BR112012011596B1 - transformante de talaromyces, processos para a produção de um transformante de talaromyces, de um transformante múltiplo de talaromyces e de uma composição polipeptídica compreendendo uma ou mais celulases, e processos para a sacarificação de material lignocelulósico e para a preparação de um produto de fermentação - Google Patents

Abstract

transformantes de talaromyces. a invenção se refere a um transformante de talaromyces compreendendo um ou mais gene recombinante, capaz de produzir celulase na ausência de indutor de celulase em um meio de glicose, tendo uma atividade de celulase de 2 wsu/ml ou mais, em um sobrenadante ou caldo diluído 16 vezes.

Description

(54) Título: TRANSFORMANTE DE TALAROMYCES, PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DE UM

TRANSFORMANTE DE TALAROMYCES, DE UM TRANSFORMANTE MÚLTIPLO DE TALAROMYCES E DE UMA COMPOSIÇÃO POLIPEPTÍDICA COMPREENDENDO UMA OU MAIS CELULASES, E PROCESSOS PARA A SACARIFICAÇÃO DE MATERIAL LIGNOCELULÓSICO E PARA A PREPARAÇÃO DE UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO (73) Titular: DSM IP ASSETS B.V., Sociedade Holandesa. Endereço: Het Overloon 1, 6411 TE Heerlen, HOLANDA (NL) (72) Inventor: ALRIK PIETER LOS; BRENDA VONK; MARCO ALEXANDER VAN DEN BERG; ROBBERTUS ANTONIUS DAMVELD; CORNELIS MARIA JACOBUS SAGT; ADRIANUS WIHELMUS HERMANUS VOLLEBREGT; MARGO ELISABETH FRANCOISE SCHOONEVELD-BERGMANS

Código de Controle: CCFDA7BF44582233 372A9794FF2ADDD3

Prazo de Validade: 20 (vinte) anos contados a partir de 04/11/2010, observadas as condições legais

Expedida em: 02/10/2018

Assinado digitalmente por:

Liane Elizabeth Caldeira Lage

Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

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TRANSFORMANTE DE TALAROMYCES, PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DE UM TRANSFORMANTE DE TALAROMYCES, DE UM TRANSFORMANTE MÚLTIPLO DE TALAROMYCES E DE UMA COMPOSIÇÃO POLIPEPTÍDICA COMPREENDENDO UMA OU MAIS CELULASES, E PROCESSOS PARA A SACARIFICAÇÃO DE MATERIAL LIGNOCELULÓSICO E PARA A PREPARAÇÃO DE UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a um processo para a produção de transformantes de Talaromyces, a transformantes de Talaromyces e a um processo para a produção de polipeptídeo usando os transformantes de Talaromyces. A presente invenção também se refere a um processo para a sacarificação de material lignocelulósico, em que o material lignocelulósico é colocado em contato com o transformante de uma celulase, hemicelulases e/ou pectinase produzida pelo transformante, sendo produzidos açúcares. Além disso, a invenção se refere a um processo parra a preparação de um produto de fermentação, etanol, por exemplo, sendo esses açúcares fermentados com um microorganismo de fermentação, de preferência uma levedura, para produzir o produto de fermentação.

Fundamentos da Invenção

Os carboidratos constituem os compostos orgânicos mais abundantes na terra. No entanto, uma grande parte destes carboidratos está sequestrada em polímeros complexos incluindo amido (o carboidrato é principalmente armazenado em sementes e grãos), e em uma combinação de carboidratos com lignina conhecida como lignocelulose. Os principais componentes de carboidratos de lignocelulose são a celulose, a hemicelulose e as pectinas. Estes polímeros de 04/06/2018, pág. 17/244

2/127 complexos são frequentemente definidos coletivamente como lignocelulose.

A bioconversão de biomassa de lignocelulose renovável em um açúcar fermentável que é subsequentemente fermentado para produzir álcool (tal como etanol, por exemplo) como uma alternativa para combustíveis líquidos atraiu uma atenção intensa de pesquisadores desde a década de 1970, quando começou a crise do petróleo devido à redução da oferta de petróleo por OPEC. O etanol vem sendo usado amplamente em forma de uma mistura a 10% com gasolina nos Estados Unidos ou como um combustível puro para veículos no

Brasil nas duas últimas décadas. Mais recentemente o uso de

E85, uma mistura de etanol a 85% foi implementada especialmente visando aplicações de despoluição de cidades. A importância do combustível de bioetanol aumentará paralelamente aos aumentos nos preços de petróleo e com a gradual redução das suas fontes. Além disso, os açúcares fermentáveis estão sendo usados para a produção de plásticos, polímeros e outros produtos a base de biomassa e espera-se que esta indústria cresça substancialmente, aumentando, portanto, a demanda de açúcares fermentáveis abundantes e de baixo custo que possam ser usados como matéria prima em vez da matéria prima à base de petróleo.

O sequestro de quantidades tão grandes de carboidratos na biomassa vegetal proporciona uma fonte abundante de energia potencial na forma de açúcares, tanto açúcares de cinco carbonos como de seis carbonos que poderiam ser utilizados para numerosos processos industriais e agrícolas. No entanto, o enorme potencial de energia destes carboidratos está atualmente utilizado de 04/06/2018, pág. 18/244

3/127 abaixo da sua capacidade, pois os açúcares estão presos em polímeros complexos, e não são, portanto, de fácil acesso para fermentação. Os métodos que geram açúcares a partir de biomassa vegetal proporcionariam matéria prima abundante economicamente competitiva para a conversão por fermentação em produtos químicos, plásticos, tais como ácido succínico e (bio)combustíveis incluindo combustíveis líquidos sintéticos de etanol, metanol, butanol e biogas.

Independentemente do tipo de base celulósica, o custo e a eficiência hidrolítica de enzimas são os fatores principais que restringem a comercialização dos processos de bioconversão de biomassa. Os custos de produção de enzimas produzidas microbiologicamente são intimamente associados com a produtividade da cepa produtora de enzima e do rendimento final da atividade no caldo de fermentação.

Apesar das pesquisas contínuas das últimas poucas décadas para compreender a degradação enzimática da biomassa lignocelulósica e a produção de celulase, continua sendo desejável a descoberta ou a construção de novas celulases e hemicelulases extremamente ativas. Seria, portanto, extremamente desejável se construir composições enzimáticas extremamente eficientes capazes de efetuar rápida e eficientemente a biodegradação de materiais lignocelulósicos.

Tais composições enzimáticas podem ser usadas para produzir açúcares para serem fermentados e transformados em substâncias químicas, plásticos, tais como, por exemplo, ácido succínico e (bio)combustíveis, incluindo etanol, metanol, butanol, combustíveis sintéticos líquidos e biogás, para silagem, e também como enzima em outros de 04/06/2018, pág. 19/244

4/127 processos industriais, tais como por exemplo na industria de alimentos ou de rações, de têxteis, de polpa ou papel ou de detergentes e outras indústrias.

Um gênero de microorganismos que é conhecido como produzindo enzimas adequadas para a degradação enzimática de biomassa lignocelulósica é o gênero Talaromyces. Talaromyces é um fungo filamentoso.

Jian, S. et al. , Mol. Gen. Genet. (1992), 234, 489493 divulga um sistema de transformação para o CL240 do fungo Talaromyces sp. Não é descrita nenhuma expressão de polipeptideos.

Murray, F. R. et al. , Curr. Genet. (1997), 32, 267375 divulga uma sobre-expressão do gene de glicose oxidase de Talaromyces flavus em Talaromyces macrosporus. Foi estudado o efeito dos isolados fungais sobre a inibição do crescimento de V. dahliae.

W0200170998 descreve beta-glucanases de Talaromyces emersonii. Na página 16 vem descrito que o polinucleotideo de beta-glucanase pode ser heterologamente expresso em um hospedeiro, tal como em uma célula de levedura.

WO200224926 descreve xilanase de Talaromyces emersonii. Na página 24, parágrafo 5, vem descrito que a produção do polipeptideo pode ser obtida por expressão recombinante da sequência de DNA de xilanase em uma célula hospedeira adequada homóloga ou heteróloga. No parágrafo 7, vem declarado que a célula hospedeira pode sobre-expressar o polipeptideo, e técnicas para a se construir a sobreexpressão são conhecidas de WO99/32617. WO99/32617 se refere à clonagem de expressão, mas não divulga a clonagem em hospedeiro de Talaromyces.

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W02007091231 descreve cepas de Talaromyces emersonii que são termo-estáveis e que codificam enzimas termoestáveis e também descreve composições enzimáticas produzidas pelas cepas de Talaromyces emersonii. Nenhuma produção recombinante de polipeptídeos homólogos ou heterólogos vem divulgada. Na tabela 1 é mostrado que fontes de carbono indutoras foram acrescentadas em uma quantidade de 0,2-6%. Foram incluídas celulose e glicose (2%) para fins de comparação. Na página 78, linha 28 é declarado que a glicose não reprime completamente a produção de exoglicosidade pelas cepas de Talaromyces emersonii (tabela 31A) . A Tabela 31A mostra que IMI3933751 produz uma atividade de beta-glicosidase de 31,90 IU com glicose como fonte de carbono, mas nenhuma outra atividade de celulase, tal como de glucanase ou xilanase. Devido à ausência de tais atividades enzimáticas, a cepa IMI393751 não é adequada para a produção de celulases para a conversão de lignocelulose em glicose como fonte de carbono.

Sumário da Invenção

A presença de um indutor de celulase necessário até agora em métodos de produção de celulase de Talaromyces, tem diversas desvantagens. Em primeiro lugar, o indutor, tal como um material vegetal, pode ter uma composição variável, o que é uma desvantagem para a controlabilidade do processo de produção de celulase. Em segundo lugar, energia é necessária para se esterilizar o material vegetal para indução. Em terceiro lugar, o material vegetal poluirá muito o equipamento. Em quarto lugar, o indutor pode resultar em uma viscosidade maior do meio de produção de de 04/06/2018, pág. 21/244

6/127 celulase. Em quinto lugar, a presença do indutor, especialmente quando ele tiver sido previamente tratado, pode resultar na produção de inibidores que podem ter efeito nocivo sobre Talaromyces. Há, portanto, a necessidade de um processo melhorado e cepas melhoradas de Talaromyces para a produção de composições polipeptídicas adequadas para a degradação enzimática da biomassa lignocelulósica em Talaromyces.

Portanto, um objetivo da presente invenção consiste em propor cepas de Talaromyces adequadas na conversão de lignocelulose em açúcar. Um outro objetivo consiste em propor tais cepas de Talaromyces que possam ser produzidas em meio de glicose, sem indutores de celulase. A invenção agora propõe um processo para a produção de um transformante de Talaromyces que compreende as etapas de:

(a) se prover um ou mais cassetes de expressão capazes de produzir um ou mais polipeptídeos de interesse e compreendendo um ou mais polinucleotídeos de interesse codificando para celulase, hemicelulase e/ou pectinase e pelo menos um promotor para a expressão do polinucleotídeo;

(b) se prover um marcador de seleção incluído no cassete de expressão de (a) ou incluído em um polinucleotídeo dedicado de marcador de seleção;

(c) se transfectar um hospedeiro de Talaromyces com o um ou mais cassetes de expressão provenientes de (a) e/ou com o marcador de seleção proveniente de (b);

(d) se selecionar um transformante de Talaromyces que contém um ou mais polinucleotídeos que codificam celulase, hemicelulase e/ou pectinase e (e) se isolar o transformante de Talaromyces.

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A presente invenção ainda propõe transformantes de Talaromyces que compreendem um ou mais genes recombinantes capazes de produzir celulase na ausência de indutor de celulase em um meio de glicose, tendo uma atividade de celulase de 2 WSU/mL ou mais em sobrenadante ou caldo diluido 16 vezes ou mais, que pode ser obtido de acordo com o processo acima.

Os transformantes de Talaromyces da presente invenção podem ser cultivados em um meio que compreende uma fonte adequada de carbono, tal como açúcar, tal como glicose, sem indutor de celulase (neste caso a glicose não é um indutor de celulase, isto é, o indutor de celulase não inclui glicose) e produz celulases que tem a atividade de degradar lignocelulose.

A presente invenção se refere ainda a um processo para a produção de uma composição polipeptidica de uma ou mais celulase, hemicelulases e/ou pectinases e que compreende as etapas de:

(a) se prover um ou mais cassetes de expressão capazes de produzir um ou polipeptideos de interesse e compreendendo um ou mais polinucleotideos de interesse que codificam para celulase, hemicelulase e/ou pectinase e pelo menos um promotor para a expressão do polinucleotideo;

(b) se prover um marcador de seleção incluído no cassete de expressão de (a) ou incluído em um polinucleotideo dedicado do marcador de seleção;

(c) se transfectar um hospedeiro de Talaromyces com o um ou mais cassetes de expressão proveniente de (a) e/ou com o marcador de seleção proveniente de b);

(d) se selecionar um transformante de Talaromyces que de 04/06/2018, pág. 23/244

8/127 contenha um ou mais polinucleotídeos que codificam para celulase, hemicelulase e/ou pectinase;

(e) se produzir a composição polipeptidica através da cultura do transformante de Talaromyces em um meio de cultura adequado em que um indutor de celulase está substancialmente ausente; e (f) se recuperar opcionalmente a composição polipeptidica.

Outras modalidades são descritas abaixo na descrição detalhada da invenção

Descrição Sucinta das Figuras

Figura 1. Detecção de fragmento PCR do gene de βlactamase de pAN8-l. Gel de agarose mostrando o fragmento PCR do gene de β-lactamase de 278 nucleotideos em transformantes de T. emersonii. As pistas 1-10 contêm fragmentos PCR de reações PCR que usam DNA cromossomal de transformante pAN8-l de T. emersonii como gabarito; pista 11 contém um marcador de peso molecular; a pista 12 contém o fragmento PCR de uma reação PCR usando plasmideo de pAN820 1 como gabarito para PCR; a pista 13 contém uma mistura de reação PCR usando o DNA cromossomal de uma cepa vazia como gabarito.

Figura 2. Detecção de integração de pAN8-l ao genoma de T. emersonii. A detecção por Southern blot de DNA de pAN8-l usando-se uma sonda rotulada com β-lactamase. A pista 1 contém um marcador de peso molecular; as pistas 2 e 3 contêm respectivamente, 0,5 e 5 ng de DNA de plasmideo pAN8-l; a pista 4 e 5 contêm DNA cromossomal digerido com MluI de dois transformantes pAN8-l diferentes de T.

emersonii (bandas especificas são indicadas por setas); a

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9/127 pista 6 contém DNA cromossomal digerido com MluI de uma cepa vazia.

Figura 3. Mapa de pGBFINEBA7 para a expressão de proteína CEB de beta-glucanase de T. emersonii identificada com FLAG. pGBFINEBA7 é um plasmídeo à base de pGBFIN5. São ilustradas a proteína CEB de beta-glucanase de T. emersonii identificada com FLAG (EBA7+FLAG) expressa a partir do promotor de glicoamilase de Aspergillus niger (PglaA). Além disso, são ilustrados o gene de marcador de seleção (amdS), expresso a partir do promotor de desidrogenase de 3-fosfato de aldeído glicérico de Aspergillus nidulans (Pgpd) e os flancos de glicoamilase (3'glaA e 3glaA) do cassete de expressão.

Figura 4. Detecção da proteína CEB de beta-glucanase de T. emersonii identificada com FLAG expressa em T.

emersonii.

(4A) : detecção por SDS-PAGE da proteína CEB de betaglucanase de T. emersonii identificada com FLAG, expressa em T. emersonii cultivado em meio 1 de Talaromyces (pistas 1-3) e meio 2 de Talaromyces (pistas 5-7) . Sobrenadantes 1#6 (pistas 1, 5) e 1 #14 (pistas 2, 6) de transformante pGBFINEBA7 de T. emersonii coletados de culturas de 72 horas; as pistas 3 e 7 contêm sobrenadantes de uma cultura de 72 horas de uma cepa vazia; a pista 4 contém um marcador de peso molecular.

(4B) : A detecção por Western blot de proteína CEB de beta-glucanase identificada por FLAG de T. emersonii, expressa em T. emersonii cultivado em meio 1 de Talaromyces (pistas 2-7) e meio 2 de Talaromyces (pistas 9-14), usandose um anticorpo específico ao identificador FLAG. As pistas de 04/06/2018, pág. 25/244

10/127 e 8 contêm um marcador de peso molecular; as pistas 2, 3, 9 e 10 contêm sobrenadantes 1#6 de transformante pGBFINEBA7 de T. emersonii coletados de uma cultura de 72 horas (pista 2, 9) e de 96 horas (pista 3, 10); as pistas 4, 5, 11 e 12 contêm sobrenadantes 1#14 do transformante pGBFINEBA7 de T. emersonii coletado de uma cultura de 72 horas (pista 4, 11) e de 96 horas (pista 5, 12); as pistas 6 e 13, e 7 e 14 contêm sobrenadantes de culturas de 72 horas e 96 horas, respectivamente, de uma cepa vazia.

(4C): Determinação do número de cópias de transformantes por PCR. Gel de agarose mostrando o fragmento de PCR de cassete de expressão de 1285 nucleotídeos e o fragmento de PCR de 373 nucleotídeos de controle/referência genômico de actina de transformantes de T. emersonii. A intensidade do produto de PCR de 1285 nucleotídeos do gene EBA7 é indicativo para o número de cópias do gene, depois da normalização do sinal de PCR de 1285 nt com o sinal de referência genômico de actina de 373 nt. Fragmentos 1#6 e 1 #14 de PCR do transformante pGBFINEBA7 são mostrados nas pistas 1 e 2, respectivamente; a pista 3 mostra um marcador de peso molecular; fragmentos 8#14, 8#18, e 8#32 de PCR do transformante pGBFIN-Pgpd-EBA7 são mostrados na pista 4, 5, e 6, respectivamente.

Figura 5. Mapa de pGBFIN-Pgpd-EBA7 para a expressão da proteína CEB de beta-glucanase de T. emersonii identificada com FLAG sob o controle do promotor de gpd. pGBFIN-Pgpd-EBA7 é um plasmídeo à base de pGBFIN38. São ilustrados a proteína CEB de beta-glucanase de T. emersonii identificada com FLAG (EBA7+FLAG) expressa a partir do promotor de desidrogenase de 3-fosfato de aldeído glicérico de 04/06/2018, pág. 26/244

11/127 de Aspergillus nidulans (Pgpd). Além disso, são descritos o gene do marcador de seleção (amdS), expresso a partir de promotor de desidrogenase (Pgpd) de 3-fosfato de aldeído glicérico (Pgpd) de Aspergillus nidulans e os flancos de glicoamilase (3'glaA e 3glaA) do cassete de expressão.

Figura 6. Comparação da expressão da proteína CEB de beta-glucanase de T. emersonii em T. emersonii sob o controle ou do promotor de glaA de A. niger ou do promotor de gpd de A. nidulans.

Western blot mostrando a proteína CEB de betaglucanase de T. emersonii identificada com FLAG, expressa em T. emersonii. As pistas 1, 10 e 11 contêm 15 pL (pista

1) , 15 pL de sobrenadante diluído 10 vezes (pista 10) e 5 pL (pista 11) de sobrenadante de uma cultura de 72 horas de uma cepa vazia; as pistas 3-5 contêm 15 pL de sobrenadante diluído 10 vezes (pista 3), 5 pL (pista 4) e 15 pL (pista

5) de sobrenadante 8#14 do transformante pGBFIN-Pgpd-EBA7 de T. emersonii coletado de uma cultura de 72 horas; as pistas 6-8 contêm 15 pL de sobrenadante diluído 10 vezes (pista 6), 5 pL (pista 7) e 15 pL (pista 8) do sobrenadante 8#18 do transformante pGBFIN-Pgpd-EBA7 de T. emersonii coletado de uma cultura de 72 horas; as pistas 12-14 contêm 15 pL de sobrenadante diluído 10 vezes (pista 12), 5 pL (pista 13) e 15 pL (pista 14) de sobrenadante 8#32 de transformante pGBFIN-Pgpd-EBA7 de T. emersonii coletado de uma cultura de 7 2 horas; as pistas 9 e 15 contêm 15 pL de sobrenadante 1#6 (promotor de glaA) diluído 100 vezes de transformante pGBFINEBA7 de T. emersonii coletado de uma cultura de 72 horas (devido ao sinal forte as bandas são sobre-expostas); a pista 2 contém um marcador de peso

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12/127 molecular.

Figura 7: Mapa de pGBTOPEBA205 para a expressão de

CBHI de T. emersonii em T. emersonii. São ilustrados EBA205 expressos a partir do promotor de glicoamilase (PglaA). Além disso, é ilustrado o flanco de glicoamilase (3'glaA) do cassete de expressão.

Figura 8: Mapa de pGBFINEBAl7 6 para a expressão de CBHII de T. emersonii em T. emersonii. pGBFINEBAl7 6 é um plasmídeo à base de pGBFINIl. É ilustrado o gene EBA176 expresso a partir do promotor de glicoamilase (PglaA). Além disso, o gene do marcador de seleção (amdS), expresso a partir do promotor de desidrogenase de 3-fosfato de aldeído glicérico (Pgpd) de Aspergillus nidulans e são ilustrados os flancos de glicoamilase (3'glaA e 3glaA) do cassete de expressão.

Figura 9. Detecção de múltiplas celulases recombinantes de T. emersonii em T. emersonii.

(9A) . A detecção por SDS-PAGE de celulases de T. emersonii expressas em T. emersonii. T. emersonii foi transformado com uma mistura de pGBTOPEBA4, pGBTOPEBA8, pGBFINEBAl76, e pGBTOPEBA205. Aproximadamente 400 transformantes foram cultivados em placas de 96 poços e testados para expressão de pelo menos uma celulase por análise SDS-PAGE sobre gel. Os transformantes de interesse foram cultivados em frascos agitados contendo meio à base de glicose e as proteínas em sobrenadantes coletados de culturas de 72 horas foram precipitadas com TCA e analisadas por análise SDS-PAGE. FBG142 é a cepa vazia.

(9B). Gráfico mostrando a atividade WSU em transformantes. Os transformantes foram cultivados durante de 04/06/2018, pág. 28/244

13/127 horas em meio à base de glicose em e a atividade WSU foi determinada em sobrenadantes das culturas diluídos 16 vezes. FBG142 era a cepa vazia.

