BR112013019247B1 - Método para produzir um polipeptídeo - Google Patents

Abstract

célula hospedeira microbiana transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo para produzir um mutante de uma célula originária, para produzir uma proteína, para degradar um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, para fermentar um material celulósico, construção de ácido nucleico ou vetor de expressão, polipeptídeo isolado, e polinucleotídeo isolado a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade celulolítica ou hemicelulolítica e a polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos. a invenção também se refere a construções de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos, assim como a métodos para produzir e usar os polipeptídeos.

Description

Referência a uma Listagem de Sequências

[001] Este pedido contém uma listagem de sequência em formato informático, que é incorporada neste documento por referência.

Histórico Da Invenção Campo da Invenção

[002] A presente invenção se refere aos polipeptídeos com atividade celulolítica ou atividade hemicelulolítica e aos polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos. A presente invenção se refere também aos construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos, bem como os métodos de produção e uso dos poplipeptídeos.

Descrição da técnica relacionada

[003] Há uma demanda cada vez maior por soluções mais sustentáveis para os problemas importantes de uma sociedade moderna. Demanda por mais processos biológicos, produtos e soluções: a era pós-pico do petróleo torna inevitável que a sociedade global terá que mudar em geral, deixando de ser baseada em recursos de carbono de fósseis e passar a utilizar fontes renováveis. Recursos de carbono renováveis são principalmente feitos de materiais vegetais. A conversão de materiais vegetais (carbono renovável) para substituir o espectro de produtos úteis e necessários (como energia, plásticos, produtos químicos, etc.) obtidos atualmente de petróleo bruto é, em geral, conseguida pela conversão dos biopolímeros vegetais com a ajuda de enzimas microbianas/proteínas. Esta necessidade envolve elevadas exigências na verificação de enzimas e proteínas adjuvantes de micróbios suficientemente diversificadas e eficientes para a conversão de um amplo espectro de diferentes tipos de biomassa, disponível globalmente: de palha de milho e palha de trigo ao bagaço de cana-de-açúcar e buquê de flores de palmeira vazios a resíduos municipais e fluxos secundários agroindustriais.

[004] A complexidade da biomassa disponível impõe altas exigências aos produtos microbianos: mais produtos agrícolas terão que ser reservados para alimentar 9 bilhões de pessoas, bem como para alimentar animais para a cadeia alimentar. A biomassa disponível para fins industriais no futuro será, em grande parte, de resíduos de cultura/materiais de resíduos biológicos. Tais materiais são principalmente compostos de lignoceluloses vegetais, uma estrutura altamente recalcitrante que precisa de um hospedeiro de enzimas para a completa decomposição. Isto exige demandas ainda maiores sobre a verificação de novas e melhores enzimas de origem microbiana.

[005] Uma maneira eficiente de aumentar a taxa de conversão de matéria-prima celulósica em etanol é elevar a temperatura, mas esta estratégia é limitada pela estabilidade térmica das enzimas disponíveis.

[006] Outra maneira de aumentar a taxa de conversão de matéria- prima celulósica em etanol é otimizar o pré-tratamento da matéria-prima antes de degradação enzimática, mas esta estratégia é limitada aos métodos de pré- tratamento ácidos pelo pH ideal das enzimas disponíveis.

[007] Uma terceira maneira de aumentar a taxa de conversão das matérias-primas celulósicas em etanol é adicionar polipeptídeos que melhoram a atividade celulolítica sob baixas temperaturas.

[008] Seria vantajoso na técnica melhorar a conversão da matéria- prima celulósica com polipeptídeos com atividade celulolítica em altas temperaturas e fornecer polipeptídeos com atividade celulolítica que seria compatível com o pré-tratamento em valores de pH elevados. Além disso, seria vantajoso na técnica melhorar a conversão de matérias-primas celulósicas com polipeptídeos com melhor atividade celulolítica em altas temperaturas. No entanto, apenas um polipeptídeo com maior atividade celulolítica em altas temperaturas é conhecido (Patente Norte-Americana No. 7,271,244). Identificou-se uma variedade de fungos termofílicos que produzem atividade celulase extracelular (atividade de endoglicanase e celobio-hidrolase) com maior estabilidade do que a atividade de celulase de outros fungos termofílicos. Além disso, vários dos fungos produzem celulases que são altamente ativas em valores de pH acima de 7. Como os fungos produzem celulases com alta termoestabilidade e um pH ótimo adequado, é razoável supor que outras enzimas secretadas destes fungos também apresentarão maior termoestabilidade e pH ótimo do que os normalmente observados para as enzimas fúngicas. Portanto, estes fungos são fontes úteis de novas enzimas para aplicações industriais e outras aplicações.

[009] A verificação de proteína e enzima pode ser baseada no sequenciamento do genoma (confinado a um organismo de cada vez e depende de anotações demoradas), varredura de atividade (que exigem ensaios de clonagem e de alto rendimento disponíveis) e busca de novidade através de similaridade de sequência (por exemplo, uma abordagem baseada em PCR).

[0010] Para a decomposição de celulose e hemiceluloses, é bastante simples construir iniciadores de PCR adequados para verificar as novas xilanases (por exemplo, GH10 e GH11) e novas endoglicanases (por exemplo, GH45) por varredura baseada em PCR. A estrutura 3D da proteína manteve, através da evolução, filamentos mais longos de regiões altamente conservadas, apropriados para a construção do iniciador. No entanto, outros tipos necessários de enzimas para a decomposição da celulose, como as celobio-hidrolases, ou as proteínas adjuvantes pertencentes ao grupo GH61, têm alta variação de sequência dentro de cada família de proteínas e/ou áreas limitadas de conservação suficiente ou similaridade de sequência.

[0011] A motivação para a presente invenção é para a verificação baseada em PCR mais eficiente. A base é uma hipótese de que deve ser possível construir construtos baseando-se em similaridades adicionais do que seria possível a partir de uma abordagem de alinhamento simplesmente abrigada no fato de que foi possível agrupar enzimas e outras proteínas em famílias de proteínas, o que engloba inclusive proteínas de similaridade de sequência muito baixa, mas com importantes semelhanças nas dobras e características/atividades. Da mesma forma, isto é também baseado no fato que uma busca Blast in silico poderia identificar uma série de proteínas que são a única orientação de sequência distantemente relacionada, mas compartilhando características como, por exemplo, agrupamento na mesma família de proteínas (Henrissat, B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, e Henrissat and Bairoch, 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696).

[0012] Nossa hipótese foi que tais regiões possíveis adequadas para a construção do iniciador poderiam ser identificadas com base na antecipação de um nível avançado de reconhecimento de padrões. Esta abordagem resultou em um método simples, por um lado, e com vantagens significativamente importantes, por outro lado, como a velocidade.

[0013] A presente invenção fornece polipeptídeos com atividade celulolítica ou atividade hemicelulolítica e aos polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos.

Sumário Da Invenção

[0014] A presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com atividade celobio-hidrolase selecionados do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 4; pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 6; pelo menos 91% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 8; ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 10; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza, pelo menos, sob condições de estringência muito alta com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9, (ii) a sua sequência de cDNA ou (iii) o complemento completo de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 1 ou SEQ ID No: 3, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 5 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 91% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 7 ou as sequências de cDNA da mesma; ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 9 ou a sequência de cDNA da mesma; (d) uma variante compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em um ou mais (p.ex., várias) posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que possua atividade celobio-hidrolase.

[0015] A presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com atividade celobio-hidrolase selecionados do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 12; pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 14 ou SEQ ID No: 16; pelo menos 91% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 18; pelo menos 96% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 20; ou pelo menos 98% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 22 ou SEQ ID No: 24; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza ao menos sob condições de estringência muito alta com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, ou SEQ ID NO: 23, (ii) a sequência de cDNA do mesmo ou (iii) o complemento completo de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de codificação de polipeptídeo SEQ ID NO: 11 ou a sequência de cDNA do mesmo; pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de codificação de polipeptídeo de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15, ou as sequências de cDNA do mesmo; pelo menos 91% de identidade de sequência com a sequência de de codificação de polipeptídeo de SEQ ID NO: 17 ou a sequência do mesmo; pelo menos 96% de identidade de sequência com a sequência de de codificação de polipeptídeo de SEQ ID NO: 19 ou a sequência de cDNA do mesmo; ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de de codificação de polipeptídeo de SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23 ou a sequência de cDNA do mesmo, ou as sequências de cDNA do mesmo; (d) uma variante que compreende o polipeptídeo da SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, ou SEQ ID NO: 24 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que possua atividade celobio-hidrolase.

[0016] A presente invenção se refere aos polipeptídeos isolados com atividade endoglicanase selecionados do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 26; pelo menos 65% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 28; pelo menos 70% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 32; pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, ou SEQ ID NO: 38; pelo menos 85% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 40 ou SEQ ID NO: 42; pelo menos 97% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 44; ou pelo menos 98% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 46; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência pelo menos muito altas com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27, (ii) a sequência de cDNA das mesmas, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); ou sob condições de estringência pelo menos muito altas com (i) a sequência codificadora do polipeptídeo de SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, ou SEQ ID NO: 45, (ii) a sequência de cDNA das mesmas, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 25 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 65% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 27 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 31, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, ou SEQ ID NO: 37, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 41, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 97% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 43 ou a sequência de cDNA da mesma; ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 45 ou a sequência de cDNA da mesma; (d) uma variante compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, ou SEQ ID NO: 46 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que possua atividade endoglicanase.

[0017] A presente invenção refere-se aos polipeptídeos GH61 isolados com maior atividade celulolítica selecionados do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 48; pelo menos 75% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, ou SEQ ID NO: 79; pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, ou SEQ ID NO: 64; pelo menos 85% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 66; ou pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70 ou SEQ ID NO: 72; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência pelo menos muito altas com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, ou SEQ ID NO: 71, (ii) a sequência de cDNA da mesma, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 47 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 75% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, ou SEQ ID NO: 53, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, ou SEQ ID NO: 63, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 65 ou a sequência de cDNA da mesma; ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, ou SEQ ID NO: 71, ou as sequências de cDNA das mesmas; (d) uma variante compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, ou SEQ ID NO: 79 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que possua atividade intensificadora celulolítica.

[0018] A presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com atividade xilanase selecionados do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 74, pelo menos 94% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 78, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 76; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência pelo menos muito altas com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, ou SEQ ID NO: 77, (ii) a sequência de cDNA da mesma, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 73 ou a sequência de cDNA da mesma, pelo menos 94% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 77 ou a sequência de cDNA da mesma, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 75 ou a sequência de cDNA da mesma; (d) uma variante compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, ou SEQ ID NO: 78 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que possua atividade xilanase.

[0019] A presente invenção refere-se também aos polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos da presente invenção; construtos de ácido nucleico, vetores de expressão recombinantes e células hospedeiras recombinantes compreendendo os polinucleotídeos; e aos métodos de produção dos polipeptídeos.

[0020] A presente invenção refere-se também aos processos para degradar ou converter um material celulósico ou contendo xilano, compreendendo: tratar o material celulósico ou contendo xilano com uma composição enzimática na presença de um polipeptídeo com atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, de intensificação celulolítica ou atividade xilanase da presente invenção. Em um aspecto, os processos compreendem ainda a recuperação do material degradado ou celulósico convertido ou material contendo xilano.

[0021] A presente invenção refere-se também aos processos de produção de um produto de fermentação, compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico ou um material contendo xilano com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo tendo atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, de intensificação celulolítica ou atividade xilanase da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico sacarificado ou contendo xilano com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação da fermentação.

[0022] A presente invenção refere-se também aos processos de fermentação de um material celulósico ou contendo xilano, compreendendo: fermentar o material celulósico ou material contendo xilano com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores, em que o material celulósico ou contendo xilano é sacarificado com uma composição enzimática na presença de um polipeptídeo com atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificadora celulolítica ou xilanase da presente invenção. Em um aspecto, a fermentação do material celulósico ou contendo xilano produz um produto de fermentação. Em outro aspecto, os processos compreendem ainda recuperar o produto da fermentação da fermentação.

Definições

[0023] Acetilxilano esterase: O termo “acetilxilano esterase” significa uma carboxilesterase (EC 3.1.1.72) que catalisa a hidrólise dos grupos acetila da xilana polimérica, xilose acetilada, glicose acetilada, acetato de alfa-naftila e acetato de p-nitrofenila. Para fins da presente invenção, a atividade da acetilxilano esterase é determinada usando 0,5 mM de p- nitrofenilacetato como substrato em pH 5,0 de acetato de sódio 50 mM contendo TWEEN 20™ a 0,01% (monolaurato de polioxietilenossorbitano). Uma unidade de acetilxilano esterase é definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmol do ânion p-nitrofenolato por minuto a um pH 5, a

[0024] Variante alélica: O termo "variante alélica" significa qualquer uma das duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo locus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação e pode resultar em polimorfismo dentro das populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (nenhuma alteração no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0025] Alfa-L-arabinofuranosidase: O termo "alfa-L- arabinofuranosidase" significa uma alfa-L-arabinofuranosídeo arabinofurano- hidrolase (EC 3.2.1.55) que catalisa a hidrólise dos resíduos de alfa-L- arabinofuranosídeo não redutores terminais em alfa-L-arabinosídeos. A enzima atua sobre os alfa-L-arabinofuranosídeos, alfa-L-arabinanos contendo ligações (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. A alfa-L- arabinofuranosidase também é conhecida como arabinosidase, alfa- arabinosidase, alfa-L-arabinosidase, alfa-arabinofuranosidase, polissacarídeo alfa-L-arabinofuranosidase, alfa-L-arabinofuranosídeo hidrolase, L- arabinosidase ou alfa-L-arabinanase. Para efeitos da presente invenção, a atividade alfa-L-arabinofuranosidase é determinada usando 5 mg de arabinoxilano de trigo de viscosidade média (Megazyme International Ireland, Ltd., Bray, Co. Wicklow, Irlanda) por mL de acetato de sódio 100 mM pH 5 em um volume total de 200 μL durante 30 minutos a 40 °C, seguido por análise de arabinose por cromatografia em coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

[0026] Alfa-glicuronidase: O termo "alfa-glicuronidase" significa um alfa-D-glicosiduronato glicurono-hidrolase (EC 3.2.1.139) que catalisa a hidrólise de um alfa-D-glicuronosídeo em D-glicuronato e um álcool. Para efeitos da presente invenção, a atividade alfa-glicuronidase é determinada de acordo com de Vries, 1998, J. Bacteriol. 180: 243-249. Uma unidade de alfa-glicuronidase equivale à quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmol de ácido glicurônico ou ácido 4-O-metilglicurônico por minuto em pH 5, a 40°C.

[0027] Sequência de aminoácidos: O termo "sequência de aminoácidos" significa a ordem em que os resíduos de aminoácidos, ligados por ligações peptídicas, ficam nas cadeias de peptídeos e proteínas. A sequência é geralmente relatada da extremidade N-terminal que contém um grupo amino livre à extremidade C-terminal, contendo um grupo carboxila livre. Códigos de aminoácidos de uma única letra são usados. O código "X" é usado para designar um ou mais resíduos de qualquer aminoácido. Códigos de ácidos nucleicos de uma única letra são usados. O código "n" é usado para designar um ou mais resíduos de qualquer ácido nucleico.

[0028] Beta-glicosidase: O termo "beta-glicosidase" significa uma beta-D-glicosídeo glico-hidrolase (E.C. 3.2.1.21) que catalisa a hidrólise dos resíduos de beta-D-glicose não redutores terminais com a liberação de beta-D- glicose. Para fins da presente invenção, a atividade da beta-glicosidase é determinada usando p-nitrofenil-beta-D-glicopiranosídeo como substrato, de acordo com o procedimento de Venturi et al., 2002, Extracellular beta-D- glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Uma unidade de beta-glicosidase é definida como 1,0 μmol de ânion p- nitrofenolato produzido por minuto, a 25°C, pH 4,8 de 1 mM de p-nitrofenil- beta-D-glicopiranosídeo, como substrato em citrato de sódio 50 mM, contendo 0,01% de TWEEN® 20.

[0029] Beta-xilosidase: O termo “beta-xilosidase” significa uma beta-D-xilosídeo xilo-hidrolase (E.C. 3.2.1.37) que catalisa a exo-hidrólise de beta(1^4)-xilo-oligossacarídeos curtos para remover resíduos de D-xilose sucessivos dos terminais não redutores. Para efeitos da presente invenção, uma unidade de beta-xilosidase, é definida como 1,0 μmol de ânion p- nitrofenolato produzido por minuto, a 40°C, pH 5 de 1 mM de p-nitrofenil- beta-D-xilosídeo como substrato em citrato de sódio 100 mM, contendo 0,01% de TWEEN® 20.

[0030] cDNA: O termo "cDNA" significa uma molécula de DNA que pode ser preparada pela transcrição reversa de uma molécula madura, unida de mRNA obtida de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário inicial é um precursor do mRNA que é processado através de uma série de etapas, incluindo a união, antes de aparecer como mRNA unido maduro.

[0031] Celobio-hidrolase: O termo “celobio-hidrolase” significa uma 1,4-beta-D-glicanocelobio-hidrolase (E.C. 3.2.1.91 e E.C. 3.2.1.176) que catalisa a hidrólise das ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, celo- oligossacarídeos ou qualquer polímero contendo glicose beta-1,4-ligada, liberando celobiose a partir de extremidades redutoras ou não redutoras da cadeia (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline cellulose?, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). A atividade da celobio-hidrolase é determinada de acordo com os procedimentos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288; e Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581.

[0032] Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e pelo menos 100% da atividade celobio-hidrolase do polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 ou da SEQ ID NO: 24.

[0033] Material celulósico: O termo “material celulósico” significa qualquer material contendo celulose. O polissacarídeo predominante na parede celular primária de biomassa é celulose, o segundo mais abundante é hemicelulose e o terceiro é pectina. A parede celular secundária, produzida após a célula parar de crescer, também contém polissacarídeos e é reforçada pela lignina polimérica reticulada covalentemente com a hemicelulose. A celulose é um homopolímero de anidrocelobiose e, deste modo, um beta-(1- 4)-D-glicano linear, enquanto que as hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, tais como xilanos, xiloglicanos, arabinoxilanos e mananos em estruturas ramificadas complexas com uma variedade de substituintes. Embora geralmente polimorfa, a celulose é encontrada em tecidos vegetais principalmente como em uma matriz cristalina insolúvel de cadeias de glicano paralelas. Hemiceluloses geralmente formam ligações de hidrogênio com a celulose, bem como com outras hemiceluloses que ajudam a estabilizar a matriz da parede celular.

[0034] A celulose é geralmente encontrada, por exemplo, em talos, folhas, cascos, cascas e espigas de plantas ou folhas, galhos e madeira de árvores. O material celulósico pode ser, mas não se limita, a resíduos agrícolas, material herbáceo (incluindo culturas energéticas), resíduos sólidos urbanos, polpa e resíduo da moagem do papel, resíduos de papel e madeira (incluindo resíduos florestais) (consulte, por exemplo, Wiselogel et al., 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), páginas 105-118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, editor executivo, Volume 65, páginas 23 a 40, Springer-Verlag, Nova Iorque). Entende-se na presente invenção que a celulose pode estar sob a forma de lignocelulose, um material da parede celular vegetal contendo lignina, celulose e hemicelulose em uma matriz mista. Em um aspecto preferencial, o material celulósico é qualquer material de biomassa. Em outro aspecto preferencial, o material celulósico é lignocelulose, que compreende celulose, hemiceluloses e lignina.

[0035] Em um aspecto, o material celulósico é resíduo agrícola. Em outro aspecto, o material celulósico é material herbáceo (incluindo culturas energéticas). Em outro aspecto, o material celulósico compreende resíduos sólidos urbanos. Em outro aspecto, o material celulósico é polpa e resíduo da moagem do papel. Em outro aspecto, o material celulósico compreende resíduos de papel. Em outro aspecto, o material celulósico é madeira (incluindo resíduos florestais).

[0036] Em outro aspecto, o material celulósico compreende arundo. Em outro aspecto, o material celulósico é bagaço. Em outro aspecto, o material celulósico é bambu. Em outro aspecto, o material celulósico compreende espiga de milho. Em outro aspecto, o material celulósico compreende fibra de milho. Em outro aspecto, o material celulósico compreende palha de milho. Em outro aspecto, o material celulósico é miscanthus. Em outro aspecto, o material celulósico é casca de laranja. Em outro aspecto, o material celulósico é palha de arroz. Em outro aspecto, o material celulósico é painço amarelo. Em outro aspecto, o material celulósico é palha de trigo.

[0037] Em outro aspecto, o material celulósico é aspen. Em outro aspecto, o material celulósico é eucalipto. Em outro aspecto, o material celulósico é abeto. Em outro aspecto, o material celulósico é pinheiro. Em outro aspecto, o material celulósico é álamo. Em outro aspecto, o material celulósico é espruce. Em outro aspecto, o material celulósico é salgueiro.

[0038] Em outro aspecto, o material celulósico é celulose de algas. Em outro aspecto, o material celulósico é celulose bacteriana. Em outro aspecto, o material celulósico é línter de algodão. Em outro aspecto, o material celulósico é papel de filtro. Em outro aspecto, o material celulósico é celulose microcristalina. Em outro aspecto, o material celulósico é celulose tratada com ácido fosfórico.

[0039] Em outro aspecto, o material celulósico é uma biomassa aquática. Conforme usado neste documento, o termo “biomassa aquática” significa biomassa produzida em um ambiente aquático por um processo de fotossíntese. A biomassa aquática pode compreender algas, plantas emergentes, plantas de folhas flutuantes ou plantas submersas.

[0040] O material celulósico pode ser usado como tal ou pode ser submetido a tratamento prévio, usando métodos convencionais conhecidos na técnica, conforme descrito neste documento. Em um aspecto preferencial, o material celulósico é pré-tratado.

[0041] Em outro aspecto, a degradação ou conversão de um material celulósico é realizada em um biorreator ou in situ, ou seja, no lugar onde o material celulósico ocorre naturalmente.

[0042] Enzima celulolítica ou celulase ou polipeptídeo degradante de celulose: O termo “enzima celulolítica” ou “celulase” ou "polipeptídeo degradante de celulose" significa uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas que hidrolisam um material celulósico. Tais enzimas podem incluir endoglicanase(s), celobio-hidrolase(s), beta-glicosidase(s) ou combinações das mesmas. O termo refere-se de modo geral às enzimas que exibem atividade celulase ou celulolítica, como glicosídeo hidrolases (GHs) e enzimas com capacidade para aumentar a quebra da lignocelulose quando usadas juntamente com uma celulase ou uma mistura de celulases. Proteínas degradantes de celulose apresentam atividade catalítica ou de outro tipo, tornando a proteína capaz, por si só ou em conjunto com outras proteínas ou com catalisadores, de converter a celulose em cadeias de celulose menores ou em açúcares monoméricos. Exemplos de tais enzimas, sem se limitar a elas, são representados por glicosídeo hidrolases (GHs) do banco de dados de enzimas ativas para carboidratos (CAZy). Assim, polipeptídeos das famílias GH6, GH7, GH10, GH45 e GH61 são aqui referidos como polipeptídeos degradantes de celulose.

[0043] As duas abordagens básicas para medir a atividade celulolítica incluem: (1) medir a atividade celulolítica total e (2) medir as atividades celulolíticas individuais (endoglicanases, celobio-hidrolases e beta- glicosidases) conforme revisto em Zhang et al., Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. A atividade celulolítica total é normalmente medida usando substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman No. 1, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose derivada de algas, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio de atividade celulolítica total mais comum é o ensaio de papel de filtro usando papel de filtro Whatman No. 1 como substrato. O ensaio foi estabelecido pela União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).

[0044] Para fins da presente invenção, a atividade enzimática celulolítica é determinada medindo-se o aumento da hidrólise de um material celulósico pela(s) enzima(s) celulolítica(s) sob as seguintes condições: 1 a 50 mg de proteína de enzima celulolítica/g de celulose em PCS (ou outro material celulósico pré-tratado) durante 3 a 7 dias a uma temperatura adequada, por exemplo, 50° C, 55° C ou 60°C, em comparação com uma hidrólise de controle sem adição de proteína de enzima celulolítica. Condições típicas são reações de 1 mL, PCS lavado ou não lavado, 5% de sólidos insolúveis, acetato de sódio 50 mM, pH 5, MnSO4 1 mM, 50°C, 55°C ou 60°C, 72 horas, análise de açúcar por coluna AMINEX® HPX-87H (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA).

[0045] Sequência codificante: O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. Os limites da sequência codificante são geralmente determinados por um quadro de leitura aberto, que começa com um códon de início, como ATG, GTG ou TTG, e termina com um códon de parada, como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou uma combinação dos mesmos.

[0046] Complementaridade: Em biologia molecular, o termo "complementaridade" é uma propriedade de ácidos nucleicos de fita dupla, como DNA e RNA, bem como duplexes de DNA:RNA. Cada fita é complementar a outra, em que os pares de bases entre eles não são covalentemente ligados através de duas ou três ligações de hidrogênio. Para o DNA, as bases da adenosina (A) complementam as bases de timina (T) e vice- versa; as bases de guanina (G) complementam as bases de citosina (C) e vice- versa. Com o RNA o mesmo ocorre, exceto que as bases adenina (A) complementam as bases uracila (U) em vez de as bases timina (T).

[0047] Uma vez que há apenas uma base complementar para cada uma das bases encontradas no DNA e no RNA, uma pessoa pode reconstruir uma cadeia complementar para qualquer fita simples. Todas as bases C em uma fita irão parear com as bases G na fita complementar, etc. Isto é essencial para a replicação do DNA.

[0048] Por exemplo, a fita complementar da sequência de DNA 5' A G T C A T G 3' é 3' T C A G T A C 5'.

[0049] A sequência 5' C A T G A C T 3' é chamada de fita complementar reversa da sequência de DNA 5' A G T C A T G 3' quando ela é escrita com a extremidade 5' à esquerda e a extremidade 3' à direita.

[0050] As sequências de nucleotídeos degenerados, como nos iniciadores, são representadas de acordo com o código IUPAC para nucleotídeos degenerados: A: adenina, C: citosina, D: A, G, ou T (A/G/T), G: guanina, H: A, C ou T (A/C/T), K: G ou T (G/T), M: A ou C (A/C), N: A, C, G, ou T (A/C/G/T), R: A ou G (A/G), S: C ou G (C/G), T: timina, V: A, C, ou G (A/C/G), W: A ou T (A/T), Y: C ou T (C/T).

[0051] Composição: O termo "composição" compreende uma mistura de duas ou mais (por exemplo, várias) substâncias, por exemplo, enzimas.

[0052] Sequências de controle: O termo "sequências de controle" significa sequências de ácidos nucleicos necessárias para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Cada sequência controle pode ser nativa (ou seja, do mesmo gene) ou estrangeira (ou seja, de um gene diferente) para o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou nativa ou estrangeira para o outro. Tais sequências de controle incluem, mas não se limitam, a uma sequência de poliadenilação líder, sequência pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal e terminador de transcrição. No mínimo, as sequências controle incluem um promotor e sinais de parada de transcrição e tradução. As sequências de controle podem ser fornecidas com ligantes para introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências de controle com a região codificadora do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

[0053] Endoglicanase: O termo “endoglicanase” significa uma endo- 1,4-(1,3;1,4)-beta-D-glicano 4-glicano-hidrolase (E.C. 3.2.1.4) que catalisa a endo-hidrólise das ligações 1,4-beta-D-glicosídicas na celulose, derivados de celulose (tais como carboximetilcelulose e hidroxietilcelulose), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glicanos misturados, como beta-D-glicanos ou xiloglicanos de cereais, e outros componentes celulósicos contendo material vegetal. A atividade endoglicanase pode ser determinada medindo-se a redução na viscosidade do substrato ou o aumento nas extremidades redutoras determinadas por um ensaio de açúcar redutor (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Para efeitos da presente invenção, a atividade endoglicanase é determinada usando carboximetilcelulose (CMC) como substrato de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268, em pH 5, 40°C.

[0054] Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e pelo menos 100% da atividade endoglicanase do polipeptídeo da SEQ ID No: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 46.

[0055] Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer etapa envolvida na produção de um polipeptídeo incluindo, mas sem se limitar, a transcrição, modificação pós-transcrição, tradução, modificação pós-tradução e secreção.

[0056] Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo e é operavelmente ligada a sequências controle que proporcionam a sua expressão.

[0057] Família 6-glicosídeo hidrolase: O termo "família 6-glicosídeo hidrolase" ou "Família GH6" ou "GH6" significa um polipeptídeo que se pertence à família glicosídeo hidrolase de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316 e Henrissat B., e Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

[0058] Família 7-glicosídeo hidrolase: O termo "família 7-glicosídeo hidrolase" ou "Família GH7" ou "GH7" significa um polipeptídeo que pertence à família glicosídeo hidrolase 7 de acordo com Henrissat, 1991, supra, e Henrissat e Bairoch, 1996, supra.

[0059] Família 10-glicosídeo hidrolase: O termo “família 10- glicosídeo hidrolase" ou "Família GH10" ou "GH10" significa um polipeptídeo que pertence à família glicosídeo hidrolase 10 de acordo com Henrissat, 1991, supra, e Henrissat e Bairoch, 1996, supra.

[0060] Família 45-glicosídeo hidrolase: O termo “família 45- glicosídeo hidrolase" ou "Família GH45" ou "GH45" significa um polipeptídeo que pertence à família glicosídeo hidrolase 45 de acordo com Henrissat, 1991, supra, e Henrissat e Bairoch, 1996, supra.

