21的多核苷酸，其中所述基因对于编码信号肽的多核苷酸是外源的；和

(b)回收所述蛋白。