Descrição sucinta da lista de sequências

SEQ	ID	NO:	1	apresenta a	sequência	de	DNA	do
iniciador	1 de	PCR;
SEQ	ID	NO:	2	apresenta a	sequência	de	DNA	do
iniciador	2 de	PCR;
SEQ	ID NO: 3	apresenta a sequência de aminoácidos	de

CEB (proteína) de β-glucanase de T. emersonii identificada com FLAG;

SEQ ID NO: 4 apresenta a sequência de codificação de CEB de β-glucanase de T. emersonii identificada com FLAG (DNA, região de codificação);

SEQ	ID	NO:	5	apresenta a	sequência	de	DNA	do
iniciador	3 de	PCR;
SEQ	ID	NO:	6	apresenta a	sequência	de	DNA	do
iniciador	4 de	PCR;
SEQ	ID NC	): 7	apresenta a sequência do promotor	de	gpd

e a sequência Kozak, o promotor de gpd tem resíduos: 1-870, os resíduos dos sítios da enzima de restrição: 871-882 e a

sequência SEQ	Kozak: resíduos : 883-892;
ID	NO:	8 apresenta a	sequência	de	DNA	do
iniciador	5 de	PCR;
SEQ	ID	NO:	9 apresenta a	sequência	de	DNA	do
iniciador	6 de	PCR;
SEQ	ID NC	i: 10	apresenta a sequência de aminoácidos	de

celobiohidrolase I de T. emersonii;

SEQ ID NO: 11 apresenta a sequência de codificação de

CBHI de T. emersonii (DNA, região de codificação) de 04/06/2018, pág. 29/244

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SEQ ID NO: 12 apresenta a sequência de aminoácidos de CEA (proteína) de β-glucanase de T. emersonii;

SEQ ID NO: 13 apresenta a sequência de codificação de CEA (DNA, região de codificação) de β-glucanase de T.

emersonii

SEQ ID NO: 14 apresenta a sequência de aminoácidos de de T. emersonii β-glucosidase (proteína)

SEQ ID NO: 15 apresenta a sequência de codificação de β-glucosidase de T. emersonii (DNA, região de codificação)

SEQ ID NO: 16 apresenta a sequência de aminoácidos de celobiohidrolase II (proteína) de T. emersonii

SEQ ID NO: 17 apresenta a sequência de codificação de celobiohidrolase I de T. emersonii (DNA, região de codificação), sequência do tipo selvagem.

SEQ ID NO: 18 apresenta a sequência de aminoácidos de uma proteína desconhecida proveniente de T. emersonii tendo

209 aminoácidos.

SEQ ID NO: 19 apresenta a sequência de codificação de uma proteína desconhecida proveniente de T. emersonii tendo uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 18.

SEQ	ID NO: 20 apresenta	a sequência	de	aminoácidos	de
swolenina	de T. emersonii.
SEQ	ID NO: 21 apresenta	a sequência	de	codificação	de
swolenina	de T. emersonii.
SEQ	ID NO: 22 apresenta	a sequência	de	aminoácidos	de
acetil xilano esterase de T.	emersonii.
SEQ	ID NO: 23 apresenta	a sequência	de	codificação	de
acetil xilano esterase de T.	emersonii.
SEQ	ID NO: 24 apresenta	a sequência	de	aminoácidos	da

xilanase de T. emersonii.

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SEQ ID NO: 25 apresenta a sequência de codificação de xilanase de T. emersonii.

Descrição detalhada da invenção

Em todo o presente relatório e nas reivindicações apensas, as palavras compreende e inclui e suas flexões tais como compreende, compreendendo, inclui e incluindo devem ser interpretadas como tendo caráter inclusivo. Isto é, estas palavras são destinadas a indicar a possível inclusão de outros elementos ou números inteiros não especificamente citados, sempre que o contexto permita.

Os artigos um e uma são usados no presente documento para se referir a um ou mais de um (isto é, a um ou a pelo menos um) do complemento gramatical do artigo. A título de exemplo, um elemento pode significar um elemento ou mais de um elemento.

De acordo com a presente invenção foi agora mostrado que as técnicas de transformação acima podem ser usadas para se obter um nível elevado de expressão de polipeptídeos heterólogos ou para aumentar a produção de polipeptídeos homólogos em Talaromyces.

Conforme usado no presente, transformante significa uma célula que tenha sido o objeto da transformação.

Transformante e célula recombinante são usados no presente documento como sinônimos.

Transformação no presente significa a alteração genética de uma célula por meio de tecnologia recombinante. Ela pode resultar na absorção, incorporação e expressão de material genético (DNA, RNA ou proteína) ou na mutação ou na deleção de material genético na célula, através da intervenção humana.

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Construção de ácido nucleico: O termo construção de ácido nucleico conforme usada no presente se refere a uma molécula de ácido nucleico, ou de um filamento ou de dois, que é isolada de um gene que ocorre naturalmente ou que tenha sido modificado para conter segmentos de ácidos nucleicos de um modo que caso contrário não existiria na natureza. O termo construção de ácido nucleico é sinônimo do termo cassete de expressão quando a construção de ácido nucleico contém as sequências de controle necessárias para a expressão de uma sequência de codificação da presente invenção.

Conforme usado no presente, os termos gene e gene recombinante se referem a moléculas de ácido nucleico que possam ser isoladas de DNA cromossomal e que incluem uma matriz de leitura aberta codificando um polipeptideo, tal como celulase, celobiohidrolase, por exemplo.

Um gene pode inclui sequências de codificação, sequências não de codificação introns e/ou sequências reguladoras. Além disso, o termo gene pode se referir a uma molécula isolada de ácido nucleico conforme definido no presente.

Conforme usado no presente, a expressão polipeptideos heter'logos significa polipeptideos não produzidos por Talaromyces ao passo que polipeptideos homólogos significa polipeptideos porduzidos pelo próprio Talaromyces. O substrato (também denominado material de alimentação) é usado para se referir a uma substância que compreende material de carboidrato, que pode ser tratado com enzimas de acordo com a invenção, de modo que o material de carboidrato nele seja modificado. Além de de 04/06/2018, pág. 32/244

17/127 material de carboidrato, o substrato pode conter qualquer outro componente, incluindo, mas sem limitação, material que não é carboidrato e amido. O carboidrato neste contexto inclui sacarideos, polissacarideos, oligossacarideos, dissacarideos ou monossacarídeos, por exemplo. Indutor de celulase é no presente definido como um composto que induz a produção de celulase em Talaromyces. Os exemplos de indutores de celulase, são celobiose pura de celulose, soforose e gentiobiose ou qualquer material lignocelulósico.

Um polipeptídeo de acordo com a presente invenção pode modificar um material de carboidrato por modificar quimica ou fisicamente tal material, a modificação química do material de carboidrato pode resultar na degradação de tal material, por hidrólise, oxidação ou outra modificação, por exemplo, tal como pela ação de uma liase. A modificação física pode estar acompanhada ou não de modificação química.

As diferentes modalidades da invenção são descritas com mais detalhes abaixo.

Transformantes de Talaromyces

A invenção propõe transformantes de Talaromyces. Os transformantes de Talaromyces são preparados pela ttransformação de um hospedeiro de Talaromyces, tal como Talaromyces emersonii, com DNA introduzido recombinantemente. Conforme indicado acima, a invenção propõe um transformante de Talaromyces capaz de produzir celulase na ausência de indutor de celulase em um meio de glicose, tendo uma atividade de celulase de 2 WSU/mL ou mais em sobrenadante ou caldo diluído 16 vezes ou em um de 04/06/2018, pág. 33/244

18/127 sobrenadante ou caldo ainda mais diluído, em uma outra modalidade 5 WSU/mL ou mais em sobrenadante ou caldo diluído 16 vezes ou em sobrenadante ou caldo diluído ainda mais. Em uma outra modalidade, o transformante de Talaromyces tem uma atividade de celulase de 2 ou mais WSU/mL em sobrenadante ou caldo diluído 16 a 10000 vezes, 3 ou mais WSU em um sobrenadante ou caldo diluído de 16 a

5000 vezes, 3 ou mais WSU/mL em um sobrenadante ou caldo diluído 16 a 2500 vezes.

Em uma modalidade, o transformante de Talaromyces tem uma atividade de endoglucanase de 50 WBCU/mL ou mais.

Em uma modalidade, o transformante de Talaromyces tem um teor total de celulase conforme determinado por APEX de 38% ou mais, 39% ou mais, 40% ou mais, 41% ou mais, 42% ou mais, 43% ou mais, 44% ou mais, 45% ou mais, 46% ou mais, 47% ou mais e/ou 48% ou mais.

Em uma outra modalidade, os transformantes de Talaromyces de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, contendo dois ou mais genes recombinantes capazes de expressar celulase. Os transformantes de Talaromyces de acordo com a presente invenção, em que os dois ou mais genes capazes de expressar celulase incluem gene de celobiohidrolase, endoglucanase e/ou de beta-glicosidase.

A invenção também inclui uma modalidade de um transformante de Talaromyces em que o gene de celobiohidrolase é celobiohidrolasee ( e/ou celobiohidrolase II. Em uma modalidade, no transformante de Talaromyces um ou mais genes estão integrados ao genoma do Talaromyces. O transformante de Talaromyces é isento de marcador em uma outra modalidade.

de 04/06/2018, pág. 34/244

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Células hospedeiras

As células hospedeiras usadas de acordo com a invenção são células do gênero Talaromyces. É preferível que a hospedeira de Talaromyces seja uma de Talaromyces emersonii, Talaromyces stipitaus, Talaromyces marxianus ou Talaromyces flavus. Em uma modalidade, a hospedeira é de Talaromyces emersonii, tal como ATCC16479 de Talaromyces emersonii, por exemplo.

Transformação

A transformação da hospedeira pode ser conduzida por qualquer método adequado conhecido incluindo, por exemplo, métodos de eletroporação, bombardeio com partículas ou bombardeio com microprojéteis, métodos de protoplastos e transformação mediada por Agrobacterium (AMT). É preferível se usar o método de protoplastos. Os procedimentos para a transformação são descritos por J.R.S. Fincham, Transformation in fungi. 1989, microbiological reviews. 53,

148-170.

Para se obter transformantes usando-se o método de protoplastos, o protocolo de transformação tem que ser otimizado. Para a geração de protoplastos, o micélio é coletado de culturas cultivadas durante 8 a 72 horas, de preferência de 14 a 24 horas. O micélio é ressuspenso em um tampão contendo um estabilizador osmótico em uma preparação de enzima lítica. Um estabilizador osmótico pode ser selecionado do grupo que inclui, mas sem limitação, sacarose, sorbitol, manitol, KC1, NH4CI, NaCl, MgSCU e NaCl, de preferência sacarose, sorbitol ou KC1 a uma concentração de 0,4-l,4M, de preferência de 0,8 a 1,2, sendo mais preferível l,0M. As preparações de enzima lítica

Petição 870180047364, de 04/06/2018, pág. 35/244

20/127 podem ser selecionadas do grupo que inclui, mas sem limitação, Glucanex 200G, Novozyme 234, Caylase C3, Zymolyase, e Driselase, de preferência, Glucanex 200G. A digestão pode ser conduzida a uma temperatura entre 30°C e 37 °C em um agitador rotativo durante 1 a 3 horas. Os protoplastos podem ser separados do micélio usando-se um filtro Miracloth, filtro de vidro sinterizado, musselina, tela de 30 pm, ou uma almofada de sorbitol, centrifugação e deixa-se o micélio se assentar e coletam-se os protoplastos por decantação. Depois de se ter lavado os protoplastos em tampão com estabilizador osmótico, 104 a 109 protoplastos são acrescentados a 0,1-40 pg de DNA e, opcionalmente, um inibidor de nuclease, tal como ácido aurintricarboxilico, em um tampão que contém um estabilizador osmótico e 10-50 mM de CaCl2, de preferência 50 mM de CaCl2. Opcionalmente a mistura é incubada durante 15-30 minutos a 4°C ou à temperatura ambiente. Polietileno glicol (PEG4000, PEG6000 ou PEG8000, de preferência, PEG4000) é acrescentado à mistura com uma concentração final de 6 a 55%. A adição de PEG pode ser efetuada em etapas em sequência em que a concentração de PEG é gradualmente aumentada. Entre as adições de PEG a suspensão é incubada durante 5-30 minutos a 4°C-37°C. É preferível se acrescentar PEG400 a 6% (concentração final) a uma suspensão de protoplastos e DNA, incubada durante 10 minutos à temperatura ambiente, e subsequentemente uma segunda quantidade de PEG4000 é acrescentada até uma concentração final de 51% seguida por uma incubação de 15 minutos a 25°C. Uma alíquota da mistura é ou diretamente acrescentada a agar macio e vertida em placas de regeneração seletiva, ou então os protoplastos de 04/06/2018, pág. 36/244

21/127 são lavados e dispostos em placas de regeneração seletiva. 0 agar macio contém o meio de cultura com um estabilizador osmótico com ou sem um marcador de seleção e uma concentração baixa de agar que permite que se verta o agar a 40°C - 60°C. O meio de regeneração contém meio de cultura com um estabilizador osmótico que pode ser o mesmo estabilizador osmótico usado para a formação de protoplastos.

O polinucleotídeo pode ser DNA, RNA ou proteína. No caso de DNA, um vetor é usado com o promotor, a região de codificação e a sequência terminadora, um elemento denominado cassete de expressão. Usando-se a sequência de polinucleotídeos desejada como uma sonda de hibridização podem ser isoladas moléculas de ácido nucleico (isto é, genes) de acordo com a invenção usando-se técnicas de hibridização e clonagem padrão (conforme descrito, por exemplo, em Sambroook, J., Fritsch, e. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Um ácido nucleico pode ser amplificado usando-se DNAc, RNAm ou alternativamente, DNA genômico, como um gabarito e iniciadores de oligonucleotídeos adequados de acordo com técnicas de amplificação PCR padrão. O ácido nucleico assim amplificado pode ser clonado em um vetor adequado e ser caracterizado por análise das sequências de

DNA.

Além disso, os oligonucleotídeos que correspondem a uma sequência de nucleotídeos ou podem ser hibridizados a ela de acordo com a presente invenção podem ser preparados de 04/06/2018, pág. 37/244

22/127 por técnicas sintéticas padrão, usando-se, por exemplo, um sintetizador de DNA automatizado.

Dependendo da funcionalidade desejada, o resultado do processo de transformação de acordo com a invenção pode ser expressão (heteróloga), sobre expressão, regulação controlada e/ou deleção controlada de genes específicos. Os polinucleotideos ou os oligonucleotídeos da presente invenção podem ser polinucleotideos sintéticos.

A introdução de genes no hospedeiro pode ser epissomal, usando-se um plasmídeo com o gene de interesse, ou então o gene pode ser integrado ao genoma do hospedeiro durante o processo de transformação em uma ou mais cópias. As construções de expressão correspondentes podem ser produzidas.

Em uma modalidade da invenção, o processo de transformação é conduzido como uma co-transformação, isto é, uma transformação com dois ou mais tipos de DNA recombinante. A co-transformação pode ser executada, por exemplo, com a) um vetor contendo um marcador e b) um vetor contendo um ou mais genes de interesse.

Em uma modalidade da invenção, a transformação pode usar bibliotecas de DNA, DNA genômico, RNA, DNAc ou proteínas.

A transformação do hospedeiro Talaromyces é conduzida com um marcador de seleção. Para a transformação estável das células de Talaromyces, constatamos que, dependendo do vetor de expressão e da técnica de transfecção usada, somente uma pequena fração das células pode integrar o DNA estranho ao seu genoma. Para se identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador de de 04/06/2018, pág. 38/244

23/127 são, por exemplo, carbamoiltransferase) , seleção (resistência a antibióticos, por exemplo) é geralmente introduzido nas células hospedeiras juntamente com o gene de interesse. Marcadores de seleção adequados amdS, argB (ornitina bar (fosfinotricina acetiltransferase) , resistência a carboxina, hemA (5aminolevulinato), hemB (porfobilinogênio sisntase), ble (resistência a fleomicina), hygB (higromicina fosfotransferase), natR (resistência a nourseotricina), niaD (nitrato reductase), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilase), DHFR, sC (sulfato adeniltransferase), trpC (antranilato sintase), pyroA, riboB. Adequados para uso em uma célula de Talaromyces são o gene de amdS (EP 635574 Bl, WO 97/06261 ), o gene de ble (Mattern, I.E., Punt, P.J., Van den Hondel, C.A.M.J.J., 1988. A vetor de Aspergillus transformation conferring fleomicina resistance. Fungai Genet. Newsl. 35, 25), e o gene de hygB (Punt P. J., Oliver R.P., Dingemanse M.A., Pouwels P.H., van den Hondel C.A.M.J.J., 1987. Transformation de Aspergillus based on the higromicina B resistance marker from Escherichia coli. Gene. 56:1 17-24) . Em uma modalidade, é usado um gene de amdS tal como um gene de amdS, por exemplo, proveniente de A. nidulans ou de A. niger. Em uma modalidade, o gene de marcador de seleção é a sequência de codificação de amdS de A. nidulans fundida ao promotor de gpdA de A. nidulans (veja EP 635574 Bl) . Os genes amdS provenientes de outros fungos filamentosos podem também ser usados (WO 97/06261).

Mais especificamente foi demonstrado que a seleção de cepas de Talaromyces transformadas com DNA codificando para um polipeptideo é possível pelo uso dos genes marcadores de 04/06/2018, pág. 39/244

24/127 usados para a transformação de A. niger. Devido à distância filogenética entre este último fungo e Talaromyces isto não poderia ser previsto.

Em uma modalidade, a transformação pode ser conduzida mais de uma vez, isto é, uma cepa transformada pode ser novamente transformada, uma vez, duas ou mais vezes. Em uma modalidade sua, a hospedeira para a transformação em uma segunda transformação é o transformante de Talaromyces isolado de uma primeira transformação e de modo análogo uma cepa precedente é o hospedeiro Talaromyces para a subsequente transformação em múltiplas transformações. Em uma modalidade sua, outro marcador pode ser usado em uma ou mais diferentes etapas de transformação, o uso de fleomicina e higromicina, por exemplo, como diferentes marcadores. As cepas resultantes de múltiplas transformações são aqui designadas transformantes múltiplos. Consequentemente, em uma modalidade, a invenção se refere a um processo para a produção de um transformante múltiplo de Talaromyces, em que um transformante de Talaromyces isolado em uma primeira transformação é usado como Talaromyces hospedeiro e é transformado em uma segunda transformação e na etapa (e) da segunda transformação é isolado o transformante múltiplo de Talaromyces.

Em uma modalidade, na primeira transformação é usado um marcador de seleção diferente do usado na segunda transformação, usando-se, por exemplo, fleomicina e higromicina como os marcadores diferentes.

Em uma modalidade, o marcador de seleção é deletado da célula hospedeira transformada depois da introdução da construção de expressão de modo a se obter células de 04/06/2018, pág. 40/244

25/127 hospedeiras transformadas capazes de produzir o polipeptídeo que sejam isentas de genes marcadores de seleção, isto é isenta de marcador. Tal abordagem é descrita em EP 0 635 57 4 e pode ser usada na invenção. Em transformações múltiplas conforme descrito acima com ela pode ser evitado o uso de marcadores diferentes.

Vetores

Os polinucleotídeos da invenção podem ser incorporados a um vetor replicável recombinante, um vetor de clonagem ou de expressão, por exemplo. O vetor pode ser usado para replicar o ácido nucleico em uma célula hospedeira compatível. Assim, em uma outra modalidade, a invenção propõe um método de preparação de polinucleotídeos da presente invenção pela introdução de um polinucleotídeo da invenção em um vetor replicável, introdução do vetor em uma célula hospedeira compatível e cultura da célula hospedeira em condições que produzem a replicação do vetor. O vetor pode ser recuperado da célula hospedeira. As células hospedeiras adequadas são descritas abaixo.

Portanto, um outro aspecto da invenção se refere a vetores, incluindo vetores de clonagem e de expressão, compreendendo um polinucleotídeo da invenção que codifica um polipeptídeo ou um equivalente funcional seu e métodos de cultura, transformação ou transfecção de tais vetores em uma célula hospedeira adequada, em condições, por exemplo, em que ocorre a expressão de um polipeptídeo da invenção. Conforme usado no presente documento, o termo vetor se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar um outro ácido nucleico ao qual ela foi ligada.

Os vetores podem ser usados in vitro, para a produção de 04/06/2018, pág. 41/244

26/127 de RNA, por exemplo, ou usados para transfectar ou transformar uma célula hospedeira.

O vetor pode ainda incluir sequências que flanqueiam o polinucleotídeo que compreende sequências homólogas às sequências genômicas eucarióticas ou sequências genômicas virais. Isto permitirá a introdução dos polinucleotídeos da invenção no genoma de uma célula hospedeira.

O sistema de vetor pode consistir em um único vetor, tal como um único plasmídeo, ou em dois ou mais vetores, tal como em dois ou mais plasmídeos, que em conjunto contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira.

O vetor no qual o cassete de expressão ou polinucleotídeo da invenção é inserido pode ser qualquer vetor que possa ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e a escolha do vetor frequentemente dependerá da célula hospedeira na qual ele deverá ser introduzido.

Um vetor de acordo com a invenção pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existe em forma de uma entidade extra-cromossomal, a replicação do qual é independente da replicação cromossomai, tal como um plasmídeo. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, se integra ao genoma da célula hospedeira e é replicado juntamente com o(s) cromossomo(s) ao qual ele foi integrado.

Um tipo de vetor é um plasmídeo que se refere a uma alça de DNA circular de dois filamentos para dentro dos quais podem ser ligados segmentos adicionais de DNA. Um outro tipo de vetor é o vetor viral, podendo segmentos de 04/06/2018, pág. 42/244

27/127 adicionais de DNA ser ligados ao genoma viral. Determinados vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (vetores bacterianos, por exemplo, que tem uma origem bacteriana de replicação e vetores epissomais de mamíferos) . Outros vetores (tais como os vetores não epissomais de mamíferos, por exemplo) são interados ao genoma de uma célula hospedeira depois da sua introdução na célula hospedeira, e deste modo se replicam juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operacionalmente ligados. Refere-se aqui a estes vetores como vetores de expressão. Em geral os vetores de expressão de utilidade nas técnicas de DNA recombinante se encontram frequentemente na forma de plasmídeos. Os termos plasmídeo e vetor podem ser usados indiferentes no presente documento, uma vez que o plasmídeo é a forma mais habitualmente usada de vetor. No entanto, a invenção se destina a incluir tais outras formas de vetores de expressão, tais como cosmídeos, vetores virais (retrovírus, adenovírus e vírus associados a adeno de replicação defeituosa, por exemplo) e vetores de fagos que desempenham funções equivalente.

Os vetores de acordo com a invenção podem ser usados in vitro, para a produção de RNA, por exemplo, ou ser usados para transfectar ou transformar uma célula hospedeira.

O vetor ou a construção de expressão é, de preferência, integrado ao genoma da célula hospedeira para a obtenção de transformantes estáveis. Em uma outra de 04/06/2018, pág. 43/244

28/127 modalidade, o vetor ou a construção de expressão é um minicromossomo ou um cromossomo artificial. Um vetor de clonagem mantido autonomamente pode compreende a sequência AMAI (veja Aleksenko e Clutterbuck (1997), Fungai Genet. Biol. 21: 373-397) . No caso em que as construções de expressão são interadas ao genoma das células hospedeiras, as construções ou são integradas em loci aleatórios no genoma, ou em loci alvo predeterminados usando-se a recombinação homóloga, sendo que neste caso os loci alvo compreende, de preferência, um gene extremamente expresso.

Um vetor da presente invenção pode compreender dois ou mais, tres, quatro ou cinco, por exemplo, polinucleotídeos da invenção, para a sobre-expressão, por exemplo.

Os vetores de expressão recombinantes da presente invenção compreendem um ácido nucleico da invenção em uma forma adequada para expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira, o que significa que a o vetor de expressão recombinante inclui uma ou mais sequências reguladora, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, que é operacionalmente ligada a sequência de ácido nucleico a ser expressa.