[0061] Família 61-glicosídeo hidrolase: O termo “família 61- glicosídeo hidrolase" ou "Família GH61" ou "GH61" significa um polipeptídeo que pertence à família glicosídeo hidrolase 61 de acordo com Henrissat, 1991, supra, e Henrissat e Bairoch, 1996, supra. As enzimas nesta família foram originalmente classificadas como uma família glicosídeo hidrolase com base na medição da atividade endo-1,4-beta-D-glicanase muito fraca em um membro da família. A estrutura e o modo de ação destas enzimas são não canônicos e elas não podem ser consideradas glicosidases autênticas. No entanto, elas são mantidas na classificação CAZy com base na sua capacidade para melhorar a quebra de lignocelulose quando usada juntamente com uma celulase ou uma mistura de celulases.

[0062] Feruloil esterase: O termo "feruloil esterase" significa uma 4- hidróxi-3-metoxicinamoil-açúcar hidrolase (EC 3.1.1.73) que catalisa a hidrólise de grupos 4-hidróxi-3-metoxicinamoila (feruloíla) de açúcar esterificado, que normalmente é arabinose em substratos naturais de biomassa, para produzir ferulato (4-hidróxi-3-metoxicinamato). A feruloil esterase é também conhecida como esterase do ácido ferúlico, hidroxicinamoil esterase, FAE-III, éster da cinamoil éster hidrolase, FAEA, cinnAE, FAE-I ou FAE-II. Para efeitos da presente invenção, a atividade feruloil esterase é determinada usando p-nitrofenilferulato 0,5 mM como substrato em acetato de sódio 50 mM, pH 5,0. Uma unidade de feruloil esterase é igual à quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmol do ânion p- nitrofenolato por minuto a um pH 5, a 25°C.

[0063] Fragmento: O termo "fragmento" significa um polipeptídeo que tem um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo; em que o fragmento tem atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificadora celulolítica ou atividade xilanase. Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 85% dos resíduos de aminoácidos, por exemplo, pelo menos 90% dos resíduos de aminoácidos ou pelo menos 90% dos resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 ou SEQ ID NO: 79.

[0064] Enzima hemicelulolítica ou hemicelulase: O termo “enzima hemicelulolítica” ou “hemicelulase” significa uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas que hidrolisam um material hemicelulósico. Consulte, por exemplo, Shallom, D. e Shoham, Y. Microbial hemicellulases. Current Opinion In Microbiology, 2003, 6(3): 219-228). Hemicelulases são componentes importantes na degradação de biomassa vegetal. Exemplos de hemicelulases incluem, mas não se limitam, a uma acetilmanano esterase, acetilxilano esterase, arabinanase, arabinofuranosidase, esterase do ácido cumarínico, feruloil esterase, galactosidase, glicuronidase, glicuronoil esterase, mananase, manosidase, xilanase e xilosidase. Os substratos destas enzimas, as hemiceluloses, são um grupo heterogêneo de polissacarídeos lineares e ramificados ligados através de ligações de hidrogênio às microfibrilas de celulose na parede celular vegetal, reticulando-os em uma rede robusta. As hemiceluloses também estão covalentemente ligadas à lignina, formando, juntamente com a celulose, uma estrutura altamente complexa. A estrutura variável e a organização de hemiceluloses exige a ação harmonizada de muitas enzimas para a sua completa degradação. Os módulos catalíticos das hemicelulases são glicosídeo hidrolases (GHs) que hidrolisam as ligações glicosídicas ou carboidrato esterases (CEs), que hidrolizam as ligações éster de acetato ou grupos laterais de ácido ferúlico. Estes módulos catalíticos, com base na homologia de suas sequências primárias, podem ser atribuídos em famílias de GH e CE. Algumas famílias, com uma dobra geralmente similar, podem ser ainda mais agrupados em clãs, marcados alfabeticamente (por exemplo, GH-A). Uma classificação mais informativa e atualizada dessas e de outras enzimas de hidrato de carbono ativo está disponível na base de dados de enzimas carboidratos-ativo (CAZy). As atividades da enzima celuolítica podem ser medidas de acordo com Ghose e Bisaria, 1987, Pure & AppI. Chem. 59: 1739-1752, em uma temperatura adequada, por exemplo, 50°C, 55°C ou 60°C, e pH, por exemplo, de 5,0 ou 5,5.

[0065] Condições de estringência alta: O termo “condições de estringência alta” significa para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5x SSPE, 0,3% de SDS, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado e 50% de formamida, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão durante 12 a 24 horas. O material de suporte é por fim lavado três vezes cada durante 15 minutos, usando 2X SSC, 0,2% de SDS a 65°C.

[0066] Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que seja suscetível à transformação, transfecção, transdução ou similares com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da presente invenção. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer progenia de uma célula de origem que não é idêntica à célula de origem devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0067] Isolado: O termo "isolado" significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitadores de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância incluindo, mas sem se limitar, a uma enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removido de um ou mais ou todos os constituintes que ocorrem naturalmente com os quais ela está associada na natureza; (3) qualquer polipeptídeo modificada pelo homem em relação àquela substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada pelo aumento da quantidade da substância em relação aos outros componentes, com os quais ela está naturalmente associada (por exemplo, múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado com o gene que codifica a substância). O polipeptídeo da presente invenção pode ser utilizado em aplicações industriais, sob a forma de um produto de caldo de fermentação, ou seja, o polipeptídeo da presente invenção é um componente de um caldo de fermentação usado como um produto em aplicações industriais (por exemplo, produção de etanol). O produto de caldo de fermentação irá compreender, além do polipeptídeo da presente invenção, ingredientes adicionais utilizados no processo de fermentação, tais como, por exemplo, as células (incluindo as células hospedeiras contendo o gene que codifica o polipeptídeo da presente invenção que são usadas para produzir um polipeptídeo de interesse), fragmentos celulares, biomassa, meios de fermentação e/ou produtos de fermentação. O caldo de fermentação pode, opcionalmente, ser submetido a uma ou mais etapas de purificação (incluindo filtração) para remover ou reduzir um mais componentes de um processo de fermentação. Por conseguinte, uma substância isolada pode estar presente em tal produto de caldo de fermentação.

[0068] Condições de estringência baixa: O termo “condições de estringência baixa” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5x SSPE, 0,3% de SDS, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado e 25% de formamida, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão durante 12 a 24 horas. O material de suporte é por fim lavado três vezes cada durante 15 minutos, usando 2X SSC, 0,2% de SDS a 50°C.

[0069] Polipeptídeo maduro: O termo "polipeptídeo maduro" significa um polipeptídeo em sua forma final após a tradução e quaisquer modificações pós-tradução, como processamento N-terminal, truncamento C- terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Sabe-se na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais diferentes polipeptídeos maduros (ou seja, com um aminoácido C-terminal e/ou N- terminal diferente) expresso pelo mesmo polinucleotídeo.

[0070] Sequência que codifica o polipeptídeo maduro: o termo "sequência que codifica o polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro com atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificadora celulolítica ou xilanase.

[0071] Condições de estringência média: O termo “condições de estringência média” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5x SSPE, 0,3% de SDS, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado e 35% de formamida, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão durante 12 a 24 horas. O material de suporte é por fim lavado três vezes cada durante 15 minutos, usando 2X SSC, 0,2% de SDS a 55°C.

[0072] Condições de estringência médio-alta: O termo “condições de estringência médio-alta” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5x SSPE, 0,3% de SDS, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado e 35% de formamida, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão durante 12 a 24 horas. O material de suporte é por fim lavado três vezes cada durante 15 minutos, usando 2X SSC, 0,2% de SDS a 60°C.

[0073] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de modo que não poderia existir outra forma na natureza ou que seja sintético, que compreende uma ou mais sequências controle.

[0074] Operavelmente ligado: O termo "operavelmente ligado" significa uma configuração na qual uma sequência controle é colocada em uma posição adequada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo, de modo que a sequência controle direciona a expressão da sequência codificante.

[0075] Peptídeo: O termo "peptídeo" significa um peptídeo menor que compreende menos de cerca de 20 aminoácidos consecutivos.

[0076] Polinucleotídeo: O termo "polinucleotídeo" significa uma sequência de ácido nucleico que compreende mais de cerca de 30 nucleotídeos consecutivos ou nucleotídeos modificados. Polinucleotídeos incluem DNA, RNA, m-RNA, r-RNA, t-RNA, cDNA, duplex de DNA-RNA, etc.

[0077] Polipeptídeo: O termo "polipeptídeo" significa um peptídeo mais longo que compreende mais de cerca de 20 aminoácidos consecutivos. O termo "polipeptídeo" compreende as proteínas, fragmentos de proteínas, formas clivadas de proteínas, proteínas parcialmente digeridas e similares, que são maiores do que cerca de 20 aminoácidos consecutivos.

[0078] Polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica: o termo "polipeptídeo com atividade intensificadora celulolítica” significa um polipeptídeo GH61 que catalisa a intensificação da hidrólise de um material celulósico pela enzima com atividade celulolítica. Para fins da presente invenção, a atividade intensificadora celulolítica é determinada medindo-se o aumento na redução de açúcares ou o aumento do total de celobiose e glicose a partir da hidrólise de material celulósico pela enzima celulolítica sob as seguintes condições: 1 a 50 mg de proteína total/g total de celulose em PCS, em que a proteína total é composta de 50 a 99,5% p/p de proteína de enzima celulolítica e de 0,5 a 50% p/p de um polipeptídeo GH61 com atividade intensificadora celulolítica durante 1 a 7 dias em uma temperatura adequada, por exemplo, 50°C, 55°C ou 60°C e pH, por exemplo, de 5,0 ou 5,5, em comparação com uma hidrólise de controle com carga de proteína total igual sem atividade intensificadora celulolítica (1 a 50 mg de proteína celulolítica/g fator de celulose em PCS). Em um aspecto preferencial, uma mistura de 1,5 L de CELLUCLAST® (Novozymes A/S, Bagsvwrd, Dinamarca), na presença de 2 a 3% de proteína total em peso de beta-glicosidase de Aspergillus oryzae (recombiantemente produzido em Aspergillus oryzae de acordo com WO 02/095014) ou 2 a 3% do peso de proteína total de beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus (produzida de modo recombinante em Aspergillus oryzae, como descrito em WO 2002/095014) da carga de proteína celulase é usado como a fonte da atividade celulolítica.

[0079] Os polipeptídeos GH61 com atividade intensificadora celulolítica aumentam a hidrólise do material celulósico catalisada por enzima com atividade celulolítica pela redução da quantidade de enzima celulolítica necessária para atingir o mesmo grau de hidrólise, preferencialmente de pelo menos 1,01 vez, por exemplo, pelo menos 1,05 vez, pelo menos 1,10 vez, pelo menos 1,25 vez, pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou pelo menos 20 vezes.

[0080] Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e pelo menos 100% da atividade intensificadora celulolítica do polipeptídeo da SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 79.

[0081] Palha de milho pré-tratada: O termo "PCS" ou “palha de milho pré-tratada” significa um material celulósico derivado de palha de milho por tratamento com calor e ácido sulfúrico diluído, pré-tratamento alcalino ou pré-tratamento neutro.

[0082] Identidade de sequência: O termo “identidade de sequência” significa uma comparação entre os pares de ácidos nucleicos ou moléculas de aminoácidos, ou seja, a relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências nucleotídicas. Em geral, as sequências são alinhadas de modo que a correspondência de ordem mais alta é obtida. Métodos para determinar a identidade de sequência são conhecidos e podem ser determinados por programas de computador comercialmente disponíveis que podem calcular a % de identidade entre duas ou mais sequências. Um exemplo típico de tal programa de computador é o CLUSTAL. Como exemplo, por um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos com pelo menos, por exemplo, 90% de identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeos de referência entende-se que a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo é idêntica à sequência de referência, exceto que a sequência polinucleotídica pode incluir, em média, até 10 mutações pontuais para cada 100 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de referência. Em outras palavras, para obter um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos pelo menos 90% idêntica a uma sequência de nucleotídeos de referência, até 10% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser eliminados ou substituídos com outro nucleotídeo, ou uma quantidade de nucleotídeos de até 10% do nucleotídeos totais na sequência de referência pode ser inserida na sequência de referência. Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer nas posições terminais 5' ou 3' da sequência de nucleotídeos de referência ou em qualquer lugar entre aquelas posições terminais, intercaladas individualmente entre os nucleotídeos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. Da mesma forma, por um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, por exemplo, 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos de referência se entende que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é idêntica à sequência de referência, exceto que a sequência do polipeptídeo pode incluir em média até 10 alterações de aminoácidos para cada 100 aminoácidos do aminoácido de referência. Em outras palavras, para obter um polipeptídeo com sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a um sequência de aminoácidos de referência, até 10% dos resíduos de aminoácidos na sequência de referência podem ser eliminados ou substituídos com outro aminoácido, ou uma quantidade de nucleotídeos de até 10% dos resíduos de aminoácidos totais na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Essas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições terminais amino ou carbóxila da sequência de aminoácidos de referência ou em qualquer lugar entre aquelas posições terminais, intercaladas individualmente entre os resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência

[0083] Métodos preferenciais para determinar a identidade são concebidos para fornecer a maior correspondência entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade são descritos em programas de computador publicamente disponíveis. Métodos de programa de computador preferidos para determinar a identidade entre duas sequências incluem o pacote de programas GCG, incluindo GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. ácido Res. 12: 387; Genetics Computer Group, Universidade de Wisconsin, Madison, WI, EUA), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410). O programa BLASTX é publicamente disponível a partir do National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD, EUA; Altschul et al., supra). O algoritmo de Smith-Waterman bem conhecido também pode ser usado para determinar a identidade. Por exemplo, usando o algoritmo computacional GAP (Genetics Computer Group, Universidade de Wisconsin, Madison, WI, EUA), duas proteínas, para as quais a identidade de sequência porcentual deve ser determinada são alinhados para a correspondência ideal de seus respectivos aminoácidos (o “período de correspondência”, conforme determinado pelo algoritmo). Uma penalidade de lacunas de abertura (que é calculada como 3 vezes a diagonal média; a “diagonal média” é a média da diagonal da matriz de comparação sendo usada; "diagonal" é a pontuação ou o número atribuído a cada aminoácido perfeito emparelhado pela matriz de comparação específica) e uma penalidade de lacunas de extensão (que normalmente é de {fração (1/10)} vezes a penalidade de lacunas de abertura), bem como uma matriz de comparação como PAM 250 ou BLOSUM 62 são usadas em conjunto com o algoritmo. Uma matriz de comparação padrão também é usada pelo algoritmo (consulte Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, Suppl. 3, (1978) para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 10915-10919, para a matriz de comparação BLOSUM 62).

[0084] Para efeitos da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) conforme implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros utilizados são a penalidade de lacunas de abertura de 10, penalidade de lacunas de extensão de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle denominado "identidade mais longa" (obtido usando a opção - nobrief) é usado como a identidade porcentual e é calculado da seguinte forma: (Resíduos idênticos x 100)/(Comprimento do alinhamento- número de lacunas total no alinhamento)

[0085] Para efeitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeo é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra), conforme implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), de preferência a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros utilizados são penalidade de lacunas de abertura de abertura de 10, penalidade de lacunas de extensão de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NUC4.4 de NCBI). O resultado de Needle denominado "identidade mais longa" (obtido usando a opção - nobrief) é usado como a identidade porcentual e é calculado da seguinte forma: (Desoxirribonucleotídeos idênticos x 100)/(Comprimento do alinhamento-número de lacunas total no alinhamento)

[0086] Subsequência: O termo “subsequência” significa um polinucleotídeo que tem um ou mais (por exemplo, vários) nucleotídeos ausentes da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificadora de polipeptídeo; em que a subsequência codifica um fragmento que tem atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificadora celulolítica ou de xilanase. Em um aspecto, uma subsequência contém pelo menos 85% dos nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 90% dos nucleotídeos ou pelo menos 95% dos nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75 ou SEQ ID NO: 77.

[0087] Variante: O termo "variante" significa um polipeptídeo que tem atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificador acelulolítica ou xilanase compreendendo uma alteração, ou seja, uma substituição, inserção e/ou eliminação, em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Uma substituição significa uma substituição do aminoácido que ocupa uma posição com um aminoácido diferente; uma eliminação significa a remoção do aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa a adição de um aminoácido adjacente a e imediatamente após um aminoácido que ocupa uma posição.

[0088] Condições de estringência muito alta: O termo “condições de estringência muito alta” significa para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5x SSPE, 0,3% de SDS, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado e 50% de formamida, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão durante 12 a 24 horas. O material de suporte é por fim lavado três vezes cada durante 15 minutos, usando 2X SSC, 0,2% de SDS a 70°C.

[0089] Condições de estringência muito baixa: O termo “condições de estringência muito baixa” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5x SSPE, 0,3% de SDS, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado e 25% de formamida, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão durante 12 a 24 horas. O material de suporte é por fim lavado três vezes cada durante 15 minutos, usando 2X SSC, 0,2% de SDS a 45°C.

[0090] Material contendo xilano: O termo “material contendo xilano” significa qualquer material que compreende um polissacarídeo de parede celular vegetal que contém uma estrutura de resíduos de xilose beta-(1-4)- ligados. Xilanos das plantas terrestres são heteropolímeros que possuem uma estrutura de beta-(1-4)-D-xilopiranose, que é ramificada por cadeias curtas de carboidratos. Eles compreendem o ácido D-glicurônico ou o seu éter 4-O- metílico, L-arabinose e/ou vários oligossacarídeos, compostos de D-xilose, L- arabinose, D- ou L-galactose e D-glicose. Polissacarídeos tipo xilano podem ser divididos em homoxilanos e heteroxilanos, que incluem glicuronoxilanos, (arabino)glicuronoxilanos, (glicurono)arabinoxilanos, arabinoxilanos e heteroxilanos complexos. Consulte, por exemplo, Ebringerova et al., 2005, Adv. Polym. Sci. 186: 1-67.

[0091] Nos processos da presente invenção, qualquer material que contenha xilano pode ser usado. Em um aspecto preferencial, o material contendo xilano é a lignocelulose.

[0092] Atividade de degradação de xilano ou atividade xilanolítica: o termo “atividade de degradação de xilano” ou “atividade xilanolítica” significa uma atividade biológica que hidrolisa xilana material contendo xilano. As duas abordagens básicas para medir a atividade xilanolítica incluem: (1) medir a atividade xilanolítica total e (2) medir as atividades xilanolíticas individuais (por exemplo, endoxilanases, beta- xilosidases, arabinofuranosidases, alfa-glicuronidases, acetilxilano esterases, feruloil esterases e alfa-glicuronil esterases). Recentes progressos nos ensaios das enzimas xilanolíticas foram resumidos em várias publicações, incluindo Biely e Puchard, Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova e Biely, 2006, Glucuronoyl esterase - Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune, FEBS Letters 580(19): 4597-4601; Herrmann, Vrsanska, Jurickova, Hirsch, Biely e Kubicek, 1997, The beta-D- xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase, Biochemical Journal 321: 375-381.

[0093] A atividade de degradação de xilano total pode ser medida pela determinação dos açúcares redutores formados a partir de vários tipos de xilano, incluindo, por exemplo: xilanos de aveia, espelta, madeira de faia e madeira de lariço, ou pela determinação fotométrica de fragmentos de xilano corados liberados de vários xilanos covalentemente corados. O ensaio da atividade xilanolítica total mais comum baseia-se na produção de açúcares redutores a partir do 4-O-metil-glicuronoxilano polimérico, conforme descrito em Bailey, Biely, Poutanen, 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270. A atividade xilanase também pode ser determinada com 0,2% de AZCL- arabinoxilanos como substrato em 0,01% de TRITON® X-100 (4-(1,1,3,3- tetrametilbutil)fenilpolietilenoglicol) e 200 mM de tampão fosfato de sódio em pH 6, a 37°C. Uma unidade da atividade xilanase é definida como 1,0 μmol de azurina produzida por minuto a 37°C, pH 6 a partir de 0,2% de AZCL-arabinoxilano como substrato em 200 mM de tampão fosfato de sódio pH 6.

[0094] Para efeitos da presente invenção, a atividade de degradação de xilano é determinada medindo-se o aumento na hidrólise do xilano de madeira de faia (Sigma Chemical Co., Inc., St. Louis, MO, EUA) por enzima(s) de degradação de xilano sob as seguintes condições típicas: reações de 1 mL, com 5 mg/mL de substrato (sólidos totais), 5 mg de proteína xilanolítica/g de substrato, acetato de sódio 50 mM, pH 5, a 50°C durante 24 horas, análise de açúcar usando o ensaio de hidrazida do ácido p- hidroxibenzoico (PHBAH), conforme descrito por Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47: 273-279.

[0095] Xilanase: O termo "xilanase" significa uma 1,4-beta-D- xilanoxilo-hidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise das ligações 1,4-beta-D-xilosídicas em xilanos. Para fins da presente invenção, a atividade xilanase é determinada com 0,2% de AZCL-arabinoxilano como substrato em 0,01% de TRITON® X-100 e tampão fosfato de sódio 200 mM, pH 6 a 37°C. Uma unidade da atividade xilanase é definida como 1,0 μmol de azurina produzida por minuto a 37°C, pH 6 a partir de 0,2% de AZCL-arabinoxilano como substrato em 200 mM de tampão fosfato de sódio pH 6.

[0096] Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e pelo menos 100% da atividade xilanase do polipeptídeo da SEQ ID No: 74, SEQ ID NO: 76 ou SEQ ID NO: 78. Descrição Detalhada da Invenção: Polipeptídeos com Atividade Celobio-hidrolase, Endoglicanase, Intensificadora Celulolítica ou Xilanase

[0097] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 81%, pelo menos, 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos, 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 4; pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% e identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 6; pelo menos 91%, por exemplo, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 8; ou pelo menos 99%, por exemplo, 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 10, que têm atividade celobio-hidrolase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem por até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, a partir do polipeptídeo da SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 8, ou SEQ ID No: 10.

[0098] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 2 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 2.

[0099] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 4 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 4.

[00100] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 6 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 6.

[00101] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 8 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 8.

[00102] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 10 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 10.

[00103] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 12; pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 14 ou SEQ ID No: 16; pelo menos 91%, por exemplo, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 18; pelo menos 96%, por exemplo, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 20; ou pelo menos 98%, por exemplo, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 22 ou SEQ ID No: 24, que têm atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, os polipeptídeos diferem por até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, a partir do polipeptídeo da SEQ ID No: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 24.

[00104] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 12 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 12.

[00105] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 14 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 14.

[00106] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 16 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 16.

[00107] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 18 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 18.

[00108] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 20 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 20.

[00109] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 22 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 22.

[00110] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 24 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 24.

[00111] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 26; pelo menos 65%, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 28; pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 30 ou SEQ ID No: 32; pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 81%, pelo menos, 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos de 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 34, SEQ ID No: 36 ou SEQ ID No: 38; pelo menos 85%, por exemplo, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 40 ou SEQ ID No: 42; pelo menos 97%, por exemplo, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 44; ou pelo menos 98%, por exemplo, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 46, que têm atividade endoglicanase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem por até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, a partir do polipeptídeo da SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 46.

[00112] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 26 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 26.

[00113] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 28 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 28.

[00114] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 30 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 30.

[00115] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 32 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 32.

[00116] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 34 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 34.

[00117] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 36 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 36.

[00118] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 38 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 38.

[00119] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 40 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 40.

[00120] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 42 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 42.

[00121] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 44 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 44.

[00122] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 46 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 46.

[00123] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 48; pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a o polipeptídeo da SEQ ID No: 50, SEQ ID No: 52, SEQ ID No: 54 ou SEQ ID No: 79; pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 56, SEQ ID No: 58, SEQ ID No: 60, SEQ ID No: 62 ou SEQ ID No: 64; pelo menos 85%, por exemplo, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 66; ou pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 68, SEQ ID No: 70 ou SEQ ID No: 72, que têm atividade intensificadora celulolítica. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem por até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo da SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 79.

[00124] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 48 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 48.

[00125] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 50 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 50.

[00126] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 52 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 52.

[00127] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 54 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 54.

[00128] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 56 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 56.

[00129] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 58 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 58.

[00130] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 60 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 60.

[00131] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 62 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 62.

[00132] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 64 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 64.

[00133] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 66 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 66.

[00134] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 68 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 68.

[00135] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 70 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 70.

[00136] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 72 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 72.

[00137] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 79 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 79.

[00138] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 74, pelo menos 94%, por exemplo, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 78, ou pelo menos 98%, por exemplo, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 76, que têm atividade xilanase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem por até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo da SEQ ID No: 74, SEQ ID No: 76 ou SEQ ID No: 78.

[00139] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 74 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 74.

[00140] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 76 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 76.

[00141] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 78 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma com atividade celobio-hidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo da SEQ ID No: 78.

[00142] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com atividade celobio-hidrolase codificados pelos polinucleotídeos que hibridizam sob condições de estringência muito baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência média, condições de estringência médio-alta, condições de estringência alta ou condições de estringência muito alta com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9, (ii) a sequência de cDNA dos mesmos ou (iii) o complemento inteiro de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[00143] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com atividade celobio-hidrolase codificados pelos polinucleotídeos que hibridizam sob condições de estringência muito baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência média, condições de estringência médio-alta, condições de estringência alta ou condições de estringência muito alta com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23, (ii) a sequência de cDNA dos mesmos ou (iii) o complemento inteiro de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[00144] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com atividade endoglicanase codificados pelos polinucleotídeos que hibridizam sob condições de estringência muito baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência média, condições de estringência médio-alta, condições de estringência alta ou condições de estringência muito alta com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 45, (ii) a sequência de cDNA dos mesmos ou (iii) o complemento inteiro de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[00145] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com atividade celulolítica codificados pelos polinucleotídeos que hibridizam sob condições de estringência muito baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência média, condições de estringência médio-alta, condições de estringência alta ou condições de estringência muito alta com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69 ou SEQ ID NO: 71, (ii) a sequência de cDNA dos mesmos ou (iii) o complemento inteiro de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[00146] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com atividade xilanase codificados pelos polinucleotídeos que hibridizam sob condições de estringência muito baixa, condições de estringência baixa, condições de estringência média, condições de estringência médio-alta, condições de estringência alta ou condições de estringência muito alta com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, (ii) a sequência de cDNA dos mesmos ou (iii) o complemento inteiro de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[00147] O polinucleotídeo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75 ou SEQ ID NO: 77, ou uma subsequência do mesmo, bem como o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 ou SEQ ID NO: 79, o polipeptídeo maduro do mesmo, ou um fragmento do mesmo, pode ser usado para conceber sondas de ácido nucleico para identificar e clonar os polipeptídeos que codificam DNA com atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificadora celulolítica ou xilanase, de cepas de diferentes gêneros ou espécies de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para a hibridização com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, de acordo com os procedimentos de Southern blotting padrão, a fim de identificar e isolar o gene correspondente nestas. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35 ou pelo menos 70 nucleotídeos de comprimento. Preferencialmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos ou pelo menos 900 nucleotídeos de comprimento. Sondas tanto de DNA quanto de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[00148] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras cepas pode ser testada para o DNA que hibridiza com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo que tem atividade celobio- hidrolase, endoglicanase, intensificadora celulolítica ou xilanase. DNA genômico ou outro de tais outras cepas pode ser separado por eletroforese em gel de poliacrilamida ou agarose ou por outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separada pode ser transferido para e imobilizado na nitrocelulose ou outro material de suporte adequado. Para identificar um clone ou DNA que hibridiza com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45. SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, or SEQ ID NO: 77, a sequência codificante do polpeptídeo madura do mesmo, ou uma subsequência do mesmo, o material de suporte é usado em um Southern blot.

[00149] Para efeitos da presente invenção, a hibridização indica que os polinucleotídeos hibridizam para uma sonda de ácido nucleico marcada que corresponde a polinucleotídeos cruzam uma sonda rotulados ácido nucleico correspondente a (i) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75 ou SEQ ID NO: 77; (ii) a sequência codificadora de polipeptídeo das mesmas; (iii) a sequência de cDNA das mesmas; (iv) o complemento inteiro das mesmas; ou (v) uma subsequência das mesmas; sob condições de estringência de muito baixa a muito alta. Moléculas para que a sonda de ácido nucleico hibridiza sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, um filme de raio-x ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[00150] Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 ou SEQ ID NO: 79; o polipeptídeo maduro da mesma; ou um fragmento da mesma. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75 ou SEQ ID NO: 77; a sequência que codifica o polipeptídeo maduro da mesma; ou a sequência de cDNA da mesma.

[00151] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com atividade celobio-hidrolase codificados pelos polinucleotídeos que têm pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, ou as sequências de cDNA da mesma; pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 5 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 91%, por exemplo, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID não: 7 ou as sequências de cDNA da mesma; ou pelo menos 99%, por exemplo, 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 9 ou a sequência de cDNA da mesma.

[00152] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com atividade celobio-hidrolase codificados pelos polinucleotídeos com pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID O: 11; ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 13 ou SEQ ID No: 15, ou as sequências de cDNA da mesma; pelo menos 91%, por exemplo, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 17 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 96%, por exemplo, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 19 ou a sequência de cDNA da mesma; ou pelo menos 98%, por exemplo, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 21 ou SEQ ID No: 23, ou as sequências de cDNA da mesma.

[00153] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com atividade endoglicanase codificados pelos polinucleotídeos com pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 25 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 65%, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 27, ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 29 ou SEQ ID No: 31, ou as sequências de cDNA da mesma; pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos de 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 33, SEQ ID No: 35 ou SEQ ID No: 37, ou as sequências de cDNA da mesma; pelo menos 85%, por exemplo, pelo menos de 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 39 ou SEQ ID No: 41, ou as sequências de cDNA da mesma; pelo menos 97%, por exemplo, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 43 ou a sequência de cDNA da mesma; u pelo menos 98%, por exemplo, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 45, ou a sequência de cDNA da mesma.

[00154] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com atividade intensificadora celulolítica codificado pelos polinucleotídeos com pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 47 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 49, SEQ ID No: 51, ou SEQ ID No: 53, ou as sequências de cDNA da mesma; pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 55, SEQ ID No: 57, SEQ ID No: 59, SEQ ID No: 61 ou SEQ ID No: 63, ou as sequências de cDNA da mesma; pelo menos 85%, por exemplo, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 65 ou a sequência de cDNA da mesma; ou pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 67, SEQ ID No: 69 ou SEQ ID No: 71, ou as sequências de cDNA da mesma.

[00155] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados com atividade xilanase codificados pelos polinucleotídeos com pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 73 ou a sequência de cDNA do mesmo, pelo menos 94%, por exemplo, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 77, ou a sequência de cDNA da mesma, ou pelo menos 98%, por exemplo, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 75 ou a sequência de cDNA da mesma. Em outra modalidade, a presente invenção refere-se às variantes que compreendem o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 ou SEQ ID NO: 79 que compreendem uma substituição, eliminação e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, em várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácidos introduzidos no polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 ou SEQ ID NO: 79 é de até 10, por exemplo, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. As alterações dos aminoácidos podem ser de natureza secundária, que são substituições ou inserções de aminoácidos conservadoras que não afetam significativamente o dobramento e/ou a atividade da proteína; pequenas eliminações, tipicamente de 1 a 30 aminoácidos; extensões amino ou carbóxila-terminais pequenas, como um resíduo de metionina aminoterminal; um peptídeo ligante pequeno de até 20 a 25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação mediante alteração da carga líquida ou outra função, como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[00156] Exemplos de substituições conservadoras estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que em geral não alteram a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, em The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. São substituições comuns Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

[00157] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de natureza tal que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade de substrato, mudar o pH ideal ou assim por diante.

[00158] Aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, como a mutagênese direcionada a sítio ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, mutações de alanina individuais são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para a atividade da celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificadora celulolítica ou xilanase para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Consulte também Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 46994708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinado por análise física da estrutura, conforme determinado por tais técnicas como a ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons ou marcação por fotoafinidade, juntamente com a mutação de aminoácidos de sitio de contato putativos. Consulte, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade dos aminoácidos essenciais também pode ser inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[00159] Substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácidos únicas ou múltiplas podem ser feitas e testados usando os métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguido por um procedimento de varredura relevante, como aqueles divulgados por Reidhaar- Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propenso, exibição de fago (p. ex., Lowman et al., 1991, 30 bioquímica: 10832-10837; Patente Norte-Americana No. 5.223.409; WO 92/06204), e mutagênese direcionada a região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[00160] Métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de varredura automatizados de alta produtividade para detectar a atividade de polipeptídeos modificado clonados expressos por células do hospedeiro (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de DNA modificadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir de células hospedeiras e rapidamente sequenciadas utilizando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a rápida determinação da importância dos resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[00161] Um polipeptídeo da presente invenção pode ser um polipeptídeo híbrido, em que uma região de um polipeptídeo é fundida no N- terminal ou C-terminal de uma região de outro polipeptídeo.

[00162] Um polipeptídeo da presente invenção pode ser um polipeptídeo de fusão ou um polipeptídeo de fusão clivável, em que outro polipeptídeo é fundido no N-terminal ou C-terminal do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido pela fusão de um polinucleotídeo que codifica outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para a produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica e incluem a ligação das sequências codificantes que codificam os polipeptídeos, de modo que eles estão na estrutura e que a expressão do polipeptídeo fundido está sob o controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador(es). Os polipeptídeos de fusão também podem ser construídos usando a tecnologia de inteína, em que os polipeptídeos de fusão são criados após a tradução (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[00163] Um polipeptídeo de fusão pode ainda compreender um sítio de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após a secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de sítios de clivagem incluem, mas não se limitam, aos sítios divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982- 987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6:240248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

[00164] Em uma modalidade, um polipeptídeo degradante de celulose da presente invenção pode ser funcionalmente estável em uma temperatura de até 120°C, em particular de até 100°C, em particular de até 80°C, em particular de até 70°C, em particular de até 60°C, mais particularmente de até 50°C.

[00165] Em outra modalidade, um polipeptídeo degradante de celulose da presente invenção pode apresentar hidrólise de substrato ideal ou atividade intensificadora de hidrólise de substrato a uma temperatura dentro da faixa de cerca de 10°C a cerca de 90°C, como de cerca de 10°C a cerca de 80°C, particularmente na faixa de cerca de 20°C a cerca de 60°C ou de cerca de 50°C a cerca de 80°C.

[00166] Em outra modalidade, um polipeptídeo degradante de celulose da presente invenção pode apresentar hidrólise de substrato ideal ou atividade intensificadora de hidrólise de substrato a um pH dentro da faixa de cerca de pH 2 a cerca de 10, como de cerca de 3 a cerca de 9, particularmente na faixa de cerca de 4 a cerca de 8 ou de cerca de 5 a cerca de 7.

[00167] Em outra modalidade, um polipeptídeo degradante de celulose da presente invenção intensifica a hidrólise de um material celulósico juntamente com outras enzimas com atividade celulolítica. Fontes de Polipeptídeos com Atividade Celulolítica ou Hemicelulolítica

[00168] Um polipeptídeo que tem atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificadora celulolítica ou xilanase da presente invenção pode ser obtido a partir dos micro-organismos de qualquer gênero. Para efeitos da presente invenção, o termo "obtido de", como usado neste documento juntamente com uma determinada fonte deve significar que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte, ou por uma cepa em que o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o polipeptídeo obtido a partir de uma determinada fonte é secretado extracelularmente. Em outro aspecto, o polipeptídeo pode ser obtido de um microrganismo como uma célula procariótica, uma célula de Archaea ou uma célula eucariótica.. Em outro aspecto, o polipeptídeo pode ser feito sinteticamente, ocorrer naturalmente ou ser uma combinação de ambos.

[00169] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Chaetomium. Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Chaetomium senegalense. Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Chaetomium thermophilum.

[00170] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Corynascus. Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Corynascus thermophilus.

[00171] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Malbranchea. Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Malbranchea cinnamomea.

[00172] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipepídeo de Melanocarpus. Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Melanocarpus albomyces.

[00173] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Remersonia. Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Remersonia thermophila.

[00174] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Rhizomucor. Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Rhizomucor miehei.

[00175] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Scytalidium. Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Scytalidium indonesiacum.

[00176] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Talaromyces. Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Talaromyces byssochlamydoides. Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Talaromyces emersonii. Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Talaromyces leycettanus. Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Talaromyces thermophilus.

[00177] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Thermoascus. Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Thermoascus aurantiacus.

[00178] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Thermomyces. Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Thermomyces lanuginosus.

[00179] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Thermomucor. Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Thermomucor indicae-seudaticae.

[00180] Será compreendido que, para as espécies acima mencionadas, a invenção abrange ambos os estados perfeito e imperfeito e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual são conhecidos. As pessoas versadas na técnica irão prontamente reconhecer a identidade de equivalentes adequados.

[00181] As cepas destas espécies são prontamente acessíveis ao público em uma variedade de coleções de cultura, como a Coleção Americana de Cultura de Células (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e a Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Centro de Pesquisa Regional do Norte (NRRL).

[00182] O polipeptídeo pode ser identificado e obtido de outras fontes, incluindo micro-organismos isolados da natureza (por exemplo, do solo, adubos, água, etc.). ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo, solo, adubos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolar os microrganismos e DNA dos habitats são bem conhecidas na arte. Uma polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode ser, deste modo, obtido pela triagem semelhante de um DNA genômico ou biblioteca de cDNA de outro microrganismo ou amostra de DNA misturada. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo foi detectado com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando as técnicas que são bem conhecidas pelas pessoas normalmente versadas na técnica (consulte, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra). Polinucleotídeos

[00183] A presente invenção refere-se também aos polinucleotídeos isolado que codificam um polipeptídeo da presente invenção, conforme descrito neste documento.

[00184] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo são conhecidas na arte e incluem isolamento do DNA genômico ou cDNA, ou uma combinação destas. A clonagem dos polinucleotídeos de tal DNA genômico pode ser realizada, por exemplo, pelo uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) bem conhecida ou varredura de anticorpos das bibliotecas de expressão para detectar os fragmentos de DNA clonados com as características estruturais comuns. Consulte, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos, tais como a reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada por ligação (LAT) e amplificação baseada em polinucleotídeo (NASBA) podem ser usados. Os polinucleotídeos podem ser clonados de uma cepa de Chaetomium, Corynascus, Malbranchea, Melanocarpus, Remersonia, Scytalidium, Talaromyces, Thermomyces ou Thermomucor, ou de um organismo relacionado e assim, por exemplo, podem ser um alelo ou uma espécie variante da região que codifica o polipeptídeo do polinucleotídeo.

[00185] A modificação de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para sintetizar polipeptídeos substancialmente semelhantes ao polipeptídeo. O termo "substancialmente semelhante” ao polipeptídeo refere-se a formas de ocorrência não natural do polipeptídeo. Esses polipeptídeos podem ser diferentes de alguma forma manipulada do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa, por exemplo, variantes que diferem em atividade específica, termoestabilidade, pH ótimo ou similares. As variantes podem ser construídas com base no polinucleotídeo presente como a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75 ou SEQ ID NO: 77, ou as sequências de cDNA das mesmas, pela introdução de substituições nucleotídicas que não resultam em uma mudança na sequência de aminoácidos do polipeptídeo, mas que correspondem ao uso de códon do organismo hospedeiro destinado à produção da enzima, ou pela introdução de substituições nucleotídicas que podem dar origem a uma sequência de aminoácidos diferente. Para uma descrição geral de substituição de nucleotídeos, consulte, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

[00186] Em uma modalidade, os polinucleotídeos da presente invenção são selecionados de um DNA, RNA ou cDNA. A sequência de nucleotídeos pode ser obtida por procedimentos de clonagem padrão usados em engenharia genética para realocar a sequência de nucleotídeos de seu local natural para um sítio diferente onde ela será reproduzida. Os procedimentos de clonagem podem envolver excisão e isolamento de um fragmento desejado que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo, a inserção do fragmento em uma molécula de vetor e a incorporação do vetor recombinante em uma célula hospedeira, onde cópias múltiplas ou clones da sequência de nucleotídeos será replicada. A sequência de nucleotídeos pode ser de origem genômica, cDNA, RNA, semissintética, sintética ou qualquer combinação das mesmas.

[00187] Em outra modalidade, os polinucleotídeos da presente invenção pertencem às famílias de glicosil hidrolases GH6, GH7, GH10, GH45 e GH61. Na presente invenção, a sequência de nucleotídeos foi obtida através da geração de bibliotecas das glicosil hidrolases GH6, GH7, GH10, GH45 e GH61 conhecidas e executando um algoritmo que pode identificar sequências de peptídeos conservadas, também chamadas de n-mers, como hexapeptídeos conservados. Tal algoritmo inclui as seguintes etapas: para cada biopolímero, fazer todos os n-meros que ocorrem na sequência de biopolímero, selecione todos os biopolímeros que contêm mais do que um número definido de n-meros, fazer todos os n-meros que ocorrem nestes biopolímeros e um número definido de n-meros mais abundante, voltar para a etapa 2 até que nenhum n-mero novo seja feito no ciclo seguinte. O algoritmo é exemplificado no Exemplo 1 da presente invenção e pode, por exemplo, ser usado para identificar peptídeos conservados, por exemplo, nas famílias de genes exemplares ou em subgrupos das famílias de genes.

[00188] O teste prático mostrou que um trecho de pelo menos seis aminoácidos conservados é necessário para conceber os iniciadores funcionais para PCR degenerado de DNA genômico ou cDNA (Sambrook e Russell, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque). Por outro lado, pode ser difícil encontrar sequências de aminoácidos conservadas que sejam mais longas do que seis resíduos ao trabalhar com famílias de proteínas grandes ou muito divergentes. Portanto, uma forma de analisar uma família de proteínas para encontrar peptídeos conservados que pode ser usada para projeto de iniciadores degenerados é identificar os hexapeptídeos que ocorrem com mais frequência na família. Hexapeptídeos conservados foram traduzidos inversamente de acordo com o código genético e posições contendo qualquer nucleotídeo (A, C, G ou T) foram substituídas com inosina. Os nucleotídeos degenerados na extremidade 3' dos iniciadores foram removidos da sequência dos iniciadores. A degeneração do iniciador que resultou da tradução reversa de cada hexapeptídeo foi calculada com base no código genético e substituição das posições contendo qualquer nucleotídeo (A, C, G ou T) com inosina. Além disso, a posição relativa dos hexapeptídeos nas proteínas foi estimada como a média da distância do peptídeo até o N-terminal de cada proteína no subgrupo que continha o peptídeo.

[00189] As sequências para os iniciadores foram selecionadas com base em três critérios: eles devem ter alta frequência na família de genes GH; eles devem fornecer um amplicon de pelo menos 40 pares de bases, excluindo as sequências iniciadoras a fim de obter informações de sequência suficientes para identificar o produto de PCR e os iniciadores devem ter a menor redundância possível, e bases redundantes na extremidade 3' não são permitidas. Uma cauda de seis bases (CTGGAC) foi adicionada à extremidade 5' de todas as sequências iniciadoras, uma vez que isto melhora o desempenho dos iniciadores curtos. Os iniciadores reversos foram concebidos para serem complementares à sequência de DNA que codifica o hexapeptídeo e de acordo com as mesmas regras, e PCR do DNA de diferentes microrganismos foram amplificados e as sequências analisadas. Explicações detalhadas desta abordagem são descritas nos Exemplos da presente invenção.

[00190] Em outra modalidade, um polinucleotídeo da presente invenção pode ser isolado ou produzido com base em uma biblioteca de DNA de um procarioto, como uma bactéria ou um eucarioto, como um fungo ou levedura.

[00191] Em outra modalidade, um polinucleotídeo da presente invenção pode ser isolado de um fungo que degrada carboidratos, como substratos celulósicos. Tais fungos incluem, por exemplo, ascomicetos, basidioicetos, zigomicetos ou oomicetos.

Construtos de ácido nucleico

[00192] A presente invenção refere-se também aos construtos de ácido nucleico que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção operavelmente ligado a uma ou mais (por exemplo, várias) sequência(s) de controle que direciona(m) a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências controle.

[00193] Um polinucleotídeo pode ser manipulado de várias formas para proporcionar a expressão do polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar os polinucleotídeos usando métodos de DNA recombinante são bem conhecidos na técnica.

[00194] A sequência controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. O promotor contém sequências de controle de transcrição que medeiam à expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostra atividade de transcrição na célula hospedeira, incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares, homólogos ou heterólogos para a célula hospedeira.

[00195] Exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula bacteriana hospedeira são os promotores obtidos do gene da alfa- amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (AmyL), gene da penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), gene da amilase maltogênica do Bacillus stearothermophilus (amyM), gene da levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis coli lac operon, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene da agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), e gene da beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Outros promotores são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" em Gilbert et al., 1980, Scientific American, 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores em tandem são divulgados em WO 99/43835.

[00196] Exemplos de promotores adequados para orientar a transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira de fungos filamentoso são promotores obtidos dos genes para acetamidase de Aspergillus nidulans,acetamidase, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável a ácido de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori (glaA), amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglicosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glicosidase de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei, endoglicanase I de Trichoderma reesei, endoglicanase II de Trichoderma reesei, endoglicanase III de Trichoderma reesei, endoglicanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta- xilosidase de Trichoderma reesei e fator de alongamento de tradução de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene da alfa-amilase neutro de Aspergillus em que o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus; exemplos não limitantes incluem os promotores modificados de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, e em que o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfatoisomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e promotores mutantes, truncados e híbridos dos mesmos. Outros promotores são descritos na Patente Norte-Americana No. 6,011,147.

[00197] Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos a partir dos genes para a enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO1), galactoquinase de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), álcool desidrogenase/glicealdeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP) triose fosfato isomerase de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) e 3- fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[00198] A sequência controle também pode ser um terminador de transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. O terminador é operavelmente ligada ao terminal 3’ do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer terminador que é funcional na célula hospedeira pode ser usado na presente invenção.

[00199] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes de protease alcalina de Bacillus clausii (aprH), alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL) e RA ribossomal de Escherichia coli (rrnB).

[00200] Terminadores preferenciais para as células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidos dos genes para acetamidase de Aspergillus nidulans, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glicoamilase de Aspergillus niger, alfa-glicosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum, beta- glicosidase de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei, endoglicanase I de Trichoderma reesei, endoglicanase II de Trichoderma reesei, endoglicanase III de Trichoderma reesei, endoglicanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta-xiloidase de Trichoderma reesei e fator de alongamento de tradução de Trichoderma reesei.

[00201] Terminadores preferenciais para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para a enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al.,1992, acima. A sequência controle também pode ser uma região estabilizadora de mRNA à jusante de um promotor e à montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.

[00202] Exemplos de regiões estabilizadoras de mRNA adequadas são obtidas de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e de um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

[00203] A sequência controle também pode ser uma região não traduzida líder, de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A sequência líder é operavelmente ligada ao terminal 5’ do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer sequência líder que é funcional na célula hospedeira pode ser usada.

[00204] Sequências líderes preferenciais para as células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidas a partir dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[00205] Sequências líderes adequadas para as células hospedeiras de levedura são obtidas a partir dos genes para a enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO1), 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa da Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

[00206] A sequência controle também pode ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operavelmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mRNA transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira pode ser usada.

[00207] Sequências de poliadenilação preferenciais para células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidas a partir dos genes para antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glicoamilase de Aspergillus niger, alfa-glicosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae e protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[00208] Sequências de poliadenilação úteis para as células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[00209] A sequência controle pode ser uma região codificadora de peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado ao N-terminal de um polipeptídeo e direciona o polipeptídeo para dentro da via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificante de peptídeo sinal naturalmente ligada no quadro de leitura de tradução com o segmento da sequência codificante que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma sequência codificante de peptídeo sinal que é estrangeira à sequência codificante. Uma sequência codificante de peptídeo sinal pode ser necessária onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência codificante de peptídeo sinal. Alternativamente, uma sequência codificante de peptídeo sinal estrangeira pode simplesmente substituir a sequência codificante de peptídeo sinal natural para aumentar a secreção do polipeptídeo. No entanto, qualquer sequência codificante de peptídeo sinal que direciona o polipeptídeo expresso na via secretora de uma célula hospedeira pode ser usada.

[00210] Sequências codificantes de peptídeo sinal eficazes para as células hospedeiras bacterianas são as sequências codificantes de peptídeo sinal obtidas a partir dos genes de amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos sinal adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[00211] Sequências codificantes de peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras de fungos filamentosos são as sequências codificantes de peptídeo sinal obtidas a partir dos genes para a amilase neutra de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglicanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[00212] Peptídeos sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos a partir dos genes para o fato alfa de Saccharomyces cerevisiae e a invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências codificantes de peptídeo sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, acima.

[00213] A sequência controle também pode ser uma sequência codificante de pró-peptídeo que codifica um pró-peptídeo posicionado no N- terminal de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma proenzima ou propolipeptídeo (ou um zimógeno em alguns casos). Um propolipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo do pró-polipeptídeo. A sequência codificante de pró-peptídeo pode ser obtida dos genes da protease alcalina do Bacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT) lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[00214] Onde ambas as sequências de peptídeo sinal e pró-peptídeo estão presentes, a sequência pró-peptídeo é posicionada próxima do N- terminal de um polipeptídeo e a sequência de peptídeo sinal é posicionada próximo do N-terminal da sequência pró-peptídeo.

[00215] Também pode ser desejável adicionar sequências reguladoras que regulam a expressão do polipeptídeo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sequências reguladoras são aquelas que causam a expressão do gene a ser ativado ou desativado em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Sequências reguladoras em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Em leveduras, o sistema ADH2 ou o sistema GAL1 pode ser usado. Em fungos filamentosos, o promotor da glicoamilase de Aspergillus niger, promotor TAKA da alfa-amilase de Aspergillus oryzae e o promotor da glicoamilase de Aspergillus oryzae, o promotor da celobio- hidrolase I de Trichoderma reesei e o promotor da celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei podem ser usados. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem a amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências reguladoras incluem o gene da di-hidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes da metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nesses casos, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo poderia estar operavelmente ligado com a sequência de regulação.

Vetores de Expressão

[00216] A presente invenção refere-se também aos vetores de expressão recombinantes que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor e sinais de parada de transcrição e tradução. As várias sequências de nucleotídeo e controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais (por exemplo, vários) sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo em tais sítios. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso pela inserção do polinucleotídeo ou um construto de ácido nucleico que compreende o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Ao criar o vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor, de modo que a sequência codificante é operavelmente ligada com as sequências de controle adequadas para expressão.

[00217] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vector (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido aos processos de DNA recombinante e pode causar a expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor tipicamente dependerá da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira, onde o vetor deve ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo circular fechado ou linear.

[00218] O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossomal, a replicação do qual sendo independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minocromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) em que ele foi integrado. Além disso, um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contêm juntos o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon, pode ser utilizado.

[00219] O vetor preferencialmente contém um ou mais (por exemplo, vários) marcadores selecionáveis que permitem a fácil seleção de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona um caráter biocida ou de resistência viral, resistência aos metais pesados, prototrofia para auxótrofos e similares.

[00220] Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são os genes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis ou marcadores que conferem resistência a antibióticos, como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3. Marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira de fungo filamentoso incluem, mas não se limitam, a adeA (fosforribosilaminoimidazolsuccinocarboxamida sintase), adeB (fosforribosilaminoimidazol sintase), amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase) e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. São preferenciais para uso em uma célula de Aspergillus os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus. São preferenciais para uso em uma célula de Trichoderma os genes adeA, adeB, amdS, hph e pyrG.

[00221] Estes marcadores selecionáveis podem ser um sistema marcador selecionável duplo conforme descrito em 2010 WO/039889. Em um aspecto, o marcador selecionável duplo é um sistema marcador selecionável duplo hph-tk.

[00222] O vetor preferencialmente contém (um) elemento(s) que permite(m) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou a replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

[00223] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para a integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionar a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local/locais preciso(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em um local preciso, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, como de 100 a 10.000 pares de bases, de 400 a 10.000 pares de bases e de 800 a 10.000 pares de bases, que têm um alto grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para aumentar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[00224] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender ainda uma origem de replicação que permite que o vetor se replique de maneira autônoma na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer plasmídeo replicador que medeia a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo "origem de replicação" ou "replicador de plasmídeo" significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[00225] Exemplos de origens bacterianas de replicação são as origens de replicação dos plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184, permitindo a replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060 e pAMβl, permitindo a replicação em Bacillus.

[00226] Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3 e a combinação de ARS4 e CEN6.

[00227] Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula de fungo filamentoso são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene pode ser realizado de acordo com os métodos divulgados em WO 00/24883.

[00228] Mais de uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento do número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou pela inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo, onde as células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável e, por meio disto, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas pelo cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.

[00229] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são conhecidos por um pessoa versada na técnica (consulte, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células Hospedeiras

[00230] A presente invenção refere-se também às células hospedeiras recombinantes, que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção operavelmente ligado a uma ou mais (por exemplo, várias) sequências controle que direcionam a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Um construto ou vetor que compreende um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira de modo que o construto ou vetor é mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante, como descrito anteriormente. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer progenia de uma célula de origem que não é idêntica à célula de origem devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande parte do gene que codifica o polipeptídeo e sua origem.

[00231] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, um procarioto ou um eucarioto.

[00232] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria gram-positiva ou gram-negativa. Bactérias gram-positivas incluem, mas não se limitam, a Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus e Streptomyces. Bactérias gram-negativas incluem, mas não se limitam a Campylobacter, E. Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella e Ureaplasma.

[00233] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus, incluindo, mas sem se limitar, às células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis.

[00234] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas sem se limitar, às células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus. Zooepidemicus cells.

[00235] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas sem se limitar, às células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus e Streptomyces lividans.

[00236] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode, por exemplo, ser realizada por transformação de protoplasto (consulte, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação de células competentes (consulte, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (consulte, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou por conjugação (consulte, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 52715278). A introdução de DNA em um E. coli cell may be effected by protoplast transformation (see, e.g., Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o eletroporação (consulte, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser realizada pela transformação de protoplastos, eletroporação (consulte, por exemplo, Gong et al., 2004, O152 Folia. Microb. (Praha) 49: 399-405), conjugação (consulte, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) ou transdução (consulte, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode, por exemplo, efetuar-se por eletroporação (consulte, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou conjugação (consulte, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode, por exemplo, ser realizada por competência natural (consulte, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformação de protoplasto (consulte, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207, por eletroporação (consulte, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou conjugação (consulte, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No entanto, qualquer método conhecido da técnica para a introdução de DNA em uma célula hospedeira pode ser usado.

[00237] A célula hospedeira pode também ser um eucarioto, como um mamífero, inseto, planta ou célula fúngica.

[00238] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. “Fungos” como usado neste documento, inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota, bem como Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definido por Hawksworth et al., em Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK).

[00239] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. "Levedura", conforme usado neste documento, inclui a levedura ascosporógena (Endomycetales), levedura de basidiosporógeno e leveduras pertencentes aos fungos imperfeitos (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de leveduras pode mudar no futuro, para efeitos da presente invenção, levedura será definido conforme descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, e Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[00240] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou célula de Yarrowia como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis ou Yarrowia lipolytica.

[00241] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glicano, quitosana, manano e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbio.. Por outro lado, o crescimento vegetativo por leveduras como Saccharomyces cerevisiae é pelo brotamento de um talo unicelular e catabolismo de carbono pode ser fermentativa.

[00242] A célula hospedeira de fungo filamentoso pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

[00243] Por exemplo, a célula hospedeira de fungo filamentoso pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

[00244] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo que envolve a formação de protoplasto, a transformação do protoplasto e a regeneração da parede celular de uma forma conhecida por si. Procedimentos adequados para a transformação das células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023 e Yelton et al., 1984, proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Métodos adequados para a transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de Produção

[00245] A presente invenção refere-se também aos métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, que compreendem: (a) cultivar uma célula, que, na sua forma tipo selvagem, produz o polipeptídeo, sob condições que contribuam para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[00246] Em um aspecto, a célula é uma célula de Chaetomium. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Chaetomium senegalense. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Chaetomium thermophilum.

[00247] Em outro aspecto, a célula é uma célula de Corynascus. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Corynascus thermophilus.

[00248] Em outro aspecto, a célula é uma célula de Malbranchea. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Malbranchea cinnamomea.

[00249] Em outro aspecto, a célula é uma célula de Melanocarpus. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Melanocarpus albomyces.

[00250] Em outro aspecto, a célula é uma célula de Remersonia. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Remersonia thermophila.

[00251] Em outro aspecto, a célula é uma célula de Rhizomucor. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Rhizomucor miehei.

[00252] Em outro aspecto, a célula é uma célula de Scytalidium. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Scytalidium indonesiacum.

[00253] Em outro aspecto, a célula é uma célula de Talaromyces. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Talaromyces byssochlamydoides. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Talaromyces emersonii. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Talaromyces leycettanus. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Talaromyces thermophilus.

[00254] Em outro aspecto, a célula é uma célula de Thermoascus. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Thermoascus aurantiacus.

[00255] Em outro aspecto, a célula é uma célula de Thermomyces. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Thermomyces lanuginosus.

[00256] Em outro aspecto, a célula é uma célula de Thermomucor. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Thermomucor indicae-seudaticae.

[00257] A presente invenção refere-se também aos métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, que compreendem (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante da presente invenção sob as condições condutoras para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[00258] As células são cultivadas em um meio nutritivo adequado para a produção do polipeptídeo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser cultivadas por cultivo em frasco sob agitação, o fermentação em pequena escala ou em grande escala (incluindo fermentações por lote, lote alimentado ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais em um meio apropriado e sob condições que permitem que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolados. O cultivo ocorre em um meio nutriente apropriado, compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados são disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, nos catálogos da Coleção Americana de Cultura de Células). Se o polipeptídeo é secretado para o meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado, ele pode ser recuperado dos lisados celulares.

[00259] O polipeptídeo pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Esses métodos de detecção incluem, mas não se limitam ao uso de anticorpos específicos, a formação de um produto enzimático ou o desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo, um ensaio de enzima pode ser usado para determinar a atividade do polipeptídeo.

[00260] O polipeptídeo pode ser recuperado usando os métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado a partir do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas sem se limitar, a coleta, centrifugação, filtração, extração, atomização, evaporação ou precipitação. Em um aspecto, o caldo de fermentação total é recuperado.

[00261] O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas sem se limitar, a cromatografia (por exemplo, de troca iônica, por afinidade, hidrofóbica, de cromatofocagem e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (consulte, por exemplo, Protein Purification, Janson e Ryden, editors, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter polipeptídeos substancialmente puros.