No interior de um vetor, tal como em um vetor de expressão, ligado operacionalmente significa que a sequência de nucleotídeos de interesse está ligada à(s) sequência(s) reguladora de um modo que permite a expressão da sequência de nucleotídeos (em um sistema de transcrição/tradução in vitro, por exemplo, ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira), isto é, o termo ligado operacionalmente se de 04/06/2018, pág. 44/244

29/127 refere a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação que permite que funcionem do seu modo predestinado. Uma sequência reguladora tal como a de um promotor, intensificador ou outro sinal de regulação de expressão ligado operacionalmente a uma sequência de codificação está posicionado de tal modo que a expressão da sequência de codificação é obtida em condições compatíveis com as sequências de controle ou então as sequências são dispostas de modo tal, que elas funcionam em conjunto para o seu fim pretendido, a transcrição se inicia, por exemplo, em um promotor, e prossegue através da sequência de DNA que codifica o polipeptídeo.

Um vetor ou construção de expressão para uma célula hospedeira dada pode assim compreender os seguintes elementos ligados de modo operacional entre si em uma ordem construtiva partindo da extremidade 5' e para a extremidade 3' em relação ao filamento de codificação da sequência que codifica o polipeptídeo da primeira invenção: (1) uma sequência de promotor capaz de direcionar a transcrição da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo na célula hospedeira dada; a sequência de início de tradução incluindo Kozak (veja W02006/077258) (2) opcionalmente, uma sequência de sinal capaz de direcionar a secreção do polipeptídeo a partir da célula hospedeira e para dentro de um meio de cultura; opcionalmente, uma pré-pro-sequência para uma secreção eficiente (3) uma sequência de DNA da invenção codificando uma forma madura e de preferência ativa de um polipeptídeo que tem atividade de celulase e, de preferência, também (4) uma região de terminação de transcrição (terminadora) capaz de terminar a transcrição a de 04/06/2018, pág. 45/244

30/127 jusante da sequência de nucleotideos que codifica o polipeptideo. Veja também sinal de terminação de tradução ótimo em W02006/07725. Isto também inclui um sinal de poliadenilação para geração de poli A + RNAm. A sequência de controle pode também ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência que seja operativamente ligada ao terminal 3' da sequência de ácido nucleicos e que, quando transcrita é reconhecida pela célula de fungo filamentoso como um sinal para acrescentar resíduos de poliadenosina ao RNAm transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação, que for funcional na célula pode ser usada na presente invenção. As sequências de poliadenilação opcionais para células de fungos filamentosos são obtidas dos genes que codificam TAKA amilase de A. oryzae. glicoamilase de A. niger, antranilato sintase de A. nidulans, protease semelhante a tripsina de Fusarium oxysporum e alfa-flicosidase de A niger. A sequência de controle pode também ser uma sequência terminadora de transcrição adequada, uma sequência reconhecida por uma célula de fungo filamentoso para terminar a transcrição. A sequência terminadora é ligada operacionalmente ao terminal 3' da sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptideo. Qualquer terminadora que for funcional na célula pode ser usada na presente invenção.

As células terminadoras opcionais para células de fungos filamentosos são obtidas dos genes que codificam TAKA amilase de A. oryzae, glicoamilase de A. niger (glaA), antranilato sintase de A. nidulans, alfa-glicosidase de A. niger, gene de trpC e protease semelhante a tripsina de Fusarium oxysporum.

de 04/06/2018, pág. 46/244

31/127

A jusante da sequência de nucleotídeos de acordo com a invenção pode haver uma região 3' não traduzida contendo um ou mais sítios de terminação de transcrição (uma terminadora, por exemplo). A origem da terminadora é menos crítica. A terminadora pode, ser, por exemplo, nativa à sequência de DNA que codifica o polipeptídeo. É preferível que a terminadora do fungo filamentoso seja usada em

E mais à célula células hospedeiras de fungos filamentosos preferível que o terminador seja endógeno hospedeira (em que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo deva ser expressa).

Na região transcrita, pode estar presente um sitio de ligação a ribossomo para tradução. A porção de codificação das transcrições maduras expressas pelas construções incluirão uma AUG de iniciação de tradução no início e um códon de terminação adequadamente posicionado no fim do polipeptídeo a ser traduzido. Veja também observações sobre Kozak e interrupção conforme W02006/07725).

O termo promotor é definido na presente invenção como uma sequência de DNA que se liga a RNA polimerase e direciona a polimerase para o sítio de início transcricional correto a jusante da sequência de ácidos nucleicos que codifica um composto biológico para iniciar a transcrição. A RNA polimerase efetivamente catalisa a montagem do RNA mensageiro complementar ao filamento de DNA adequado de uma região de codificação. Ficará também subentendido que o termo promotor incluirá a região não codificadora 5' (entre o promotor e o início de tradução) para a tradução depois da transcrição em RNAm, elementos de controle de transcrição cis-atuantes tais como os de 04/06/2018, pág. 47/244

32/127 intensificadores e outras sequências de nucleotídeos capazes de interagir com fatores de transcrição. O promotor pode consistir em qualquer sequência de promotor adequada para uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica, que apresenta uma atividade transcricional, incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares tanto homólogos (nativos) ou heterólogos (estranhos) à célula. O promotor pode ser um promotor constitutivo ou induzível. Exemplos de promotores induzíveis que podem ser usados são promotores induzíveis por amido, cobre, ácido oléico. O promotor pode ser selecionado do grupo que inclui, mas sem limitação, promotores obtidos dos genes que codificam TAKA amilase de A. oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfaamilase neutra de A. niger, alfa-amilase estável a ácido de A. niger, glicoamilase (glaA) de A. awamori, lipase de R. miehei, protease alcalina de A. oryzae, fosfato de triose isomerase de A. oryzae, acetamidase de A. nidulans, o promotor NA2-tpi (um híbrido dos promotores provenientes dos genes que codificam alfa-amilase neutra de A. niger, e de fosfato de triose isomerase de A. oryzae), promotores obtidos dos genes que codificam cbhl, cbh2, egl, eg2, eg3, eg5, eg6, xinl, xin2 ou xyll, e promotores mutantes, truncados e híbridos deles. Em uma modalidade, o promotor é selecionado entre o promotor da sequência de DNA que codifica o polipeptídeo e um promotor heterólogo selecionado do grupo que consiste em promotores de glaA de A. niger, de cbhl de T. emersonii, e bg de T. emersonii, ou partes funcionais suas opcionalmente precedidas por de 04/06/2018, pág. 48/244

33/127 epissomais e derivados de sequências ativadoras a montante.

Em uma modalidade outra, os promotores para serem usados me células de fungos filamentosos são um promotor, ou uma parte funcional sua, proveniente de um gene de protease; tal como de um gene de protease semelhante a tripsina de Fusarium oxysporum (U.S. 4.288.627), gene da protease alcalina (alp) de A. oryzae, gene de pacA de A. niger, gene de protease alcalina de A. oryzae, gene de metaloprotease neutra de A. oryzae, gene de pepA aspergilopepsina protease de A. niger, ou gene de tripsina de F. venenatum, gene de pepB protease aspártica de A. niger. Outros promotores são os promotores descritos em W02006/092396 e W02005/100573, que são incorporados ao presente documento a título de referência.

O uso de promotores múltiplos em uma única cepa é descrito em WO 2008/098933. Os ensinamentos de WO 2008/098933 podem ser aplicados à presente invenção.

Será observado pelos versados na técnica que o projeto do vetor de expressão pode depender de tais fatores como o nível de expressão do polipeptídeo desejado etc. Os vetores, tais como vetores de expressão, da invenção podem ser introduzidos nas células hospedeiras para assim produzir polipeptídeos ou peptídeos, codificados por ácidos nucleicos conforme descrito o presente documento (polipeptídeos, formas mutantes de polipeptídeos, fragmentos, variantes ou equivalente funcionais seus, por exemplo). Consequentemente, os vetores de expressão úteis na presente invenção incluem vetores cromossomais, derivados de vírus, tais como vetores plasmídeos bacterianos, bacteriófagos, de 04/06/2018, pág. 49/244

34/127 epissomos de levedura, elementos cromossomais da levedura, vírus tais como baculovírus, papova vírus, Vacínia vírus, adenovírus, vírus de fowl pox, vírus de pseudo-hidrofobia e retrovírus, e vetores derivados de suas combinações tais como aqueles derivados de elementos genéticos de plasmídeos e de bacteriófagos, tais como os cosmídeos e fagemídeos. De acordo com a presente invenção, o meio de cultura é usado do modo descrito no presente documento nos exemplos e nas condições de cultura conforme descritas nos exemplos ou em meio alternativo e em condições de cultura que tenham um desempenho análogo.

Integração

De acordo com uma modalidade da presente invenção é obtida a integração. Em tal modalidade, um vetor de clonagem integrativo pode se integrar aleatoriamente ou então a um lócus alvo predeterminado do(s) cromossomo(s) da célula hospedeira ao qual ele deve ser integrado. Em uma modalidade da invenção, um vetor de clonagem integrativo pode compreender um fragmento de DNA que é homólogo a uma sequência de DNA em um lócus alvo predeterminado no genoma da célula hospedeira, para ter como alvo a integração do vetor de clonagem a este lócus predeterminado. Para promover a integração direcionada, o vetor de clonagem pode ser, de preferência, linearizado antes da transformação da célula hospedeira. A linearização pode ser conduzida, de preferência, de modo tal que pelo menos uma extremidade, mas de preferência as duas do vetor de clonagem sejam flanqueadas por sequências homólogas ao lócus alvo. O comprimento das sequências homólogas que flanqueiam o lócus alvo é de pelo menos aproximadamente 0,1 kb, tal como de de 04/06/2018, pág. 50/244

35/127 pelo menos aproximadamente 0,2 kb, sendo mais preferível pelo menos aproximadamente 0,5 kb, ainda mais preferível que seja de pelo menos aproximadamente 1 kb, sendo o mais preferível de pelo menos aproximadamente 2 kb. É preferível que as cepas de hospedeira genitora possam ser modificadas para uma frequência aumentada de integração de DNA alvo conforme descrito em WO 05/095624 e/ou WO2007/115886.

É preferível que a eficiência da integração direcionada ao genoma da célula hospedeira, isto é, a integração em um lócus alvo predeterminado, seja aumentada pelas capacidades de recombinação homóloga aumentada da célula hospedeira. Tal fenótipo da célula envolve, de preferência, um gene de hdfA ou de hdfB deficiente, conforme descrito em WO 05/095624. WO 05/095624 descreve um método para se obter uma célula de fungo filamentoso que compreende uma eficiência aumentada de integração direcionada.

0 vetor	pode
orientado	em	uma
produção	de	RNA

O vetor pode conter um polinucleotídeo da invenção ireção anti-sentido para prover a anti-sentido. Os polinucleotídeos sintéticos podem ser otimizados em uso de códons, de preferência de acordo com os métodos descritos em W02006/077258 e/ou PCT/EP2007/055943, que são incorporados ao presente documento a título de referência. O documento PCT/EP2007/055943 é voltado para a otimização do par de códons. A otimização de par de códons é um método em que as sequências de nucleotídeos que codificam o polipeptídeo foram modificadas no tocante ao seu uso de códons. Mais especificamente aos pares de códons que são usados para se obter uma maior expressão da sequência de nucleotídeos que de 04/06/2018, pág. 51/244

36/127 codifica o polipeptídeo e/ou uma maior produção do polipeptídeo codificado. Os pares de códons são definidos como conjuntos de dois tripletos subsequentes (códons) em uma sequência de codificação.

Modalidades de construção

Quando o polipeptídeo de acordo com a invenção deve ser secretado da célula hospedeira para o meio de cultura, pode ser acrescentada uma sequência de sinal adequada ao polipeptídeo para direcionar o polipeptídeo sintetizado de novo para a via de secreção da célula hospedeira. Os versados na técnica saem como selecionar uma sequência de sinal adequada para uma hospedeira específica. A sequência de sinal pode ser nativa à célula hospedeira ou pode ser estranha à célula hospedeira. Como exemplo, pode ser usada uma sequência de sinal de um polipeptídeo nativo à célula hospedeira. É preferível que o polipeptídeo nativo seja um polipeptídeo extremamente secretado, isto é, um polipeptídeo que é secretado em quantidades superiores a 10% da quantidade total do polipeptídeo que está sendo secretado.

Como uma alternativa a uma sequência de sinal, o polipeptídeo da invenção pode ser fundido a um polipeptídeo portador secretado, ou parte dele. Tal construção quimérica é direcionada à via de secreção por meio da sequência de sinal do polipeptídeo portador pode ser qualquer polipeptídeo. É preferível que seja usado um polipeptídeo extremamente secretado como um polipeptídeo portador. 0 polipeptídeo portador pode ser nativo ou estanho ao polipeptídeo de acordo com a invenção. O polipeptídeo portador pode ser nativo ou estranho à célula hospedeira.

de 04/06/2018, pág. 52/244

37/127

Exemplos de tais polipeptídeos portadores são glicoamilase, pro-pré-sequência de fator de emparelhamento alfa, domínio de ligação a celulose de polipeptídeo A de ligação a celulose de Clostridium cellulovorans, glutatione Stransferase, domínio de ligação a quitina da quitinase Al de Bacillus circulans, domínio de ligação a maltose codificado pelo gene malE de E. coli K12, beta galactosidase, e fosfatase alcalina. Um polipeptídeo portador opcional para a expressão de tal construção quimérica em células de Aspergillus é a glicoamilase. O polipeptídeo portador e o polipeptídeo de acordo com a invenção podem conter um motivo de aminoácidos específico para facilitar o isolamento do polipeptídeo; o polipeptídeo de acordo com a invenção pode ser liberado por um agente de liberação especial. O agente de liberação pode ser uma enzima proteolítica ou um agente químico. Um exemplo de tal motivo de aminoácidos é o sítio de divagem de protease KEX, que é conhecido dos versados na técnica.

Uma sequência de sinal pode ser usada para facilitar a secreção e o isolamento de um polipeptídeo ou do polipeptídeo da invenção. As sequências de sinal são tipicamente caracterizadas por um núcleo de aminoácidos hidrófobos, que são geralmente clivados do polipeptídeo maduro durante a secreção em um ou mais eventos de divagem. Tais peptídeos de sinal contêm sítios de processamento que permitem a divagem da sequência de sinal a partir dos polipeptídeos maduros à medida que eles atravessam o trajeto de secreção. A sequência de sinal direciona a secreção do polipeptídeo, tal como de um hospedeiro eucariótico no qual o vetor de expressão é de 04/06/2018, pág. 53/244

38/127 transformado e a sequência de sinal é subsequentemente ou simultaneamente clivada. O polipeptídeo pode então ser facilmente purificado a partir do meio extracelular por métodos conhecidos. Alternativamente, a sequência de sinal pode ser ligada ao polipeptídeo de interesse usando uma sequência que facilita a purificação tal como uma com um domínio GST. Assim, a sequência que codifica o polipeptídeo pode ser fundida, por exemplo, a uma sequência marcadora, tal como uma sequência que codifica um peptídeo, o que facilita a purificação do polipeptídeo fundido. Em determinadas modalidades deste aspecto da invenção, a sequência de marcador é um peptídeo hexa-histidina, tal como o identificador provido em um vetor pQE (Qiagen, Inc.), dentre outros, muitos dos quais são disponíveis no comércio. Conforme descrito em Gentz et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:821-824 (1989), por exemplo, a hexa histidina proporciona uma purificação conveniente do polipeptídeo de fusão. O identificador HÁ é um outro peptídeo útil para a purificação e que corresponde a um epítopo derivado do polipeptídeo de hemaglutinina da influenza, que foi descrito por Wilson et ai., Cell 37: 767 (1984), por exemplo.

Em geral, o transformante pode ser construído por redução ou eliminação de expressão de determinados genes.

A redução ou eliminação destes genes pode ser uma vantagem, uma vez que ela pode aumentar o rendimento dos polipeptídeos desejáveis e pode também reduzir a decomposição de polipeptídeos desejáveis sob a influência de polipeptídeo expresso pelo gene reduzido ou deletado. A redução ou deleção pode ser efetuada usando-se um ou mais de 04/06/2018, pág. 54/244

39/127 métodos bem conhecidos na técnica, inserções, destruições, substituições ou deleções, por exemplo. Os métodos para a redução ou deleção podem ser métodos de mutagênese direcionados a sítio ou aleatória A porção do gene a ser modificada ou inativada pode ser, por exemplo, a região de codificação ou um elemento regulador necessário para a expressão da região de codificação. Um exemplo de tal sequência reguladora ou de controle de um gene pode ser uma sequência de promotor ou uma parte funcional sua, isto é, uma parte que é suficiente para afetar a expressão do gene. Outras sequências de controle para uma possível modificação incluem, mas sem limitação, uma líder, uma sequência de polipeptídeo, pre-pro-peptídeo, Kozak, de inicio de transcrição de sequência de sinal, de terminador de transcrição, ativador transcricional sítio de iniciação traducional e sítio de terminação traducional.

Em uma modalidade, os polinucleotídeos da presente invenção conforme descritos no presente documento podem ser sobre-expressos em uma cepa microbiana da invenção em comparação com a cepa microbiana genitora em que o gene não é sobre-expresso. A sobre-expressão de uma sequência de polinucleotídeos é definida no presente documento como a expressão do gene da sequência que resulta em uma atividade da enzima codificada pela sequência em uma cepa microbiana sendo pelo menos uma atividade 1,2 vezes maior do que a da enzima na cepa microbiana genitora; pelo menos 1,5 vezes maior do que esta atividade, sendo de preferência, a atividade da enzima pelo menos aproximadamente 2 vezes, pelo menos aproximadamente 3 vezes, pelo menos aproximadamente 4 vezes, pelo menos aproximadamente 5 de 04/06/2018, pág. 55/244

40/127 vezes, pelo menos aproximadamente 10 vezes, pelo menos aproximadamente 20 vezes, pelo menos aproximadamente 50 vezes, pelo menos aproximadamente 100 vezes, pelo menos aproximadamente 200 vezes, pelo menos aproximadamente 500 vezes, pelo menos aproximadamente 1000 vezes maior do que a atividade da enzima na cepa microbiana genitora.

Em uma modalidade, pode ser produzido um polipeptideo de fusão. Os fragmentos de DNA que codificam para sequências de polipeptideos diferentes, por exemplo, são ligados entre si em matriz de acordo com técnicas convencionais, empregando terminais de extremidade cega ou escalonada para ligação, digestão por enzima de restrição para proporcionais os terminais adequados, preenchimento de extremidades coesas conforme adequado tratamento com fosfatase alcalina para evitar uma ligação indesejável e ligação enzimática. Em uma outra modalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais incluindo sintetizadores automatizados de DNA.

Alternativamente pode ser conduzida a amplificação por PCR de fragmentos de genes usando-se iniciadores de ancoragem para dar origem a pendentes complementares entre dois fragmentos de genes consecutivos que podem ser subsequentemente anelados e reamplifiçados para gerar uma sequência de gene quimérico (veja, por exemplo, Currnet Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992) . Além disso, já são disponíveis no comércio muitos vetores de expressão que codificam uma fração de fusão (tal como um polipeptideo GST, por exemplo). Um ácido nucleico codificador pode ser clonado em tal vetor de expressão que a fração de fusão esteja ligada de 04/06/2018, pág. 56/244

41/127 em matriz ao polipeptídeo de tal modo, que os polipeptídeos fundidos estejam em matriz e a expressão do polipeptídeo fundido esteja sob o controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Os polipeptídeos híbridos podem compreender uma combinação de sequências de polipeptídeo completas ou parciais obtidas de pelo menos dois diferentes polipeptídeos em que um ou mais podem ser heterólogos à célula hospedeira.

Expressão/produção de polipeptídeos

De acordo com a invenção, o polipeptídeo é expresso pelo transformante de Talaromyces. O transformante de Talaromyces pode assim ser usado na preparação de um polipeptídeo de acordo com a invenção. Tal método compreende a cultura de uma célula hospedeira (transformada conforme foi descrito acima, por exemplo) em condições tais que proporcionem a expressão de uma sequência de codificação que codifica o polipeptídeo e opcionalmente recuperando o polipeptídeo expresso.

Dentro do contexto da presente invenção, o termo recombinante se refere a qualquer modificação genética que não envolva exclusivamente processos que ocorrem naturalmente e/ou modificações genéticas induzidas submetendo-se a célula hospedeira a uma mutagênese aleatória, mas também destruições genéticas e/ou deleções e/ou mutagênese específica, por exemplo. Consequentemente, são consideradas como sendo recombinantes combinações de processos recombinantes e de ocorrência natural e/ou modificações genéticas induzidas submetendo-se a célula hospedeira a mutagênese aleatória.

As células de Talaromyces recombinante de 04/06/2018, pág. 57/244

42/127 (transformantes) de acordo com a invenção podem ser cultivadas usando-se procedimentos conhecidos na técnica. Para cada combinação de um promotor e de uma célula hospedeira, são disponíveis condições de cultura que conduzem à expressão da sequência de DNA que codifica o polipeptídeo. Depois de se ter atingido a densidade celular desejada ou o título desejado do polipeptídeo, a cultura é interrompida e o polipeptídeo é recuperado empregando-se procedimentos conhecidos.

O meio de fermentação pode compreender um meio de cultura que contém uma fonte de carbono (glicose, maltose, melaço, amido, celulose, xilano, pectina hidrolisado de biomassa lignocelulolítica, por exemplo, etc.), uma fonte de nitrogênio (sulfato de amônio, nitrato de amônio, cloreto de amônio, por exemplo, etc.) e fontes de nutrientes inorgânicos (fosfato, magnésio, potássio, zinco, ferro, por exemplo, etc.). Opcionalmente pode ser incluído um indutor (celulose, pectina, xilano, maltose, maltodextrina ou xilogalacturonana, por exemplo).

A seleção do meio adequado pode ser baseada na escolha da hospedeira de expressão e/ou baseada nas exigências reguladoras da construção de expressão. Tais meios são conhecidos dos versados na técnica. O meio pode conter, se for desejado, componentes adicionais que favorecem as hospedeiras de expressão transformadas contra outros microorganismos potencialmente contaminantes.

A fermentação pode ser conduzida durante um período que vai de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 dias. Ele pode ser um processo de bateladas, de alimentação de bateladas ou contínuo, adequadamente a uma temperatura que de 04/06/2018, pág. 58/244

43/127 varia de aproximadamente 20 a aproximadamente 90°C, por exemplo, de preferência de 20 a 55°C, sendo mais preferível de 40 a 50°C e/ou a um pH de aproximadamente 2 a aproximadamente aproximadamente

Depois da interrupção da remoção das células, o

8, por exemplo, de preferência, de 3 a 5. As condições adequadas são geralmente selecionadas com base na escolha da hospedeira de expressão e do polipeptídeo a ser expresso.

Depois da fermentação, se for necessário, as células podem ser removidas do caldo de fermentação por meio de centrifugação ou filtração.

fermentação ou depois da polipeptídeo da invenção pode então ser recuperado e, se for desejado, purificado e isolado por meios convencionais. Polipeptídeo/Composições polipeptídicas

A invenção propõe um polipeptídeo ou uma composição polipeptídica que compreende uma celulase e/ou uma hemicelulase e/ou uma pectinase.

No presente documento, uma celulase é qualquer polipeptídeo que seja capaz de degradar ou modificar celulase e/ou glucanos. Um polipeptídeo que é capaz de degradar celulose é aquele que é capaz de catalisar o processo de decompor a celulose em unidades menores, ou parcialmente, em celodextrinas, por exemplo, ou completamente em monômeros de glicose. Uma celulase, de acordo com a presente invenção, pode dar origem a uma população de celodextrinas e monômeros de glicose quando entra em contato com a celulose. Tal degradação tipicamente ocorrerá por meio de uma reação de hidrólise.