[00262] Em um aspecto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas ao invés disso, uma célula hospedeira da presente invenção expressando o polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo. Plantas

[00263] A presente invenção refere-se também às plantas, por exemplo, uma planta transgênica, parte da planta ou célula vegetal, que compreende um polinucleotídeo da presente invenção para expressar e produzir um polipeptídeo em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode ser recuperado da planta ou parte da planta. Alternativamente, a planta ou parte da planta que contém o polipeptídeo pode ser utilizada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorando o valor nutritivo, a palatabilidade e os propriedades reológicos, ou para destruir um fator antinutritivo.

[00264] A planta transgênica podem ser uma dicotiledônea (dicot) ou uma monocotiledônea (monocot). Exemplos de plantas monocot são gramíneas, como a gramínea dos prados (pasto dos prados, Poa), gramíneas forrageiras como Festuca, Lolium, grama de clima temperado, como Agrostis e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho (milho).

[00265] Exemplos de plantas dicot são tabaco, leguminosas, como o tremoço, batata, beterraba, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), como couve-flor, sementes de colza e o organismo modelo intimamente relacionado Arabidopsis thaliana.

[00266] Exemplos de partes vegetais são haste, calo, folhas, raiz, frutas, sementes e tubérculos, bem como os tecidos individuais compreendendo estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares e meristemas. Compartimentos celulares vegetais específicos, como cloroplastos, apoplastos, mitocôndrias, vacúolos, peroxissomas e citoplasma também são considerados uma parte da planta. Além disso, qualquer célula vegetal, qualquer que seja a origem do tecido, é considerada uma parte da planta. Da mesma forma, partes da planta como tecidos específicos e células isoladas para facilitar a utilização da invenção também são consideradas partes da planta, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e revestimentos de semente.

[00267] Também são incluídos no escopo da presente invenção a progenia de tais plantas, partes de plantas e células vegetais.

[00268] Uma planta transgênica ou célula vegetal expressando o polipeptídeo pode ser construída de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Em resumo, a planta ou a célula vegetal é construída pela incorporação de um ou mais construtos de expressão que codificam o polipeptídeo no genoma hospedeiro da planta ou no genoma do cloroplasto e a propagação da planta modificada resultante ou célula vegetal em uma planta transgênica ou célula vegetal.

[00269] O construto de expressão é convenientemente um construto de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo operavelmente ligado com sequências reguladoras apropriadas necessárias para a expressão de polinucleotídeo na planta ou parte da planta de escolha. Além disso, o construto de expressão pode compreender um marcador selecionável útil para identificar células vegetais em que o construto de expressão foi integrado e sequências de DNA necessárias para a introdução do construto na planta em questão (este último depende do método de introdução de DNA a ser usado).

[00270] A escolha das sequências reguladoras, tais como as sequências promotora e de terminação e opcionalmente sequências de sinal ou trânsito é determinada, por exemplo, com base em quando, onde e como deseja-se que o polipeptídeo seja expresso. Por exemplo, a expressão do gene que codifica um polipeptídeo pode ser constitutiva ou indutível, ou pode ser específica do desenvolvimento, estágio ou tecido, e o produto do gene pode ser alvejado a um tecido ou parte da planta específico, como sementes ou folhas. As sequências reguladoras são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

[00271] Para a expressão constitutiva, 35S-CaMV, a ubiquitina do milho 1 e o promotor de actina 1 do arroz podem ser usados (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Promotores de órgãos específicos podem ser, por exemplo, um promotor dos tecidos coletores de armazenamento, tais como sementes, tubérculos de batata e frutas (Edwards e Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303) ou de tecidos de coleta metabólicos como os meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863878), um promotor específico de sementes como o promotor da glutelina, prolamina, globulina ou promotor da albumina de arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39:. 39: 885-889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene da proteína de semente desconhecida de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), um promotor de uma proteína de corpo de óleo de semente (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), o promotor napA da proteína de armazenamento de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico de semente conhecido na técnica, por exemplo, como descrito em WO 91/14772. Além disso, o promotor pode ser um promotor específico de folha como o promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), o promotor do gene de adenina metiltransferase do vírus chlorella (Mitra e Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), o promotor do gene aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674), ou um promotor induzível por ferida, como o promotor pin2 de batata (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Da mesma forma, o promotor pode ser induzido por tratamentos abióticos como a temperatura, secura ou alterações na salinidade ou ser induzido por substâncias exogenamente aplicadas que ativam o promotor, por exemplo, etanol, estrogênios, hormônios vegetais tais como etileno, ácido abscísico, ácido giberélico e metais pesados.

[00272] Um elemento potenciador do promotor também pode ser usado para atingir uma expressão mais alta de um polipeptídeo na planta. Por exemplo, o elemento potenciador do promotor pode ser um íntron que é colocado entre o promotor e o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, divulga o uso do primeiro íntron do gene 1 da actina de arroz para aumentar a expressão.

[00273] O gene marcador selecionável e todas as outras partes do construto de expressão podem ser escolhidos dentre aqueles disponíveis na técnica.

[00274] O construto de ácido nucleico é incorporado no genoma da planta, de acordo com técnicas convencionais conhecidas na arte, incluindo a transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeio de partículas, transformação biolística e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338:274).

[00275] A transferência de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens é um método para a geração de dicotiledôneas transgênicas (para uma revisão, consulte Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19:1538) e para transformar monocotiledôneas, embora outros métodos de transformação podem ser usados estas plantas. Um método para a geração de monocotiledôneas transgênicas é o bombardeio de partículas (ouro microscópico ou partículas de tungstênio microscópicas revestidas com o DNA transformante) de caules embrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant J. de Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para a transformação das monocotiledôneas baseia-se na transformação de protoplasto, conforme descrito por Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Additional transformation methods include those described in U.S. Patent Nos. 6.395.966 e 7.151.204 (ambas sendo aqui incorporadas por referência nas suas totalidades).

[00276] Após a transformação, os transformantes tendo incorporado o construto de expressão são selecionados e regenerados em plantas inteiras de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Muitas vezes, o procedimento de transformação é projetado para a eliminação seletiva dos genes de seleção durante a regeneração ou nas gerações seguintes pelo uso, por exemplo, da cotransformação com dois construtos de T-DNA separados ou excisão sítio específica do gene da seleção por uma recombinase específica.

[00277] Além da transformação direta de um genótipo vegetal particular com um construto da presente invenção, plantas transgênicas podem ser feitas pelo cruzamento de uma planta com o construto para uma segunda planta sem o construto. Por exemplo, um construto que codifica um polipeptídeo pode ser introduzido em uma variedade de planta particular por cruzamento, sem a necessidade de transformar diretamente uma planta daquela determinada variedade. Portanto, a presente invenção compreende não apenas uma planta diretamente regenerada de células que foram transformadas de acordo com a presente invenção, mas também a progenia de tais plantas. Como usado aqui, a progenia pode se referir à descendência de qualquer geração de uma planta de origem preparada de acordo com a presente invenção. Tal descendência pode incluir um construto de DNA preparado de acordo com a presente invenção. O cruzamento resulta na introdução de um transgene em uma linhagem vegetal por polinização cruzada de uma linhagem inicial com uma linhagem vegetal doadora. Nonlimiting examples of such steps are described in U.S. Patent No. 7,151,204.

[00278] As plantas podem ser geradas através de um processo de conversão de cruzamento reverso. Por exemplo, as plantas incluem plantas referidas como um genótipo, linhagem, puro ou híbrido.

[00279] Os marcadores genéticos podem ser usados para ajudar na introgressão de um ou mais transgenes da invenção de um cenário genético para outro. A seleção assistida por marcador oferece vantagens em relação à reprodução convencional pelo fato de que ela pode ser usada para evitar erros causados por variações fenotípicas. Além disso, marcadores genéticos podem fornecer dados sobre o grau relativo de germoplasma elite na progenia individual de um determinado cruzamento. Por exemplo, quando uma planta com uma característica desejada que, de outra forma, tem uma base genética não agronomicamente desejável, é cruzada com uma origem de elite, os marcadores genéticos podem ser usados para selecionar a progenia que não só possui a característica de interesse, mas que também tem uma proporção relativamente grande do germoplasma desejado. Desta forma, o número de gerações necessárias para introgredir uma ou mais características em uma base genética particular é minimizado.

[00280] A presente invenção refere-se também aos métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, que compreendem: (a) cultivar uma planta ou uma célula de planta transgênica que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo sob condições que contribuam para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. Remoção ou Redução da Atividade Celulolítica ou Hemicelulolítica

[00281] A presente invenção refere-se também aos métodos de produção de um mutante de uma célula de origem que compreende romper ou eliminar um polinucleotídeo, ou uma porção do mesmo, que codifica um polipeptídeo da presente invenção que resulta na célula mutante, produzindo menos do polipeptídeo do que a célula de origem quando cultivada sob as mesmas condições.

[00282] A célula mutante pode ser construída pela redução ou eliminação da expressão do polinucleotídeo usando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, inserções, interrupções, substituições ou eliminações. Em um aspecto preferencial, o polinucleotídeo é inativado. O polinucleotídeo a ser modificado ou inativado pode ser, por exemplo, a região codificadora ou uma parte da mesma essencial para a atividade, ou um elemento regulador necessário para a expressão da região codificadora. Um exemplo de tal sequência reguladora ou de controle pode ser uma sequência promotora ou uma parte funcional da mesma, ou seja, uma parte que é suficiente para afetar a expressão do polinucleotídeo. Outras sequências controle para possível modificação incluem, mas não se limitam, a uma sequência líder, de poliadenilação, sequência pró-peptídeo, sequência de peptídeo sinal, terminador de transcrição e ativador de transcrição.

[00283] A modificação ou inativação do polinucleotídeo pode ser realizada submetendo a célula de origem à mutagênese e selecionando células mutantes nas quais a expressão do polinucleotídeo foi reduzida ou eliminada. A mutagênese, que pode ser específica ou aleatória, pode ser realizado, por exemplo, pelo uso de um agente de mutagênese físico ou químico adequado, pelo uso de um oligonucleotídeo adequado ou submetendo a sequência de DNA à mutagênese gerada por PCR. Além disso, a mutagênese pode ser realizada pelo uso de qualquer combinação desses agentes de mutagênese.

[00284] Exemplos de um agente de mutagênese físico ou químico adequado para a presente invenção incluem irradiação ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil- hidroxilamina, ácido nitroso, sulfonato de etilmetano (EMS), bissulfito de sódio, ácido fórmico e análogos de nucleotídeo.

[00285] Quando tais agentes são realizados, a mutagênese é tipicamente realizada por incubação da célula de origem a sofrer mutagênese na presença do agente de mutagênese de escolha sob condições adequadas, e triagem e/ou seleção para as células mutantes que não exibem ou apresentam expressão reduzida do gene.

[00286] A modificação ou inativação do polinucleotídeo pode ser acompanhada pela inserção, substituição ou eliminação de um ou mais nucleotídeos no gene ou um elemento regulador necessário para a transcrição ou tradução do mesmo. Por exemplo, nucleotídeos podem ser inseridos ou removidos de modo a resultar na introdução de um códon de parada, a remoção do códon de início ou uma alteração no quadro de leitura aberto. Tal modificação ou inativação pode ser realizada por mutagênese direcionada a sítio ou mutagênese gerara por PCR de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Embora, a princípio, a modificação pode ser realizada in vivo, diretamente sobre a célula expressando o polinucleotídeo a ser modificado, é preferível que a modificação seja realizada in vitro, como exemplificado abaixo.

[00287] Um exemplo de uma maneira conveniente para eliminar ou reduzir a expressão de um polinucleotídeo baseia-se nas técnicas de substituição de gene, eliminação de gene ou interrupção de gene. Por exemplo, no método de interrupção de gene, uma sequência do ácido nucleico correspondendo ao polinucleotídeo endógeno é modificada in vitro para produzir uma sequência de ácidos nucleicos defeituosa que é, em seguida, transformada na célula de origem para produzir um gene defeituoso. Por recombinação homóloga se entende que a sequência de ácidos nucleicos defeituosa substitui o polinucleotídeo endógeno. Pode ser desejável que o polinucleotídeo defeituoso também codifique um marcador que pode ser usado para a seleção de transformantes em que o polinucleotídeo tenha sido modificado ou destruído. Em um aspecto, o polinucleotídeo é interrompido com um marcador selecionável como aqueles descritos neste documento.

[00288] A presente invenção também refere-se aos métodos de inibição da expressão de um polipeptídeo com atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificadora celulolítica ou xilanase em uma célula, que compreende a administração à célula ou expressão na célula de uma molécula de RNA de fita dupla (dsRNA), em que a dsRNA compreende uma subsequência de um polinucleotídeo da presente invenção. Em um aspecto preferencial, a dsRNA é de cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplex de comprimento.

[00289] O dsRNA é preferencialmente um RNA interferente pequeno (siRNA) ou um micro RNA (miRNA). Em um aspecto preferencial, o dsRNA é um RNA interferente pequeno para inibir a transcrição. Em outro aspecto preferencial, o dsRNA é micro RNA para inibir a tradução.

[00290] A presente invenção refere-se também a tais moléculas de RNA de fita dupla que compreendem uma parte da sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75 ou SEQ ID NO: 77 para inibir a expressão do polipeptídeo em uma célula. Embora a presente invenção não seja limitada por qualquer mecanismo específico de ação, o dsRNA pode entrar em uma célula e causar a degradação de um RNA de fita simples (ssRNA) de sequências similares ou idênticas, incluindo mRNAs endógenos. Quando uma célula é exposta ao dsRNA, o mRNA do gene homólogo é seletivamente degradado por um processo chamado de interferência de RNA (RNAi).

[00291] Os dsRNAs da presente invenção podem ser usados no silenciamento genético. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para degradar seletivamente o RNA usando um dsRNAi da presente invenção. O processo pode ser praticado in vitro, ex vivo ou in vivo. Em um aspecto, as moléculas de dsRNA podem ser usadas para gerar uma mutação de perda de função em uma célula, órgão ou animal. Métodos para fazer e usar moléculas de dsRNA para degradar seletivamente o RNA são bem conhecidos na técnica; consulte, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas Nos. Patent Nos. 6.489.127; 6.506.559; 6.511.824; e 6.515.109.

[00292] A presente invenção refere-se ainda a uma célula mutante de uma célula de origem que compreende uma interrupção ou eliminação de um polinucleotídicas que codifica o polipeptídeo ou uma sequência controle do mesmo ou um gene silenciador que codifica o polipeptídeo, que resulta na célula mutante produzindo menos polipeptídeo ou nenhum polipeptídeo em comparação com a célula de origem.

[00293] As células mutantes deficientes de polipeptídeo são particularmente úteis como as células hospedeiras para expressão de polipeptídeos nativos e heterólogos. Portanto, a presente invenção refere-se adicionalmente aos métodos de produção de um polipeptídeo nativo ou heterólogo, compreendendo (a) cultivar a célula mutante sob condições que contribuam para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. O termo “polipeptídeos heterólogos” significa os polipeptídeos que não são nativos para a célula hospedeira, por exemplo, uma variante de uma proteína nativa. A célula hospedeira pode compreender mais de uma cópia de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo nativo ou heterólogo.

[00294] Os métodos utilizados para o cultivo e purificação do produto de interesse podem ser realizados por métodos conhecidos na técnica.

[00295] Os métodos da presente invenção para produzir um produto essencialmente isento de celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificação celulolítica ou xilanase é de particular interesse na produção de polipeptídeos eucarióticos, particularmente de proteínas fúngicas, como enzimas. As células deficientes de celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificação celulolítica ou xilanase também podem ser usadas para expressar proteínas heterólogas de interesse farmacêutico como hormônios, fatores de crescimento, receptores e similares. O termo "polipeptídeos eucariótico" inclui não apenas os polipeptídeos nativos, mas também os polipeptídeos, por exemplo, enzimas, que foram modificados por substituições, eliminações ou adições de aminoácidos, ou outras tais modificações para melhorar a atividade, termoestabilidade, tolerância ao pH e similares.

[00296] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um produto de proteína essencialmente isento de celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificação celulolítica ou xilanase que é produzido por um método da presente invenção.

Composições

[00297] A presente invenção também refere-se às composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. Peferencialmente, as composições são enriquecidas em tal polipeptídeo. O termo "enriquecido" indica que a atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificadora celulolítica ou xilanase da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1.1.

[00298] As composições podem compreender um polipeptídeo da presente invenção como o principal componente enzimático, por exemplo, uma composição de um único componente. Alternativamente, as composições podem compreender várias atividades enzimáticas, tais como uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas adicionais selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo que tem atividade intensificadora celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, um expansina, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

[00299] As composições podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos na técnica e podem estar sob a forma de um líquido ou uma composição seca. As composições podem ser estabilizadas de acordo com os métodos conhecidos na técnica.

[00300] Em uma modalidade, a composição compreende ainda uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma ou mais (por exemplo, várias) xilanases, mananases, glicanases, celulases, lipases, esterases, proteases, endoglicosidases, endo-beta-1,4-glicanases, beta- glicanases, endo-beta-1,3(4)-glicanases, cutinases, peroxidases, catalases, lacases, amilases, glicoamilases, pectinases, redutases, oxidases, fenoloxidases, ligninases, pululanases, arabinanases, hemicelulases, mananases, xiloglicanases, xilanases, mananases, glicanases, pectina acetil esterases, ramnogalacturonano acetil esterases, poligalacturonases, ramnogalacturonases, galactanases, pectina liases, pectina metilesterases e transglutaminases.

[00301] As composições podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos na técnica e podem ter qualquer aparência física, como líquido, pasta ou sólido. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode ser formulada usando os métodos conhecidos na técnica de formulação de enzimas e/ou produtos farmacêuticos, por exemplo, em grânulos ou microgrânulos revestidos ou não revestidos. O polipeptídeo para ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com os métodos conhecidos na técnica, por exemplo, pela estabilização do polipeptídeo na composição pela adição de um antioxidante ou agente redutor para limitar a oxidação, ou o polipeptídeo pode ser estabilizado pela adição de polímeros, tais como PVP, PVA, PEG ou outros polímeros adequados conhecidos por serem benéficos para a estabilidade de polipeptídeos em composições sólidas ou líquidas.

[00302] As composições podem ser uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição de células, conforme descrito neste documento. Consequentemente, a presente invenção também refere-se às formulações de caldo de fermentação e às composições de células que compreendem um polipeptídeo que tem atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificadora celulolítica ou xilanase da presente invenção. Em algumas modalidades, a composição é um caldo integral de células mortas contendo ácido(s) orgânico(s), células mortas e/ou fragmentos celulares, e meio de cultura.

[00303] O termo “caldo de fermentação”, como usado neste documento, refere-se a uma preparação produzida por fermentação celular que não sofre, ou sofre mínima recuperação e/ou purificação. Por exemplo, os caldos de fermentação são produzidos quando culturas microbianas são cultivadas sob condições de saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas (por exemplo, a expressão de enzimas por células hospedeiras) e a secreção no meio de cultura de células. O caldo de fermentação pode conter conteúdos não fracionados ou fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Normalmente, o caldo de fermentação não é fracionado e compreende o meio de cultura usado e os fragmentos celulares presentes após as células microbianas (por exemplo, células de fungos filamentosos) serem removidas, por exemplo, por centrifugação. Em algumas modalidades, o caldo de fermentação contém meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares e células microbianas viáveis e/ou não viáveis.

[00304] Em uma modalidade, a formulação de caldo de fermentação e as composições de células compreendem um primeiro componente ácido orgânico que compreende pelo menos um ácido orgânico e/ou sal do mesmo com de 1 a 5 carbonos e um segundo componente de ácido orgânico que compreende pelo menos um ácido orgânico e/ou um sal do mesmo com 6 ou mais carbonos. Em uma modalidade específica, o primeiro componente ácido orgânico é o ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um sal do mesmo ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores, e o segundo componente de ácido orgânico é o ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 4- metilvalérico, ácido fenilacético, um sal dos mesmos ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores.

[00305] Em um aspecto, a composição contém (um) ácido(s) orgânico(s) e, opcionalmente, contém adicionalmente células mortas e/ou fragmentos celulares. Em uma modalidade, as células mortas e/ou fragmentos celulares são removidos de um caldo integral de células mortas para fornecer uma composição que é isenta desses componentes.

[00306] As formulações de caldo de fermentação ou composições de células podem ainda compreender um agente conservante e/ou antimicrobiano (por exemplo, um agente bacteriostático) incluindo, mas sem se limitar, ao sorbitol, cloreto de sódio, sorbato de potássio e outros conhecidos na técnica.

[00307] O caldo integral de células mortas pode compreender ainda uma ou mais atividades enzimáticas como acetilxilano esterase, alfa- arabinofuranosidase, alfa-galactosidase, alfa-glicuronidase, amilase, arabinanase, arabinofuranosidase, beta-galactosidase, beta-glicosidase, celobio-hidrolase, endoglicanase, endo-beta-1,3(4)-glicanase, esterase do ácido ferrúlico, galactanase, glicoamilase, glico-hidrolase, peroxidases híbridas, com propriedades combinadas de lignina peroxidases e peroxidases dependentes de manganês, mananase, manano acetil esterase, manosidase, pectato liase, pectina acetil esterase, pectina liase, pectina metil esterase, poligalacturonase, protease, ramnogalacturonano liase, ramnogalacturonano acetil esterase, ramnogalacturonase, xilanase, xilogalacturonosidase, xilogalacturonase, xiloglucanase e xilosidase.

[00308] Em algumas modalidades, o caldo integral de células mortas ou a composição incluem enzimas celulolíticas que incluem, mas não se limitam, a (i) endoglicanases (EG) ou 1,4-D-glicano-4-glicano-hidrolases (EC 3.2.1.4), (ii) exoglicanases, incluindo 1,4-D-glicano glicano-hidrolases (também conhecidas como celodextanases) (EC 3.2.1.74) e 1,4-D-glicano celobio-hidrolases (exocelobio-hidrolases, CBH) (EC 3.2.1.91) e (iii) beta- glicosidase (BG) ou beta-glicosídeo glico-hidrolases (EC 3.2.1.21).

[00309] O caldo integral de células mortas ou composição pode conter os conteúdos não fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo integral de células mortas ou a composição contêm o meio de cultura usado e fragmentos celulares presentes após as células microbianas (por exemplo, células de fungos filamentosos) serem cultivadas até a saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas (por exemplo, a expressão de enzima(s) celulase e/ou glicosidase. Em algumas modalidades, o caldo integral de células mortas ou a composição contêm o meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares e células de fungos filamentosos mortas. Em algumas modalidades, as células microbianas presentes no caldo integral de células mortas ou composição pode ser permeabilizado e/ou lisado usando métodos conhecidos na técnica.

[00310] Um caldo integral ou composição de células, conforme descrito neste documento, é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, fragmentos celulares, componentes de meio de cultura e/ou enzimas insolúveis. Em algumas modalidades, os componentes insolúveis podem ser removidos para fornecer uma composição líquida clarificada.

[00311] As formulações de caldo integral e composições celulares da presente invenção podem ser produzidas por um método descrito em WO 90/15861 ou WO 2010/096673.

[00312] São dados abaixo exemplos dos usos preferenciais das composições da presente invenção. A dosagem da composição e outras condições em que a composição é utilizada podem ser determinados com base nos métodos conhecidos na técnica. Usos

[00313] A presente invenção também é direcionada para os processos a seguir para uso dos polipeptídeos com atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificadora celulolítica ou xilanase, ou composições dos mesmos.

[00314] A presente invenção refere-se também aos processos para degradar ou converter um material celulósico ou contendo xilano, compreendendo: tratar o material celulósico ou contendo xilano com uma composição enzimática na presença de um polipeptídeo com atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, de intensificação celulolítica ou atividade xilanase da presente invenção. Em um aspecto, os processos compreendem ainda a recuperação do material degradado ou celulósico convertido ou material contendo xilano. Produtos solúveis de degradação ou conversão do material celulósico ou contendo xilano podem ser separados do material celulósico insolúvel ou contendo xilano usando um método conhecido na técnica como, por exemplo, centrifugação, filtração ou sedimentação por gravidade.

[00315] A presente invenção refere-se também aos processos de produção de um produto de fermentação, compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico ou um material contendo xilano com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo tendo atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, de intensificação celulolítica ou atividade xilanase da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico sacarificado ou contendo xilano com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação da fermentação.

[00316] A presente invenção refere-se também aos processos de fermentação de um material celulósico ou contendo xilano, compreendendo: fermentar o material celulósico ou material contendo xilano com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores, em que o material celulósico ou contendo xilano é sacarificado com uma composição enzimática na presença de um polipeptídeo com atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificadora celulolítica ou xilanase da presente invenção. Em um aspecto, a fermentação do material celulósico ou contendo xilano produz um produto de fermentação. Em outro aspecto, os processos compreendem ainda recuperar o produto da fermentação da fermentação.

[00317] A presente invenção refere-se também ao uso de um polipeptídeo degradante de celulose da presente invenção em uma composição detergente, em processos de acabamento têxtil, purificação de polipeptídeos, para a imobilização de enzimas ativas, para cozimento, para a fabricação de biocombustível, para a modificação das paredes celulares vegetais ou para o processamento de fibras de celulose.

[00318] Os processos da presente invenção podem ser usados para sacarificar o material celulósico ou contendo xilano em açúcares fermentáveis e para converter os açúcares fermentáveis em muitos produtos de fermentação úteis, por exemplo, combustível, etanol potável e/ou produtos químicos de plataforma (por exemplo, ácidos, álcoois, cetonas, gases e similares). A produção de um produto de fermentação desejável do material celulósico ou contendo xilano envolve tipicamente pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação) e fermentação.

[00319] O processamento do material celulósico ou contendo xilano de acordo com a presente invenção pode ser realizado usando métodos convencionais na técnica. Além disso, os processos da presente invenção podem ser implementados usando qualquer aparelho de processamento de biomassa convencional configurado para operar de acordo com a invenção.

[00320] Hidrólise (sacarificação) e fermentação, separada ou simultânea, incluem, mas não se limitam, a hidrólise e fermentação separadas (SHF); sacarificação e fermentação em simultâneo (SSF); sacarificação e cofermentação em simultâneo (SSCF); híbrido de hidrólise e fermentação (HHF); hidrólise e cofermentação em separado (SHCF); híbrido de hidrólise e cofermentação (HHCF); e conversão microbiana direta (DMC), também chamada algumas vezes de bioprocessamento consolidado (CBP). SHF usa etapas de processo separadas para primeiro hidrolisar enzimaticamente o material celulósico em açúcares fermentáveis, por exemplo, glicose, celobiose e monômeros de pentose e, em seguida, fermentar os açúcares fermentáveis em etanol. Em SSF, a hidrólise enzimática do material celulósico e a fermentação de açúcares em etanol são combinados em uma etapa (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212). SSCF envolve a cofermentação de vários açúcares (Sheehan, J., e Himmel, M., 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy’s research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817827). HHF envolve uma etapa de hidrólise separada, e além disso uma etapa de sacarificação e hidrólise simultânea, que pode ser realizada no mesmo reator. As etapas em um processo HHF podem ser realizadas em temperaturas diferentes, ou seja, sacarificação enzimática em alta temperatura seguida por SSF em uma temperatura mais baixa do que a cepa de fermentação pode suportar. DMC combina todos os três processos (produção enzimática, hidrólise e fermentação) em uma ou mais (por exemplo, várias) etapas, onde o mesmo organismo é usado para produzir as enzimas para conversão do material celulósico em açúcares fermentáveis e para converter os açúcares fermentáveis em um produto final (Lynd, L. R., Weimer, P. J., van Zyl, W. H., e Pretorius, I. S., 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentals and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66: 506-577). Entende-se na presente invenção que qualquer método conhecido na técnica que compreende pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação), fermentação ou uma combinação destes pode ser usado na prática dos processos da presente invenção.

[00321] Um aparelho convencional pode incluir um reator agitado de lote alimentado, um reator lote com agitação, um reator com agitação de fluxo contínuo com ultrafiltração e/ou um reator de coluna de fluxo pistão (Fernanda de Castilhos Corazza, Flávio Faria de Moraes, Gisella Maria Zanin and Ivo Neitzel, 2003, Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov, A. V., e Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batch reactor process, Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), an attrition reactor (Ryu, S. K., e Lee, J. M., 1983, Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 5365), ou um reator com intensa agitação induzida por campo eletromagnético (Gusakov, A. V., Sinitsyn, A. P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, O. V., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 141-153). Tipos de reatores adicionais incluem reatores tipo leito fluidizado, UASB, imobilizado e extrusora para hidrólise e/ou fermentação.

[00322] Pré-tratamento. Na prática dos processos da presente invenção, qualquer processo de pré-tratamento conhecido na técnica pode ser usado para interromper os componentes da parede celular vegetal do material celulósico ou contendo xilano (Chandra et al., 2007, Substrate pretreatment: The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics?, Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 67-93; Galbe e Zacchi, 2007, Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production, Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks e Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 96: 673-686; Taherzadeh e Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review, Int. J. of Mol. Sci. 9: 1621-1651; Yang e Wyman, 2008, Pretreatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr. 2: 26-40).

[00323] O material celulósico ou contendo xilano pode também ser submetido à redução de tamanho de partícula, peneiração, pré-imersão, umidificação, lavagem e/ou condicionamento antes do pré-tratamento usando métodos conhecidos na técnica.

[00324] Pré-tratamentos convencionais incluem, mas não se limitam, ao pré-tratamento com vapor (com ou sem explosão), pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com água quente, pré-tratamento alcalino, pré- tratamento com cal, oxidação por via úmida, explosão por via úmida, explosão por fibra de amônia, pré-tratamento com organosolv e pré- tratamento biológico. Pré-tratamentos adicionais incluem percolação com amônia, ultrassom, eletroporação, micro-ondas, CO2 supercrítico, H2O supercrítico, ozônio, líquido iônico e pré-tratamentos com irradiação gama.

[00325] O material celulósico ou contendo xilano pode ser pré-tratado antes da hidrólise e/ou fermentação. O pré-tratamento é preferencialmente realizado antes da hidrólise. Alternativamente, o pré-tratamento pode ser realizado simultaneamente com a hidrólise enzimática para liberação de açúcares fermentáveis, como a glicose, xilose e/ou celobiose. Na maioria dos casos, a etapa de pré-tratamento resulta em certo grau de conversão de biomassa em açúcares fermentáveis (mesmo na ausência de enzimas).

[00326] Pré-tratamento com vapor. No pré-tratamento com vapor, o material celulósico ou contendo xilano é aquecido para romper os componentes da parede celular vegetal, incluindo lignina, hemicelulose e celulose para tornar a celulose e outras fracções, por exemplo, hemicelulose, acessíveis às enzimas. O material celulósico ou contendo xilano passa para ou através de um recipiente reacional onde o vapor é injetado para aumentar a temperatura até a temperatura e pressão necessários, e é mantido nisso durante o tempo reacional desejado. O pré-tratamento com vapor é realizado preferencialmente de 140 a 250°C, por exemplo, de 160 a 200°C ou de 170 a 190°C, onde a faixa de temperatura ideal depende da adição de um catalisador químico. O tempo de residência para o pré-tratamento com vapor é preferencialmente de 1 a 60 minutos, por exemplo, de 1 a 30 minutos, de 1 a 20 minutos, de 3 a 12 minutos ou de 4 a 10 minutos, onde o tempo de residência ideal depende da faixa de temperatura e da adição de um catalisador químico. O pré-tratamento com vapor permite cargas com teor de sólidos relativamente altos, de modo que o material celulósico ou contendo xilano é geralmente apenas umedecido durante o pré-tratamento. O pré- tratamento com vapor é geralmente combinado com uma descarga explosiva do material após o pré-tratamento, que é conhecido como explosão de vapor, ou seja, a rápida evaporação para a pressão atmosférica e o fluxo turbulento do material para aumentar a área de superfície acessível por fragmentação (Duff e Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe e Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628; U.S. O Pedido de Patente Norte-Americana No. 20020164730). Durante o pré-tratamento com vapor, os grupos acetil da hemicelulose são clivados e o ácido resultante autocatalisa a hidrólise parcial da hemicelulose em monossacarídeos e oligossacarídeos. A lignina é removida apenas de forma parcial.

[00327] Pré-tratamento Químico: O termo "tratamento químico" refere- se a qualquer pré-tratamento químico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina. Tal pré-tratamento pode converter celulose cristalina em celulose amorfa. Exemplos de pré-tratamentos químicos adequados incluem, por exemplo, pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com cal, oxidação por via úmida, explosão por fibra de amônia/congelamento (AFEX), percolação com amônia (APR), líquido iônico e pré-tratamentos com organosolv.

[00328] Um catalisador como H2SO4 ou SO2 (tipicamente de 0,3 a 5% p/p) é frequentemente adicionado antes do pré-tratamento com vapor, o que diminui o tempo e a temperatura, aumenta a recuperação e melhora a hidrólise enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol. 39: 756-762). No pré- tratamento com ácido diluído, o material celulósico ou contendo xilano é misturado com ácido diluído, tipicamente H2SO4 e água para formar uma pasta fluida, aquecido por vapor até a temperatura desejada e, após um tempo de permanência, evaporado até a pressão atmosférica. O pré-tratamento com ácido diluído pode ser realizado com uma série de projetos de reator, por exemplo, reatores de fluxo em pistão, reatores contracorrente ou reatores com encolhimento de leito contracorrente contínuos (Duff e Murray, 1996, supra; Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115).

[00329] Vários métodos de pré-tratamento sob condições alcalinas também podem ser usados. Esses pré-tratamentos alcalinos incluem, mas não se limitam, a hidróxido de sódio, cal, oxidação por via úmida, percolação com amônia (APR) e explosão por fibra de amônia/congelamento (AFEX).

[00330] O pré-tratamento com cal é realizado com óxido de cálcio ou hidróxido de cálcio em temperaturas de 85 a 150°C e tempos de residência de 1 hora a vários dias (Wyman et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 1959- 1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673-686). WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900 e WO 2006/110901 divulgam métodos de pré-tratamento usando amônia.

[00331] A oxidação por via úmida é um pré-tratamento térmico realizado tipicamente de 180 a 200°C durante 5 a 15 minutos com a adição de um agente oxidativo, como o peróxido de hidrogênio ou oxigênio superpressurizado (Schmidt e Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677). O pré-tratamento é realizado preferencialmente com de 1 a 40% de matéria seca, por exemplo, de 2 a 30% de matéria seca ou de 5 a 20% de matéria seca, e muitas vezes o pH inicial aumenta pela adição de álcali, como carbonato de sódio.

[00332] Uma modificação do método de pré-tratamento de oxidação por via úmida, conhecido como explosão por via úmida (combinação de oxidação por via úmida e explosão de vapor) pode lidar com matéria seca de até 30%. Na explosão por via úmida, o agente oxidante é introduzido durante o pré-tratamento após um determinado tempo de residência. O pré-tratamento é, a seguir, finalizado por evaporação para a pressão atmosférica (WO 2006/032282).

[00333] A explosão de fibra de amônia (AFEX) envolve tratar o material celulósico ou contendo xilano ou amônia gasosa em temperaturas moderadas, tais como de 90 a 150°C e pressão elevada, como de 17 a 20 bar (1.7 a 2 MPa) durante 5 a 10 minutos, onde o teor de matéria seca pode ser tão alto quanto 60% (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 2014-2018). Durante o pré-tratamento AFEX, celulose e hemiceluloses permanecem relativamente intactos. Os complexos de lignina-carboidrato são clivados.

[00334] O pré-tratamento com organosolv deslignifica o material celulósico ou contendo xilano por extração usando etanol aquoso (40 a 60% de etanol) a 160 a 200°C durante 30 a 60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 90: 473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 219-230). Ácido sulfúrico é normalmente adicionado como um catalisador. No pré- tratamento de organosolv, a maior parte da hemicelulose e lignina é removida.

[00335] Outros exemplos de métodos de pré-tratamento adequados são descritos por Schell et al., 2003, Appl. Biochem. e Biotechnol. Vol. 105-108, páginas 69-85, and Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, and U.S. Published Application 2002/0164730.

[00336] Em um aspecto, o pré-tratamento químico é preferencialmente realizado como um tratamento com ácido diluído, e mais preferencialmente como um tratamento com ácido diluído contínuo. O ácido é, normalmente, ácido sulfúrico, mas outros ácidos também podem ser usados, como o ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido clorídrico ou misturas dos mesmos. O tratamento com ácido brando é realizado na faixa de pH de preferencialmente de 1 a 5, por exemplo, de 1 a 4 ou de 1 a 2,5. Em um aspecto, a concentração do ácido está na faixa, preferencialmente, de 0,01 a 10% em peso de ácido, por exemplo, de 0,05 a 5% em peso ou de 0,1 a 2% em peso. O ácido está em contato com o material celulósico ou contendo xilano e é mantido em uma temperatura na faixa de 140 a 200°C, por exemplo, de 165 a 190°C, por períodos que variam de 1 a 60 minutos.

[00337] Em outro aspecto, o pré-tratamento ocorre em uma fluida aquosa. Em aspectos preferenciais, o material celulósico ou contendo xilano está presente durante o pré-tratamento em quantidades preferencialmente entre 10 a 80% em peso, por exemplo, de 20 a 70% em peso ou de 30 a 60% em peso, como cerca de 40% em peso. O material celulósico ou contendo xilano pode ser não lavado ou lavado usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, lavado com água.

[00338] Pré-tratamento Mecânico ou Pré-tratamento Físico: O termo “pré-tratamento mecânico” ou “pré-tratamento físico” refere-se a qualquer pré-tratamento que promove a redução de tamanho de partículas. Por exemplo, tal pré-tratamento pode envolver vários tipos de trituração ou moagem (por exemplo, moagem a seco, moagem por via úmida ou moagem com bolas vibratórias).

[00339] O material celulósico ou contendo xilano pode ser pré-tratado fisicamente (mecanicamente) e quimicamente. O pré-tratamento mecânico ou físico pode ser acoplado a vaporização/explosão por vapor, hidrotermólise, tratamento com ácido diluído ou brando, alta temperatura, tratamento de alta pressão, irradiação (por exemplo, irradiação por micro-ondas) ou combinações dos mesmos. Em um aspecto, alta pressão significa pressão, preferencialmente, de cerca de 100 a cerca de 400 psi, por exemplo, de cerca de 150 a cerca de 250 psi. Em outro aspecto, alta temperatura significa temperaturas na faixa de cerca de 100 a cerca de 300°C, por exemplo, de cerca de 140 a cerca de 200°C. Em um aspecto preferencial, o pré-tratamento mecânico ou físico é realizado em um processo em lote usando um sistema hidrolisante de arma de vapor que usa alta pressão e alta temperatura, tal como definido acima, por exemplo, um Hidrolisador Sunds disponível junto à Sunds Defibrator AB, Suécia. Os pré-tratamentos físicos e químicos podem ser realizados em sequência ou simultaneamente, como desejado.

[00340] Portanto, em um aspecto preferencial, o material celulósico ou contendo xilano é submetido ao pré-tratamento físico (mecânico) ou químico, ou qualquer combinação dos mesmos, para promover a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina.

[00341] Pré-tratamento biológico: O termo "pré-tratamento biológico" refere-se a qualquer pré-tratamento biológico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina do material celulósico ou contendo xilano. Técnicas de pré-tratamento biológicas podem envolver a aplicação de microrganismos solubilizantes de lignina e/ou de enzimas (consulte, por exemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh e Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, em Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., e Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, Sociedade Americana de Química, Washington, DC, capítulo 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson e Hahn- Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; e Vallander e Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).

[00342] Sacarificação. Na etapa de hidrólise, também conhecida como sacarificação, o material celulósico ou contendo xilano, por exemplo, pré- tratado, é hidrolisado para quebrar a celulose e/ou hemicelulose em açúcares fermentáveis, como a glicose, celobiose, xilose, xilulose, arabinose, manose, galactose e/ou oligossacarídeos solúveis. A hidrólise é realizada enzimaticamente por uma composição enzimática, conforme descrito aqui na presença de um polipeptídeo com atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificadora celulolítica ou xilanase da presente invenção. Os componentes de enzima das composições podem ser adicionados simultaneamente ou sequencialmente.

[00343] A hidrólise enzimática é preferencialmente realizada em um ambiente aquoso adequado sob condições que podem ser facilmente determinadas por uma pessoa versada na técnica. Em um aspecto, a hidrólise é realizada sob condições adequadas para a atividade dos componentes da enzima, ou seja, ideal para os componentes da enzima. A hidrólise pode ser realizada como um lote alimentado ou um processo contínuo, onde o material celulósico ou contendo xilano é alimentado gradualmente, por exemplo, a uma enzima que contém solução de hidrólise.

[00344] A sacarificação é geralmente realizada em reatores de tanque agitado ou fermentadores com pH controlado, temperatura e condições de mistura. O tempo, a temperatura e as condições de pH do processo adequado podem ser determinadas facilmente por uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, a sacarificação pode durar até 200 horas, mas normalmente é realizada de cerca de 12 a cerca de 120 horas, por exemplo, de cerca de 16 a cerca de 72 horas ou de cerca de 24 a cerca de 48 horas. A temperatura está na faixa preferencialmente de cerca de 25°C a cerca de 70°C, por exemplo, de cerca de 30°C a cerca de 65°C, de cerca de 40°C a cerca de 60°C ou de cerca de 50°C a cerca de 55°C. O pH está preferencialmente na faixa de cerca de 3 a cerca de 8, por exemplo, de cerca de 3,5 a cerca de 7, de cerca de 4 a cerca de 6 ou de cerca de 5,0 a cerca de 5,5. O teor de sólidos secos está preferencialmente na faixa de cerca de 5 a cerca de 50% em peso, por exemplo, de cerca de 10 a cerca de 40% em peso ou de cerca de 20 para cerca de 30% em peso.

[00345] As composições de enzima podem compreender qualquer proteína útil na degradação ou conversão de material celulósico ou contendo xilano.

[00346] Em um aspecto, a composição enzimática compreende, ou compreende adicionalmente, uma o mais (por exemplo, várias) proteínas selecionadas do grupo consistindo em uma celulase, um polipeptídeo que tem atividade intensificadora celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina. Em outro aspecto, a celulase é preferencialmente uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma endoglicanase, uma celobio-hidrolase e uma beta-glicosidase. Em outro aspecto, a hemicelulase é preferencialmente uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em acetilmanano esterase, acetilxilano esterase, arabinanase, arabinofuranosidase, esterase do ácido cumarínico, feruloil esterase, galactosidase, glicuronidase, glicuronoil esterase, mananase, manosidase, xilanase e xilosidase.

[00347] Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas celulolíticas. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende ou compreende adicionalmente uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas hemicelulolíticas. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma o mais (por exemplo, várias) enzimas celulolíticas e uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas hemicelulolíticas. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma o mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo de enzimas celulolíticas e enzimas hemicelulolíticas. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglicanase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobio-hidrolase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma beta-glicosidase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende um polipeptídeo que tem atividade intensificadora celulolítica. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglicanase e um polipeptídeo que tem atividade intensificadora celulolítica. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobio-hidrolase e um polipeptídeo que tem atividade intensificadora celulolítica. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma beta-glicosidase e um polipeptídeo que tem atividade intensificadora celulolítica. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglicanase e uma celobio-hidrolase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglicanase e uma beta- glicosidase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobio-hidrolase e uma beta-glicosidase. Em outro aspecto, a composição enzimática composição uma endoglicanase, uma celobio-hidrolase e um polipeptídeo que tem atividade intensificadora celulolítica. Em outro aspecto, a composição enzimática composição uma endoglicanase, uma beta- glicosidase e um polipeptídeo que tem atividade intensificadora celulolítica. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobio- hidrolase, uma beta-glicosidase e um polipeptídeo que tem atividade intensificadora celulolítica. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglicanase, uma celobio-hidrolase e uma beta- glicosidase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglicanase, uma celobio-hidrolase, uma beta-glicosidase e um polipeptídeo que tem atividade intensificadora celulolítica.

[00348] Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma acetilmanano esterase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma acetilxilano esterase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma arabinanase (por exemplo, alfa-L-arabinanase). Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma arabinofuranosidase (por exemplo, alfa-L-arabinofuranosidase).. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma esterase do ácido cumarínico. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma swolenina. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma galactosidase (por exemplo, alfa-galactosidase e/ou beta-galactosidase). Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma glicuronidase (por exemplo, uma alfa-D-glicuronidase). Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma glicuronoil esterase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma mananase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma manosidase (por exemplo, uma beta-manosidase). Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma xilanase. Em um aspecto preferencial, a xilanase é uma xilanase da Família 10. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma xilosidase (por exemplo, uma beta-xilosidase).

[00349] Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma esterase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma expansina. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma lacase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma enzima lignolítica. Em um aspecto preferencial, a enzima lignolítica é uma manganês peroxidase. Em um aspecto preferencial, a enzima lignolítica é uma lignina peroxidase. Em um aspecto preferencial, a enzima lignolítica é uma enzima produtora de H2O2. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma pectinase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma peroxidase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma protease. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma swolenina.

[00350] Nos processos da presente invenção, a(s) enzima(s) podem ser adicionadas antes ou durante a sacarificação, sacarificação e fermentação ou fermentação.

[00351] Um ou mais (por exemplo, vários) componentes da composição enzimática podem ser proteínas tipo selvagem, proteínas recombinantes ou uma combinação de proteínas tipo selvagem e proteínas recombinantes. Por exemplo, um ou mais (por exemplo, vários) componentes podem ser proteínas nativas de uma célula, que é usada como uma célula hospedeira para expressar, de modo recombinante, um ou mais (por exemplo, vários) outros componentes da composição enzimática. Um ou mais (por exemplo, vários) componentes da composição enzimática podem ser produzidos como monocomponentes, que são em seguida combinados para formar a composição enzimática. A composição enzimática pode ser uma combinação de preparações de proteína com múltiplos componentes e com um componente.

[00352] As enzimas usadas nos processos da presente invenção podem estar em qualquer forma adequada para uso como, por exemplo, uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição celular, um lisado de células com ou sem fragmentos celulares, uma preparação enzimática semipurificada ou purificada ou uma célula hospedeira como uma fonte de enzimas. A composição enzimática pode ser um pó seco ou granulado, um granulado não pulverulento, um líquido, um líquido estabilizado ou uma enzima protegida estabilizada. Preparações enzimáticas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas pela adição de estabilizantes, tais como um açúcar, um álcool de açúcar ou outro poliol, e/ou ácido láctico ou outro ácido orgânico de acordo com os processos estabelecidos.

[00353] As quantidades ideais das enzimas e polipeptídeos com atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificadora celulolítica ou xilanase dependem de vários fatores incluindo, mas sem se limitar, à mistura de componentes de enzima celulolítica e/ou hemicelulolítica, o material celulósico ou contendo xilano, a concentração de material celulósico ou contendo xilano, o(s) pré-tratamento(s) do material celulósico ou contendo xilano, temperatura, tempo, pH e inclusão do organismo fermentador (por exemplo, levedura para a sacarificação e fermentação simultânea).

[00354] Em um aspecto, uma quantidade eficaz de enzima celulolítica ou hemicelulolítica para o material celulósico ou contendo xilano é de cerca de 0,5 a cerca de 50 mg, por exemplo, de cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, de cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, de cerca de 0,75 a cerca de 20 mg, de cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, de cerca de 0,5 a cerca de 10 mg ou de cerca de 2,5 a cerca de 10 mg/g do material celulósico ou contendo xilano.

[00355] Em outro aspecto, uma quantidade efetiva de um polipeptídeo que tem atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificadora celulolítica ou xilanase para o material celulósico ou contendo xilano é de cerca de 0,01 a cerca de 50,0 mg, por exemplo, de cerca e 0,01 a cerca de 40 mg, de cerca de 0,01 a cerca de 30 mg, de cerca de 0,01 a cerca de 20 mg, de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg, de cerca de 0,01 a cerca de 5 mg, de cerca de 0,025 a cerca de 1,5 mg, de cerca de 0,05 a cerca de 1,25 mg, de cerca de 0,075 a cerca de 1,25 mg, de cerca de 0,1 a cerca de 1,25 mg, de cerca de 0,15 a cerca de 1,25 mg ou de cerca de 0,25 a cerca de 1,0 mg/g do material celulósico ou contendo xilano.

[00356] Em outro aspecto, uma quantidade efetiva de um polipeptídeo que tem atividade celobio-hidrolase, endoglicanase, intensificadora celulolítica ou xilanase para a enzima celulolítica ou hemicelulolítica é de cerca de 0,005 a cerca de 1,0 g, por exemplo, de cerca de 0,01 a cerca de 1,0 g, de cerca de 0,15 a cerca de 0,75 g, de cerca de 0,15 a cerca de 0,5 g, de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g, de cerca de 0,1 a cerca de 0,25 g ou de cerca de 0,05 a cerca de 0,2 g/g de enzima celulolítica ou hemicelulolítica.

[00357] Os polipeptídeos que têm atividade enzimática celulolítica ou atividade enzimática hemicelulolítica, bem como outras proteínas/polipeptídeos úteis na degradação do material celulósico ou contendo xilano, por exemplo, polipeptídeos GH61 com atividade intensificadora celulolítica (coletivamente doravante denominados “polipeptídeos com atividade enzimática”) podem ser derivados ou obtidos de qualquer origem adequada, incluindo origem bacteriana, fúngica, de levedura, vegetal ou de mamíferos. O termo "obtido" também significa na presente invenção que a enzima pode ter sido produzida de modo recombinante em um organismo hospedeiro que utiliza os métodos descritos neste documento, em que a enzima produzida de modo recombinante é nativo ou estrangeira para o organismo hospedeiro ou tem uma sequência de aminoácidos modificada, por exemplo, com um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos que são eliminados, inseridos e/ou substituídos, ou seja, uma enzima produzida de modo recombinante que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência de aminoácidos nativa ou uma enzima produzida pelos processos de embaralhamento de ácido nucleico conhecidos na técnica. São englobados no significado de enzima nativa as variantes naturais e, no significado de uma enzima estrangeira, estão as variantes obtidas de modo recombinante, como por mutagênese direcionada a sítio ou embaralhamento.

[00358] Um polipeptídeo que tem atividade enzimática pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de bactéria gram-positiva, tal como um polipeptídeo de Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, Caldicellulosiruptor, Acidothermus, Thermobifidia ou Oceanobacillus com atividade enzimática, ou um polipeptídeo de bactéria gram-negativa como um polipeptídeo de E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria ou Ureaplasma com atividade enzimática.

[00359] Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis que tem atividade enzimática.

[00360] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus que tem atividade enzimática.

[00361] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus ou Streptomyces lividans que tem atividade enzimática.

[00362] O polipeptídeo que tem atividade enzimática também pode ser um polipeptídeo fúngico e, mais preferencialmente, um polipeptídeo de levedura como um polipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia que tem atividade enzimática; ou mais preferencialmente um polipeptídeo de fungo filamentoso como um polipeptídeo de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella ou Xylaria que tem atividade enzimática.

[00363] Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis que tem atividade enzimática.

[00364] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, ou Trichophaea saccata que tem atividade enzimática.

[00365] Mutantes quimicamente modificados ou proteína modificados dos polipeptídeos com atividade enzimática podem também ser utilizados.

[00366] Um ou mais (por exemplo, vários) componentes da composição enzimática pode(m) ser um componente recombinante, ou seja, produzido por clonagem de uma sequência de DNA que codifica o componente único e a subsequente célula transformada com a sequência de DNA e expresso em um hospedeiro (consulte, por exemplo, WO 91/17243 e WO 91/17244). O hospedeiro é preferencialmente um hospedeiro heterólogo (enzima é estrangeira ao hospedeiro), mas o hospedeiro pode, sob certas circunstâncias, também ser um hospedeiro homólogo (enzima é nativa ao hospedeiro). Proteínas celulolíticas com um componente também podem ser preparadas por purificação de tal proteína a partir de um caldo de fermentação.

[00367] Em um aspecto, a um ou mais (por exemplo, várias) enzimas celulolíticas compreendem uma preparação enzimática celulolítica comercial. Exemplos de preparações de enzimas celulolíticas comerciais adequadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, CELLIC® CTec (Novozymes A/S), CELLIC® CTec2 (Novozymes A/S), CELLUCLAST™ (Novozymes A/S), NOVOZYM™ 188 (Novozymes A/S), CELLUZYME™ (Novozymes A/S), CEREFLO™ (Novozymes A/S) e ULTRAFLO™ (Novozymes A/S), ACCELERASE™ (Genencor Int.),, LAMINEX™ (Genencor Int.), SPEZYME™ CP (Genencor Int.), FILTRASE® NL (DSM); METHAPLUS® S/L 100 (DSM), ROHAMENT™ 7069 W (Rohm GmbH), FIBREZYME® LDI (Dyadic International, Inc.), FIBREZYME® LBR (Dyadic International, Inc.)ou VISCOSTAR® 150L (Dyadic International, Inc.). As enzimas celulase são adicionadas em quantidades eficazes de cerca de 0,001 a cerca de 5,0% em peso de sólidos, por exemplo, de cerca de 0,025 a cerca de 4,0% em peso de sólidos ou de cerca de 0,005 a cerca de 2,0% em peso de sólidos.

[00368] Exemplos de endoglicanases bacterianas que pode ser usadas nos processos da presente invenção incluem, mas não se imitam, a uma endoglicanase de Acidothermus cellulolyticus (WO 91/05039; WO 93/15186; patente Norte-Americana No. 5.275.944; WO 96/02551; patente Norte- Americana No. 5.536.655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglicanase III de Thermobifida fusca (WO 05/093050); e endoglicanase V de Thermobifida fusca (WO 05/093050).

[00369] Exemplos de endoglicanases fúngicas que podem ser usadas na presente invenção incluem, mas não se limitam, à endoglicanase I de Trichoderma reesei (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263, endoglicanase I Cel7B de Trichoderma reesei (No. de registro GENBANK™ No. M15665), endoglicanase II de Trichoderma reesei (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:11- 22), endoglicanase II Cel5A de Trichoderma reesei (No. de registro GENBANK™ No. M19373), endoglicanase III de Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563, No. de registro GENBANK™ AB003694), endoglicanase V de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228, No. de Registro GENBANK™ Z33381), endoglicanase de Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884), endoglicanase de Aspergillus kawachii (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439), endoglicanase de Erwinia carotovara (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14), endoglicanase de Fusarium oxysporum (No. de Registro GENBANK™ L29381), endoglicanase de Humicola grisea var. thermoidea (No. de registro GENBANK™ AB003107), endoglicanase de Melanocarpus albomyces (No. de Registro GENBANK™ MAL515703), endoglicanase de Neurospora crassa (No. de Registro GENBANK™ XM_324477), endoglicanase V de Humicola insolens, endoglicanase de Myceliophthora thermophila CBS 117.65, endoglicanase de basidiomiceto CBS 495.95, endoglicanase de basdiomiceto CBS 494.95, endoglicanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6B, endoglicanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6C, endoglicanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7C, endoglicanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7E, endoglicanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7F, endoglicanase de Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A e endoglicanase da cepa de Trichoderma reesei No. VTT-D-80133 (No. de Acesso GENBANK™ M15665).

[00370] Exemplos de celobio-hidrolases úteis na presente invenção incluem, mas não se limitam, a celobio-hidrolase II de Aspergillus aculeatus (WO 2011/059740), celobio-hidrolase I de Chaetomium thermophilum, celobio-hidrolase II de Chaetomium thermophilum, celobio-hidrolase I de Humicola insolens, celobio-hidrolase II de Myceliophthora thermophila (WO 2009/042871), celobio-hidrolase II de Thielavia hyrcanie (WO 2010/141325), celobio-hidrolase II de Thielavia terrestris (CEL6A, WO 2006/074435), celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei e celobio-hidrolase II de Trichophaea saccata (WO 2010/057086).

[00371] Exemplos de beta-glicosidases úteis na presente invenção incluem, mas não se limitam, às beta-glicosidases de Aspergillus aculeatus (Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288), Aspergillus fumigatus (WO 2005/047499), Aspergillus niger (Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 49734980), Aspergillus oryzae (WO 2002/095014), Penicillium brasilianum IBT 20888 (WO 2007/019442 e WO 2010/088387), Thielavia terrestris (WO 2011/035029) e Trichophaea saccata (WO 2007/019442).

[00372] A beta-glicosidase pode ser uma proteína de fusão. Em um aspecto, a beta-glicosidase é uma variante da beta-glicosidase de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637), ou uma proteína de fusão da beta-glicosidase de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637).

[00373] Outras endoglicanases, celobio-hidrolases e beta-glicosidases úteis são divulgadas em várias famílias de glicosil-hidrolases usando a classificação de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309316 e Henrissat B., e Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

[00374] Outras enzimas celulolíticas que podem ser usadas na presente invenção são descritas em WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, na patente Norte-Americana No. 5.648.263, na Patente Norte-Americana No. 5.648.263 e na Patente Norte-Americana No. 5.686.593.

[00375] Nos processos da presente invenção, qualquer polipeptídeo GH61 com atividade intensificadora celulolítica pode ser usado como um componente da composição enzimática.

[00376] Exemplos de polipeptídeos GH61 com atividade intensificadora celulolítica úteis nos processos da presente invenção incluem, mas não se limitam, aos polipeptídeos GH61 de Thielavia terrestris (WO 2005/074647, WO 2008/148131 e WO 2011/035027), Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656 e WO 2010/065830), Trichoderma reesei (WO 2007/089290), Myceliophthora thermophila (WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868), Aspergillus fumigatus (WO 2010/138754), polipeptídeos GH61 de Penicillium pinophilum (WO 2011/005867), Thermoascus sp. (WO 2011/039319), Penicillium sp. (WO 2011/041397) e Thermoascus crustaceous (WO 2011/041504).

[00377] Em um aspecto, o polipeptídeo GH61 que tem atividade intensificadora celulolítica é usado na presença de um cátion metálico divalente ativador solúvel de acordo com WO 2008/151043, por exemplo, sulfato de manganês ou cobre.

[00378] Em outro aspecto, o polipeptídeo GH61 que tem atividade intensificadora celulolítica é usado na presença de um composto dióxi, um composto bicíclico, um composto heterocíclico, um composto contendo nitrogênio, um composto quinona, um composto contendo enxofre ou um líquido obtido a partir de um material celulósico pré-tratado, como palha de milho pré-tratada (PCS).