No presente documento, uma hemicelulase é um polipeptídeo que é capaz de degradar ou modificar a de 04/06/2018, pág. 59/244

44/127 hemicelulose. Isto significa que uma hemicelulase pode ser capaz de degradar ou modificar um ou mis de xilano, arabano, glicuronoxilano, arabinogalactano, arabinoxilano, glucomanano, galactomanano e xiloglucano. Um polipeptídeo que é capaz de degradar uma hemicelulose é aquele que é capaz de catalisar o processo de decomposição da hemicelulose em polissacarídeos menores, parcialmente, em oligossacarídeos, por exemplo, ou completamente em monômeros de açúcar, tais como, por exemplo, monômeros de hexose e pentose. Uma hemicelulase de acordo com a invenção pode dar origem a uma população mista de oligossacarídeos e monômeros de açúcar quando colocada em contato com a hemicelulase, Tal degradação tipicamente ocorrerá por meio de uma reação de hidrólise.

No presente documento, uma pectinase é qualquer polipeptídeo que é capaz de degradar ou modificar a pectina. Um polipeptídeo que é capaz de degradar a pectina é aquele que é capaz de catalisar o processo de decompor a pectina em unidades menores, quer parcialmente, em oligossacarídeo, por exemplo, ou completamente em monômeros de açúcar. Uma pectinase de acordo com a invenção pode dar origem a uma população mista de oligossacarídeos e monômeros de açúcar quando colocada em contato com a pectinase. Tal degradação tipicamente ocorrerá por meio de uma reação de hidrólise.

Consequentemente, uma composição da invenção pode compreender qualquer celulase, uma celobiohidrolase, uma endo-β-Ι,4-glucanase, uma β-glicosidase ou uma β(1,3) (1,4)-glucanase.

No presente documento, uma celobiohidrolase (EC de 04/06/2018, pág. 60/244

45/127

3.2.1.91) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de ligações 1,4-p-D-glicosídicas em celulose ou em celotetraose, liberando a celobiose das extremidades não redutoras das cadeias., esta enzima pode também ser denominada celulase 1,4-p-celobiosidase, 1,4-βcelobiohidrolase, 1,4-p-D-glucano-celobiohidrolase, avicelase, exo-1,4-p-d-glucanase, exocelobiohidrolase ou exoglucanase.

No presente documento, uma endo-β-Ι,4-glucanase (EC 3.2.1.4) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a endoidrólise de ligações 1,4^-D-glicosídicas em celulose, liquenina ou em β-Dp-glucanos dos cereais. Tal polipeptídeo pode também ser capaz de hidrolisar as ligações 1,4 nos βD-glucanos que também contêm ligações 1,3. Esta enzima pode também ser denominada celulase, avicelase, β-1,4endoglucano hidrolase, β-l,4-glucanase, carbosimetil celulases, celudextrinase, endo-1,4^-D-glucanase, endo1,4^-D-glucanoidrolase, endo-1,4^-glucanase ou endoglucanase.

No presente documento, uma β-glicosidase (EC

3.2.1.21) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos terminais não redutores de β-Dglicose com a liberação de β-D-glicose. Tal polipeptídeo pode ter uma ampla especificidade para β-D-glicosídeos e pode também hidrolisar um ou mais dos seguintes: um β-D galactosídeo, um α-L-arabinosídeo, um β-D-xilosídeo ou um β-D-fucosídeo. Esta enzima pode também ser denominada amigdalase, β-D-glicosídeo glicoidrolase, celobiase ou gentobiase.

No presente documento, uma β-(1,3)(1,4)-glucanase de 04/06/2018, pág. 61/244

46/127 (EC3.2.1.73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de ligações 1,4-p-D-glicosídicas em β-D-glucanos contendo ligações 1,3 e ligações 1,4. Tal polipeptídeo pode atuar sobre liquenina e sobre β-Dglucanos de cereais, mas não sobre β-D-glucanos que contem ou somente ligações 1,3 ou somente ligações 1,4. esta enzima pode também ser denominada liqueninase, 1,3-1,4-β-ϋglucano 4-glucanoidrolase, β-glucanase, endo-β-Ι,3-1,4glucanase, liquenase ou β-glucanase de ligações mistas. Uma alternativa para este tipo de enzima é EC 3.2.1.6 que é descrita como endo-1,3(4)-β-glucanase. Este tipo de enzima hidrolisa ligações 1,3 ou 1,4 em β-D-glucanos quando o resíduo de glicose, cujo grupo redutor está envolvido na ligação a ser hidrolisada, é ele mesmo substituído em C-3. Nomes alternativos incluem endo-1,3^-glucanase, laminarinase, 1,3-(1,3;1,4)-β-D-glucano 3 (4) glucanoidrolase;. os substratos incluem laminarina, liquenina e β-D-glucanos de cereais.

Uma composição da invenção pode compreender qualquer hemicelulase, endoxilanase, uma β-xilosidase, uma a-Larabinofuranosidase, uma 1,4-D-arabinoxilano arabinofuranoidrolase, uma acetil-xilano esterase, uma a-Dglicuronidase, uma celobiohidrolase, uma feruloil esterase, uma cumaroil esterase, uma α-galactosidase, uma βgalactosidase, uma β-mananase, ou uma β-manosidase.

No presente documento, uma endoxilanase (EC 3.2.1.8) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a endo hidrólise de ligações 1,4^-D-xilosídicas em xilanos. Esta enzima pode também ser conhecida como endo-1,4^-xilanase ou 1,4^-D-xilano xilanoidrolase. Uma alternativa é EC de 04/06/2018, pág. 62/244

47/127

3.2.1.136, uma glicuronoarabinoxilano endoxilanase, uma enzima que é capaz de hidrolisar ligações 1,4-xilosídicas em glicuronoarabinoxilanos.

No presente documento, a β-xilosidase (EC 3.2.1.37) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de 1,4^-D-xilanos, para remover resíduos sucessivos de Dxilose dos terminais não redutores. Tais enzimas podem também hidrolisar xilobiose. Esta enzima pode também ser conhecida como xilano 1,4^-xilosidase, 1,4^-D-xilano xiloidrolase, exo-1,4^-xilosidase ou xilobiase.

No presente documento, uma a-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo que é capaz de agir sobre α-L-arabinofuranosídeos, α-L-arabinanos contendo ligações (1,2) e/ou (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. Esta enzima pode também ser conhecida como oí-N-arabinofuranosidase, arabinofuranosidase ou arabinosidase.

No presente documento, uma α-D-glicuronidase (EC 3.2.1.139) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma reação da seguinte forma: α-D-glicuronosídeo + H(2)O = um álcool + D-glicuronato. Esta enzima pode também ser conhecida como α-glicuronidase ou α-glicosiduronase. Estas enzimas podem também hidrolisar ácido glicurônico 4-0-, que pode também estar presente como um substituinte em xilanos. Uma alternativa é EC 3.2.1.131: xilano oí-1,2glicuronosidase, que catalisa a hidrólise de ligações a1,2-(4-0-metil)glicuronosila.

No presente documento, uma celobiohidrolase (EC

3.1.1.72) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a desacetilação de xilanos e de xilo-oligossacarídeos. Tal de 04/06/2018, pág. 63/244

48/127 polipeptídeo pode catalisar a hidrólise de grupos acetila de xilano poliméico, de xilose acetilada, glicose acetilada, acetato de α-naftila ou acetoa de p-nitrofenila mas, tipicament, não de triacetilglicerol. Tal polipeptídeo tipicamente não age sobre manano acetilado ou pectina acetilada.

No presente documento, uma acetil-xilano esterase (EC 3.1.1.6) é qualquer polipeptídeo que é capaz de hidrolisar especificamente as ligações éster de grupos acetila nas posições 2 e/ou 3 das frações xilose de xilano natural.

No presente documento, a feruloil esterase (EC

3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma reação da forma: feruloil-sacarídeo+ H(2)O = ferulato + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Ele pode tipicamente catalisar a hidrólise do grupo 4-hidróxi-3-metoxicinamoil (feruloil) de um açúcar esterifiçado, que é geralmente arabinose em substratos naturais, acetato de p-nitrofenol e ferulato de metila são tipicamente substratos mais precários. Esta enzima pode também ser conhecida como éster cinamoílico hidrolase, esterase do ácido ferúlico ou hidroxicinamoil esterase. Ela pode também ser conhecida como uma enzima accessória de hemicelulase, uma vez que ela pode auxiliar as xilanases e as pectinases a decompor a hemicelulose e a pectina da parede celular das plantas.

No presente documento, uma cumaroil esterase (EC

3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma reação da forma: cumaroil-sacarídeo + H(2)O = cumarato + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Esta enzima pode de 04/06/2018, pág. 64/244

49/127 também ser conhecida como trans-4-cumaroil esterase, transp-coumaroil esterase, p-cumaroil esterase ou esterase do ácido p-cumárico. Esta enzima também incide em EC 3.1.1.73, de modo que ela pode também ser conhecida como feruloil esterase.

No presente documento, uma α-galactosidase (EC

3.2.1.22) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise dos resíduos terminais não redutores de a-Dgalactose em α-D-galactosídeos, incluindo oligossacarídeos de galactose, galactomananos, galactanos e arabinogalactanos. Tal polipeptídeo pode também ser capaz de hidrolisar α-D-fucosídeos. Esta enzima pode também ser conhecida como melibiase.

No presente documento, uma β-galactosidase (EC

3.2.1.23) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos terminais não redutores de β-Dgalactose em β-D-galactosídeos. Tal polipeptídeo pode também ser capaz de hidrolisar oí-L-arabinosideos. Esta enzima pode também ser conhecida como exo-(l->4)-β-Dgalactanase ou lactase.

No presente documento, uma β-mananase (EC 3.2.1.78) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise aleatória de ligações 1,4^-D-manosídicas em mananos, galactomananos e glucomananos. Esta enzima pode também ser conhecida como manano endo-1,4^-manosidase ou endo-1,4mananase.

No presente documento, a β-manosidase (EC 3.2.1.25) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos terminais, não redutores de β-D-manose em β-Dmanosídeos. Esta enzima pode também ser conhecida como de 04/06/2018, pág. 65/244

50/127 mananase ou manase.

Uma composição da presente invenção pode compreender qualquer pectinase, endo poligalacturonase, uma pectina metil esterase, uma endo-galactanase, uma β-galactosidase, uma pectina acetil esterase, uma endo-pectina liase, pectato liase, alfa ramnosidase, uma exo-galacturonase, uma exo-poligalacturonato liase, uma ramnogalacturonano hidrolase, uma ramnogalacturonano liase, umaa ramnogalacturonano acetil esterase, uma ramnogalacturonano galacturonoidrolase ou uma xilogalacturonase.

No presente documento, uma endo-poligalacturonase (EC 3.2.1.15) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise aleatória de ligações 1,4-oí-Dgalactosidurônicas em pectato e em outros galacturonanos. Esta enzima pode também ser conhecida como poligalacturonase, pectina depolimerase, pectinase, endopoligalacturonase, pectolase, pectina hidrolase, pectina poligalacturonase, poli-a-1,4-galacturonídeo glicanoidrolase, endogalacturonase; endo-D-galacturonase ou poli (1,4-oí-D-galacturonideo) glicanoidrolase .

No presente documento, uma pectina metil esterase (EC 3.1.1.11) é qualquer enzima que é capaz de catalisar a reação: pectina + η H2O = n metanol + pectato. A enzima pode também ser conhecida como pectinesterase, pectina demetoxilase, pectina metoxilase, pectina metilesterase, pectase, pectinesterase ou pectina pectilidrolase.

No presente documento, uma endo-galactanase (EC 3.2.1.89) é qualquer enzima capaz de catalisar a endohidrólise de ligações 1,4-p-D-galactosídicas em arabinogalactanos. A enzima pode também ser conhecida como de 04/06/2018, pág. 66/244

51/127 arabinogalactano galactanase, endo-1,4-p-galactosidase, endo-1,4-βgalactanase, arabinogalactanase ou arabinogalactano 4-p-D-galactanoidrolase.

No presente documento, uma pectina acetil esterase é definida no presente documento como qualquer enzima que tem uma atividade de acetil esterase que catalisa a desacetilação dos grupos acetila nos grupos hidroxila de resíduos GalUA de pectina

No presente documento, uma endo-pectina liase (EC 4.2.2.10) é qualquer enzima capaz de catalisar a divagem eliminativa de éster (l->4)-α-D-galacturonano metílico para produzir oligossacarídeos com grupos 4-desóxi-6-O-metil-aD-galact-4-enuronosila nas suas extremidades não redutoras. A enzima pode também ser conhecida como pectina liase, pectina trans-eliminase; endo-pectina liase, transeliminase polimetilgalacturônica, pectina metiltranseliminase, pectoliase, PL, PNL ou PMGL ou (l->4)-6-O-metil-a-Dgalacturonano liase.

No presente documento, uma pectato liase (EC 4.2.2.2) é qualquer enzima capaz de catalisar a divagem eliminativa de (l->4)-α-D-galacturonano para produzir oligossacarídeos com grupos 4-desóxi-oí-D-galact-4-enuronosila nas suas extremidades não redutoras. A enzima pode também ser conhecida como transeliminase poligalacturônica, transeliminase do ácido péctico, poligalacturonato liase, endopectina metiltranseliminase, pectato transeliminase, endogalacturonate transeliminase, liase do ácido péctico, liase péctica, liase do ácido oí-1,4-Dendopoligalacturônico, PGA liase, PPase-N, liase do ácido endo-a-1,4-poligalacturônico, liase do ácido de 04/06/2018, pág. 67/244

52/127 poligalacturônico, pectina trans-eliminase, trans-eliminase do ácido poligalacturônico ou (l->4)-a-D-galacturonano liase.

Neste documento, uma α-ramnosidase (EC 3.2.1.40) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos terminais não redutores de α-L-ramnose em a-Lramnosídeos ou alternativamente em ramnogalacturonano. Esta enzima pode também ser conhecida como α-L-ramnosidase T, aL-ramnosidase N ou α-L-ramnosídeo ramnoidrolase.

No presente documento, uma exo-galacturonase (EC 3.2.1.82) é qualquer polipeptídeo capaz de hidrolisar o ácido péctico da extremidade não redutora, liberando digalacturonato. A enzima também pode ser conhecida como apoli-a-galacturonosidase, exopoligalacturonosidase ou exopoligalacturanosidase.

No presente documento, exo-galacturonase (EC 3.2.1.67) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar: (1,4oí-D-galacturonideo) _n + H2O = (1,4-a-D-galacturonídeo) _n-i + D-galacturonato. A enzima pode também ser conhecida como galacturano 1,4-a-galacturonidase, exopoligalacturonase, poli(galacturonateo) hidrolase, exo-D-galacturonase, exo-Dgalacturonanase, exopoli-D-galacturonase ou poli(1,4-a-Dgalacturonídeo) galacturonoidrolase.

No presente documento, exo-poligalacturonato liase (EC 4.2.2.9) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar a clivagem eliminativa de 4-(4-desóxi-a-D-galact-4enuronosil)-D-galacturonato da extremidade redutora de pectato, isto é, da pectina desesterifiçada. Esta enzima pode ser conhecida como pectato dissacarídeo-liase, pectato exo-liase, transeliminase do ácido exopéctico, exopectato de 04/06/2018, pág. 68/244

53/127 liase, trans-eliminase do ácido exopoligalacturônico, PATE, exo-PATE, exo-PGL ou dissacarídeo liase de extremidade redutora de (l->4)-a-D-galacturonano.

No presente documento, uma ramnogalacturonano hidrolase é qualquer polipeptídeo que é capaz de hidrolisar a ligação entre o ácido galactosilurônico e ramnopiranosila de um modo endo em estruturas estritamente alternantes, consistindo no dissacarídeo [ácido (1,2-oí-L-ramnoil- (1,4) oí-galactosilurônico] .

No presente documento, ramnogalacturonano liase é qualquer polipeptídeo que é capaz de clivar ligações a-LRhap- (l->4) -oí-D-GalpA de um modo endo em ramnogalacturonano por β-eliminação.

No presente documento, uma ramnogalacturonano acetil esterase é qualquer polipeptídeo que catalisa a desacetilação da cadeia principal de resíduos alternantes de ramnose e de ácido galacturônico no ramnogalacturonano.

No presente documento, uma ramnogalacturonano galacturonoidrolase é qualquer polipeptídeo que é capaz de hidrolisar o ácido galacturônico da extremidade não redutora de estruturas estritamente alternantes de ramnogalacturonano de um modo exo.

No presente documento, xilogalacturonase é qualquer polipeptídeo que age sobre xilogalacturonano pela clivagem da cadeia de ácido galacturônico substituído com β-xilose de um modo endo. Esta enzima pode também ser conhecida como xilogalacturonano hidrolase.

No presente documento, uma a-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo que é capaz de agir sobre oí-L-arabinofuranosideos, α-L-arabinanos contendo de 04/06/2018, pág. 69/244

54/127 ligações (1,2) e/ou (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. Esta enzima pode também ser conhecida como oí-N-arabinofuranosidase, arabinofuranosidase ou arabinosidase.

No presente documento, endo-arabinanase (EC 3.2.1.99) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a endohidrólise de ligações 1,5-a-arabinofuranosídicas em 1,5arabinanos. A enzima pode também ser conhecida como endoarabinase, arabinano endo-1,5-a-L-arabinosidase, endo-1,5α-L-arabinanase, endo-a-1,5-arabanase; endo-arabanase ou 1,5-a-L-arabinano 1,5-a-L-arabinanoidrolase.

Uma composição da invenção tipicamente compreenderá pelo menos uma celulase, e/ou pelo menos uma hemicelulase e/ou pelo menos uma pectinase, (uma das quais é um polipeptídeo de acordo com a invenção). Uma composição da invenção pode compreende uma celobiohidrolase, uma endoglucanase e/ou uma β-glicosidase. Tal composição pode também compreender uma ou mais hemicelulases e/ou uma ou mais pectinases.

Uma ou mais (duas, tres, quatro, por exemplo, ou todas) de uma amilase, uma protease, uma lipase, uma ligninase, uma hexosiltransferase ou uma glicuronidase pode estar presente em uma composição da invenção.

Protease inclui enzimas que hidrolisam ligações peptídicas (peptidases), assim como enzimas que hidrolisam ligações entre peptídeos e outras frações, tais como açúcares (glicopeptidases). caracterizadas em EC 3.4 e

Muitas proteases são são adequadas para uso na invenção incorporadas ao presente documento a título de referência. Alguns tipos específicos de proteases incluem de 04/06/2018, pág. 70/244

55/127 proteases de cisteina incluindo proteases de pepsina, papaína e serina incluindo quimotripsinas, carboxipeptidases e metaloendopeptidases.

Lipase inclui enzimas que hidrolisam lipídios, ácidos graxos e acilglicerídeos, incluindo fosfoglicerídeos, lipopolipeptídeos, diacilgliceróis e semelhantes. Em plantas os lipídios são usados como componentes estruturais para limitar perdas de água e infecção por patógenos. Estes lipídios incluem ceras derivadas de ácidos graxos, assim como cutina e suberina.

Ligninase inclui enzimas que podem hidroliar ou decompor aestrutura de polímeros da lignina. As enzimas que podem decompor a lignina incluem peroxidases de lignina, peroxidases de manganês, laccases e feruloil esterases, e outras enzimas descritas na técnica conhecidas como despolimerizando ou de outro modo qualquer decompondo os polímeros de lignina. Também são incluídas enzimas capazesde hidrolisar ligações formadas entre açúcares hemicelulósicos (especialmente arabinose) e lignina. As ligninases incluem, mas sem limitação, o seguinte rupo de enzimas: peroxidases de lignina (EC 1.11.1), peroxidases de manganês (EC1.11.1.13), laccases (EC 1.10.3.2.) e feruloil esterases (EC 3.1.1.73).

Hexosiltransferase (2.4.1-) inclui enzimas que são capazes de transferir grupos glicosila, mais especificamente grupos hexosila. Além de transferir um grupo glicosil de um doador contendo glicosila a um outro composto contendo glicosila, o aceitador, as enzimas podem também transferir o grupo glicosila para água como um aceitador. Esta reação é também conhecida como uma reação de 04/06/2018, pág. 71/244

56/127 de hidrólise, em vez de uma reação de transferência. Um exemplo de uma hexosiltransferase que pode ser usada na invenção é uma β-glucanosiltransferase. Tal enzima pode ser capaz de catalisar a degradação de (1,3) (l,4)glucano e/ou celulose, e/ou um produto de degradação da celulose.

Glicuronidase inclui enzimas que catalisam a hidrólise de um glicuronosídeo, tal como, por exemplo, βglicuronosídeo para produzir um álcool. Muitas glicuronidases já foram caracterizadas e podem ser adequadas para uso na invenção, tal como, por exemplo, βglicuronidase (EC 3.2.1.31), hialurono-glicuronidase (EC 3.2.1.36), glicuronosil-dissulfoglicosamina glicuronidase (3.2.1.56), glicirizinato β-glicuronidase (3.2.1.128) ou aD-glicuronidase (EC 3.2.1.139).

Uma composição da invenção pode compreender uma expansina ou um polipeptideo semelhante a expansina, tal uma swolenina (veja Saloheimo et al. , Eur.. J. Biohem. .269, 4202-4211,,2002) ou um polipeptideo semelhante a swolenina.

As expansinas estão implicadas no afrouxamento da estrutura da parede celular durante o crescimento da célula vegetal. As expansinas foram propostas para destruir a ligação hidrogênio entre celulose e outros polissacarídeos da parede celular sem ter atividade hidrolítica. Deste modo elas são consideradas como permitindo o deslizamento das fibras de celulose e a ampliação da parede celular. Swolenina, um polipeptideo semelhante a expansina contém um domínio de Família 1 de Módulo de Ligação de Carboidrato no terminal N (CBD) e um domínio semelhante a expansina no terminal C. Para os fins da presente invenção, um de 04/06/2018, pág. 72/244

57/127 polipeptídeo semelhante a expansina ou um polipeptídeo semelhante a swolenina pode compreender um deste domínios ou os dois e/ou pode destruir a estrutura das membranas celulares (tal como destruir a estrutura celulósica), opcionalmente sem produzir qds detectáveis de açúcares redutores.

Polipeptídeos alternativos que podem estar presentes são escolhidos, por exemplo, do grupo de catalase, laccase, fenoloxidase, oxidase, oxidoreductases, celulase, xilanase, peroxidase, lipase, hidrolase, esterase, cutinase, protease e outros polipeptídeos proteolíticos, aminopeptidase, carboxipeptidase, fitase, liase, pectinase e outras enzimas pectinolíticas, amilase, glicoamilase, α-galactosidase, βgalactosidase, a-glicosidase, β-glicosidase, manosidase, isomerase, invertase, transferase, ribonuclease, quitinase, mutanase e desoxirribonuclease.

A invenção se efere ainda a composições que compreendem um ou mais polipeptídeos de acordo com a invenção.

Em uma modalidade, o polipeptídeo da invenção é uma hemicelulase, e a composição da invenção tipicamente compreenderá uma celulase e/ou uma pectinase além do polipeptídeo da invenção.