[00379] O composto dióxi pode incluir qualquer composto apropriado contendo dois ou mais átomos de oxigênio. Em alguns aspectos, os compostos dióxi contêm uma porção arila substituída, conforme descrito na presente invenção. Os compostos dióxi podem compreender uma ou mais (por exemplo, vários) hidroxilas e/ou derivados de hidroxila, mas também incluem porções arila substituídas sem hidroxila e derivados de hidroxila. Exemplos não limitadores dos compostos dióxi incluem pirocatecol ou catecol; ácido cafeico; ácido 3,4-di-hidroxibenzoico; 4-terc-butil-5-metóxi-1,2-benzenodiol; pirogalol; ácido gálico; metil-3,4,5-tri-hidroxibenzoato; 2,3,4-tri- hidroxibenzofenona; 2,6-dimetoxifenol; ácido sinapínico; ácido 3,5-di- hidroxibenzoico; 4-cloro-1,2-benzenodiol; 4-nitro-1,2-benzenodiol; ácido tânico; galato de etila; glicolato de metila; ácido di-hidroxifumárico; 2-butino- 1,4-diol; (ácido crocônico; 1,3-propanodiol; ácido tartárico; 2,4-pentanodiol; 3-etóxi-1,2-propanodiol; 2,4,4'-tri-hidroxibenzofenona; cis-2-buteno-1,4-diol; 3,4-di-hidróxi-3-ciclobuteno-1,2-diona; di-hidroxiacetona; acroleína acetal; metil-4-hidroxibenzoato; ácido 4-hidroxibenzoico; e metil-3,5-dimetóxi-4- hidroxibenzoato; ou um sal ou solvato dos mesmos.

[00380] O composto bicíclico pode incluir qualquer sistema de anel fundido substituído adequado conforme descrito neste documento. Os compostos podem compreender um ou mais (por exemplo, vários) anéis adicionais, e não são limitado a um número específico de anéis, a menos que seja especificado de outra forma. Em um aspecto, o composto bicíclico é um flavonoide. Em outro aspecto, o composto bicíclico é um isoflavonoide opcionalmente substituído. Em outro aspecto, o composto bicíclico é um íon flavínio opcionalmente substituído, como uma antocianidina opcionalmente substituída ou uma antocianina opcionalmente substituída, ou um derivado dos mesmos. Exemplos não limitadores dos compostos bicíclicos incluem epicatequina; quercetina; miricetina; taxifolina; kaempferol; morina; acacetina; naringenina; isoramnetina; apigenina; cianidina; cianina; curomanina; queracianina; ou um sal ou solvato do mesmo.

[00381] O composto heterocíclico pode ser qualquer composto apropriado, como um anel aromático ou não aromático opcionalmente substituído, compreendendo um heteroátomo, conforme descrito neste documento. Em um aspecto, o heterocíclico é um composto que compreende uma porção heterocicloalquila opcionalmente substituída, ou uma porção heteroarila opcionalmente substituída. Em outro aspecto, a porção heterocicloalquila opcionalmente substituída ou a porção heteroarila opcionalmente substituída é uma heterocicloalquila com 5 membros substituída ou uma porção heteroarila com 5 membros opcionalmente substituída. Em outro aspecto, a heterocicloalquila opcionalmente substituída ou a porção heteroarila opcionalmente substituída é uma porção opcionalmente substituída selecionada de pirazolila, furanila, imidazolila, isoxazolila, oxadiazolila, oxazolila, pirrolila, piridila, pirimidila, piridazinila, tiazolila, triazolila, tienila, di-hidrotienopirazolila, tianaftenila, carbazolila, benzimidazolila, benzotienila, benzofuranila, indolila, quinolinila, benzotriazolila, benzotiazolila, benzoxazolila, benzimidazolila, isoquinolinila, isoindolila, acridinila, benzoisazolila, dimetil-hidantoína, pirazinila, tetra- hidrofuranila, pirrolinila, pirrolidinila, morfolinila, indolila, diazepinila, azepinila, tiepinila, piperidinila e oxepinila. Em outro aspecto, a porção heterocicloalquila opcionalmente substituída ou a porção heteroarila opcionalmente substituída é uma furanila opcionalmente substituída. Exemplos não limitadores dos compostos heterocíclicos incluem (1,2-di- hidroxietil)-3,4-di-hidroxifuran-2-(5H)-ona; 4-hidróxi-5-metil-3-furanona; 5- hidróxi-2(5H)-furanona; [1,2-di-hidroxietil]furan-2,3,4(5H)-triona; a-hidróxi- Y—butirolactona; Y—lactona ribônica; Y—lactona do ácido aldo-hexuronicaldo- hexurônico; δ-lactonado ácido glicônico; 4-hidroxicumarina; di- hidrobenzofurano; 5-(hidroximetil)furfural; furoína; 2(5H)-furanona; 5,6-di- hidro-2H-piran-2-ona; e 5,6-di-hidro-4-hidróxi-6-metil-2H-piran-2-ona; ou um sal o solvato dos mesmos.

[00382] O composto contendo nitrogênio pode ser qualquer composto adequado com um ou mais átomos de nitrogênio. Em um aspecto, o composto contendo nitrogênio compreende uma porção amina, imina, hidroxilamina ou nitróxido. Exemplos não limitadores dos compostos contendo nitrogênio incluem oxima acetona; ácido violúrico; piridina-2-aldoxima; 2-aminofenol; 1,2-benzenodiamina; 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidinilóxi; 5,6,7,8-tetra- hidrobiopterina; 6,7-dimetil-5,6,7,8-tetra-hidropterina; e ácido maleâmico/ ou um sal ou solvato dos mesmos.

[00383] O composto quinona pode ser qualquer composto adequado que compreende uma porção quinona, conforme descrito neste documento. Exemplo não limitadores dos compostos quinona incluem 1,4-benzoquinona; 1,4-naftoquinona; 2-hidróxi-1,4-naftoquinona; 2,3-dimetóxi-5-metil-1,4- benzoquinona ou coenzima Q0; 2,3,5,6-tetrametil-1,4-benzoquinona ou duroquinona; 1,4-di-hidroxiantraquinona; 3-hidróxi-1-metil-5,6-indolinediona ou adrenocromo; 4-terc-butil-5-metóxi-1,2-benzoquinona; pirroloquinolinoquinona;

[00384] O composto contendo enxofre pode ser qualquer composto adequado que compreende com um ou mais átomos de enxofre. Em um aspecto, o composto contendo enxofre compreende uma porção selecionada de tionila, tioéter, sulfinila, sulfonila, sulfamida, sulfonamida, ácido sulfônico e éster sulfônico. Exemplos não limitadores dos compostos contendo enxofre incluem etanotiol; 2-propanotiol; 2-propeno-1-tiol; ácido 2- mercaptoetanossulfônico; benzenotiol; benzeno-1,2-ditiol; cisteína; metionina; glutationa; cistina; ou um sal ou solvato dos mesmos.

[00385] Em um aspecto, uma quantidade efetiva de tal composto descrito acima para material celulósico, como uma razão molar para unidades de celulose é de cerca de 10-6 a cerca de 10, por exemplo, de cerca de 10-6 a cerca de 7,5, de cerca de 10-6 a cerca de 5, de cerca de 10-6 a cerca de 2,5, de cerca de 10-6 a cerca de 1, de cerca de 10-5 a cerca de 1, de cerca de 10-5 a cerca de 10-1, de cerca de 10-4 a cerca de 10-1, de cerca de 10-3 a cerca de 10-1 ou de cerca de 10-3 a cerca de 10-2. Em outro aspecto, uma quantidade efetiva de tal composto descrito acima é de cerca de 0,1 μM a cerca de 1 M, por exemplo, de cerca de 0,5 μM a cerca de 0,75 M, de cerca de 0,75 μM a cerca de 0,5 M, de cerca de 1 μM a cerca de 0,25 M, de cerca de 1 μM a cerca de 0,1 M, de cerca de 5 μM a cerca de 50 mM, de cerca de 10 μM a cerca de 25 mM, de cerca de 50 μM a cerca de 25 mM, de cerca de 10 μM a cerca de 10 mM, de cerca de 5 μM a cerca de 5 mM ou de cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM.

[00386] O termo "líquido" significa a fase da solução, seja ela aquosa, orgânica ou uma combinação de ambas, decorrente do tratamento de um material de lignocelulose e/ou hemicelulose em uma pasta fluida, ou monossacarídeos das mesmas, por exemplo, xilose, arabinose, manose, etc., sob condições conforme descrito neste documento, e seu os conteúdos solúveis das mesmas. Um líquido para a intensificação celulolítica de um polipeptídeo GH61 pode ser produzido pelo tratamento de um material de lignocelulose ou hemicelulose (ou matéria-prima) pela aplicação de calor e/ou pressão, opcionalmente, na presença de um catalisador, por exemplo, ácido, opcionalmente na presença de um solvente orgânico e, opcionalmente, em combinação com a perturbação física do material e em seguida, separação da solução dos resíduos sólidos. Tais condições determinam o grau de aumento celulolítico que pode ser obtido através da combinação de líquido e um polipeptídeo GH61 durante a hidrólise de um substrato celulósico por uma preparação de celulase. O líquido pode ser separado do material tratado usando um padrão na técnica, como filtração, sedimentação ou centrifugação.

[00387] Em um aspecto, uma quantidade efetiva do líquido para celulose é de cerca de 10-6 a cerca de 10 g por g of celulose, por exemplo, de cerca de 10-6 a cerca de 7,5 g, de cerca de 10-6 a cerca de 5, de cerca de 10-6 a cerca de 2,5 g, de cerca de 10-6 a cerca de 1 g, de cerca de 10-5 a cerca de 1 g, de cerca de 10-5 a cerca de 10-1 g, de cerca de 10-4 a cerca de 10-1 g, de cerca de 10-3 a cerca de 10-1 g ou de cerca de 10-3 a cerca de 10-2 g por g de celulose.

[00388] Em um aspecto, a uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas hemicelulolíticas compreendem uma preparação enzimática hemicelulolítica comercial. Exemplos de preparações de enzima hemicelulolítica comerciais adequadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, SHEARZYME™ (Novozymes A/S), CELLIC® HTec (Novozymes A/S), CELLIC® HTec2 (Novozymes A/S), VISCOZYME® (Novozymes A/S), ULTRAFLO® (Novozymes A/S), PULPZYME® HC (Novozymes A/S), MULTIFECT® Xylanase (Genencor), ACCELLERASE® XY (Genencor), ACCELLERASE® XC (Genencor), ECOPULP® TX-200A (AB Enzymes), HSP 6000 Xylanase (DSM) e DEPOL™ 333P (Biocatalysts Limit, Wales, UK), DEPOL™ 740L. (Biocatalysts Limit, Wales, Reino Unido), e DEPOL™ 762P (Biocatalysts Limit, Wales, Reino Unido).

[00389] Exemplos de xilanases úteis nos processos da presente invenção incluem, mas não se limitam, às xilanases de Aspergillus aculeatus (GeneSeqP:AAR63790; WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (WO 2006/078256), Penicillium pinophilum (WO 2011/041405), Penicillium sp. (WO 2010/126772), Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/079210) e Trichophaea saccata GH10 (WO 2011/057083).

[00390] Exemplos de beta-xilosidases úteis nos processos da presente invenção incluem, mas não estão limitadas, às beta-xilosidases de Neurospora crassa (número de registro SwissProt Q7SOW4), Trichoderma reesei (número de registro UniProtKB/TrEMBL Q92458) e Talaromyces emersonii (número de registro SwissProt Q8X212).

[00391] Exemplos de acetilxilano esterases úteis nos processos da presente invenção incluem, mas não se limitam, a acetilxilano esterases de Aspergillus aculeatus (WO 2010/108918), Chaetomium globosum (número de registro Uniprot Q2GWX4), Chaetomium gracile (número de registro GeneSeqP AAB82124), Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073709), Hypocrea jecorina (WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (WO 2010/014880), Neurospora crassa (número de registro Uniprot q7s259), Phaeosphaeria nodorum (número de registro Uniprot Q0UHJ1) e Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/042846).

[00392] Exemplos de feruloil esterases (esterases do ácido ferúlico) úteis nos processos da presente invenção incluem, mas não se limitam, às feruloil esterases de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/076122), Neosartorya fischeri (número de registro Uniprot A1D9T4), Neurospora crassa (número de registro Uniprot Q9HGR3), Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/127729) e Thielavia terrestris (WO 2010/053838 e WO 2010/065448).

[00393] Exemplos de arabinofuranosidases úteis nos processos da presente invenção incluem, mas não se limitam, às arabinofuranosidases de Aspergillus niger (número de registro GeneSeq AAR94170), Humicola insolens DSM 1800 (WO 2006/114094 e WO 2009/073383) e M. giganteus (WO 2006/114094).

[00394] Exemplos de alfa-glicuronidases úteis nos processos da presente invenção incluem, mas não se limitam, às alfa-glicuronidases de Aspergillus clavatus (número de registro Uniprot alcc12), Aspergillus fumigatus (número de registro SwissProt Q4WW45), Aspergillus niger (número de registro Uniprot Q96WX9), Aspergillus terreus (número de registro SwissProt Q0CJP9), Humicola insolens (WO 2010/014706), Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/068565), Talaromyces emersonii (número de registro UniProt Q8X211) e Trichoderma reesei (número de registro Uniprot Q99024).

[00395] Os polipeptídeos com atividade enzimática utilizados nos processos da presente invenção podem ser produzidos por fermentação das cepas microbianas acima descritas em um meio nutriente contendo fontes adequadas de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Bennett, J.W. e LaSure, L. (eds.),., More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Meios adequados são disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, nos catálogos da Coleção Americana de Cultura de Células). Faixas de temperatura e outras condições adequadas para o crescimento e a produção de enzimas são conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Bailey, J.E. e Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986).

[00396] A fermentação pode ser de qualquer método de cultivo de uma célula resultando na expressão ou isolamento de uma enzima ou proteína. A fermentação pode, portanto, ser considerada como compreendendo cultivo em frasco sob agitação, ou fermentação em pequena escala ou em grande escala (incluindo fermentações contínuas, por lote, lote alimentado ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais em um meio apropriado e sob condições que permitem que o polipeptídeo seja expresso ou isolado. As enzimas resultantes produzidas pelos métodos descritos acima podem ser recuperadas do meio de fermentação e purificadas por procedimentos convencionais.

[00397] Fermentação. Os açúcares fermentáveis obtidos a partir do material celulósico ou contendo xilano pode ser fermentado por um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores capazes de fermentar os açúcares diretamente ou indiretamente em um produto de fermentação desejado. "Fermentação" ou "processo de fermentação" refere-se a qualquer processo de fermentação ou qualquer processo que compreende uma etapa de fermentação. Os processos de fermentação também incluem processos de fermentação utilizados na indústria de álcool para consumo (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de laticínios (por exemplo, produtos lácteos fermentados), indústria de couro e indústria do tabaco. As condições de fermentação dependem do produto de fermentação desejado e do organismo fermentador, e podem ser facilmente determinadas por uma pessoa versada na técnica.

[00398] Na etapa de fermentação, os açúcares, liberados do material celulósico ou contendo xilano como resultado das etapas de pré-tratamento e hidrólise enzimática, são fermentados para um produto, por exemplo, etanol, por um organismo fermentador, como uma levedura. A hidrólise (sacarificação) e a fermentação podem ser separadas ou simultâneas, conforme descrito neste documento.

[00399] Qualquer material celulósico ou contendo xilano adequado pode ser usado na etapa de fermentação na prática da presente invenção. O material é geralmente selecionado com base no produto de fermentação desejado, ou seja, a substância a ser obtida a partir da fermentação, e o processo utilizado, tal como é conhecido na técnica.

[00400] O termo "meio de fermentação" é compreendido na presente invenção para se referir a um meio antes de o(s) microrganismo(s) fermentadores ser adicionados, como um meio resultante de um processo de sacarificação, bem como um meio utilizado em um processo de sacarificação e fermentação simultâneo (SSF).

[00401] "Microrganismo fermentador" refere-se a qualquer microrganismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, adequados para uso em um processo de fermentação desejado para produzir um produto de fermentação. O organismo fermentador pode ser organismos fermentadores de hexose e/ou de pentose, ou uma combinação dos mesmos. Organismos fermentadores tanto de hexose quanto de pentose são bem conhecidos na técnica. Microrganismos fermentadores adequados são capazes de fermentar, ou seja, de converter açúcares, como glicose, xilose, xilulose, arabinose, maltose, manose, galactose e/ou oligossacarídeos, diretamente ou indiretamente no produto de fermentação desejado. Exemplos de organismos fermentadores bacterianos e fúngicos produtores de etanol são descritos por Lin et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.

[00402] Exemplos de microrganismos fermentadores que podem fermentar açúcares hexose incluem organismos bacterianos e fúngicos, como levedura. Leveduras preferenciais incluem cepas de Candida, Kluyveromyces e Saccharomyces, por exemplo, Candida sonorensis, Kluyveromyces marxianus e Saccharomyces cerevisiae.

[00403] Exemplos de organismos fermentadores que podem fermentar açúcares pentose em seu estado nativo incluem organismos bacterianos e fúngicos, como levedura. A levedura fermentadora de xilose preferencial inclui cepas de Candida, preferencialmente de C. sheatae ou C. sonorensis; e cepas de Pichia, preferencialmente de P. stipitis, como P. stipitis CBS 5773. Leveduras fermentadoras de pentose preferenciais incluem cepas de Pachysolen, preferencialmente de P. tannophilus. Organismos que não são capazes de fermentar açúcares pentose, tais como a xilose e arabinose, podem ser modificados geneticamente para fazer isso pelos métodos conhecidos na técnica.

[00404] Exemplos de bactérias que podem fermentar eficientemente hexose e pentose em etanol incluem, por exemplo, Bacillus coagulans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermocellum, Clostridium phytofermentans, Geobacillus sp., Thermoanaerobacter saccharolyticum e Zymomonas mobilis (Philippidis, 1996, supra).

[00405] Outros organismos fermentadores incluem cepas de Bacillus, tal como Bacillus coagulans; Candida, tais como C. sonorensis, C. methanosorbosa, C. diddensiae, C. parapsilosis, C. naedodendra, C. blankii, C. entomophilia, C. brassicae, C. pseudotropicalis, C. boidinii, C. utilis e C. scehatae; Clostridium, como C. acetobutylicum, C. thermocellum, e C. phytofermentans; E. coli, especialmente cepas de E. coli que foram geneticamente modificadas para melhorar o rendimento de etanol; Geobacillus sp.; Hansenula, tal como Hansenula anomala; Klebsiella, tal como K. oxytoca; Kluyveromyces, como K. marxianus, K. lactis, K. thermotolerans, e K. fragilis; Schizosaccharomyces, como S. pombe; Thermoanaerobacter, como Thermoanaerobacter saccharolyticum; e Zymomonas, como Zymomonas mobilis.

[00406] Em um aspecto preferencial, a levedura é uma Bretannomyces. Em um aspecto mais preferencial, a levedura é Bretannomyces clausenii. Em outro aspecto preferencial, a levedura é uma Candida. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida sonorensis. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida boidini. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida blankii. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida brassicae. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida diddensii. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida entomophiliia. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida pseudotropicalis. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida scehatae. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Candida utilis. Em outro aspecto preferencial, a levedura é Clavispora. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Clavispora lusitaniae. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Clavispora opuntiae. Em outro aspecto preferencial, a levedura é uma Kluyveromyces. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Kluyveromyces fragilis. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Kluyveromyces marxianus. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Kluyveromyces thermotolerans. Em outro aspecto preferencial, a levedura é Pachysolen. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Pachysolen tannophilus. Em outro aspecto preferencial, a levedura é P Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Pichia stipitis. Em outro aspecto preferencial, a levedura é Saccharomyces spp. Em um aspecto mais preferencial, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Saccharomyces distaticus. Em outro aspecto mais preferencial, a levedura é Saccharomyces uvarum.

[00407] Em um aspecto preferencial, a bactéria é um bacilo. Em um aspecto mais preferencial, a bactéria é Bacillus coagulans. Em outro aspecto preferencial, a bactéria é um Clostridium. Em outro aspecto mais preferencial, a bactéria é Clostridium acetobutylicum. Em outro aspecto mais preferencial, a bactéria é Clostridium phytofermentans. Em outro aspecto mais preferencial, a bactéria é Clostridium thermocellum. Em outro aspecto mais preferencial, a bactéria é Geobacilus sp. Em outro aspecto mais preferencial, a bactéria é uma Thermoanaerobacter. Em outro aspecto mais preferencial, a bactéria é Thermoanaerobacter saccharolyticum. Em outro aspecto preferencial, a bactéria é uma Zymomonas. Em outro aspecto mais preferencial, a bactéria é Zymomonas mobilis.

[00408] Leveduras comercialmente disponíveis para a produção de etanol incluem, por exemplo, BIOFERM™ AFT e XR (NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, EUA), levedura ETHANOL REDa (Fermentis/Lesaffre, EUA), FALI™ (Levedura Fleischmann, EUA), FERMIOL™ (DSM Specialties), GERT STRAND™ (Gert Strand AB, Suécia), e SUPERSTART™ e levedura fresca THERMOSACC™ (Ethanol Technology, WI, EUA).

[00409] Em um aspecto preferencial, o microrganismo fermentador foi geneticamente modificado para fornecer a capacidade de fermentar açúcares pentose, tais como microrganismos que usam xilose, microrganismos que usam arabinose e que coutilizam xilose e arabinose.

[00410] A clonagem de genes heterólogos em vários microrganismos fermentadores levou à construção de organismos capazes de converter hexoses e pentoses em etanol (cofermentação) (Chen e Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter e Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylose- metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principle, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470; WO 2003/062430, xilose isomerase).

[00411] Em um aspecto preferencial, o microrganismos fermentador geneticamente modificado é Candida sonorensis. Em outro aspecto preferencial, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Escherichia coli. Em outro aspecto preferencial, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Klebsiella oxytoca. Em outro aspecto preferencial, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Kluyveromyces marxianus. Em outro aspecto preferencial, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Saccharomyces cerevisiae. Em outro aspecto preferencial, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Zymomonas mobilis.

[00412] É bem conhecido na técnica que os organismos descritos acima também podem ser usados para produzir outras substâncias, conforme descrito neste documento.

[00413] O microrganismo fermentador é normalmente adicionado ao material celulósico ou contendo xilano degradado ou hidrolisado e a fermentação é realizada durante cerca de 8 a cerca de 96 horas, por exemplo, de cerca de 24 a cerca de 60 horas. A temperatura é tipicamente de cerca de 26°C a cerca de 60°C, por exemplo, de cerca de 32°C ou 50°C e cerca de pH 3 até cerca de pH 8, por exemplo, pH 4 a 5, 6 ou 7.

[00414] Em um aspecto, a levedura e/ou outro microrganismo são aplicados ao material celulósico ou contendo xilano degradado e a fermentação é realizada durante cerca de 12 a cerca de 96 horas, tal como tipicamente de 24 a 60 horas. Em outro aspecto, a temperatura está preferencialmente entre de cerca de 20°C a cerca de 60°C, por exemplo, de cerca de 25°C a cerca de 50°C, de cerca de 32°C a cerca de 50°C ou de cerca de 32°C a cerca de 50°C, e o pH é geralmente de cerca de pH 3 a cerca de pH 7, por exemplo, de cerca de pH 4 a cerca de pH 7. No entanto, alguns organismos fermentadores, por exemplo, bactérias, têm temperatura ótima de fermentação mais alta. Levedura ou outro microrganismo é preferencialmente aplicado em quantidades de cerca de 105 a 1012, preferencialmente de cerca de 107 a 1010, especialmente aproximadamente uma contagem de 2 x 108 células viáveis por mL de caldo de fermentação. Outras orientações em relação ao uso de leveduras para fermentação podem ser encontradas, por exemplo, em “The Alcohol Textbook” (Editors K. Jacques, T.P. Lyons e D.R. Kelsall, Nottingham University Press, Reino Unido 1999), que é por meio disto incorporada por referência.

[00415] Para a produção de etanol, após a fermentação a pasta fluida fermentada é destilada para extrair o etanol. O etanol obtido de acordo com os processos da invenção pode ser usado, por exemplo, como etanol combustível, etanol para consumo, por exemplo, espíritos neutros potáveis ou etanol industrial.

[00416] Um estimulador de fermentação pode ser usado juntamente com qualquer um dos processos descritos neste documento para melhorar ainda mais o processo de fermentação e, em particular, o desempenho do microrganismo fermentado, como o aumento da razão e rendimento de etanol. Um "estimulador de fermentação" refere-se aos estimuladores para crescimento dos microrganismos fermentadores, particularmente de leveduras. Estimuladores de fermentação preferenciais para crescimento incluem vitaminas e minerais. Exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, mesoinositol, tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzoico, ácido fólico, riboflavina e vitaminas A, B, C, D e E. Consulte, por exemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é incorporado por meio deste documento por referência. Exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais que podem fornecer nutrientes compreendendo P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn e Cu.

[00417] Produtos de fermentação: Um produto de fermentação pode ser qualquer substância derivada da fermentação. O produto de fermentação pode ser, sem limitação, um álcool (por exemplo, arabinitol, n-butanol, isobutanol, etanol, glicerol, metanol, etilenoglicol, 1,3-propanediol [propilenoglicol], butanodiol, glicerina, sorbitol e xilitol); um alcano (por exemplo, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano e dodecano), um cicloalcano (por exemplo, ciclopentano, ciclo-hexano, cycloheptano e ciclo-octano), um alqueno (por exemplo, penteno, hexeno, hepteno e octeno); um aminoácido (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina e treonina); um gás (por exemplo, metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO2) e monóxido de carbono (CO)); isopreno; uma cetona (por exemplo, acetona); um ácido orgânico (por exemplo, ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glicárico, ácido glicônico, ácido glicurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido lático, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido succínico e ácido xilônico); e policetídeo. O produto de fermentação também pode ser a proteína, como um produto de alto valor.

[00418] Em um aspecto preferencial, o produto de fermentação é um álcool. Será compreendido que o termo "álcool" engloba uma substância que contém uma ou mais porções hidroxila. Em um aspecto mais preferencial, o álcool é n-butanol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é isobutanol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é etanol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é metanol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é arabinitol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é butanodiol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é etilenoglicol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é glicerina. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é glicerol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é 1,3- propanodiol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é sorbitol. Em outro aspecto mais preferencial, o álcool é xilitol. Consulte, por exemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Silveira, M. M., e Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400-408; Nigam, P., e Singh, D., 1995, Processes for fermentative production of xylitol - a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, T. C., Qureshi, N. e Blaschek, H. P., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.

[00419] Em outro aspecto preferencial, o produto de fermentação é um alcano. O alcano pode ser um alcano não ramificados ou ramificados. Em outro aspecto mais preferencial, o alcano é pentano. Em outro aspecto mais preferencial, o alcano é hexano. Em outro aspecto mais preferencial, o alcano é heptano. Em outro aspecto mais preferencial, o alcano é octano. Em outro aspecto mais preferencial, o alcano é nonano. Em outro aspecto mais preferencial, o alcano é decano. Em outro aspecto mais preferencial, o alcano é undecano. Em outro aspecto mais preferencial, o alcano é dodecano.

[00420] Em outro aspecto preferencial, o produto de fermentação é um cicloalcano. Em outro aspecto mais preferencial, o cicloalcano é ciclopentano. Em outro aspecto mais preferencial, o cicloalcano é ciclo-hexano. Em outro aspecto mais preferencial, o cicloalcano é ciclo-heptano. Em outro aspecto mais preferencial, o cicloalcano é ciclo-octano.

[00421] Em outro aspecto preferencial, o produto de fermentação é um alqueno. O alqueno pode ser um alqueno não ramificado ou ramificado. Em outro aspecto mais preferencial, o alqueno é penteno. Em outro aspecto mais preferencial, o alqueno é hexeno. Em outro aspecto mais preferencial, o alqueno é hepteno. Em outro aspecto mais preferencial, o alqueno é octeno.

[00422] Em outro aspecto preferencial, o produto de fermentação é um aminoácido. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido aspártico. Em outro aspecto mais preferencial, o aminoácido é ácido glutâmico. Em outro aspecto mais preferencial, o aminoácido é glicina. Em outro aspecto mais preferencial, o aminoácido é lisina. Em outro aspecto mais preferencial, o aminoácido é serina. Em outro aspecto mais preferencial, o aminoácido é treonina. Consulte, por exemplo, Richard, A., e Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid) production and other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515.

[00423] Em outro aspecto preferencial, o produto de fermentação é um gás. Em outro aspecto mais preferencial, o gás é metano. Em outro aspecto mais preferencial, o gás é H2. Em outro aspecto mais preferencial, o gás é CO2. Em outro aspecto mais preferencial, o gás é CO. Consulte, por exemplo, Kataoka, N., A. Miya, e K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; e Gunaseelan V.N. in Biomass and Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production: A review.

[00424] Em outro aspecto preferencial, o produto de fermentação é isopreno.

[00425] Em outro aspecto preferencial, o produto de fermentação é uma cetona. Será compreendido que o termo "cetona" engloba uma substância que contém uma ou mais porções cetona. Em outro aspecto mais preferencial, a cetona é acetona. Consulte, por exemplo, Qureshi e Blaschek, 2003, supra.

[00426] Em outro aspecto preferencial, o produto de fermentação é um ácido orgânico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido acético. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido acetônico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido adípico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido ascórbico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido cítrico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido 2,5- diceto-D-glicônico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido fórmico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido fumárico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido glicárico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido glicônico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido glicurônico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido glutárico. Em outro aspecto preferencial, o ácido orgânico é ácido 3- hidroxipropiônico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido itacônico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido lático. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido málico.. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido malônico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido oxálico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido propiônico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido succínico. Em outro aspecto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido xilônico. Consulte, por exemplo, Chen, R., e Lee, Y. Y., 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448.

[00427] Em outro aspecto preferencial, o produto de fermentação é policetídeo.

[00428] Recuperação. O(s) produto(s) de fermentação pode(m) ser recuperados do meio de fermentação usando qualquer método conhecido na técnica incluindo, mas sem se limitar, a cromatografia, procedimentos eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação ou extração. Por exemplo, álcool é separado do material celulósico ou contendo xilano e purificado por métodos convencionais de destilação. Etanol com uma pureza de até cerca de 96% em volume pode ser obtido, que pode ser usado como, por exemplo, etanol combustível, etano para consumo, por exemplo, espíritos neutros potáveis ou etanol industrial.