Em uma outra modalidade, o polipeptídeo da invenção é uma pectinase, e a composição da invenção tipicamente compreenderá uma celulase e/ou uma hemicelulase além do polipeptídeo da invenção.

Em uma outra modalidade, o polipeptídeo da invenção é uma celulase, e a composição da invenção tipicamente compreenderá uma hemicelulase e/ou uma pectinase além do de 04/06/2018, pág. 73/244

58/127 polipeptídeo da invenção.

Em uma modalidade, a celulase é uma ou mais de CBH I, CBH II, EG ou BG. O polipeptídeo pode ser uma celulase isolada e/ou uma hemicelulase isolada ou uma pectinase isolada ou uma mistura de celulase e/ou uma hemicelulase e/ou uma pectinase e/ou outros polipeptídeos. em uma modalidade, o polipeptídeo é uma celulase que é uma mistura de dois polipeptídeos selecionados de CBH I, CBH II, EG ou

BG.

É preferível que a celulase seja uma mistura compreendendo CBH I, CBH II, EG ou BG. Uma composição da invenção pode compreender uma, duas ou tres classes de celulase, uma, duas ou todas, por exemplo, de uma endo-1,4β-glicanase (EG), uma exo-celobiohidrolase (CBH) e uma βglicosidase (BG).

Uma composição dainvv pode compreender um polipeptídeo que tem a mesma atividade aenzimatica, tal tomo o mesmo tipo de celulase, hemicelulase e/ou pectinase, por exemplo, que aquele proporcionado por um polipeptídeo da invenção.

Uma composição da invenção pode compreender um polipeptídeo que tem um tipo de atividade diferente de celulase e/ou atividade de hemicelulase e/ou atividade de pectinase do que o proporcionado por um polipeptídeo da invenção. .Uma composição da invenção pode compreender um tipo de atividade de celulase e/ou atividade de hemicelulase e/ou atividade de pectinase proporcionado por um polipeptídeo da invenção e um segundo tipo de atividade de celulase e/ou de hemicelulase e/ou atividade de pectinase proporcionada por uma hemicelulase/pectinase de 04/06/2018, pág. 74/244

59/127 adicional.

Uma composição da invenção pode compreender o produto polipeptídico de um polipeptídeo que integra celulase, escafoldina ou um polipeptídeo semelhante a escafoldina, tal como, por exemplo, CipA ou CipC proveniente de Clostridium thermocellum ou de Clostridium cellulolyticum, respectivamente.

As escafoldinas e polipeptídeos que se integram a celulose são subunidades multifuncionais integrantes que podem organizar subunidades celulolíticas em um complexo multienzimático. Isto é obtido pela interação de duas classes complementares de domínio, isto um domínio de coesão em escafoldina e um domínio de doquerina em cada unidade enzimática. A subunidade de escafoldina também tem um módulo de ligação a celulose (CBM) que medeia a fixação do celulossomo ao seu substrato. Uma escafoldina ou polipeptídeo que se integra a celulose para os fins da invenção pode compreende um dos tais domínios ou ambos.

Em uma modalidade a composição polipeptídica pode compreender polipeptídeos que se originam de outros microorganismos que não são Talaromyces, tais como CBH I de Trichoderma, CBH II de Trichoderma, BG de Trichoderma e/ou EG de Trichoderma, β-D-glicosídeo glicohidrolase, endogalactanase, swolenina, Cipl, Cip2, Xilanase III, βxilosidase XylA, acetilxilano esterase, quitinase, βmanase.

Uma composição da invenção pode compreender um polipeptídeo induzido por celulose ou polipeptídeo modulador, conforme codificado pelo gene cipl ou cip2, por exemplo, ou por genes semelhantes provenientes de de 04/06/2018, pág. 75/244

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Trichoderma reesei/Hypocrea jacorina (veja Foreman et al., J. Biol. Chem. 278(340. 31988-31997, 2003). O produto polipeptídico destes genes são polipeptídeos bimodulares, que contém um módulo de ligação a celulose e um domínio cuja função ou atividade não pode ser relacionada com famílias conhecidas de glicosil hidrolase. No entanto, a presença de um módulo de ligação a celulose e a coregulação da expressão destes genes com componentes de celulases indica atividades que não foram reconhecidas anteriormente e que tem um papel potencial na degradação da biomassa.

Uma composição da invenção pode ser composta por um membro de cada uma das classes dos polipeptídeos mencionados acima, diversos membros de uma classe de polipeptídeos ou qualquer combinação destas classes de polipeptídeos.

Uma composição da invenção pode ser composta por polipeptídeos, enzimas, por exemplo, provenientes de (1) fornecedores comerciais; (2) genes clonados que expressam polipeptídeos, enzimas, por exemplo; (3) caldo complexo (tal como o que resulta do crescimento de uma cepa microbiana em meio de cultura, em que as cepas secretam polipeptídeos e enzimas para dentro do meio; (4) lisados celulares de cepas cultivadas como em (3); e/ou (5) material vegetal que expressa polipeptídeos, tais como enzimas, por exemplo. Diferentes polipeptídeos, enzimas, por exemplo, em uma composição da invenção podem ser obtidos de diferentes fontes.

Uso dos polipeptídeos

Os polipeptídeos e cmpspolipeptídicas de acordo com a de 04/06/2018, pág. 76/244

61/127

de	um	produto	de
que	os	açúcares	são
de	fermentação,	de
ir	o	produto	de

invenção podem ser usados em muitas aplicações diferentes

Eles podem ser usados, por exemplo, para produzir açucares fermentáveis. Em uma modalidade eles podem ser usados em um processo par a sacarificação de material lignocelulósico, em que o material lignoceulósico que teha sido opcionalmente tratado preiamente, é colocado em contato com um transformante de Talaromyces de acordo com a invenção ou uma celulase, hemicelulase ou pectinase, de acordo com a invenção, em que um ou mais açúcares são produzidos. Os açúcares fermentáveis podem então, como parte de um processo de biocombustível, serem convertidos em biogas ou em etanol, butanol, isobutanol, 2-butanol ou em outras substâncias adequadas. A invenção assim se refere a um processo para a preparaçã fermentação etanol, por exemplo, ei fermentados com um microorganismc preferência levedura, para produzir fermentação.

Alternativamente, os polipeptídeos e suas composições podem ser usados como enzima, na produção de produtos alimentícios, em composições detergentes na indústria de papel e polpa e em formulações antibacterianas, por exemplo, em produtos farmacêuticos tais como pastilhas para garganta, pastas dentais e enxaguantes bucais. Alguns dos usos serão ilustrados com mais detalhes abaixo.

Nos usos e métodos descritos abaixo, os componentes das composições descritos acima podem ser fornecidso concomitantemente (isto é, em forma de uma composição única por si) ou separadamente ou em sequência.

A invenção também se refere ao uso do polipeptídeo de de 04/06/2018, pág. 77/244

62/127 acordo com a invenção e a composições que compreendem tal enzima em processos industriais.

Apesar da experiência longa obtida com estes processos, o polipeptídeo de acordo com a invenção pode apresentar uma série de vantagens significativas em relação a enzimas atualmente usadas. dpdnedndo da aplicação específica, estas vantagens podem incluir aspectos tais como custos mais baixos de produção uma especificidade maior em relação ao substrato, uma antigenicidade reduzida, uma quantidade menor de atividades colaterais indesejáveis, rendimentos maiores quando produzido em um microorganismo adequado, limites mais adequados de pH e de temperatura, não inibição por produtos hidrófobos derivados de lignina ou uma quantidade menor de inibição do produto ou, no caso da industria alimentícia, um sabor ou textura melhores de um produto final assim como aspectos de categoria alimentícia e aspectos kosher.

Em princípio, um polipeptídeo ou composição da invenção pode ser usado em qualquer processo que exija o tratamento de um material que compreende polisacarídeo. Assim, um polipeptídeo ou composição da invenção pode ser usado no tratamento de material polissacarídico. No presente documento, o material polissacarídico é um material que compreende ou consiste essencialmente em um ou, mais tipicamente, mais de um polissacarídeo.

Tipicamente, as plantas e o material delas derivado compreendem quantidades significaivas de material polissacarídico não-amido. consequentemente, um polipeptídeo da invenção pode ser usado no trttde um material vegetal ou fúngico ou um maerial dele derivado.

de 04/06/2018, pág. 78/244

63/127

Lignocelulose

Os polipeptídeos podem ser usados com vantagem para degrada material lignocelulósico. Os principais polissacrídeos são celulose (glucanos), hemiceluloses (xilanos, heteroxilanos e xiloglucanos). Além disso, alguma hemicelulose pode estar presente em forma de glucomananos em matéria prima derivada da madeira, por exemplo. A hidrólise enzimática destes polissacarídeos em açúcares solúveis, em glicose, xilose, arabinose, galactose, frutose, manoses, ramnose, ribose, ácido D-galacturônico, por exemplo, e outras hexoses e pentoses ocorre sob a ação de diferentes enzimas que agem em conjunto.

Além disso, as pectinas e outras substâncias pécticas tais como os arabinanos podem constituir uma proporção considerável da massa seca de paredes celulares tipicamente provenientes de tecidos vegetais não lenhosos (aproximadamente de um quarto à metade da massa seca pode consistir em pectinas).

A celulose é um polissacarídeo linear composto de resíduos de glicose ligados por ligações β-1,4. A natureza linear das fibras celulósicas, assim como a estequiometria da glicose ligada em β (em relação a ligada em a) gera estruturas mais propensas a se interligar com ligações hidrogênio do que as estruturas extremamente ramificadas ligadas em α de amido. Assim os polímeros celulósicos são eralmente menos solúveis, e formais fibras ligadas mais firmemente do que as fibras encontradas em amido.

A hemicelulose é um polímero complexo e a sua composição frequentemente varia amplamente de um organismo a outro, e de um tipo de tecido a outro. Em geral o de 04/06/2018, pág. 79/244

64/127 principal componente de hemicelulose é xilose ligada em β1,4, um açúcar pentose. No entanto esta xilose é frequentemente ramificada em 0-3 e/ou 0-2 e pode ser substituída com ligações a arabinose, galactose, manose, ácido glicurônico, ácido galacturônico ou por esterificação ao ácido acético (por esterificação do ácido ferúlico a arabinose). A hemicelulose pode também conter glucano, que é um termo geral para hexoses ligadas em β (tais como β(1,3)(1,4)glucanos e heteroglucanos já citados)e adicionalmente glucomananos (em que tanto a glicose como a manose estão presentes na estrutura principal linear ligado entre si por ligações β).

As substâncias pécticas incluem pectinas, arabinanos, galactanos e arabinoalactano. As pectinas são os polissacarídeos mais complexos na parede celular vegetal. Elas são constituídas ao redor de uma cadeia interna de unidades de ácido D-galacturônico ligadas em oí(1,4) interligadas até um certo ponto com L-ramnose. Em qualquer uma parede celular há uma série de unidades estruturais que se ajustam a esta descrição e tem sido geralmente considerado que em uma única molécula péctica, as cadeias internas de diferentes unidades estruturais são continuas entre si.

Os tipos principais da unidade estrutural são: galacturonano (homogalacturonano), que pode ser substituído com metanol no grupo carboxila e com acetato em 02 e 03; ramnogalacturonano I (RGI) em que as unidades de ácido galacturônico se alternam com unidades de ramnose portando cadeias laterais de galactano ligado em (1,4) e de arabinano ligado em (1,5). As cadeias laterais de arabinano de 04/06/2018, pág. 80/244

65/127 podem ser ligadas diretamente a ramnose ou indiretamente através de cadeias de galactano; xilogalacturonano com unidades simples de xilosina no 03 de ácido galacturônico (associado proximamente com RGI); e ramnogalacturonano II (RGIIO, uma unidade menos importante especialmente complexa contendo açúcares pouco habituais, tal como, por exemplo apiose. Uma unidade de RGII pode conter dois resíduos apiosila que, em condições iônicas adequadas pode formar de modo reversível ésteres com borato.

A composição, a natureza da substituição e o grau de ramificação de hemiceluloses é muito diferente em plantas dicotiledôneas (isto é, plantas cujas sementes têm dois cotilédones ou folhas embrionárias nas sementes tais como feijões, amendoins, amêndoas, ervilhas, vagens) em comparação com plantas monocotiledôneas (isto é, plantas que têm um único cotilédone ou folha embrionária na semente tais como o milho, trigo, arroz, gramíneas, cevada) . Nas dicotiledôneas a hemicelulose é constituída principalmente por xiloglucanos que são cadeias de glicose ligada em 1,4-β com cadeias laterais xilosila ligadas em 1,6-β. Em monocotiledôneas, inclusive na maioria das culturas de grãos, o principal componente de hemicelulose são os heteroxilanos. Estes são principalmente compostos por polímeros de cadeia principal de xilose ligada em 1,4-β com ligação em 1,3-oí a arabinose, galactose, manose e ácido glicurônico,, ou ácido 4-0-metil-glicurônico assim como xilose modificada por ácidos acéticos ligados a éster. Também estão presentes β-glucanos constituídos por cadeias de glicosila ligadas em 1,3 e 1,4-β. Nas monocotiledôneas, a celulose, os heteroxilanos e os β-glucanos podem estar de 04/06/2018, pág. 81/244

66/127 presentes em quantidades aproximadamente iguais, constituindo cada uma delas aproximadamente 15-25% do material seco das paredes celulares. Além disso, plantas diferentes podem compreender quantidades diferentes e composições diferentes de substâncias pécticas. A beterraba açucareira, por exemplo, contém aproximadamente 19% de pectina e aproximadamente 21% de arabinano em uma base de peso seco.

Consequentemente, uma composição da invenção pode ser ajustada levando-se em conta a matéria prima específica (também denominada substrato) que deve ser usada. Isto significa que o espectro das atividades em uma composição da invenção pode variar dependendo do substrato em questão.

As combinações enzimáticas ou os tratamentos físicos podem ser administrados concomitantemente ou em sequência. As enzimas podem ser produzidas ou de modo exógeno em microorganismos, leveduras, fungos, bactérias ou plantas, sendo então isoladas e acrescentadas ao substrato lignocelulósico. Alternativamente, as enzimas são produzidas, mas não isoladas, e o mosto de fermentação de massa celular bruta, ou material vegetal (tal como restolho de milho) e semelhantes são acrescentados á matéria prima. Alternativamente, a massa celular bruta ou o meio de produção de enzima ou o material vegetal pode ser tratado para impedir a continuação do crescimento microbiano (por aquecimento ou pela adição de agentes antimicrobianos, por exemplo) sendo então acrescentada à matéria prima. Estas misturas enzimáticas brutas podem incluir o organismo produtor da enzima. Alternativamente, a enzima pode ser produzida em uma fermentação que usa matéria prima (tal de 04/06/2018, pág. 82/244

67/127 como restolho de milho) para proporcionar nutrição a um organismo que produz a(s) enzima(s). Deste modo, as plantas que produzem as enzimas podem servir como o substrato lignocelulósico e ser acrescentadas à matéria prima lignocelulósica. Os polímeros de carboidratos (celulose e hemicelulose) são intimamente ligados a lignina por ligações hidrogênio e ligações covalentes. Consequentemente, um polipeptídeo da invenção pode ser usado no tratamento de material lignocelulolitico. No presente documento, o material lignocelulolitico é um material que compreende ou essencialmente consiste em lignocelulose. Portanto em um método da invenção para o tratamento de um polissacarídeo distinto do amido, o polissacarídeo distinto do amido pode ser um material lignocelulósico/biomassa lignocelulósica.

De acordo com, a invenção propõe um método de tratamento de um substrato que compreende polissacarídeo não-amido em que o tratamento compreende a degradação e/ou hidrólise e/ou modificação da sustância celulósica e/ou da hemicelulósica e/ou da péctica.

As endol,4-p-glucanases (EG) e as exocelobiohidrolases (CBH) catalisam a hidrólise da celulose insolúvel em celooligossacarídeos (celobiose como um produto principal) enquanto β-glicosidases (BG) convertem os oligossacarídeos, principalmente celobiose e celotriose em glicose.

As xilanases juntamente com outras enzimas acessórias, α-L-arabinofuranosidases, feruloil e acetilxilano esterases, glicuronidases e β-xilosidases, catalisam a hidrólise de hemiceluloses.

de 04/06/2018, pág. 83/244

68/127

As pectinases, a endo poligalacturonase, por exemplo, uma metil esterase de pectina, uma endo-galactanase, uma βgalactosidase, uma acetil esterase de pectina, uma endopectina liase, uma pectato liase, uma ramnogalacturonano hidrolase, uma ramnogalacturonano liase, uma ramnogalacturonano acetil esterase, uma ramnogalacturonano galacturonohidrolase, uma xilogalacturonase, uma aarabinofuranosidase.

A degradação dentro deste contexto indica que o tratamento resulta na geração de produtos de hidrólise de uma substância celulósica e/ou hemicelulósica e/ou uma péctica, isto é, estão presentes como resultado do tratamento sacarídeos de comprimento menor do que estariam presentes em um polissacarídeo não-amido sem tratamento. Assim a degradação dentro deste contexto pode resultar na liberação de oligossacarídeos e/ou monômeros de açúcares.

Todas as plantas contêm polissacarídeos distintos de amido como praticamente todos os materiais polissacarídeos derivados de plantas. Consequentemente em um método da invenção para o tratamento de substrato que compreende um polissacarídeo não-amido, tal substrato pode ser provido na forma de uma planta ou de um material derivado de planta ou um material que compreende uma planta ou material derivado de planta, polpa vegetal, por exemplo, um extrato vegetal, um alimento ou ingrediente para o alimento, um tecido, um têxtil ou uma peça de vestuário.

A biomassa lignocelulolítica adequada para uso na invenção inclui biomassa e pode inclui biomassa virgem e/ou não virgem tal como uma biomassa agrícola, produtos orgânicos comerciais, detritos de construção e demolição, de 04/06/2018, pág. 84/244

69/127 detritos sólidos municipais, papel usado e detritos de jardins. Formas comuns de biomassa incluem árvores, arbustos e gramíneas, trigo, casca de trigo, bagaço da cana de açúcar, milho, casca de milho, sabugos de milho, grãos de milho, incluindo fibra proveniente dos grãos, produtos e produtos secundários da moagem de grãos tais como milho, trigo e cevada, (inclusive a moagem úmida e seca) frequentemente denominadas fibras assim como resíduos sólidos municipais, papel usado e resíduos de jardins. A biomassa pode também ser, mas sem limitação, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos municipais, papel usado e polpa e resíduos de fabricação de polpa e papel. Biomassa agrícola inclui ramos, arbustos, canas, milho e casca de milho, culturas energéticas, florestas, frutos, flores, grãos, gramíneas, cultura herbáceas, folhas, casca de troncos, agulhas, toras, raízes, plântulas, culturas lenhosas de curta rotação, arbustos, Panicum virgatum, árvores, vegetais, cascas de frutas, cipós, polpa de beterraba açucareira, resíduos da moagem de trigo, cascas de aveia e madeiras duras e macias (não incluindo madeiras contendo materiais deletérios). Além disso, a biomassa agrícola inclui materiais de resíduos orgânicos gerados por processos agrícolas incluindo atividades agrícolas e florestal, incluindo especificamente resíduos de material florestal. A biomassa agrícola pode qualquer uma das citadas acima individualmente ou em qualquer combinação ou mistura delas. Outros exemplos de biomassa adequada são aparas de pomares, chaparral, resíduos de moinhos, resíduos de madeira urbana, resíduos municipais, resíduos de madeireiros, raleios de 04/06/2018, pág. 85/244

70/127 florestais, culturas de madeira de curta rotação, resíduos industriais, palha de trigo, palha de aveia, palha de arroz, palha de cevada, palha de centeio, palha de linho, a cascas de soja, cascas de arroz, palha de arroz, ração de glúten de milho, cascas de milho, cana de açúcar, restolho de milho, talos de milho, sabugos de milhos, cascas de milho, gramíneas de pradarias, Tripsacum dactyloides, carrapicho (Alopecurus); polpa de beterraba açucareira, polpa de cítricos, cascas de sementes, resíduos animais celulósicos, resíduos de tosa de gramados, algodão, algas, árvores, arbustos, gramíneas, trigo, palha de trigo, bagaço de cana, milho, casca de milho, sabugos de milho, grão de milho, fibras dos grãos, produtos e produtos secundários da moagem úmida ou seca de grãos, resíduos sólidos municipais, resíduos de papel, resíduos de jardins, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos municipais, resíduos de papel, polpa, resíduos de fabrica de papel, galhos, arbustos, canas, milho, cascas de milho, uma cultura energética, material florestal, de frutas, de flores, de grãos, de gramíneas, de uma cultura herbácea, de folhas, casca de árvore, de agulhas, de toras, de raízes, de plântulas, de arbustos, de Tripsacum dactyloides, de árvores, de verduras, de cascas de fruta, de cipós de polpa de beterraba açucareira, de resíduos de moagem de trigo, de cascas de aveia, de madeira dura ou macia, de resíduos orgânicos gerados de um processo agrícola, resíduos de madeiras florestais, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais deles.

Além da biomassa virgem ou das matérias primas já processadas em indústrias de alimentos e rações ou de papel de 04/06/2018, pág. 86/244

71/127 e polpa, a biomassa/matéria prima pode ainda ser previamente tratada com calor, modificação mecânica e/ou química ou com qualquer combinação de tais métodos para aumentar a degradação enzimática.

Tratamento prévio

Antes do tratamento enzimático, o material lignocelulósico pode ser previamente tratado o tratamento prévio pode compreender a exposição do material lignocelulósico a um ácido, a uma base, a um líquido iônico, um solvente, calor, um peróxido, ozônio, trituração mecânica, trituração moagem ou despressurização rápida ou uma combinação de quaisquer dois ou mais deles. Este tratamento químico prévio é frequentemente combinado com um tratamento prévio com calor, tal como a 150 a 220°C durante dum período de 1 a 30 minutos.

Depois da etapa de tratamento prévio, pode ser utilizada uma etapa de liquefação/hidrólise ou sacarificação prévia envolvendo a incubação com uma enzima ou com uma mistura de enzimas. O tratamento prévio pode ser conduzido a muitas temperaturas diferentes. Em uma modalidade, o tratamento prévio ocorre a uma temperatura mais bem adequada à misturas de enzimas que estiverem sendo testadas ou então à temperatura ótima da enzima prevista

das enzimas a serem testadas.	A temperatura do	tratamento
prévio pode	variar	de	aproximadamente	10°C	a
aproximadamente	95°C,	de	aproximadamente	20°C	a
aproximadamente	85°C,	de	aproximadamente	30°C	a
aproximadamente	70°C,	de	aproximadamente	40°C	a
aproximadamente	60°C,	de	aproximadamente	37°C	a
aproximadamente	50°C, de	preferência, de aproximadamente

de 04/06/2018, pág. 87/244

72/127

37°C a aproximadamente 80°C, sendo mais preferível de aproximadamente 60-70°C sendo ainda mais preferível a aproximadamente 65°C. O pH da mistura de tratamento prévio pode varia de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0, mas é preferível de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 7,0, sendo mais preferível aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,0, sendo ainda mais preferível de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0. Novamente, o pH pode ser ajustado para maximizar a atividade enzimática e pode ser ajustado com a adição da enzima. A comparação dos resultados dos resultados de ensaios deste teste permitirá que se modifique o método para se ajustar melhor às enzimas sendo testadas.

A reação da etapa de liquefação/hidrólise ou a sacarificação prévia pode ocorrer de diversos minutos a diversas horas, tal como de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 120 horas, de preferência de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 48 horas, sendo mais preferível de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas, sendo mais preferível de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 horas. O tratamento de celulase pode ocorrer durante diversos minutos a diversas horas, tal como de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 120 horas, de preferência de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 72 horas, sendo mais preferível de aproximadamente 24 a 48 horas.

Sacarificação

A invenção propõe um método para a produção de um açúcar a partir de material lignocelulósico, compreendendo este método a colocação de um polipeptídeo da invenção para de 04/06/2018, pág. 88/244

73/127 uma composição da invenção em contato com o material lignocelulósico.

Tal método permite que sejam gerados açúcares livres (monômeros) e/ou oligossacarídeos a partir da biomassa lignocelulósica. Estes métodos envolvem a conversão da biomassa lignocelulósica para liberar açúcares e oligossacarídeos pequenos com um polipeptídeo ou uma composição da invenção.

O processo de conversão de um carboidrato complexo tal como a lignocelulose em açúcares permite de preferência a conversão em açúcares fermentáveis. Tal processo pode ser conhecido como sacarificação. Consequentemente, um método da invenção pode resultar na liberação de uma ou mais açúcares hexose e/ou pentose, tal como um ou mais de glicose, xilose, arabinose, galactose, ácido galacturônico, ácido glicurônico, manose, ramnose, ribose e frutose.

Consequentemente, um outro aspecto da invenção inclui métodos que utilizam o polipeptídeo da composição da invenção, descrito acima juntamente com outros tratamentos enzimáticos ou físicos tais como com temperatura e pH para converter a biomassa vegetal lignocelulósica em açúcares e oligossacarídeos.

Embora a composição tenha sido discutida como uma mistura individual é fato conhecido que as enzimas podem ser acrescentadas em sequência, podendo a temperatura, pH e outras condições ser alteradas para se aumentar a atividade de cada enzima individual. Alternativamente, um pH e temperatura ótimos podem ser determinados para a mistura de enzimas.

Fazem-se reagir as enzimas com substrato em condições de 04/06/2018, pág. 89/244

74/127 adequadas. As enzimas podem ser incubadas, por exemplo, a aproximadamente 25°C, aproximadamente 30°C, aproximadamente 35°C, aproximadamente 37°C, aproximadamente 40°C, aproximadamente 45°C, aproximadamente 50°C, aproximadamente 55°C, aproximadamente 60°C, aproximadamente 65°C, aproximadamente 70°C, aproximadamente 75°C, aproximadamente 80°C, aproximadamente 85°C, aproximadamente 90°C ou mais. Isto é, elas podem ser incubadas a uma temperatura que varia de aproximadamente 20°C a aproximadamente 95°C, por exemplo, em tampões de baixa a média intensidade iônica e/ou de pH de baixo a neutro. Intensidade iônica média significa que o tampão tem uma concentração iônica de aproximadamente 200 milimol (mM) ou menos para qualquer componente iônico. O pH pode variar de aproximadamente pH

2,5, aproximadamente	PH	3,0, aproximadamente	PH	3,5,
aproximadamente	PH	4,0	, aproximadamente	PH	4,5,
aproximadamente	PH	5,	aproximadamente	PH	5,5,
aproximadamente	PH	6,	aproximadamente	PH	6,5,
aproximadamente	PH	7,	aproximadamente	PH	7,5,
aproximadamente	PH	8,0,	a aproximadamente	PH	8,5.

Geralmente os limites de pH variarão de aproximadamente pH 3,0 a aproximadamente pH 7. Para a produção de etanol pode ser usado um meio ácido a um pH = 4, por exemplo, ao passo que para a produção do biogas um pH neutro, tal como pH = 7. A incubação das combinações de enzimas nestas condições resulta na liberação de quantidades substanciais do açúcar da lignocelulose. Quantidade substancial significa pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de açúcar disponível.

Os polipeptídeos, tais como enzimas, podem ser de 04/06/2018, pág. 90/244

75/127 produzidos tanto de modo exógeno em microorganismos, leveduras, fungos, bactérias, ou plantes, sendo então isolados e acrescentados, por exemplo, ao material lignocelulósico. Alternativamente, as enzimas são produzidas, mas não isoladas, e o mosto de fermentação da massa celular bruta, ou o material vegetal (tal como restolho de milho) e semelhante pode ser acrescentado à matéria prima, por exemplo. Alternativamente, a massa celular bruta ou o meio de produção de enzima ou o material vegetal pode ser tratado para impedir a continuação do crescimento microbiano (aquecendo ou acrescentando agentes antimicrobianos, por exemplo), sendo então acrescentado, por exemplo, à matéria prima. Estas misturas enzimáticas brutas podem incluir o organismo que produz a enzima. Alternativamente, a enzima pode ser produzida em uma fermentação que usa matéria prima (tal como restolho de milho) para proporcionar nutrição a um organismo que produz uma enzima(s). Deste modo, as plantas que produzem as enzimas podem elas mesmas servir como uma matéria prima lignocelulósica e serem acrescentadas à matéria prima lignocelulósica.

Fermentação de açúcares

Os açúcares fermentáveis podem ser convertidos em produtos de fermentação com valor agregado, incluindo os exemplos não limitantes deles aminoácidos, vitaminas, produtos farmacêuticos, suplementos de rações animais, produtos de química fina, matérias primas químicas, plásticos, solventes, combustíveis ou outros polímeros orgânicos, ácido lático e etanol, incluindo etanol combustível. Mais especificamente os açúcares podem ser de 04/06/2018, pág. 91/244

76/127 combinação de lignocelulósico usados como matéria prima para a fermentação em produtos químicos, plásticos, tais como, por exemplo, ácido succínico e (bio)combustíveis, incluindo etanol, metanol, combustíveis líquidos de butanol sintético e biogas.

No método da invenção, por exemplo, uma enzima ou enzimas age sobre um substrato ou biomassa vegetal, servindo como substrato, de modo a converter este substrato complexo em açúcares simples e oligossacarídeos para a produção de etanol ou de outros produtos úteis de fermentação.

Os açúcares liberados da biomassa podem ser convertidos em produtos de fermentação úteis, tais como um que inclui, mas sem limitação, aminoácidos,, vitaminas, produtos farmacêuticos, suplementos de rações animais, produtos de química fina, matéria prima química, plásticos e etanol, inclusive o etanol combustível.

Consequentemente, a invenção propõe um método para a preparação de um produto de fermentação, compreendendo o método:

a. a degradação de lignocelulose usando um método conforme descrito no presente documento; e

b. fermentação do material resultante, para preparar assim um produto de fermentação.

A fermentação pode ser conduzida em condições aer5óbicas ou anaeróbicas. É preferível que o processo seja conduzido em condições micro-aerófilas ou em condições de oxigênio limitado.

Um processo de fermentação anaeróbico é definido no presente documento como um processo de fermentação conduzido na ausência de oxigênio ou aquele em que não é de 04/06/2018, pág. 92/244

77/127 consumido substancialmente nenhum oxigênio, de preferência aproximadamente 5 ou menos aproximadamente 2,5 ou menos ou aproximadamente 1 mmol/L/h ou menos e em que as moléculas orgânicas servem tanto como doadoras de elétrons como aceitadoras de elétrons.

Um processo de fermentação com o oxigênio limitado é um processo em que o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gas para o líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e a composição do fluxo de gas que entra assim como pelas propriedades reais da mistura/transferência de massa do equipamento de fermentação usado. É preferível em um processo nas condições de oxigênio limitado que a taxa de consumo de oxigênio seja de pelo menos aproximadamente 5,5, pelo menos aproximadamente 6, sendo ainda mais preferível que seja de pelo menos aproximadamente 7 mmol/L/h.

Um método para a preparação de um produto de fermentação pode compreender opcionalmente a recuperação do produto de fermentação.

SSF

A fermentação e	a	sacarificação podem	também ser
executados no	modo	de	Sacarificação e	Fermentação
Simultâneas (SSF)	. Uma	das	vantagens deste modo	é a redução
da inibição de	açúcar	sobre a hidrólise	enzimática

(inibição de açúcar sobre as celulases é descrita por Caminal B&B Vol. XXVII Pp 1282-1290).

Produtos de Fermentação

Os produtos de fermentação que podem ser produzidos de acordo com a invenção incluem aminoácidos, vitaminas, produtos farmacêuticos, suplementos de rações animais, de 04/06/2018, pág. 93/244

78/127 produtos de química fina, matérias primas químicas, plásticos, solventes, combustíveis ou outros polímeros orgânicos, ácido lático e etanol, inclusive etanol combustível (o termo etanol significando que inclui álcool etílico ou misturas de álcool etílico e água).

Os produtos específicos com valor agregado que podem ser produzidos pelos métodos da presente invenção incluem, mas sem limitação, biocombustíveis (incluindo etanol e butanol e biogas); ácido lático; um plástico; um produto químico especial; um ácido orgânico, incluindo ácido cítrico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido itacônico e ácido maleico; ácido 3-hidróxi-propiônico; ácido acrílico; ácido acético; 1,3-propano-diol; etileno, glicerol; um solvente; um suplemento para ração animal; um produto farmacêutico, tal como um antibiótico de β-lactama ou uma cefalosporina; vitaminas; um aminoácido, tal como lisina, metionina, triptofano, treonina, e ácido aspártico; uma enzima industrial, tal como uma protease, uma celulase, uma amilase, uma glicanase, uma lactase, uma lipase, uma liase, uma óxido-redutase, uma transferase ou uma xilanase; e uma matéria prima química.

Biogas

A invenção também propõe o uso de um polipeptídeo ou de uma composição conforme descrito no presente documento em um método para a preparação de biogas. Biogas tipicamente se refere a um gas produzido pela decomposição biológica de matéria orgânica, material contendo carboidratos distintos de amido, na ausência de oxigênio. 0 biogas se origina de material biogênico e é um tipo de biocombustível. Um tipo de biogas é produzido pela digestão de 04/06/2018, pág. 94/244

79/127 ou fermentação anaeróbica de materiais biodegradáveis, tais como biomassa, esterco, silagem ou esgoto, resíduos municipais e culturas energéticas. Este tipo de biogas é constituído principalmente por metano e dióxido de carbono. O gas metano pode ser combustado ou oxidado com oxigênio. O ar contém 21% de oxigênio. Esta liberação de energia permite que o biogas seja usado como um combustível. O biogas pode ser usado como um combustível de baixo custo em qualquer país para qualquer finalidade de aquecimento, tal como para cozinhar. Ele pode também ser utilizado em instalações modernas de gerenciamento de resíduos onde ele pode ser usado para fazer funcionar qualquer tipo de motor de combustão, para gerar ou energia mecânica ou elétrica.

A primeira etapa na produção de biogas microbiano consiste na degradação enzimática de polímeros e de substratos complexos (de carboidratos distintos do amido, por exemplo). Consequentemente, a invenção propõe um método para a preparação de biogas em que um substrato que compreende carboidrato não-amido é colocado em contato com um polipeptídeo ou composição da invenção, para produzir material fermentável que possa ser convertido em um biogas por um organismo tal como um microorganismo. Em tal método, um polipeptídeo da invenção pode ser provido por meio de um organismo, de um microorganismo que expressa tal polipeptídeo, por exemplo.

Uso de enzimas em produtos alimentícios.

Os polipeptídeos e composições da invenção podem ser usados em um método de processamento de material vegetal para degradar ou modificar os constituintes celulose ou hemicelulose ou substância péctica das paredes celulares do de 04/06/2018, pág. 95/244

80/127 material vegetal ou fúngico. Tais métodos podem ser úteis na preparação de produtos alimentícios. Consequentemente, a invenção propõe um método para a preparação de um produto alimentício, compreendendo tal método a incorporação de um polipeptideo ou composição da invenção durante a preparação do produto alimentício.

A invenção também propõe um método de processamento de um material vegetal, compreendendo tal método a colocação do material vegetal em contato com um polipeptideo ou composição da invenção para degradar ou modificar a celulose no material (vegetal). É preferível que o material vegetal seja uma polpa vegetal ou extrato de planta, tal como os seus sucos.

A presente invenção também propõe um método para a redução da viscosidade, transparência e/ou filtrabilidade de um extrato vegetal, compreendendo tal método a colocação do extrato vegetal em contato com um polipeptideo ou composição da invenção numa quantidade eficaz para degradar celulose ou hemicelulose ou substâncias pécticas contidas no extrato vegetal.

Os materiais vegetais e que contêm celulose/hemicelulose/substância péctica incluem polpa vegetal, partes de plantas e extratos vegetais. Dentro do contexto da invenção um extrato de um material vegetal é qualquer substância que pode ser derivada do material vegetal por extração (mecânica e/ou química), processamento ou por outras técnicas de separação. O extrato pode ser suco, néctar, base ou concentrados preparados a partir destes. O material vegetal pode compreender ou ser derivado de verduras, tais como cenouras, salsão, cebolas, plantas de 04/06/2018, pág. 96/244

81/127 de vagens ou plantas leguminosas (soja, feijão de soja, ervilhas) ou frutas, tais como pomos ou nozesf (maçãs, peras, marmelo etc.), uvas, tomates, cítricas (laranja, limão, lima tangerina), melões, ameixas, cerejas, groselha preta, groselha vermelha, framboesas, morangos, oxicoco, abacaxi e outras frutas tropicais, árvores e partes delas (tal como, pólen de pinheiros, por exemplo), ou cereais (aveia, cevada, trigo, milho, arroz). O material (a ser hidrolisado) pode também consistir em resíduos agrícolas, tais como polpa de beterraba açucareira, sabugos de milho, palha de trigo, cascas de nozes (trituradas) ou materiais recicláveis, tal como papel (de resíduos), por exemplo.

Os polipeptideos da invenção podem, portanto, ser usados para tratar material vegetal incluindo polpa vegetal e extratos vegetais. Eles podem também ser usados para tratar alimentos líquidos ou sólidos e ingredientes alimentícios comestíveis ou podem ser usados na extração de café, óleos vegetais, amido ou como um espessante em alimentos.

Tipicamente os polipeptideos da invenção são usados como uma composição/preparado enzimático conforme foi descrito acima. A composição geralmente será acrescentada à polpa vegetal que pode ser obtida por processamento mecânico, por exemplo, tal como trituração ou moagem de material vegetal. A incubação da composição com a planta tipicamente será conduzida durante um período que vai de 10 minutos a 5 horas, tal como de 30 minutos a 2 horas, de preferência durante aproximadamente 1 hora. A temperatura de processamento varia, de preferência, de aproximadamente 10°C a aproximadamente 55°C, tal como de aproximadamente de 04/06/2018, pág. 97/244

82/127

15°C a aproximadamente 25°C, sendo ótimo aproximadamente 2 0°C, e pode se usar de aproximadamente 10 g a aproximadamente 300 g, de preferência de aproximadamente 30 g a aproximadamente 70 g, sendo ótimo a aproximadamente 50 g de enzima por tonelada de material a ser tratado.

Todas as enzimas ou suas composições usadas podem ser acrescentadas em sequência ou simultaneamente à polpa vegetal. Dependendo da composição do preparado enzimático, o material vegetal pode ser primeiro macerado (tal como até reduzido a uma pasta, por exemplo) ou liquefeito. Usando-se

os polipeptídeos da	invenção podem	ser	melhorados	os
parâmetros tais como	o rendimento	da	extremidade,	a
viscosidade do extrato	e/ou a qualidade	do	extrato.
Alternativamente,	ou em adição	ao acima,	um

polipeptídeo da invenção pode ser acrescentado ao suco bruto obtido da prensagem ou liquefação da polpa vegetal. O tratamento do suco bruto será conduzido de um modo análogo ao da polpa vegetal no tocante à dosagem temperatura e tempo de duração. Novamente podem ser incluídas outras enzimas, tais como aquelas discutidas anteriormente. As condições de incubação típicas são as descritas no parágrafo anterior.

Quando o suco bruto tiver sido incubado com os polipeptídeos da invenção, o suco é então centrifugado ou (ultra)filtrado para produzir o produto final.

Depois do tratamento com o polipeptídeo da invenção o produto (final) pode ser tratado termicamente, tal como a aproximadamente 100°C, por exemplo, durante um período de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 1 hora, em condições tais que inativem parcial ou completamente o(s) de 04/06/2018, pág. 98/244

83/127 polipeptídeo(s) da invenção.

Uma composição que contém um polipeptídeo da invenção pode também ser usada durante a preparação de purês de fruta ou de vegetais.

O polipeptídeo da invenção pode também ser usado na fabricação de cerveja, de vinho, na destilação ou em padaria. Ele pode, portanto, ser usado na preparação de bebidas alcoólicas tais como vinho e cerveja. Ele pode melhorar a filtrabilidade ou a transparência de cervejas, por exemplo, de mosto (contendo malte de cevada e/ou de sorgo, por exemplo) ou do vinho.

Além disso, um polipeptídeo ou composição da invenção pode ser usado para o tratamento dos grãos usados dos fabricantes de cerveja, isto é, resíduos da produção do mosto da cerveja contendo cevada ou cevada maltada ou outros cereais, de modo a melhorar a utilização dos resíduos, tal como, para ração animal.

O polipeptídeo pode auxiliar na remoção de

substâncias orgânicas dissolvidas do	caldo ou	do meio de
cultura, nos	casos em que os resíduos de	destilarias
provenientes	de origem	orgânica	são	convertidos
biologicamente	em biomassa	microbiana	0 polipeptídeo da
invenção pode	melhorar a	filtrabilidade e/ou	reduzir a
viscosidade em	xaropes de	glicose tal	como os	procedentes
de cereais produzidos por	liquefação	(com α-amilase, por
exemplo).

Na indústria de padaria, o polipeptídeo pode melhora a estrutura da massa, modificar a sua pegajosidade ou flexibilidade, melhorar o volume do pão e/ou a estrutura de migalhas ou conferir características texturais melhores, de 04/06/2018, pág. 99/244

84/127 tais como a qualidade de quebra, trituração ou formação de migalhas.

A presente invenção se refere, portanto, a métodos para a preparação de uma massa para pão ou de um produto alimentício à base de cereais compreendendo a incorporação à massa de pão de um polipeptídeo ou composição da presente invenção. Isto pode melhorar uma ou mais propriedades da massa ou do produto alimentício à base de cereal obtido da massa em relação a uma massa para pão ou a um produto alimentício a base de cereal ao qual não tenha sido incorporado o polipeptídeo.

A preparação do produto alimentício à base de cereal de acordo com a invenção pode ainda compreender etapas conhecidas na técnica tais como as de ferver, secar, fritar, tratar com vapor ou assar a massa obtida.

Os produtos que são fabricados a partir de uma massa que é fervida são, por exemplo, massas, bolinhos fervidos, produtos que são fabricados de massa frita são, por exemplo, rosquinhas, bolinhos fritos, massas fritas, produtos que são fabricados com massa cozida no vapor são, por exemplo, bolinhos e massas cozidas no vapor, exemplos de produtos que são fabricados de massa seca são massas e macarrões secos e exemplos de produtos fabricados de massa assas sãop pão, biscoitos, bolo.

O termo propriedade melhorada é definido no presente documento como qualquer propriedade de uma massa e/ou um produto obtido da massa, especialmente um produto alimentício à base de cereal que é melhorado pela ação do polipeptídeo de acordo com a invenção em relação à massa ou ao produto ao qual o polipeptídeo de acordo com a invenção de 04/06/2018, pág. 100/244

85/127 não tenha sido incorporado. A propriedade melhorada pode incluir, mas sem limitação, uma resistência maior da massa, uma maior elasticidade da massa, uma estabilidade aumentada da massa, uma melhor capacidade de ser manipulada por maquinas da massa, uma resistência a prova melhorada da massa, uma pegajosidade reduzida da massa, uma extensibilidade melhorada a massa, um maior volume do produto alimentício à base de cereal, menos formação de bolhas do produto alimentício à base de cereal, uma estrutura de migalhas melhorada do produto asado, uma maciez melhorada do produto alimentício à base de cereal, um sabor melhorado do produto alimentício à base de cereal, uma melhor resistência a mofo do produto alimentício à base de cereal. Propriedades melhoradas em relação ao tipo de massa e macarrão dos produtos à base de cereais são, por exemplo, uma maior firmeza, uma menor pegajosidade, uma coesão melhorada e menos perdas devidas ao ato de cozinhar.

A propriedade melhorada pode ser determinada comparando-se uma massa e/ou um produto alimentício à base de cereal com ou sem a adição de um polipeptídeo da presente invenção. As qualidades organolépticas podem ser avaliadas usando-se procedimentos bem estaelecidos na indústria de padaria e podem inclui, , por exemplo, o uso de um painel de provadores de sabor treinados.

O termo massa de pão conforme definido no presente documento consiste em uma mistura de farinha de cereal e outros ingredientes que seja firme suficientemente para ser sovada ou estendida. Exemplos de cereais são trigo, centeio, milho, milho, cevada, arroz, granulado de cereais, trigo sarraceno e aveia. O termo trigo, aqui e a seguir, se de 04/06/2018, pág. 101/244

86/127 destina a abranger todas as espécies do gênero Triticum, o aestivum, durum e/ou spelta, por exemplo. Exemplos de outros ingredientes adequados são: o polipeptídeo de acordo com a presente invenção, enzimas adicionais, aditivos químicos e/ou auxiliares de processamento. A massa pode ser fresca, congelada, pré-aparada, ou pré-cozida. A preparação de uma massa de pão a partir dos ingredientes descritos acima é bem conhecida na técnica e compreende a mistura dos ingredientes e adjuvantes de processo e uma ou mais etapas de moldagem e opcionalmente de fermentação. A preparação de massa de pão congelada é descrita por Kulp e Lorenz em Frozen and Refrigerated Doughts and Batters.

O termo produto alimentício à base de cereal é definido no presente documento como qualquer produto preparado a partir de massa de pão ou de caráter macio ou crocante. Exemplos de produtos alimentícios à base de cereal, tanto brancos, como de cor clara ou escura, que possam ser produzidos com vantagem pela presente invenção são pão (especialmente branco, de trigo integral ou pão de centeio), tipicamente na forma de broas ou broinhas, pão do tipo bisnaga, massa, macarrão, rosquinhas, roscas, bolo, pão sírio, tortillas, tacos, bolos, panquecas, biscoitos, cookies, crosta para torta, pão cozido no vapor e pão crocante e semelhantes.

O termo produto assado é definido no presente documento como qualquer produto alimentício à base de cereal preparado assando-se a massa.

Os polissacarídeos não-amido (NSP) podem aumentar a viscosidade do material sendo digerido, o que pode, por sua vez, reduzir a disponibilidade de nutrientes e o desempenho de 04/06/2018, pág. 102/244

87/127 dos animais. 0 uso do polipeptideo da presente invenção pode melhorar a utilização do fósforo assim como os cátions minerais e do polipeptideo durante a digestão do animal.

Acrescentando-se nutrientes específicos à ração melhora a digestão do animal e reduz, portanto, os custos com a ração. Uma grande quantidade de aditivos de rações está agora sendo usada e novos programas estão sendo continuamente desenvolvidos. O uso de enzimas especificas, tais como enzimas que degradam carboidratos não-amido poderiam decompor a fibra liberando a energia, aumentando também a digestibilidade do polipeptideo devido à melhor acessibilidade do polipeptideo quando a fibra é decomposta. Deste modo, poderiam ser reduzidos os custos com a ração, podendo também ser reduzidos os níveis de polipeptideo na ração.