[00429] A presente invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como sendo limitantes do escopo da invenção. Exemplos Exemplo 1

[00430] Algoritmo computacional para classificar biopolímeros relacionados em grupos e encontrar sequências n-méricas com uma frequência predefinida e um exemplo de classificação de proteínas de origem animal com função relacionada e sequência em seis grupos distintos. Algoritmo

[00431] O algoritmo a ser implementado foi: 1. Para cada biopolímero, fazer todos os n-meros que ocorrem na sequência do biopolímero. 2. Selecionar todos os biopolímeros que contêm mais de um número definido de n-meros. 3. Fazer todos os n-meros que ocorrem nestes biopolímeros e um número definido de n-meros mais abundante. 4. Retornar para a etapa 2 até que nenhum n-mero novo seja feito no ciclo seguinte. Programa

[00432] O programa é escrito na linguagem de programação Ruby 1.8.6 e normalmente executado em uma máquina com sistema operacional Microsoft Windows XP versão 2002, mas também pode ser executado em outros sistemas operacionais e poderia ser facilmente adaptado para outras versões do Ruby. Classify_family3.rb: cut_off = 9 limit = 100 pep_length = 6 Our ref. P1895EP00 class Protein attr_accessor:seq,:name,:score,:peptides def initialize(seq) @seq = seq.to_s.upcase.chomp end def count_occurence(x) occurence = 0 seq = "" seq += @seq while seq.include?(x) occurence += 1 seq = seq.slice(seq.index(x)+1, seq.length) end occurence end def calc_score(array) score = 0 if array.first.class.to_s == "String" array.each{|pep| score += 1 if @seq.include?(pep)} end if array.first.class.to_s == "Peptide" array.each{|pep| score += 1 if @seq.include?(pep.seq)} end score end def find_family #@family_array.sort.last[1] array = @family_array.sort.reverse if array [0] [0] != array[1] [0] family = array [0][1] else family = 0 end family end def split_to_20pep array = Array.new seq = "" seq += @seq 20.times do array << seq.scan(/ /) seq.slice!(0,1) end array.flatten.uniq end def split_to_15pep array = Array.new seq = "" seq += @seq 15.times do array << seq.scan(/ /) seq.slice!(0,1) end array.flatten.uniq end def split_to_decapep array = Array.new seq = "" seq += @seq 10.times do array << seq.scan(/ /) seq.slice!(0,1) end array.flatten.uniq end def split_to_nonapep array = Array.new seq = "" seq += @seq 9.times do array << seq.scan(/ /) seq.slice!(0,1) end array.flatten.uniq end def split_to_octapep array = Array.new seq = "" seq += @seq 8.times do array << seq.scan(/ /) seq.slice!(0,1) end array.flatten.uniq end def split_to_heptapep array = Array.new seq = "" seq += @seq 7.times do array << seq.scan(/ /) seq.slice!(0,1) end array.flatten.uniq end def split_to_hexapep array = Array.new seq = "" seq += @seq 6.times do array << seq.scan(/ /) seq.slice!(0,1) end array.flatten.uniq end def split_to_pentapep array = Array.new seq = "" seq += @seq 5.times do array << seq.scan(/ /) seq.slice!(0,1) end array.flatten.uniq end def split_to_tetrapep array = Array.new seq = "" seq += @seq 4.times do array << seq.scan(/ /) seq.slice!(0,1) end array.flatten.uniq end def split_to_tripep array = Array.new seq = "" seq += @seq 3.times do array << seq.scan(/.../) seq.slice!(0,1) end array.flatten.uniq end def split_to_dipep array = Array.new seq = "" seq += @seq 2.times do array << seq.scan(/../) seq.slice!(0,1) end array.flatten.uniq end def mark_sequence_stretch(seq1, seq2) cut1 = @seq.index(seq1.seq) cut2 = @seq.index(seq2)+seq2.length ampliqon_length = cut2-cut1 x = @seq.slice(0, cut1) + "[ " y = @seq.slice(cut1, ampliqon_length).upcase + " ]" z = @seq.slice(cut2, @seq.length) x+y+z end end class Peptide < Protein attr_accessor:seq,:name,:score,:degeneracy,:degeneracy_w_in osine, :average_position,:frequency,:prot_score def initialize(seq) @seq = seq.to_s end def calc_score(array) score = 0 array.each{|p| score += 1 if p.seq.include?(@seq)} score end def calc_degeneracy antal_codons = {'a' => '4', 'c' => '2', 'd' => '2', 'e' => '2', 'f' => '2', 'g' => '4', 'h' => '2', 'i' => '3', 'k' => '2', 'l' => '8', 'm' => '1', 'n' => '2', 'p' => '4', 'q' => '2', 'r' => '8', 's' => '16', 't' => '4', 'v' => '4', 'w' => '1', 'y' => '2'} array = @seq.split(//) degeneracy_number = 1 degeneracy_number = 4 if array.last.downcase == 's' degeneracy_number = 2 if array.last.downcase == 'r' degeneracy_number = 2 if array.last.downcase == 'l' array.pop array.each {|x| degeneracy_number * antal_codons[x.downcase].to_i} @degeneracy = degeneracy_number @degeneracy end def calc_degeneracy_w_inosine antal_codons = {'a' => '1', 'c' => '2', 'd' => '2', 'e' => '2', 'f' => '2', 'g' => '1', 'h' => '2', 'i' => '3', 'k' => '2', 'l' => '2', 'm' => '1', 'n' => '2', 'p' => '1', 'q' => '2', 'r' => '2', 's' => '4', 't' => '1', 'v' => '1', 'w' => '1', 'y' => '2'} array = @seq.split(//) degeneracy_number = 1 degeneracy_number = 4 if array.last.downcase == 's' degeneracy_number = 2 if array.last.downcase == 'r' degeneracy_number = 2 if array.last.downcase == 'l' array.pop array.each {|x| degeneracy_number antal_codons[x.downcase].to_i} @degeneracy_w_inosine = degeneracy_number @degeneracy_w_inosine end def calc_frequency(n) freq = 100*@score.to_f/n.to_f.round.to_f/100 freq end end class Array def fetch_proteins_from(file, info) array = IO.readlines(file) var1 = 0 while var1 < array.length if array[var1].slice(0,1) == '>' p = Protein.new(array[var1+1]) p.name = array[var1].chomp p.peptides = p.split_to_20pep if info == 20 p.peptides = p.split_to_15pep if info == 15 p.peptides = p.split_to_decapep if info == 10 p.peptides = p.split_to_nonapep if info == 9 p.peptides = p.split_to_octapep if info == 8 p.peptides = p.split_to_heptapep if info == 7 p.peptides = p.split_to_hexapep if info == 6 25 p.peptides = p.split_to_pentapep if info == 5 p.peptides = p.split_to_tetrapep if info == 4 p.peptides = p.split_to_tripep if info == 3 p.peptides = p.split_to_dipep if info == 2 self << p end var1 += 1 end end def find_master_prot(fetch) master = Protein.new("") self.each{|p| master = p if p.name.include?(fetch)} master end end class Time def Time.now_glp m = { "1" => "Jan", "2" => "Feb", "3" => "Mar", "4" => "Apr", "5" => "May", "6" => "Jun", "7" => "Jul", "8" => "Aug", "9" => "Sep", "10" => "Oct", "11" => "Nov", "12" =>  "Dec" } t = Time.now "#{t.day}.#{m[t.mon.to_s]}.#{t.year}" end end class Peptid_all_prots def self.calc(cut_off, limit, pep_length) prot_array = [] prot_array.fetch_proteins_from("peptidcycler_excluded_protei ns2.txt", pep_length) array_output = [] prot_array.each do |master_prot| master_cut_off = master_prot.peptides.length*(1+cut_off)/limit selected_proteins_array = [] peptide_array = [] prot_array.each do |p| #Make group of proteins similar to the master p.score = 0 #zero the hexa_score master_prot.peptides.each{|peptide| p.score += 1 if p.seq.include?(peptide)} if p.score > master_cut_off selected_proteins_array << p peptide_array << p.peptides #Collect the peptides of the group end end peptide_array.flatten!.uniq! if peptide_array != [] sort_peptide_array = [] peptide_array.each do |peptide| #Select the peptides with  highest frequency score = 0 prot_score = 0 selected_proteins_array.each do |p| if p.seq.include?(peptide) score += 1 prot_score += p.score end end sort_peptide_array << [score, prot_score, peptide] if score > 1 end peptide_array = [] if sort_peptide_array.length == 0 peptideprofile =:nothing else sort_peptide_array.sort!.reverse! sort_peptide_array.slice!(limit, sort_peptide_array.length) if sort_peptide_array.length > limit sort_peptide_array.each{|a| peptide_array << a[2]} #Best peptides in array peptideprofile =:evolving end while peptideprofile ==:evolving selected_proteins_array = [] array = [] prot_array.each do |p| #score the proteins against the valid peptide_array and choose the best p.score = 0 peptide_array.each{|peptide| p.score += 1 if p.seq.include?(peptide)} if p.score > cut_off #Best proteins in array selected_proteins_array << p array << p.peptides #Their peptides in array end end array.flatten!.uniq! if array !=[] sort_peptide_array = [] array.each do |peptide| #find best peptides score = 0 #zero peptide_score prot_score = 0 selected_proteins_array.each do |p| if p.seq.include?(peptide) score += 1 prot_score += p.score end end sort_peptide_array << [score, prot_score, peptide] end peptide_array2 = [] if sort_peptide_array.length == 0 peptideprofile =:nothing else sort_peptide_array.sort!.reverse! sort_peptide_array.slice!(limit, sort_peptide_array.length) if sort_peptide_array.length > limit sort_peptide_array.each{|a| peptide_array2 << a[2]} #Best peptides in array  end if peptide_array.sort == peptide_array2.sort #If nothing happens peptideprofile =:finished else peptide_array = [peptide_array2].flatten end end master_prot.score = 0 peptide_array.each{|peptide| master_prot.score += 1 if master_prot.seq.include?(peptide)} array = [] #[# of members, score, name, score + number of family members, family members, peptider] array << selected_proteins_array.length array << master_prot.score array << master_prot.name array << "score = #{master_prot.score}, Group members = #{selected_proteins_array.length}" array2 = [] selected_proteins_array.each{|p|array2 << p.name.slice(1,5).to_i array << array2 array << peptide_array array_output << array print "." end array_output.sort!.reverse! ud_array = array_output.first[2,5]  output_file = File.new("family_file2.txt", "w") array_output.each do |array| output_file.puts ">#{array[2].slice(1,5).to_i}" output_file.puts array[3] output_file.puts array[4].join(",") output_file.puts "" end output_file.close puts "." ud_array end end class Peptidcycler def self.calc(peptide_array, cut_off, limit) prot_array = [] prot_array.fetch_proteins_from("peptidcycler_excluded_protei ns2.txt", "nothing") excluded_file = File.new("peptidcycler_excluded_proteins2.txt", "w") #non-family members in back to pool selected_proteins_array = [] prot_array.each do |p| #score the proteins against the valid peptide_array and choose the best p.score = 0 peptide_array.each{|peptide| p.score += 1 if p.seq.include?(peptide)} if p.score > cut_off #de bedste proteiner i array selected_proteins_array << p else excluded_file.puts p.name excluded_file.puts p.seq excluded_file.puts "" end end excluded_file.close exhausted =:no exhausted =:yes if prot_array.length == selected_proteins_array.length [selected_proteins_array, exhausted] end end class Peptidegenerator def self.calc(family_array, peptide_array, group_number) family_array.each do |p| #score the proteins against the valid peptide_array and choose the best p.score = 0 peptide_array.each{|peptide| p.score += 1 if p.seq.include?(peptide)} end family_array.sort!{|x,y| x.name.slice(1,5).to_i <=> y.name.slice(1,5).to_i} f = File.new("group_#{group_number}.txt", "w") family_array.each do |p| f.puts "#{p.name}, score = #{p.score}" f.puts p.seq f.puts ""  end f.close n = family_array.length best_peptides = [] #Find best peptides peptide_array.each do |seq| pep = Peptide.new(seq) pep.score = pep.calc_score(family_array) best_peptides << pep end best_peptides.each do |pep| #Find properties of each hexapeptide position_array = [] family_array.each{|p| position_array << p.seq.index(pep.seq)} position_array.compact! position_array.sort! pep.average_position = position_array[position_array.length/2] pep.degeneracy = pep.calc_degeneracy pep.degeneracy_w_inosine = pep.calc_degeneracy_w_inosine end best_peptides.sort!{|x,y| [y.score, x.degeneracy, x.degeneracy_w_inosine] <= "w") [x.score, y.degeneracy, y.degeneracy_w_inosine]} output_file = File.new("group_#{group_number}_peps.txt", output_file.puts "group #{group_number}\t#{family_array.length} proteins" output_file.puts "Peptides:" output_file.puts  "position\tsequence\tfrequency\thits\tdegeneracy\tdegeneracy_w_I" best_peptides.each do |pep| output_file.puts "#{pep.average_position}\t#{pep.seq}\t#{pep.calc_frequency( family_array.length)}\t#{p ep.score}\t#{pep.degeneracy}\t#{pep.degeneracy_w_inosine}" end output_file.close "Results for group #{group_number} written to files" end end f = File.new("peptidcycler_excluded_proteins2.txt", "w") n_input_prots = 0 IO.foreach("six_families.txt") do |line| f.puts line.chomp n_input_prots += 1 if line.slice(0,1) == '>' end f.close classifier_peptides = File.new("new_family_classifying_peptides.txt", "w") master_prot_array = [] score = 100 members = 100 rounds = 1 exhausted =:no while members > 8 && rounds < 20 && exhausted ==:no puts "Starting round #{rounds}" best_family = Peptid_all_prots.calc(cut_off, limit, pep_length) puts "Finished peptid_all_prots10"  fetch = "#{best_family [0].chomp}gi" info = best_family[1].chomp score = info.split("=")[1].to_i members = info.split("=").last.to_i master_prot_array << [fetch, info] peptide_array = best_family[3] puts "Family #{rounds}" puts "master_protein: #{fetch}" puts "score: #{score}" puts "members: #{members}" array = Peptidcycler.calc(peptide_array, cut_off, limit) #make group and peptides family_array = array [0] exhausted = array[1] puts "Finished peptidcycler6" puts family_array.length puts peptide_array.length classifier_peptides.print "family #{rounds}," classifier_peptides.puts peptide_array.join(",") guf = Peptidegenerator.calc(family_array, peptide_array, rounds) puts guf rounds += 1 end classifier_peptides.close File.delete("family_file2.txt") puts master_prot_array output_file = File.new("parameter_variation.txt", "a") output_file.puts Time.now_glp  output_file.puts "input = #{n_input_prots} sequences" output_file.puts "limit=#{limit}\tcut_off=#{cut_off}\tpep_length=#{pep_length}" output_file.puts "#{master_prot_array.length} groups" var1 = 0 while var1 < master_prot_array.length output_file.print "Group #{var1+1}\t" #family_array.each{|m| output_file.print "#{m.name.slice(1,5).to_i},"} output_file.print "FAS \t" if master_prot_array[var1] [0].slice(1,5).to_i < 100 output_file.print "cycD \t" if master_prot_array[var1] [0].slice(1,5).to_i.between?(100, 199) output_file.print "EDF1 \t" if master_prot_array[var1] [0].slice(1,5).to_i.between?(200, 299) output_file.print "SP1 \t" if master_prot_array[var1] [0].slice(1,5).to_i.between?(300, 399) output_file.print "PKC \t" if master_prot_array[var1] [0].slice(1,5).to_i.between?(400, 499) output_file.print "CAT1 \t" if master_prot_array[var1] [0].slice(1,5).to_i.between?(500, 599) #output_file.puts “” output_file.puts master_prot_array[var1].last.split(",").last.strip  var1 += 1 end output_file.puts "" output_file.close puts " output in \"parameter_variation.txt\"" Final de “classify_family3.rb

[00433] A entrada consiste em um arquivo de texto ("txt" no formato do windows) que contém sequências de biopolímero em formato FASTA. No presente exemplo, o arquivo de entrada é chamado de "six_families.txt" e contém 105 sequências de proteínas diferentes.

[00434] "classify_family3.rb" pode ser aberto em um editor de texto como o bloco de notas, SciTE, wordpad, MSword ou outro para definir uma variedade de parâmetros. Os parâmetros usados com mais frequência são:

[00435] Cut_Off: O número de n-meros selecionados que estão presentes em um biopolímero deve ser maior do que esse valor para incluir o biopolímero no grupo que é definido pelos n-meros.

[00436] limit: número de n-meros que são selecionados com base na frequência. E.g.; limit = 100 indica que os 100 n-meros que ocorrem com mais frequência serão selecionados.

[00437] pep_length: Comprimento dos n-meros.

[00438] O valor destes três parâmetros é listado nas linhas 1 a 3 de "classify_family3.rb". Outros parâmetros podem ser alterados, por exemplo, os nomes de arquivo ou informações escritas no arquivo de log podem ser alterados.

[00439] No presente exemplo, os parâmetros são: cut_off = 9 (a proteína A deve conter pelo menos 10 dos peptídeos selecionados a serem incluídos no grupo); limit = 100 (os 100 peptídeos que ocorrem com mais frequência são selecionados); e pep_length = 6 (os peptídeos são hexâmeros (seis aminoácidos de comprimento)).

[00440] Classes, matrizes, métodos e outros parâmetros e objetos podem ser nomeados como "aminoácido", "peptídeo", "proteína" ou similares, referindo-se à nomenclatura dos aminoácidos, mas o programa funciona igualmente bem para biopolímeros e n-meros, consistindo em sequências nucleotídicas.

[00441] Ao executar "classify_family3.rb", o algoritmo irá gerar dois arquivos de saída para cada grupo de biopolímeros:

[00442] Um arquivo ("group_n.txt" onde n é um número inteiro) com os biopolímeros selecionados no formato FASTA e com a pontuação incluída na linha da sequência do nome (a pontuação é o número de n-meros selecionados que foram encontrados na proteína).

[00443] Outro arquivo ("group_n_peps.txt" onde n é o mesmo número inteiro) com as sequências de n-meros selecionadas correspondentes listadas de acordo com a frequência de ocorrência (frequência). Além disso, as seguintes informações sobre cada n-mero estão listadas:

[00444] Posição: A posição média nos biopolímeros selecionados que contêm o n-mero.

[00445] Hits: Número de biopolímeros no grupo que contêm o n-mero. Isto é igual a frequência.

[00446] Degeneracy: Número de sequências nucleotídicas que codificará o n-mero, último nucleotídeo não incluído se esta posição estiver degenerada,

[00447] Degeneracy_w_I: Igual à degeneração, mas com posições de nucleotídeos que podem incluir todas as quatro bases (A, C, G, T) substituídas com uma inosina que não é degenerada.

[00448] Degeneracy e degeneracy_w_I apenas são relevantes quando os n-meros são peptídeos. "group_n_peps.txt" é um arquivo de texto que pode ser aberto como tal ou aberto ou importado no MS excel Open Office calc ou outra planilha.

[00449] Além dos arquivos para cada grupo, o programa vai escrever informações selecionadas sobre o resultado para um arquivo de log chamado "parameter_variation.txt".

[00450] No presente exemplo, as informações escritas no arquivo de log são a data da análise, o número de sequências de entrada, valores para o limite, cut_off e pep_length, o número de grupos gerados e, para cada grupo: número do grupo, atividade da proteína usada para gerar o primeiro conjunto de hexapeptídeos para geração do grupo e número de proteínas incluídas no grupo. Sequências de proteínas:

[00451] As proteínas incluídas no arquivo de entrada (números de registro: 1705782, 224983391, 224983654, 301757408, 301785071, 296474442, 77736363, 114053227, 115496822, 260789607, 296211128, 296198149, 73997778, 54114982, 145558686, 148231179, 18858509, 113682259, 19880484, 194211581, 198443141, 2506136, 1345958, 193695213, 157115283, 301754163, 312376091, 158299938, 66515350, 60592790, 170587440, 309360367, 268566311, 212642053, 308499509, 73964695, 148841334,78214939, 170038418, 292619618, 229366888, 225718944, 41152191, 225716152, 57525242, 159159985, 3043445, 225713940, 126302643, 225705832, 149546904, 225706882, 114627636, 226372738, 157817161, 209737752, 148228671, 296487921, 45709387, 45382955, 38512205, 62088936, 291389251, 114644522, 149031929, 5069468, 38511776, 148232916, 260831456, 296215214, 73963109, 292619987, 176866349, 317419553, 4885563, 28557781, 241293326, 22085162, 114653371, 291239731, 47224750, 270010958, 301757916, 209447036, 296203637, 73993349, 73993361, 57104988, 149730179, 224458362, 35920, 4507047, 189053509, 109120366, 4096268, 148673899, 291410388, 114649243, 114649241, 114649245, 55730091, 297693777, 18181964, 6981556 and 60302866) foram encontradas em bancos de dados fornecidos pelo National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) por meio da busca por proteínas relacionadas com os seguintes nomes de proteínas: "ácido graxo sintetases", "ciclina D", "EDF-1", "SP1", "PKC" e "transportador de aminoácidos catiônicos 1", e sequências relacionadas com esses nomes.

[00452] A cada proteína foi atribuído um número entre ">" e "gi" na linha do nome da sequência formatada FASTA. O número pode ser usado para o rastreamento manual da origem da proteína:

[00453] Números menores que 100: ácido graxo sintetases (FAS)

[00454] Números entre 100 e 200: ciclina D (cycD)

[00455] Números entre 200 e 300: fator de diferenciação endotelial 1 (EDF-1)

[00456] Números entre 300 e 400: fator de transcrição Sp1 (SP1)

[00457] Números entre 400 e 500: proteína quinase C (PKC)

[00458] Números entre 500 e 600: transportador de aminoácidos catiônicos 1 (CAT1) Resultados

[00459] O arquivo de entrada continha sequências de proteínas de origem animal de seis tipos diferentes. Entre 11 e 23 sequências de proteínas de cada tipo foram incluídas.

[00460] A execução de "classify_family3.rb" classificou as proteínas em seis grupos, com os arquivos correspondentes: “group_1.txt”, “group_1_peps.txt”, “group_2.txt”, “group_2_peps.txt”, “group_3.txt”, “group_3_peps.txt”, “group_4.txt”, “group_4_peps.txt”, “group_5.txt”, “group_5_ peps.txt”, “group_6.txt” e “group_6_peps.txt”.

[00461] Os grupos e as sequências foram relacionados das seguintes maneiras, conforme mostrado abaixo na Tabela 1:

Conclusão

[00462] Como é observado na Tabela 1, todas as sequências foram classificadas juntamente com as outras proteínas do mesmo tipo, como esperado. Este resultado mostra que o algoritmo executado por "classify_family3.rb" é capaz de classificar muitas sequências de diversos tipos diferentes em grupos funcionalmente relacionados. Além disso, o programa fornece uma biblioteca de hexapeptídeos que ocorrem com mais frequência para cada grupo. Esta biblioteca é útil para a caracterização adicional da proteína, para geração de iniciadores degenerados ou sondas, ou para outros fins relacionados à compreensão dos grupos de proteínas. Exemplo 2

[00463] Classificação das proteínas GH61 em novos grupos.

[00464] Sequências de entrada:

[00465] Os nomes e as sequências de 467 proteínas com números de registro do domínio da família glicosil-hidrolase 61: 74667001, 74623591, 296439555, 262118542, 296439558, 74681380, 166327, 225557038, 150407066, 239612339, 239607981, 261199970, 261202604, 291178704, 296817237, 119403851, 119403039, 119402879, 121706932, 121699858, 121701491, 119401707, 238490450, 220691752, 238497908, 238491658, 238503077, 220700751, 159129837, 159122044, 159123538, 66848476, 70986426, 70994524, 66853425, 70986442, 42820662, 259486007, 67517718, 259480946, 40740355, 40739935, 259479347, 259480639, 259487791, 75859132, 40739882, 259481977, 134082518, 134080048, 145239987, 145258912, 145246562, 145249108, 169772537, 169776393, 169772353 , 83766624, 83770187, 83775441, 83774271, 114192450, 114196513, 114192138, 114196092, 114189374, 115385899, 115391767, 115401906, 115433194, 114192785, 115491813, 115401646, 194010899, 157679842, 154319179, 150848256, 150843601, 154291544, 154305677, 154305687, 150846167, 150843791, 154303615, 154321720, 116198863, 116197146, 88180011, 116208464, 116196852, 88179151, 116194372, 88176999, 88175803, 88177898, 116206022, 116208766, 88180297, 116201473, 88184980, 116178904, 88176171, 116193969, 116208324, 88178730, 88178174, 88178872, 116181126, 88182035, 116208244, 88181972, 88184289, 88179554, 88182057, 116195750, 88181172, 116202763, 116199761, 116203843, 116179468, 88178947, 116199201, 88184520, 88177588, 116196738, 116200237, 116199041, 116200816, 116203395, 119183059, 240109478, 23429037, 116503205, 116498049, 116497843, 299742296, 299741430, 116506365, 299744767, 169851646, 299741891, 299742644, 299753892, 169856301, 116506859, 298405205, 299747134, 116500962, 298409438, 169855583, 298408738, 298405278, 169863978, 298404712, 298405412, 169857546, 298408101, 116497409, 298405114, 298408187, 169868872, 169866035, 116504243, 298405932, 169856214, 299754619, 298405923, 134107111, 57223077, 46118057, 46115580, 46119467, 46139947, 46110641, 46115706, 46116252, 46124039, 46127069, 46127267, 46123465, 46123419, 46123661, 209570280, 209570302, 209570284, 209570424, 31747162, 2315274, 170102152, 170092074, 164651300, 164636998, 164642401, 170109392, 164642863, 164642075, 170105517, 170101484, 170105309, 145011373, 145011030, 145020107, 145014411, 145011646, 145015510, 145019304, 145016906, 145017744, 145014077, 145015931, 145021993, 39945800, 39968819, 145603548, 39946206, 149209397, 145608220, 145608962, 39972659, 145607904, 39971969, 39944092, 145605188, 145609409, 238616327, 238615335, 215456441, 238568683, 238587009, 238583365, 238591056, 215461462, 238579289, 238590448, 215458915, 215450835, 215451124, 238587956, 238567983, 238569868, 238579260, 215458309, 238616405, 302911456, 302883424, 302911391, 302888437, 302885549, 256726867, 302890355, 302885390, 302889367, 302887358, 256726596, 256727058, 256726169, 119498947, 119406222, 119485741, 119500958, 119415683, 119481757, 119495445, 119474543, 119481769, 28919725, 28920895, 85118747, 85078092, 28919956, 28924255, 28919596, 28925415, 28920933, 157071792, 85119231, 85107660, 28881165, 18376179, 16945376, 211583790, 255933578, 255945663, 255937397, 212532291, 111056092, 160705691, 160701235, 169617890, 111070506, 160706762, 111061286, 169596753, 160703463, 169596264, 111068298, 160705400, 169616886, 111060360, 160706840, 111065694, 169598246, 169622513, 169598063, 169594960, 169604850, 169608836, 111069743, 160704974, 160701263, 169617193, 111062780, 169619068, 160703254, 21694047, 170936818, 171693009, 171677338, 170939885, 171685476, 170946510, 171679531, 171676648, 170946519, 171680024, 170941538, 170936992, 170942657, 171683179, 171683736, 170945726, 170944138, 171684255, 170941524, 170941094, 170945939, 171694598, 171681337, 171688168, 171692645, 171690944, 171681359, 171683760, 170942722, 171681569, 170942522, 170941813, 170939504, 242218042, 242217378, 220731934, 220723726, 189198079, 187980642, 189199012, 189194773, 189193113, 187983705, 187976621, 187983395, 189201760, 189207084, 189188194, 189200058, 187979887, 189188372, 187977147, 187984916, 189200631, 189192108, 189193871, 189205641, 187972977, 187983372, 189191958, 187979866, 189194025, 302686954,  300103229, 300103287, 300108602, 300101553, 300111682, 302696233, 300105858, 302674513, 300100257, 300103639, 300106070, 302675767, 300101263, 302683644, 302679828, 302682756, 300101194, 300103387, 302677564, 300100552, 300100648, 302689207, 300105576, 302674561, 300101299, 154700549, 156063440, 154694216, 156050139, 156045950, 154700442, 156039846, 154700551, 156049573, 289621959, 289615175, 289616424, 289621869, 289618672, 289622259, 289614784, 289619034, 289615496, 289618626, 289616197, 289616196, 289617770, 289620809, 289620945, 289620832, 289621556, 289615045, 289618715, 289618337, 148553353, 218722209, 284451272, 201066457, 299892806, 302656446, 296418037, 295636680, 237904675, 302409770, 261358989, 302420443, 261361024, 302410193, 261352381, 261358929, 302414852, 302418676, 261360020, 302413657, 302417124, 302405483, 261353895, 302419149, 261358115, 302405803, 261359888, 261359952, 302405821, 261361512, 302409258, 49333361, 238011426, 194704134 e 11359621 foram usadas como entradas. Algoritmo e implementação

[00466] O mesmo programa, como no exemplo 1, foi usado com os parâmetros cut_off = 9, limit = 100 e pep_length = 6. Resultados

[00467] O programa foi executado com 467 proteínas gh61 como entrada. Após 13 ciclos os grupos tornaram-se muito pequenos (cinco proteínas ou menos) para definir qualquer perfil de peptídeo comum porque as proteínas restantes tinham sequências muito diferentes. No entanto, a rodada 13 definiu os grupos conforme listado na Tabela 2. Cada grupo tinha o seu próprio perfil de hexapeptídeos (os 100 hexapepídeo que ocorrem com mais frequência) com pouca sobreposição entre os grupos, conforme ilustrado na Tabela 3. Tabela 2: Grupos de proteínas GH61

Tabela 3: Comparação cruzada das assinaturas do hexapeptídeo para cada grupo (grupo) de proteínas GH61

Conclusão

[00468] A distribuição dos hexapeptídeos mostrou que quase todos os peptídeos conservados foram encontrados nos primeiros 240 aminoácidos das proteínas gh61, enquanto que a parte restante das proteínas foi altamente variável. Curiosamente, dois picos foram observados onde a maioria dos hexapeptídeos conservados foram encontrados para toda a família. A região 1 localizada entre os resíduos de aminoácidos 100 a 120 tem um pico claro, enquanto que a região 2 (aminoácidos 160 a 200) tem um ombro nos aminoácidos 200 a240. A distribuição dos peptídeos para cada grupo mostra que os grupos de 1, 5, 7, 8, 9, 10 e 12 (tipo 1) têm apenas picos nas regiões 1 e 2, enquanto que os grupos 1, 2, 3, 4, 6, 11 e 13 (tipo 2) têm um pico adicional para os aminoácidos 200 a 220. O pico 1 foi muito pequeno no grupo 7, indicando que este grupo é mal conservado na região 1.