Os polissacarídeos não-amido (NSPs ) estão também presente praticamente em todos os ingredientes de rações de origem vegetal. Os NSPs são precariamente utilizados e podem, quando solubilizados, exercer efeitos adversos sobre a digestão. As enzimas podem contribuir para uma melhor utilização destes NSPs e reduzir, consequentemente, qualquer efeito anti-nutricional. As enzimas que degradam os carboidratos não-amido da presente invenção podem ser usadas para este fim em dietas à base de cereais para aves e, até um ponto menor, para porcos e outras espécies.

Um polipeptídeo/enzima que degrada carboidratos não amido da presente invenção (de uma composição que compreende o polipeptídeo/enzima da invenção) pode ser usado na indústria de detergentes, para a remoção da roupa de nódoas à base de carboidrato, por exemplo. Uma de 04/06/2018, pág. 103/244

88/127 composição detergente pode compreender um polipeptídeo/enzima da invenção e, além disso, uma ou mais de uma celulase, uma hemicelulase, uma pectinase, uma protease, uma lipase, uma cutinase, uma amilase ou uma carboidase.

uso de enzimas em composições detergentes

Uma composição detergente que compreende um polipeptídeo ou composição da presente invenção pode estar em qualquer forma conveniente, uma pasta, um gel, um pó ou um líquido, por exemplo. Um detergente líquido pode ser aquoso contendo tipicamente até aproximadamente 70% de água e de aproximadamente 0 a aproximadamente 30% de solvente orgânico ou de um material não aquoso.

Tal composição detergente pode ser formulada, por exemplo, em forma de uma composição detergente para lavagem de roupa à mão ou à máquina incluindo uma composição aditiva de lavagem de roupa adequada para o tratamento prévio de tecidos manchados e uma composição acrescentada de enxágue de amaciante de tecido, ou então pode ser formulada em forma de uma composição detergente para uso doméstico em operações de limpeza de superfícies duras, ou pode ser formulada para operações de lavagem de louça à mão ou à máquina.

Em geral, as propriedades da enzima devem ser compatíveis com o detergente selecionado (pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e/ou não enzimáticos, por exemplo, etc.) e a(s) enzima(s) devem estar presentes em uma quantidade efetiva.

Uma composição detergente pode compreender um tensoativo, um tensoativo aniônico ou não iônico, um agente de 04/06/2018, pág. 104/244

89/127 de carga ou de complexação de detergente, um ou mais polímeros, um sistema de alvejamento (uma fonte de H2O2, por exemplo), ou um estabilizador de enzima. Uma composição detergente pode também compreender qualquer outro ingrediente detergente convencional, tal como, por exemplo, um condicionador, incluindo uma argila, um intensificador de espuma, um supressor de espuma, um agente anticorrosão, um agente de suspensão de sujeira, um agente contra a redeposição de sujeira, um corante, um bactericida, um abrilhantador ótico, um hidrotropo, um inibidor de encardido ou um perfume.

Uso de enzimas no processamento de papel e de polpa Um polipeptídeo ou composição da presente invenção pode ser usado na indústria de papel e polpa, dentre outros 15 no processo de alvejamento para aumentar o brilho de polpas alvejadas podendo assim ser reduzida a quantidade de cloro usada nos estágios de alvejamento, e para aumentar a liberdade de polpas no processo de papel reciclado (Eriksson, K. E. L, Wood Science and Technology 24 (1990) :79-101; Paice, et al., Biotechnol. and Bioeng. 32 (1988):235-239 e Pommier et al., Tappi Journal (1989):187191) . Além disso, um polipeptídeo ou composição da invenção pode ser usado para o tratamento de polpa lignocelulósica de modo a melhorar a sua capacidade de alvejamento. Assim pode ser reduzida a quantidade de cloro necessária para se obter um alvejamento satisfatório da polpa.

Um polipeptídeo ou composição da invenção pode ser usado em um método de redução da taxa à qual os tecidos contendo celulose se tornam ásperos ou para reduzir o caráter áspero dos tecidos que contêm celulose,

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90/127 compreendendo o método o tratamento dos tecidos contendo celulose com um polipeptídeo ou composição conforme descrito acima. A presente invenção se refere ainda a um método para proporcionar uma clarificação de tecidos coloridos contendo celulose, compreendendo o método o tratamento de tecidos coloridos contendo celulose com um polipeptídeo ou composição conforme descrito acima, e um método de se proporcionar uma variação localizada na cor de tecidos coloridos contendo celulose, compreendendo o método o tratamento de tecidos coloridos contendo celulose com um polipeptídeo ou composição conforme descrito acima. Os métodos da invenção podem ser conduzidos tratando-se os tecidos contendo celulose durante a lavagem. No entanto, se for desejado o tratamento dos tecidos pode também ser conduzido durante o molho ou o enxágue ou simplesmente pela adição do polipeptídeo ou da composição conforme descrito acima à água em que os tecidos estão imersos ou serão imersos.

Outros usos da enzima

Além disso, o polipeptídeo ou composição da presente invenção pode também ser usado em uma formulação antibacteriana assim como em produtos farmacêuticos tais como pastilhas para a garganta, pastas dentais e enxaguantes bucais.

Os exemplos abaixo ilustram a invenção:

EXEMPLOS

Materiais e Métodos Gerais

Cepas

Cepas de Talaromyces emersonii da presente invenção são derivados de ATCC16479 que era anteriormente denominado de 04/06/2018, pág. 106/244

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Penicillium geosmithia emersonii. Outras denominações de ATCC 16479 de T. emersonii são CBS393.64, IFO31232 eIMI116815.

Procedimentos de DNA.

Foram conduzidos procedimentos de DNA padrão conforme já descrito em outros documentos (Sambrook et al., 1989,

Molecular cloning: a laboratory manual 2a. Ed., Cold Spring Harbor laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova York) a não ser que seja declarado em contrário. 0 DNA foi amplificado usando-se uma enzima de verificação Phusion polymerase (Finnzymes). As enzimas de restrição eram provenientes de Invitrogen ou de New England Biolabs

Meios e soluções:

Batata dextrose agar, PDA (Fluka,	Cat. No. 70139)
Extrato de batata	4 g/L
Dextrose	20 g/L
Bacto agar	15 g/L
PH	5,4
Água	Ajuste até	um litro
Esterilização	20 minutos	a 120°C

Meio agar de Talaromyces

Fração de sal no. 3	15g
Celulose (3%)	30 g
Bacto peptona	7,5 g
Farinha de grãos	15 g
KH2PO4	5 g
CaCl2.2aq	1 g
Bacto agar	20 g
PH	6, 0
Água	Ajuste até um

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Esterilização	20 minutos a 120°C
Composição da fração de sal

A fração de sal era conforme a divulgação de WO98/37179, Tabela 1. Desvios da composição desta tabela

eram CaCl2.2aq 1,0 g/L, KC1 1,8 g/L,	ácido cítrico laq 0,45
5 g/L (agente quelante)
Meios nos frascos de agitação
Meio 1 de Talaromyces
Glicose	20 g/L
Extrato de levedura (Difco)	20 g/L
Clerol FBA3107 (AF)	4 gotas/L
PH	6, 0
Esterilização	20 minutos a 120°C
Meio 2 de Talaromyces
Fração de sal	15 g
Celulose	30 g
Bacto peptona	7,5 g
Farinha de grãos	15 g
KH2PO4	10 g
CaCl2.2H2O	0,5 g
Clerol FBA3107 (AF)	0,4 mL
PH	5
Água	Ajustar até um litro
Esterilização	20 minutos a 120°C
Meio 3 de Talaromyces
Fração de sal	15 g
Glicose	50 g
Bacto peptona	7,5 g
KH2PO4	10 g
CaCl2.2H2O	0,5 g

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Clerol FBA3107 (AF)

PH

Água

Esterilização

Ajuste até um litro minutos a 120°C

Preparação da batelada de esporos

As cepas foram cultivadas a partir de matéria prima em meio de agar de Talaromyces em placas Petri de 10 cm de diâmetro durante 5-7 dias a 40°C. O material das cepas foi armazenado a -80°C em glicerol a 10%.

Protocolo de cultura em frascos de agitação

Os esporos foram diretamente inoculados em frascos de agitação de500 mL contendo 100 mL ou de meio 1 ou 2 de Talaromyces e incubados a 45°C a 2150 rpm em um agitador incubador durante 3-4 dias.

Preparação de amostra

Para as culturas em frascos de agitação 3 mL de caldo de cultura foram transferidos a um tubo descartável de 12 mL e centrifugados durante 10 minutos a 5300 rotações. Pelo menos 1 mL de sobrenadante foi coletado.

Análise de proteína

As amostras de proteína foram separadas em condições de redução em NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen, Breda, Países Baixos) e tingidas conforme indicado. Os géis foram tingidos ou com InstantBlue (Expedeon, Cambridge, Reino Unido), ou com SimplyBlue safestain (Invitrogen, Breda, Países Baixos) ou com SyproRuby (Invitrogen, Breda, Países Baixos)) de acordo com as instruções do fabricante.

Para a análise por Western blot, as proteínas foram transferidas para nitrocelulose. O filtro de nitrocelulose foi bloqueado com TBST (solução salina tamponada com Tris de 04/06/2018, pág. 109/244

94/127 contendo 0,1% de Tween 40) contendo 3% de leite desnatado e foi incubado durante 16 horas com anticorpo anti-FLAG M2 (Sigma, Zwijndrecht, Países Baixos). As manchas foram lavadas duas vezes com TBST durante 10 minutos e tingidas com peroxidase de rábano conjugada a anticorpo antimurino de coelho (DAKO, Glostrup, Dinamarca) durante 1 hora. Depois de se ter lavado as manchas cinco vezes com TBST durante 10 minutos, as proteínas foram visualizadas usandose SuperSignal (Pierce, Rockford, U.S.A).

Ensaios com Celulase

1. Ensaio com Palha de trigo (ensaio WSU)

Preparação de substrato de palha de trigo lavado previamente tratado

O substrato de palha de trigo lavado foi homogeneizado usando-se um agitador ultra-turrax, lavado, liofilizado e triturado antes da análise.

Medição da atividade de celulase em WSU/mL

A atividade de celulase foi medida de acordo com a invenção em termos de Unidades de Palha de Trigo (WSU) por mililitro em um ensaio de Palha de Trigo (ensaio de WSU) . O substrato de palha de trigo lavado foi agitado em ultra-turrax, lavado, liofilizado e triturado antes da análise.

400 pL de sobrenadantes coletados de experimentos em frascos agitados foram diluídos 16 vezes. Amostras de 200 pL em duplicata foram transferidas para dois frascos adequados: um frasco contendo 700 pL a 3% (peso/peso) de material seco do substrato de palha de trigo lavado previamente tratado e 100 pL de tampão de citrato a 250 mM, tamponado a um pH 4,5. O outro frasco consistia em um de 04/06/2018, pág. 110/244

95/127 controle, em que 700 mol de material seco a 3% (peso/peso) de substrato de palha de trigo lavado previamente tratado, foram substituídos por 700 pL de água, com 100 pL de tampão de citrato a 250 mM, tamponado a pH 4,5. As amostras do ensaio são incubadas durante 20 e/ou 60 horas a 65°C. Depois da incubação das amostras de ensaio, é acrescentado um volume fixo de D2O contendo um padrão interno, ácido maleico. A quantidade de açúcar liberado é baseada no sinal entre 5,25-5,20 ppm, em relação ao sulfonato de dimetilsila-pentano, determinado por meio de RMN ^-H 1D operando a uma frequência protônica de 500 MHz, usando um programa de pulsos com supressão de água, a uma temperatura de 27°C. A solução de enzima celulase pode conter açúcares residuais. Portanto, os resultados dos ensaios são corrigidos para o teor em açúcar da solução enzimática.

2. Atividade de endoglucanases (WBCU)

A endoglucanase catalisa a hidrólise da carboximetil celulose. A quantidade de açúcares redutores formados durante a reação enzimática foi determinada com reagente de ácido dinitro-salicílico. As amostras foram incubadas na presença de 18 g/L de solução de carboximetil celulose (Novacel, ref. 394) em tampão de acetato pH 4,60 a 37°C. A incubação foi interrompida depois de 60 minutos acrescentando-se uma solução de hidróxido de sódio. As amostras foram fervidas durante 5 minutos na presença de reagente ácido dinitro-salicílico (Acros 15644500). Depois de se diluir com água, a intensidade da cor foi medida a 540 nm. A metodologia foi usada como um método relativo. Os resultados foram relacionados à composição de celulase com uma atividade oficialmente atribuída. A atividade foi de 04/06/2018, pág. 111/244

96/127 expressa em unidades WBCU. A unidade WBCU é definida como a quantidade de celulase que hidrolisa em uma hora um número de ligações glicosídicas equivalente à produção de 0,5 mg de glicose nas condições do ensaio. A atividade foi calculada usando-se protocolos de cálculo padrão conhecidos na técnica, lançando-se em gráfico delta DO540 pela atividade de amostras com uma atividade conhecida, calculando-se em seguida a atividade das amostras desconhecidas usando-se a equação geradas a partir da linha de calibração.

EXEMPLO 1

TRANSFORMAÇÃO DE Talaromyces emersonii COM PLASMÍDEOS CONTENDO MARCADORES DE RESISTÊNCIA A FLEOMICINA.

Esta amostra descreve um método para transformar T. emersonii com o plasmídeo pAN8-l portando um marcador de resistência a fleomicina (Mattern, I.E., Punt, P.J., Van den Hondel, C.A.M.J.J.,1988. A vetor de Aspergillus transformation conferring phleomycin resistance. Fungai Genet.. Newsl. 35, 25).

Transformação de T. emersonii com pAN8-l

Os esporos foram cultivados durante 16 horas a 45°C em um agitador rotativo a 250 rpm em meio YGG (por litro: 8 g de KC1, 16 g de glicose.H2O, 20 mL de extrato de levedura a 10%, 10 mL de 100 x pen/estrep, 6,66 g de YNB + aminoácidos, 1,5 g de ácido cítrico e 6 g de K2HPO4) . O micélio foi coletado usando-se filtro Miracloth (Calbiochem, Nottingham, Reino Unido). Para a formação de protoplastos, por 2 g de micélio 10 mL de tampão STC (por litro: 218 g de Sorbitol (1,2M), 7,35 g de CaCl2.2H2O, 10 mM de Tris/HCl pH 7,5) e foi acrescentado 1 mL de solução de 04/06/2018, pág. 112/244 §Ί/ΥλΊ de glucanex (250 mg/mL mg/mL de Glucanex 200G (Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca) em H2O) . A mistura foi incubada em um agitador rotativo a 100 rpm a 34 °C durante 90-150 minutos. Os protoplastos foram separados do micélio usando-se um filtro Miracloth e acrescentou-se STC até um volume final de 45 mL. A suspensão de protoplastos foi centrifugada durante 5 minutos a 1560 rotações a 4°C e foi ressuspensa em tampão STC a uma concentração del08 protoplastos/mL. Para a transformação foram acrescentados 200 pL de suspensão de protoplastos a 10 pg de DNA de pAN8-l e tampão TE (10 mM de Tris-HCl pH 7,5, EDTA a 0,1 mM) el8 pL de ácido aurintricarboxilico a 0,4 M. Subsequentemente, foram acrescentados 100 pL de uma solução de PEG (20% de PEG 4000 (Merck, Nottingham, Reino Unido) em STC), e depois de incubação da suspensão de DNA-protoplastos durante 10 minutos à temperatura ambiente, acrescentou-se lentamente

1,5 mL de solução de PEG (PEG 4000 a 60% (Merck) em STC), com uma mistura repetida dos tubos. Depois de uma incubação durante 15 minutos a 25°C, diluíram-se as suspensões com 2 mL de STC e misturou-se por inversão. Aproximadamente 200 a 600 pL de suspensão de protoplastos foi acrescentada a 5 ml de agar macio (o meio de regeneração contendo 6 g/L de agar, sem seleção) e dispôs-se diretamente em placas em

placas	petri de 10	cm	com 2 0 mL	de	meio	de	Regeneração
25 contendo 10 pg/mL	de	fleomicina.	0	meio	de	Regeneração
contém	por litro: 6	g	de NaN03, 0,	52	g de	KC1	, 1,52 g de

KH2PO4, 1,12 mL de KOH a 4 M, 0,52 g de MgS0₄.7H₂O, 22 mg de ZnS0₄.7H2O, 11 mg de H3BO3, 5 mg de FeS0₄.7H2O, 1,7 mg de C0CI2.6H2O, 1,6 mg de CuS0₄.5H2O, 5 mg de MnCl2.4H2O, 1,5 mg de Na2Mo0₄.2H2O, 50 mg de EDTA, 10 mL de 100 x pen/estrep

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98/127 (Gibco) , 2,5 g de glicose, 2,5 g de extrato de levedura, 341 g de sacarose, e 20 g de agar (em sobreposição 6 g/L).

Depois da incubação durante 4-6 dias a 40°C, os conidiosporos dos transformantes foram transferidos para placas que consistiam em PDA suplementado com 10 pg/mL de fleomicina e incubou-se durante 2 dias a 40°C.

Análise por PCR de transformantes no micélio fúngico

Os transformantes foram incubados sobre placas de agar contendo dextrose de batata durante dois dias a 40°C. Aproximadamente um terço de uma colônia foi incubado durante 1 hora a 25 pL de tampão de KC (60 g/L de KC1, 2 g/L de ácido cítrico, pH 6,2), suplementado com 5 mg/mL de Glucanex 200G (Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca). Subsequentemente, foram acrescentados 75 pL de tampão de diluição de DNA (10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, 10 mM de NaCl, pH 7,5). As amostras foram incubadas durante 5 minutos a 98°C e, subsequentemente, diluídas com 100 pL de H2O. Uma alíquota de 5 pL da mistura foi usada como gabarito para PCR.

Os iniciadores foram sintetizados por Invitrogen (Breda, Países Baixos). Foram usados os seguintes iniciadores de PCR para amplificar um fragmento de gene de β-lactamase de pAN8-l de 278 nucleotídeos:

Amp-For (SEQ ID NO: 1): TATGCAGTGCTGCCATAACCAT; e

Amp-Rev (SEQ ID NO: 2): GCAGAAGTGGTCCTGCAACTTT

As condições de PCR para as reações: 50 pL de mistura de reação com 5 pL de DNA gabarito, 2 0 pmol de cada iniciador, 0,2 mM de dNTPs, 1 x tampão de 1 x Phusion HF e 1U de Phusion DNA-polimerase, de acordo com o Manual Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes, Espoo, de 04/06/2018, pág. 114/244

99/127

Finlândia), 30 s de desnaturação a 98°C, amplificação em 30

ciclos (10 s a	98°C,	10 s a	60°C,	15 s a 72°C),	e uma
incubação final	de 10 minutos a	72°C.
Os resultados	do gel	de	agarose	gel	estão
apresentados na	Figura	1. Uma	faixa	específica	de	PCR de

278 nucleotídeos foi observada em transformantes, mas não na cepa vazia, indicando que os transformantes continham o gene de ampicilina do vetor pAN8-. Assim, T. emersonii é transformado com sucesso com o vetor pAN8-l.

Para se determinar se pAN8-l está integrado ao genoma foi conduzido um Southern blot. DNA cromossomal foi isolado dos transformantes usando-se o kit de Puregene Yeast and Bactéria Kit (Gentra Systems Inc., Mineapolis, USA). Os transformantes foram cultivados durante 16 horas em 10 ml de meio YGG a 45°C e o micélio foi usado para o isolamento do DNA cromossomal. A lise do micélio (~50 mg de peso fresco) foi efetuada acrescentando-se 250 pL de tampão Cell Suspension Buffer (Puregene kit, Gentra Systems, Mineapolis, USA) e 50 pL de Glucanex 200G (Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca, 100 mg/mL em tampão de KCl-citrato pH 6,2) . O micélio ressuspenso foi incubado a 37°C durante 1 hora. Subsequentemente, foi conduzida uma etapa de centrifugação (1 minuto a 15.700 rotações) e a pelota formada foi ressuspensa em 600 pL de Solução de Lise Celular e foram acrescentados 3 pL de solução de Proteinase K (20 mg/ml, Invitrogen, Breda, Países Baixos), incubandose em seguida a 55°C durante 1 hora. As etapas subsequentes que incluíram o Tratamento de RNAse, a Precipitação de Proteína, a Precipitação de DNA e a Hidratação de DNA foram conduzidas de acordo com o protocolo do fornecedor para de 04/06/2018, pág. 115/244

100/127 bactérias Gram positivas.

DNA Cromossomal foi digerido com MluI e submetido a eletroforese em um gel de agarose a 0,7% (w/v) agarose gel. DNA foi transferido para Hybond N+ (GE Healthcare, Eindhoven, Países baixos) por blotting a vácuo. Os blots foram subsequentemente previamente hibridizados durante aproximadamente 1 hora a 42 °C em tampão de hibridização ECL Gold (GE Healthcare, Eindhoven, Países Baixos) e hibridizados de um dia para o outro a 42°C com uma sonda rotulada representando o gene de resistência a ampicilina presente em pAN8-l. A sonda foi obtida por PCR usando-se o iniciador Amp-For (SEQ ID NO: 1) e o Amp-Rev (SEQ ID NO: 2) e pAN8-l como gabarito. As condições de PCR para a reação: 30 s de desnaturação a 98°C, amplificação em 30 ciclos (10 s a 98°C, 10 s a 60°C, 20 s a 72°C), e uma incubação final de 5 minutos a 7 2°C. A sonda foi rotulada de acordo com o método ECL (GE Healthcare, Eindhoven, Países Baixos). Depois da hibridização, os blots foram lavados e tratados com reagente de detecção de acordo com o método ECL (GE Healthcare, Eindhoven, Países Baixos). O sinal foi detectado usando-se o aparelho Biorad ChemiDoc XRS de acordo com as instruções do fornecedor.

O resultado do Southern blot está apresentado na Figura 2. Nas pistas 2 e 3, duas concentrações do plasmídeo pAN8-l foram carregadas no gel, que foram detectadas como bandas de 6,1 kpb no Southern blot. A banda de 6,1 kpb não foi observada em transformantes de T. emersonii em pAN8-l (pistas 4 e 5) , mas, em vez disso, a sonda de β-lactamase hibridizou com fragmentos de DNA cromossomal de diferentes comprimentos, indicando que o plasmídeo está integrado ao de 04/06/2018, pág. 116/244

101/127 genoma.

A estabilidade do fenótipo transformado foi verificada purificando-se os transformantes de pAN8-l sobre placas contendo agar e dextrose de batata sem seleção de fleomicina. Colônias individuais foram subsequentemente purificadas em placas contendo agar de dextrose de bata com seleção de fleomicina. Dos 20 transformantes testados, todos pareciam ser resistentes a fleomicina. Portanto, o vetor pAN8-l está estavelmente integrado ao genoma de T. emersonii.

Este experimento claramente demonstrou que T. emersonii pode ser transformado com um plasmídeo, que é estavelmente integrado ao genoma de T. emersonii.