[00469] Para investigar as três regiões conservadas com mais detalhes, alinhamos os hexapeptídeos para cada grupo nestas regiões gerar uma sequência consenso. O alinhamento das sequências consenso para cada grupo mostra a região 1 é semelhante em 11 dos 13 grupos e contém uma das histidinas que coordena o átomo de níquel divalente ligado à estrutura cristalina gh61 (Karkehabadi, S. et al., 2008. A primeira estrutura de um membro da família glicosídeo hidrolase 61, Cel61B, de Hypocrea jecorina, em uma resolução de 1.6. Journal of Molecular Biology, 383(1), 144-154). Além disso, as duas cisteínas que formam uma ponte de cisteína na estrutura cristalina foram encontradas nesta região, mas estavam conservadas apenas nos grupos 1, 8 e 11. No grupo 11, a segunda das duas cisteínas foi encontrada nas sequências de proteínas, mas localizava-se fora dos hexapeptídeos conservados.

[00470] A região 2 foi conservada em todos os 13 grupos e contém uma histidina conservada que não participa na coordenação do átomo de níquel (Karkehabadi, S. et al., 2008. A primeira estrutura de um membro da família glicosídeo hidrolase 61, Cel61B, de Hypocrea jecorina, em uma resolução de 1.6. Journal of Molecular Biology, 383(1), 144-154), mas, por outro lado, está localizada na superfície de ligação ao níquel de gh61, juntamente com dois outros resíduos conservados (Q/E49 e Y51), na região 2. A região 3 está fora da estrutura cristalina reportada e contém um dipeptídeo conservado de prolina-glicina.

[00471] Para comparar adicionalmente os grupos as proteínas que forneceram a maior pontuação em cada grupo foram alinhadas. Notavelmente, este alinhamento mostrou que His23 que participa da ligação com o átomo de níquel foi conservada em todas as famílias. Também as duas cisteínas (Cys78 e Cys228) que formam uma ponte de cisteína no cristal foram conservadas. Curiosamente, o alinhamento é fraco entre os aminoácidos 60 e 80, onde vários resíduos mapeiam para a superfície de ligação ao níquel de gh61. Assim, o algoritmo descrito neste documento programado como no exemplo 1 é capaz de dividir um grande número de proteínas da família gh61 muito divergentes em grupos compreensíveis. Exemplo 3

[00472] Geração de iniciadores para isolar genes pertencentes aos genes do grupo 1 de GH61. Projeto dos iniciadores degenerados

[00473] Os hexapeptídeos conservados identificados no exemplo 2 foram traduzidos inversamente de acordo com o código genético e posições contendo qualquer nucleotídeo (A, C, G ou T) foram substituídas com inosina (Tabela 4). Os nucleotídeos degenerados na extremidade 3' dos iniciadores foram removidos da sequência dos iniciadores. A degeneração do iniciador que resulta da tradução reversa de cada hexapeptídeo foi calculada com base no código genético e nas posições de substituição contendo qualquer nucleotídeo (A, C, G ou T) com inosina (Tabela 4). Além disso, a posição relativa dos hexapeptídeos nas proteínas foi estimada como a média da distância do peptídeo até o N-terminal de cada proteína no subgrupo que continha o peptídeo.

[00474] As sequências dos iniciadores foram selecionadas em três critérios: 1. Elas devem ter alta frequência na subfamília de proteínas 2. Elas devem fornecer um amplicon de pelo menos 40 pares de bases, excluindo as sequências iniciadoras para ser capaz de obter informações de sequência suficientes para identificar o produto da PCR. 3. Os iniciadores devem possuir a menor redundância possível e bases redundantes na extremidade 3’ não são permitidas.

[00475] Uma cauda de seis bases (CTGGAC) foi adicionada à extremidade 5' de todas as sequências iniciadoras, uma vez que está documentado que isto melhora o desempenho dos iniciadores curtos. Os iniciadores reversos foram concebidos para serem reversamente complementares à sequência de DNA que codifica o hexapeptídeo e de acordo com as mesmas regras. Os iniciadores foram sintetizados e purificados por HPLC por Sigma-Aldrich (Reino Unido/Europa). Tabela 4: Lista de iniciadores degenerados

Fungos

[00476] Os seguintes fungos, conforme listado na Tabela 6 foram comprados junto à The Centraalbureau voor Schimmelcultures, Holanda, e cultivados em placas com 6% de farelo de trigo (Finax, Dinamarca) e 15% de ágar (Sigma-Aldrich, Reino Unido/Europa) na temperatura recomendada. Tabela 5: Lista de fungos

Purificação de DNA

[00477] O micélio fúngico foi raspado do topo de uma placa de ágar farinha de trigo, congelado em N2(l) e moído com pistilo e gral. O DNA foi extraído do micélio homogeneizado com o mini kit de DNA fúngico (Fungal DNA Mini Kit) (Omega Bio-Tek, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. PCR

[00478] Uma mistura de 100 ng de RNA de fungo total em 1x corrida com tampão de PCR, 2 mM de cada um de dATP, dCTP, dGTP e dTTP, 400 nM de iniciador normal; 400 de iniciador reverso; 1U de DNA polimerase RUN (AandA Biotechnology, Polônia) em um volume total de 20 μL foi usada para o PCR em um MyCycler (Bio-Rad, EUA) com o seguinte perfil térmico: desnaturação inicial a 95° C durante 5 minutos. 40 ciclos de 95 °C durante 20 segundos; 54 °C, 30 segundos; 72 °C, 60 segundos e uma extensão final a 72 °C de 5 minutos. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose e o DNA selecionado foi cortado e purificado usando o kit QIAQUICK® (QIAGEN, Alemanha). Um μL do produto de PCR purificado foi reamplificado em uma reação de 50 μL sob as mesmas condições que o PCR original, exceto que apenas de 15 a 20 ciclos de PCR foram realizados. Sequenciamento e análise

[00479] Produtos PCR foram sequenciados no ciclo por Eurofins- MWG (Alemanha) ou StarSEQ (Alemanha) com um dos iniciadores degenerados usados para o PCR. As sequências resultantes foram traduzidas para a sequência de aminoácidos e usadas para a pesquisa BLAST (Altschul et al., 1997) contra o banco de dados de sequências de proteínas não redundantes no NCBI e inspecionadas quanto aos domínios conservados (Marchler-Bauer et al., 2009) no banco CDD no NCBI para identificar as sequências que codificam proteínas tipo 61 da família glicosídeo hidrolase. Resultados

[00480] Os hexapeptídeos que ocorrem com mais frequência definindo o grupo 1 de GH61s foram usados para conceber os iniciadores degenerados (Tabela 4). Como os dois hexapeptídeos mais conservados (ocorrendo em 80 e 78% das proteínas) poderiam ser usados para projetar os iniciadores reversos, não consideramos necessário projetar um terceiro iniciador reverso. Um dos três hexapeptídeos usados para conceber o iniciador normal (SHHGPV) contém um resíduo de serina que é codificado por 6 códons diferentes no N-terminal. Um iniciador degenerado para serina não contribui significativamente para a especificidade e, portanto, o iniciador foi feito por tradução reversa do peptídeo HHGPV. No PCR virtual, os três iniciadores normais e os dois iniciadores reversos foram capazes de amplificar 66 das 85 proteínas no grupo 1 e nenhuma proteína dos outros grupos.

[00481] Os iniciadores foram usados para todas as seis combinações possíveis para PCR de DNA dos 14 fungos termofílicos.

[00482] Para todos os fungos, pelo menos um dos conjuntos de iniciado forneceu um produto de amplificação com o tamanho esperado e, para alguns fungos, todos os conjuntos de iniciadores forneceram um produto positivo. Para cada fungo, o amplicon mais longo que tinha o tamanho esperado foi sequenciado e analisado para os quadros de leitura abertos. Todos os amplicons produziram uma sequência que codifica um gene da família GH61 putativo novo. Embora as sequências sejam apenas parciais, foi possível classificar todas, exceto uma como pertencente ao grupo 1. A sequência não atribuída de Chaetomium senegalense foi a mais curta das sequências e possui apenas 37 aminoácidos de comprimento, mas tinha até 73% de identidade com as sequências gh61 conhecidas, e 78% de identidade com a nova sequência de Remersonia thermophila. De fato, é surpreendente que algumas das novas sequências tinham muitos hexapeptídeos conservados. Por exemplo; a sequência parcial de gh61 de Malbranchea cinnamomea tinha 17 dos peptídeos conservados do grupo 1, embora a sequência tenha apenas 73 aminoácidos de comprimento. Em resumo, o resultado do PCR mostrou que os iniciadores degenerados, com base no algoritmo seletor poderiam ser usados para encontrar novas proteínas gh61. Exemplo 4

[00483] Geração de iniciadores para isolar novos genes pertencentes aos genes GH6, GH7 e GH45.

[00484] Usando a mesma abordagem, os hexapeptídeos conservado foram identificados para o GH6, 7 e 45 famílias.

[00485] Sequências de entrada:

[00486] Nomes e sequências de: números de registro de 17 proteínas com um domínio da família glicoil-hidrolase 6: (119473935, 119495997, 220693815, 70986018, 145239297, 145246118, 115401052, 115491303, 67521632, 67538224, 95025919, 913560, 60729586, 68270848, 50837707, 50837690, 50837696)

[00487] Números de registro das 19 proteínas com um domínio da família glicosil-hidrolase 7: (950686, 4883502, 156712278, 156712280, 156712284, 20986705, 27125837, 150021831, 29160357, 117935080, 58045187, 156712282, 50844407, 2761, 950686, 950688, 4883502, 7224903, 29160311)

[00488] Números de registro das 12 proteínas com um domínio da família glicosil-hidrolase 45: (154294519, 222103630, 116180480, 310789959, 312217600, 39951371, 169616266, 171687659, 189197649, 27530617, 156032908 e 158138919) foram usados como entrada.

[00489] Os hexapeptídeos conservados foram identificados para as 3 famílias de genes como no Exemplo 2 e os iniciadores degenerados listados abaixo foram gerados e a amplificação por PCR foi realizada conforme descrito no Exemplo 3. Tabela 6: Lista de iniciadores degenerados

Resultados

[00490] Através da realização de amplificação por PCR do DNA isolado dos 14 fungo listados na Tabela 5, o uso de combinações dos iniciadores degenerados listados na tabela 6 e análise de sequência dos fragmentos de DNA amplificado resultantes levou ao isolamento de fragmentos dos 6 novos genes GH6, 8 novos genes GH7 e 10 novos genes GH45.

[00491] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos parágrafos numerados a seguir: [1] Polipeptídeo isolado com atividade celobio-hidrolase, selecionado do grupo consitindo em: (a) um polipeptídeo que tem ao menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 4; pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 6; pelo menos 91% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 8; ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 10; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza pelo menos sob condições de estringência muito alta com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9, (ii); a sequência de cDNA da mesma, ou (iii) o complemento completo de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 1 ou SEQ ID No: 3, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 90% de identidade de sequência coma sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 5 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 91% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 7 ou as sequências de cDNA da mesma; ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 9 ou a sequência de cDNA da mesma; (d) uma variante que compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 10, que compreende uma substituição, eliminação e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, em várias) posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c) ou (d) que tem atividade celobio-hidrolase. [2] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 1, que tem pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos, 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 4; pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 6; pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 8; ou pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 10. [3] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 1, que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza, sob condições de estringência muito alta com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9, (ii) a sua sequência de cDNA ou (iii) o complemento completo de (i) ou (ii); [4] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 1, que é codificado por um polinucleotídeo que tem pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo que codifica a sequência de SEQ ID No: 1 ou SEQ ID No: 3, ou as porções das sequências de cDNA; pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 5 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 7, ou as sequências de cDNA da mesma; ou pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 9 ou a sua sequência de cDNA. [5] Polipeptídeo, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 4, compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 10, ou no polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 10. [6] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 1, que é uma variante compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 10, compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em um ou mais posições. [7] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 1, que é um fragmento da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 10, em que o fragmento tem atividade celobio-hidrolase. [8] Polipeptídeo isolado com atividade celobio-hidrolase, selecionado do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo que tem atividade celobio-hidrolase com pelo menos 70% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 12; pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 14 ou SEQ ID No: 16; pelo menos 91% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 18; pelo menos 96% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 20; ou pelo menos 98% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 22 ou SEQ ID No: 24; (b) um polipeptídeo que tem atividade celobio-hidrolase codificado por um polinucleotídeo que hibridiza pelo menos sob condições de estringência muito alta com (i) a sequência codificador ade polipeptídeo da SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, ou SEQ ID NO: 23, (ii) a sequência de cDNA das mesmas, ou (iii) o complemento completo de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo que tem atividade celobio-hidrolase codificado por um polinucleotídeo que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo SEQ ID No: 11 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 13 ou SEQ ID No: 15, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 91% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 17 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 96% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 19 ou a sequência de cDNA da mesma; ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 21 ou SEQ ID No: 23, ou as sequências de cDNA das mesmas; (d) uma variante da celobio-hidrolase que compreende o polipeptídeo da SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 24 que compreende uma substituição, eliminação e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c) ou (d) que tem atividade celobio-hidrolase. [9] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 8, que tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos de 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos, 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 12; pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 14 ou SEQ ID No: 16; pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 18; pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 20; ou pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 22 ou SEQ ID No: 24. [10] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 8, que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência muito alta com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23, (ii) a sequência de cDNA do mesmo ou (iii) o complemento completo de (i) ou (ii). [11] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 8, que é codificado por um polinucleotídeo que tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 11 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a identidade de sequência para a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 13 ou SEQ ID No: 15, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 17 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 19 ou a sequência de cDNA da mesma; ou pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 21 ou SEQ ID No: 23, ou as sequências de cDNA das mesmas. [12] Polipeptídeo, de acordo com qualquer um dos parágrafos 8 a 11, compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 24, ou o polipeptídeo da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 24. [13] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 8, que é uma variante que compreende o polipeptídeo da SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, ou SEQ ID NO: 24 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais posições. [14] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 8, que é um fragmento da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 242, em que o fragmento tem atividade celobio-hidrolase. [15] Polipeptídeo isolado com atividade endoglicanase, selecionado do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 26; pelo menos 65% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 28; pelo menos 70% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 30 ou SEQ ID No: 32; pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 34, SEQ ID No: 36 ou SEQ ID No: 38; pelo menos 85% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 40 ou SEQ ID No: 42; pelo menos 97% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 44; ou pelo menos 98% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 46; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza pelo menos sob condições de estringência alta com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 25 ou SEQ ID No: 27, (ii) a sequência de cDNA das mesmas ou (iii) o complemento completo de (i) ou (ii); ou pelo menos sob condições de estringência muito alta com (i) o polipeptídeo que codifica a SEQ ID No: 29, SEQ ID No: 31, SEQ ID No: 33, SEQ ID No: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 45, (ii) a sequência de cDNA das mesmas ou (iii) o complemento completo de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 25 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 65% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 27 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 29 ou SEQ ID No: 31, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 33, SEQ ID No: 35, ou SEQ ID No: 37, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 39 ou SEQ ID No: 41, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 97% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 43, ou a sequência de cDNA da mesma; ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 45, ou a sequência de cDNA da mesma; (d) uma variante que compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 46 compreendendo uma substituição, exclusão e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c) ou (d) que tem atividade endoglicanase. [16] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 15, que tem pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos, 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 26; pelo menos 65%, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 28; pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 30 ou SEQ ID No: 32; pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 34, SEQ ID No: 36 ou SEQ ID No: 38; pelo menos 85%, por exemplo, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 40 ou SEQ ID No: 42; pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 44; ou pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 46. [17] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 15, que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência alta ou muito alta com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo de SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27, (ii) a sequência de cDNA da mesma, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); ou sob condições de estringência muito altas com (i) a sequência codificadora do polipeptídeo de SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 ou SEQ ID NO: 45, (ii) a sequência de cDNA das mesmas, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii). [18] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 15, que é codificado por um polinucleotídeo que tem pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No: 25 ou com a sequência de cDNA das mesmas; pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 27 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 29 ou SEQ ID No: 31, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 33, SEQ ID No: 35 ou SEQ ID No: 37, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 39 ou SEQ ID No: 41, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 43 ou a sequência de cDNA da mesma; ou pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 45 ou a sequência de cDNA da mesma. [19] Polipeptídeo, de acordo com qualquer um dos parágrafos 15 a 18, compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 46, ou o polipeptídeo da SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 46. [20] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 15, que é uma variante que compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, ou SEQ ID NO: 462, compreendendo uma substituição, exclusão e/ou inserção em uma ou mais posições. [21] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 15, que é um fragmento da SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 46, em que o fragmento tem atividade endoglicanase. [22] Polipeptídeo isolado que tem atividade intensificadora celulolítica, selecionado do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 48; pelo menos 75% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, ou SEQ ID NO: 79; pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, ou SEQ ID NO: 64; pelo menos 85% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 66; ou pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 68 ou SEQ ID NO: 70; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza pelo menos sob condições de estringência muito alta com (i) o polipeptídeo que codifica a sequência da SEQ ID No: 47, SEQ ID No: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69 ou SEQ ID NO: 71, (ii) a sequência de cDNA das mesmas ou (iii) o complemento de comprimento completo de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 47 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 75% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, ou SEQ ID NO: 53, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, ou SEQ ID NO: 63, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 65 ou a sequência de cDNA da mesma; ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, ou SEQ ID NO: 71, ou as sequências de cDNA das mesmas; (d) uma variante que compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 79 compreendendo uma substituição, exclusão e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c) ou (d) que tem atividade intensificadora celulolítica. [23] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 22, que tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com o polipeptídeo da sequência SEQ ID No: 48; pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 50, SEQ ID No: 52, SEQ ID No: 54, ou SEQ ID No: 79; pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62 ou SEQ ID NO: 64; pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 66; ou pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 68, SEQ ID No: 70, ou SEQ ID No: 72. [24] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 22, que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência pelo menos muito altas com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, ou SEQ ID NO: 71, (ii) a sequência de cDNA da mesma, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); [25] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 22, que é codificado por um polinucleotídeo que tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 47 ou a sequência de cDNA da mesma; pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 49, SEQ ID No: 51 ou SEQ ID No: 53, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 55, SEQ ID No: 57, SEQ ID No: 59, SEQ ID No: 61 ou SEQ ID No: 63, ou as sequências de cDNA das mesmas; pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 65 ou a sequência de cDNA da mesma; ou pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 67, SEQ ID No: 69 ou SEQ ID No: 71, ou as sequências de cDNA das mesmas. [26] Polipeptídeo, de acordo com qualquer um dos parágrafos 22 a 25, que compreende ou consiste na SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, ou SEQ ID NO: 72 ou o polipeptídeo da SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 79. [27] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 22, que é uma variante compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, ou SEQ ID NO: 79 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais posições. [28] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 22, que é um fragmento da SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, ou SEQ ID NO: 79, em que o fragmento tem atividade intensificadora celulolítica. [29] Polipeptídeo isolado que tem atividade xilanase, selecionado do grupo consistido em: um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 74, pelo menos 94% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 78, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 76; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência pelo menos muito altas com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, ou SEQ ID NO: 77, (ii) a sequência de cDNA das mesmas, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 73 ou a sequência de cDNA da mesma, pelo menos 94% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 77 ou a sequência de cDNA da mesma, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 75 ou a sequência de cDNA da mesma; (d) uma variante que compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76 ou SEQ ID NO: 78, compreendendo uma substituição, eliminação e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que possua atividade xilanase. [30] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 29, que tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com ao polipeptídeo da SEQ ID No: 74, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 78, ou pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo da SEQ ID No: 76. [31] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 29, que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência pelo menos muito altas com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75 ou SEQ ID NO: 77, (ii) a sequência de cDNA das mesmas, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii). [32] Polipeptideo, de acordo com o parágrafo 29, que é codificado por um polinucleotídeo que tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 73 ou a sequência de cDNA da mesma, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID No: 77 ou a sequência de cDNA da mesma, ou pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificadora de polipeptídeo da SEQ ID NO: 75 ou a sequência de cDNA da mesma. [33] Polipeptídeo, de acordo com qualquer um dos parágrafos 29 a 32, que compreende ou consiste da SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76 ou SEQ ID NO: 78, ou o polipeptídeo da SEQ ID No: 74, SEQ ID No: 76 ou SEQ ID No: 78. [34] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 29, que é uma variante compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, ou SEQ ID NO: 78 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais posições. [35] Polipeptídeo, de acordo com o parágrafo 29, que é um fragmento da SEQ ID No: 74, SEQ ID No: 76 ou SEQ ID No: 78, em que o fragmento tem atividade xilanase. [36] Composição compreendendo o polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 35. [37] Polinucleotídeo isolado que codifica o polipetídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 35. [38] Construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo do parágrafo 37 operavelmente ligado a uma ou mais sequências controle que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão. [39] Célula hospedeira recombinante que compreende o polinucleotídeo, de acordo com o parágrafo 37 operavelmente ligado a uma ou mais sequências controle que direcionam a produção do polipeptídeo. [40] Método de produção do polipeptídeo, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 35, que compreende: (a) cultivar uma célula que, na sua forma tipo selvagem, produz o polipeptídeo sob condições que contribuam para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. [41] Método de produção de um polipeptídeo que tem atividade enzimática, compreendendo: (a) cultivar a célula hospedeira de acordo com o parágrafo 39 sob condições que contribuam para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. [42] Planta transgênica, parte da planta ou célula vegetal transformada com um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 35. [43] Método de produção de um polipeptídeo com atividade xilanase, compreendendo: (a) cultivar a planta transgênica ou célula vegetal do parágrafo 42 sob condições que contribuam para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. [44] Método de produção de uma célula mutante ou de origem, que compreende inativar um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 35, que resulta em um mutante produzindo menos quantidade do polipeptídeo do que a célula de origem. [45] Célula mutante produzida de acordo com o método do parágrafo 44. [46] Célula mutante, de acordo com o parágrafo 45, compreendendo ainda um gene que codifica uma proteína nativa ou heteróloga. [47] Método de produção de uma proteína que compreende:(a) cultivar a célula mutante de acordo com o parágrafo 45 ou 46 sob condições que contribuam para a produção da proteína; e (b) recuperar a proteína. [48] Molécula de RNA inibidora de fita dupla (dsRNA) que compreende uma subsequência do polinucleotídeo de acordo com o parágrafo 37, em que, opcionalmente, o dsRNA é um molécula de siRNA ou miRNA. [49] Molécula de RNA inibidora de fita dupla (dsRNA), de acordo com o parágrafo 48, que compreende cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplex de comprimento. [50] Método de inibição da expressão de um polipeptídeo com atividade xilanase em uma célula, compreendendo administrar à célula, ou expressar na célula a molécula de RNA inibidora e fita dupla (dsRNA) de acordo com o parágrafo 48 ou 49. [51] Célula produzida pelo método de acordo com o parágrafo 50. [52] Célula, de acordo com o parágrafo 51, compreendendo ainda um gene que codifica uma proteína nativa ou heteróloga. [53] Método de produção de uma proteína, compreendendo: (a) cultivar a célula do parágrafo 51 ou 52 sob condições que contribuam para a produção da proteína; e (b) recuperar a proteína. [54] Processo para degradar ou converter um material celulósico ou contendo xilano que compreende: tratar o material celulósico ou contendo xilano com uma composição enzimática na presença do polipeptídeo com atividade xilanase de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 35. [55] Processo, de acordo com o parágrafo 54, em que o material celulósico ou contendo xilano é pré-tratado. [56] Processo, de acordo com o parágrafo 54 ou 55, em que a composição enzimática compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma celulase, um polipeptídeo que tem atividade intensificadora celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina. [57] Processo, de acordo com o parágrafo 56, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionada(s) do grupo consistindo em uma endoglicanase, celobio-hidrolase e beta-glicosidase. [58] Processo, de acordo com o parágrafo 56, em que a hemicelulase compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistido em uma xilanase, acetilxilano esterase, feruloil esterase, arabinofuranosidase, xilosidase e glicuronidase. [59] Processo, de acordo com qualquer um dos parágrafos 54 a 58, compreendendo ainda recuperar o material celulósico ou contendo xilano degradado. [60] Processo, de acordo com o parágrafo 59, em que o material celulósico ou contendo xilano degradado é um açúcar. [61] Processo, de acordo com o parágrafo 60, em que o açúcar é selecionado do grupo consistindo em glicose, xilose, manose, galactose e arabinose. [62] Processo para produzir um produto de fermentação, compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico ou contendo xilano com uma composição enzimática na presença do polipeptídeo com atividade xilanase de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 35; (b) fermentar o material celulósico ou contendo xilano sacarificado com um ou mais microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação da fermentação. [63] Processo, de acordo com o parágrafo 62, em que o material celulósico ou contendo xilano é pré-tratado. [64] Processo, de acordo com o parágrafo 62 ou 63, em que a composição enzimática compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma celulase, um polipeptídeo que tem atividade intensificadora celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina. [65] Processo, de acordo com o parágrafo 64, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionada(s) do grupo consistindo em uma endoglicanase, celobio-hidrolase e beta-glicosidase. [66] Processo, de acordo com o parágrafo 64, em que a hemicelulase compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistido em uma xilanase, acetilxilano esterase, feruloil esterase, arabinofuranosidase, xilosidase e glicuronidase. [67] Processo, de acordo com qualquer um dos parágrafos 62 a 66, em que as etapas (a) e (b) são realizadas simultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultâneas. [68] Processo, de acordo com qualquer um dos parágrafos 62 a 67, em que o produto de fermentação é um álcool, um alcano, um cicloalcano, um alqueno, um aminoácido, um gás, isopreno, uma cetona, um ácido orgânico ou policetídeo. [69] Processo de fermentação de um material celulósico ou contendo xilano, que compreende: fermentar o material celulósico ou contendo xilano com um ou mais microrganismos fermentadores, em que o material celulósico ou contendo xilano é sacarificado com uma composição enzimática na presença do polipeptídeo que tem atividade xilanase, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 35. [70] Processo, de acordo com o parágrafo 69, em que a fermentação do material celulósico ou contendo xilano produz um produto de fermentação. [71] Processo, de acordo com o parágrafo 70, compreendendo ainda recuperar o produto de fermentação da fermentação. [72] Processo, de acordo com o parágrafo 71, em que o produto de fermentação é um álcool, um alcano, um cicloalcano, um alqueno, um aminoácido, um gás, isopreno, uma cetona, um ácido orgânico ou policetídeo. [73] Processo, de acordo com qualquer um dos parágrafos 69 a 72, em que o material celulósico ou contendo xilano é pré-tratado antes da sacarificação. [74] Processo, de acordo com qualquer um dos parágrafos 69 a 73, em que a composição enzimática compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo que tem atividade intensificadora celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, um expansina, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina. [75] Processo, de acordo com o parágrafo 74, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionada(s) do grupo consistindo em uma endoglicanase, celobio-hidrolase e beta-glicosidase. [76] Processo, de acordo com o parágrafo 74, em que a hemicelulase compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistido em uma xilanase, acetilxilano esterase, feruloil esterase, arabinofuranosidase, xilosidase e glicuronidase. [77] Formulação de caldo integral ou composição de cultura de células que compreende o polipeptídeo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 35.

[00492] A invenção descrita e reivindicada neste documento não é para ser limitada no escopo pelos aspectos específicos divulgados neste documento, uma vez que estes aspectos destinam-se a ser ilustrativos dos vários aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes destinam-se a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritas aqui vão ser evidentes para as pessoas versadas na técnica a partir da descrição acima. Tais modificações também se destinam a estarem dentro do escopo das reivindicações em anexo. No caso de conflito, a presente divulgação incluindo as definições prevalecerá.

Claims (3)

1. Método para produzir um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de compreender: (a) extrair e purificar um DNA fúngico; (b) amplificar os genes de interesse por meio de iniciadores degenerados como definidos nas SEQ ID NOs: 80 a 84; e c) recuperar o polipeptídeo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o DNA fúngico consiste na SEQ ID NO: 55.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de a amostra é proveniente de Talaromyces leycettanus.