EXEMPLO 2

TRANSFORMAÇÃO DE Talaromyces emersonii COM PLASMÍDEOS QUE CODIFICAM AS CELULASES DE Talaromyces emersonii

Este exemplo descreve a clonagem e a expressão de proteína CEB de β-glucanase de T. emersonii identificada com FLAG em T. emersonii.

Clonagem do plasmídeo de expressão de I. emersonii pGBFINEBA7 que codifica a proteína CEB de β-glucanase de I.

emersonii identificada com FLAG.

O gene que codifica a proteína CEB de β-glucanase de T. emersonii e um identificador FLAG de terminal C foi sintetizado por DNA2.0 (Menlo Park, USA) e clonado como fragmento Pacl/Ascl em pGBFIN-5, sendo este plasmídeo descrito em WO 9932617. O vetor de expressão pGBFIN5 compreende o promotor de glicoamilase, o sítio de clonagem, a região terminadora, um marcador amdS ligado operacionalmente ao promotor de gpd, e flancos 3' e 3 de de 04/06/2018, pág. 117/244

102/127 glaA. As sequências de aminoácidos e de nucleotídeos da proteína CEB de β-glucanase de T. emersonii identificada com FLAG são representadas respectivamente por SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4. A Figura 3 representa um mapa de pGBFINEBA7 contendo proteína CEB de β-glucanase de T. emersonii sob o controle do promotor de glicoamilase no interior do vetor pGBFIN-5.

Transformação de T. emersonii com pGBFINEBA7 A transformação de T. emersonii foi conduzida de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 1, exceto que T. emersonii foi co-transformado com 2 pg de pAN8-l e 10 pg de DNA de pGBFINEBA7. Os co-transformantes foram identificados por análise por PCR. A presença do plasmídeo pAN8-l foi determinada usando-se o iniciador Amp-For (SEQ ID NO: 1) e

Amp-Rev (SEQ ID NO: 2). Os iniciadores abaixo foram usados para amplificar a sequência de codificação de CEB de βglucanase de T. emersonii:

EBA7-For (SEQ ID NO: 5) :

CAGCTTAATTAACACCGTCAAAATGGACCGTATAC; e

EBA7-Rev (SEQ ID NO: 6) :

GGCGCGCCTTTACTTGTCATCATCATCCTTGTAGTCTGACTGGAAGGTGCTGCCAATG.

Foram usadas as condições de PCR conforme descrito no Exemplo 1.

Fermentações de T. emersonii em frascos de agitação

Os transformantes foram cultivados em frascos de agitação usando meio 1 de Talaromyces e meio 2 de Talaromyces, e as amostras foram tomadas depois de 72 horas. As proteínas em 65 pL de sobrenadante foram precipitadas acrescentando-se 228 pL de TCA-acetona (1,2 g de ácido triclórico, 9 mL de acetona, 1 mL de H2O. Depois

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103/127 da precipitação durante 2 horas a -20°C, as amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm a 4°C durante 10 minutos em uma centrífuga eppendorf e os grânulos foram lavados com acetona. Os grânulos secos foram dissolvidos em 1 x tampão de amostras (25 pL de tampão de amostra LDS (Invitrogen, Breda, Países Baixos), 10 pL de agente redutor (Invitrogen, Breda, Países Baixos) , 65 pL de H2O) .

Análise de Proteína

As amostras de proteína foram separadas em condições redutoras em NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen, Breda, Países Baixos). Os géis foram incubados com InstantBlue (Expedeon, Cambridge, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante ou usados para Western blotting usando-se um anticorpo específico a FLAG.

Os resultados fingimento com InstantBlue do gel de proteína e de Western blotting estão ilustrados nas Figuras 4A e 4B, respectivamente. O gel tingido com InstantBlue apresentou uma banda específica EBA7-FLAG tendo aproximadamente 58 kDa em sobrenadante dos transformantes de pGBFINEBA7 cultivados no meio 1 de Talaromyces (pistas 1 e 2) . A banda de EBA7-FLAG não pode ser observada em sobrenadantes de transformantes cultivados em meio 2 de

Talaromyces devido ao fundo de alto teor protéico das proteínas que são induzidas na celulose (pistas 5 e 6). No entanto, no Western blot pudemos observar uma faixa específica de proteína EBA7-FLAG nos sobrenadante de transformantes de pGBFINEBA7 cultivados em cada um dos meios, indicando que a proteína de EBA7-FLAG é produzida em meio à base de glicose e de celulose. Como não pudemos detecta nenhum sinal de FLAG no Western blot nos de 04/06/2018, pág. 119/244

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sobrenadantes	da	cepa	vazia	(pistas 6	e 7, 13 e 14 na
Figura 4B) ,	a	proteína	expressa	é uma	proteína
recombinante.
Determinação	do	número	de cópias	de pGBFINEBA7 em

transformantes de T, emersonii

Dois transformantes foram testados para a expressão de EBA7-FLAG, transformante 1#6 e 1#14, e mais produto foi observado no transformante 1#6 (compare a pista 1 com a pista 2 na Figura 4A; compare a pista 2+3 e a pista 4+5 na

Figura 4B) . Para se testas se a diferença do nível de expressão é devida a diferenças em número de cópias, o DNA cromossomal foi isolado e usado para uma reação de PCR. O

DNA cromossomal foi isolado do micélio cultivado durante 24 horas a 45°C em um agitador rotativo a 250 rpm em meio YGG usando-se o kit FastDNA Spin Kit (MP Biomedicals, Solon USA) de acordo com o manual do fornecedor. Aproximadamente 100 ng de DNA foram usados como gabarito para PCR. Parte do cassete de expressão foi amplificada usando-se o iniciador EBA7-For (SEQ ID NO: 5) e o iniciador EBA7-Rev (SEQ ID NO:

6). Os iniciadores de actina foram usados como um controle para a quantidade de DNA que foi usada para as reações de PCR. Foram usados os seguintes iniciadores para amplificar parte do gene de actina de T. emersonii'.

Actina-For (SEQ ID NO: 8): CCACCTTCAACTCCATCATGAAG; e

Actina-Rev (SEQ ID NO: 9) : TTAGAAGCACTTGCGGTGGA. A mistura de PCR era igual à descrita no EXEMPLO 1 e foram usadas as seguintes condições de PCR: 30 s de desnaturação a 98°C, amplificação em 20 ciclos (10 s a 98°C, 15 s a

60°C, 30 s a 72°C), e uma incubação final de 5 minutos a

72°C.

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Conforme mostrado na Figura 4C, o transformante 1#6 (pista 1) mostrou um sinal de PCR de cassete de expressão mais forte em comparação com o transformante 1#14 (pista 2) que está de acordo com a diferença no nível de expressão. O resultado indica que o transformante 1#6 contém múltiplas cópias de pGBFINEBA7.

Portanto, uma proteína recombinante foi expressa com sucesso em T. emersonii. Além disso, é possível se gerar transformantes com múltiplas cópias do gene de interesse.

EXEMPLO 3

MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DE CELULASE DE SOBRENADANTES ISOLADOS DE Talaromyces emersonii TRANSFORMADA COM pGBFINEBA7

Este exemplo descreve a medição da atividade de endoglucanase em sobrenadantes de T. emersonii transformada com pGBFINEBA7 (veja EXEMPLO 2 para a descrição do transformante). A atividade foi medida usando-se carboximetil celulose como substrato e detectando-se os açúcares redutores usando-se ® do ácido dinitrosalicílico.

Os transformantes de T. emersonii contendo pGBFINEBA7 (veja EXEMPLO 2) foram usados para inocular 100 mL de meio 1 de tlmme incubados a 45°C a 250 rpm em um agitador incubador durante 3 dias. Os sobrenadantes foram coletados e usadso para medir a atividade de endoglucanase. Os resultadso dos testes no ensaio da atividade de endoglucanase são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1. Resultadso da mediçõa da atividade de endoglucanase em sobrenadantes de uma cepa vasia e de um trnasformante de T. emersonii.

Cepa

Atividade de endoglucanase

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106/127

	(WBCU/mL)
pGBFINEBA7 1#6	321
Cepa vazia	<1-

Os transformantes de T. emersonii que expressam a endoglucanase recombinante de T. emersonii apresentaram pelo menos 32 vezes mais atividade de endoglucanase em comparação da cepa do tipo selvage.

Este experimento demonstrou claramente que a endoglucanase recombinante de T. emersonii expressa em T. emersonii é ativa. Portanto, as enzimas podem ser expressas em T. emersonii.

EXEMPLO 4

COMPARAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO ACIONADA PELO PROMOTOR

DE GLICOAMILASE E O PROMOTOR DE 3-FOSFATO DE ALDEÍDO GLICÉRICO DESIDROGENASE EM Talaromyces emersonii

Este exemplo descreve a clonagem e a expressão de proteína CEB de beta-glucanase de T. emersonii identificada com FLAG em T. emersonii sob o controle do promotor 3fosfato de aldeído glicérico desidrogenase (gpd). A expressão é comparada com a expressão de pGBFINEBA7.

Clonagem de plasmídeo de expressão pGBFI N-Pgpd-EBA7 de T. emersonii codificando a proteína CEB de beta20 glucanase de T. emersonii identificada com FLAG acionada pelo promotor de gpd

O gene que consistia no promotor de gpd e a região de codificação da proteína CEB de beta-glucanase de T. emersonii e um identificador FLAG de terminal C foi sintetizado por DNA2.0 (Menlo Park, USA) e clonado por meio de uma ligação de 3 pontos como fragmentos Xhol/HindIII, HindIII/Ascí em pGBFIN38, sendo o plasmídeo descrito em

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107/127

W02008053018. O vetor de expressão pGBFIN38 compreende o promotor de gpd, o sítio de clonagem, a região terminadora, um marcador amdS ligado operacionalmente ao promotor de gpd, e flancos 3' e 3 de glaA. As sequências de nucleotídeos do promotor de gpd e da sequência Kozak é representada por SEQ ID NO: 7. As sequências de aminoácidos e de nucleotídeos da proteína CEB de beta-glucanase de T. emersonii são representadas por SEQ ID NO: 3 e por SEQ ID NO: 4, respectivamente. A Figura 5 representa um mapa de pGBFIN-Pgpd-EBA7 contendo a proteína CEB de beta-glucanase de T. emersonii sob o controle do promotor de gpd no interior do vetor pGBFIN-38.

Transformação de T. emersonii com pGBFIN-Pgpd-EBA7 A transformação de T. emersonii com pGBFIN-Pgpd-EBA7 foi conduzida conforme descrito no EXEMPLO 2.

Fermentações de T. emersonii em frascos de agitação

Foram usados transformantes de T. emersonii contendo ou pGBFINEBA7 (transformante 1#6, veja EXEMPLO 2) ou pGBFIN-Pgpd-EBA7 para as fermentações em frascos de agitação. As fermentações em frascos de agitação e a análise da expressão de proteína por análise por Western blot usando um anticorpo específico a FLAG foram conduzidas conforme descrito no EXEMPLO 2.

Os resultados do Western blot são apresentados na Figura 6. Diversas diluições dos sobrenadantes foram separadas sobre gel para se poder comparar a expressão entre transformantes. Os sobrenadantes (diluição a 1:100) de culturas de transformante 1#6 de 3 dias em que EBA7 é acionado pelo promotor de glaA mostrou uma banda de EBA7FLAG forte(sobre-exposta) (pistas 9 e 15). O sobrenadante de 04/06/2018, pág. 123/244

108/127 banda tinha uma sobrenadante do per revelou que de 3 dias indiluído de tres transformantes em que EBA7 é acionado pelo promotor de gpd (pistas 5, 8 e 14) apresentou uma banda no Western blot, mas a intensidade menor comparada com o transformante 1#6 diluído 100 vezes. Nenhuma expressão de EBA7-FLAG foi observada nos sobrenadantes de uma cepa vazia (pistas 1, 10 e 11) . A estimativa do número de cópias por transformante 8#18 contém a menor quantidade de cópias ao passo que os transformantes 8#32 10 contém a maior quantidade de cópias (Figura 4C, pistas 46) , o que está correlacionado com a expressão de EBA7-FLAG observada no Western blot (Figura 6, compare as pistas 4, 7 e 13) . Como o número de cópias do transformante pGBFINEBA7 1#6 é comparável ao do transformante pGBFIN-Pgpd-EBA7 8#14 15 (compare pista 1 com a pista 4 na Figura 4C) , enquanto a expressão de EBA7-FLAG nos sobrenadantes do transformante 1#6 é muito maior em comparação com a expressão no transformante 8#14, o promotor de glaA é mais forte do que o promotor de gpd.

Ensaio de atividade de endoglucanase (WBCU)

Amostras do experimento com frascos de agitação foram também analisadas para a atividade de endoglucanase. O mesmo método foi conduzido conforme descrito no EXEMPLO 3.

Os resultados dos testes no ensaio de atividade de endoglucanase são mostrados na Tabela 2.

Tabela 2. Resultados da medição da atividade de endoglucanase em sobrenadantes de uma cepa vazia e de transformantes de T. emersonii

Cepa

Atividade (WBCU/mL)

de

endoglucanase

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109/127

pGBFINEBA7 1#6	321
pGBFIN-Pgpd-EBA7 8#14	<10
pGBFIN-Pgpd-EBA7 8#18	<10
pGBFIN-Pgpd-EBA7 8#32	<10
Cepa vazia	<10

A atividade de endoglucanase em sobrenadantes de transformantes de pGBFIN-Pgpd-EBA7 não foi aumentada acima do fundo do ensaio (<10 WBCU/mL) , ao passo que a atividade de endoglucanase em sobrenadantes de transformantes de pGBFINEBA7 1#6 foi pelo menos 32 vezes mais elevada em comparação com a cepa do tipo selvagem (321 WBCU/mL).

EXEMPLO 5

SOBRE-EXPRESSÃO DE MÚLTIPLAS CELULASES DE Talaromyces emersonii EM Talaromyces emersonii

Este exemplo descreve a clonagem e a expressão de celobiohidrolases-I (CBHI) de T. emersonii, de celobiohidrolase-II (CBHII) de T. emersonii, beta-glucanase (EG) CEA de T. emersonii e β-glicosidase (BG) de T. emersonii em T. emersonii. Além disso, a atividade de celulase de transformantes é comparada com a atividade de celulase de uma cepa vazia depois de se ter cultivado as cepas sobre glicose.

Clonagem de genes de T. emersonii em vetores de expressão

Os genes que codificam cobiohidrolases-I (CBHI) de T.

emersonii, beta-glucanase (EG) CEA de T. emersonii, e βglicosidase (BG) de T. emersonii foram sintetizados por DNA2.0 (Menlo Park, USA) e clonados em forma de fragmento EcoRI/SnaBI no vetor pGBTOPl2, compreendendo o promotor de glicoamilase e sequência terminadora, resultando no vetor

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110/127 pGBTOPEBA205, pGBTOPEBA8 e pGBTOPEBA4, respectivamente. Para fins de clonagem, 198 nucleotídeos da parte 3' do promotor de glicoamilase foi também sintetizado juntamente com os genes. As sequências de aminoácidos da celobiohidrolase-1 (CBHI) de T. emersonii, beta-glucanase CEA (EG) de T. emersonii, e β-glicosidase (BG) de T. emersonii são representadas por SEQ ID NO: 10, 12, e 14, respectivamente. As sequências de DNA dos genes são representadas por SEQ ID NO: 11, 13 e 15, respectivamente. A Figura 7 representa um mapa de um pGBTOPEBA205 contendo a proteína de CBHI de T. emersonii sob o controle do promotor de promotor de glaA no interior do vetor pGBTOPl2. pGBTOPEBA205 é representativo de pGBTOPEBA8, que compreende EG de T. emersonii, e pGBTOPEBA4, que compreende BG de T.

emersonii.

O gene que codifica celobiohidrolase-II (CBHII) de T. emersonii, foi obtido de uma biblioteca de DNAc de T. emersonii descrita na patente WO/2001/070998. A Figura 8 representa um mapa de pGBFINEBAl76 contendo a proteína de CBHII de T. emersonii sob o controle do promotor de glaA no interior do vetor pGBFINll. A sequência de aminoácidos e a sequência de nucleotídeos são representadas por SEQ ID NO: 16 e 17, respectivamente.

Transformação de T. emersonii com construções que codificam celulases

A t rans f ormanoõm, de T. emersonii com construções que codificam celulases foi conduzida conforme descrito no

EXEMPLO 1. Ao todo, foram usados 10 pg de DNA para cotransformar T. emersonii: 1 pg de pAN8-l e 2 pg de cada um dos vetores pGBTOPEBA4, pGBTOPEBA8, pGBTOPEBA205 e de 04/06/2018, pág. 126/244

111/127 pGBFINEBAl76.

Testes para a obtenção de transformantes que expressam todas as 4 celulases

Os transformantes foram tirados das placas e cultivados ainda mais em placas de microtitulação (MTPs) de 96 poços contendo meio de Talaromyces em agar durante 5 dias a 40°C. As placas foram replicadas usando-se um replicador de 96 pinos em MTPs de 96 poços contendo meio PDA. As placas MTP foram incubadas durante 3 dias a 40°C e usadas para coletar esporos para análise de frascos de agitação. Para tal fim, 100 pL de meio 1 de Talaromyces foram acrescentados a cada poço e depois de se ter ressuspenso a mistura, 30 pL de suspensão de esporos foram usados para inocular 17 0 pL de meio 1 de Talaromyces em placas MTP. As placas de 96 poços foram incubadas em agitadores de umidade (Infors) a 44°C a 550 rpm, e 80% de umidade durante 96 horas. Foram usadas placas de imersão para empurrar o micélio para baixo, e subsequentemente foram coletados aproximadamente 100 pL de sobrenadante por poço.

Aproximadamente 10 pL de sobrenadante foram analisados para a expressão de proteína usando-se o sistema de eletroforese de proteína E-PAGE 96 (Invitrogen, Breda, Países Baixos). Os géis foram tingidos com proteína SimplyBlue e foram selecionados os transformantes que expressavam múltiplas celulases. Esporos de transformantes interessantes foram coletados das placas MTP mestras e usados para preparações de bateladas de esporos.

Fermentações de T. emersonii em frascos de agitação e análise de amostras de 04/06/2018, pág. 127/244

112/127

Transformantes de T. emersonii que expressavam uma ou mais celulases foram usados para fermentações em frascos de agitação em meio 2 de Talaromyces contendo 5% de glicose. A análise de expressão de proteína por análise SDS-PAGE foi conduzida conforme descrito no EXEMPLO 2. As proteínas foram visualizadas usando-se tingimento da proteína com SYPRO Ruby.

Os resultados do SDS-PAGE sobre gel tingido com SYPRO Ruby está apresentado na Figura 9A. Os diferentes transformantes expressavam diferentes combinações e níveis de expressão de celulases. O sobrenadante do transformante 20 (cepa 20) continha todas as 4 celulases, ao passo que, por outro lado, nenhuma proteína de celulase foi observada na cepa vazia (FBG142) . No entanto, uma multiplicidade de celulases pôde ser simultaneamente sobre-expressa em T. emersonii na presença de glicose.

Para se testar a atividade de celulase em transformantes de T. emersonii que expressam uma ou mais celulases, mediu-se a atividade WSU em sobrenadantes de uma cepa vazia e dos transformantes. Os resultados do ensaio WSU são mostrados na Figura 9B. Nos sobrenadantes coletados depois de 72 horas de culturas da cepa vazia cultivada em meio contendo glicose não pode ser medida nenhuma atividade WSU. Por outro lado, nos transformantes pode ser observada uma faixa de atividades.

O transformante 20, que expressou todas as 4 celulases, mostrou a atividade máxima: quase 6 WSU/mL, ou 5 WSU/mL ou mais. Os transformantes 20 e 28 tinham uma atividade de 4 WSU/mL ou mais, os transformantes 20, 28, 6, 64, 33, 11 e 48 tinham uma atividade de 3 WSU/mL ou mais, de 04/06/2018, pág. 128/244

113/127 os transformantes 20, 28, 6, 64, 33, 11, 48, 36, 35 e 1 tinham uma atividade de 2,5 WSU/mL ou mais, e os transformantes 20, 28, 6, 64, 33, 11, 48, 36, 35, 1, 43, 53 e 7 tinham uma atividade de 2 WSU/mL ou mais. Todos os demais transformantes tinham uma atividade muito abaixo de

1,5 WSU/mL.

Para se testar se o transformante 20 também produzia atividade de celulase na ausência de um indutor, foi conduzida uma fermentação em frascos de agitação usando-se o meio 3 de Talaromyces. Os sobrenadantes foram coletados nos dias 3, 4 e 5 e foram analisados para atividade WSU. Os resultados do ensaio WSU são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3. Resultados de medição de atividade WSU em sobrenadantes de uma cepa vazia e transformante 20 de T.

emersonii em meio 3 de Talaromyces

	Atividade	de celulase (WSU/mL)
Cepa	Dia 3	Dia 4	Dia 5
Transformante	20	6,1	7,7	8,1
(múltiplas	celulases
recombinantes)
Cepa vazia	0,0	0,4	0,9

Nenhuma atividade de celulase foi observada nos caldos do dia 3 de uma cepa vazia, embora alguma atividade tenha sido observada em pontos posteriores no tempo. Por outro lado o transformante que sobre-expressava celulases múltiplas sob o controle do promotor de glaA mostrou atividade WSU no dia 3 (6,1 WSU/mL) e a atividade aumento ainda mais com o decorrer do tempo.

Este experimento dá fortes indicações de que os transformantes de T. emersonii que compreendem múltiplas (4

Petição 870180047364, de 04/06/2018, pág. 129/244

114/127 neste exemplo, por exemplo) celulases sob o controle do promotor de glaA são capazes de produzir atividade de celulase em glicose contendo meio com ou sem celulose. O transformante pode ser obtido testando-se uma combinação de transformantes que tenham sido transformados com construções de 4 celulases.

EXEMPLO 6

SEGUNDA TRANSFORMAÇÃO DE TRANSFORMANTES Talaromyces emersonii

SOBRE-EXPRESSÃO DE MÚLTIPLAS CELULASES EM Talaromyces emersonii

Este exemplo descreve a segunda transformação do transformante EBAT147-1 com (hemi)celulases e como segundo marcador de seleção higromicina B. É descrita a clonagem da proteína desconhecida de T. emersonii, de swolenina de T. emersonii, de acetil xilano esterase de T. emersonii e de xilanase de T. emersonii, e a transformação do transformante EBAT147-1 de T. emersonii com celobiohidrolase-II (CBHII) de T. emersonii, beta-glucanase CEA (EG) de T. emersonii, β-glicosidase (BG) de T. emersonii, proteína desconhecida de T. emersonii, swolenina de T. emersonii, acetil xilano esterase de T. emersonii e com xilanase de T. emersonii.

Clonagem de (hemi)celulases de T. emersonii em vetores de expressão

Os genes que codificam a proteína desconhecida de T. emersonii e a swolenina de T. emersonii, foram sintetizados por DNA2.0 (Menlo Park, USA) e clonados em forma de fragmento EcoRI/SnaBI no vetor pGBTOPl2, compreendendo o promotor de glicoamilase e a sequência terminadora, de 04/06/2018, pág. 130/244

115/127 resultando no vetor pGBTOPEBA224, e no vetor pGBTOPEBA225, respectivamente. Para fins de clonagem, 198 nucleotídeos da parte 3' do promotor de glicoamilase foi também sintetizado com os genes. As sequências de aminoácidos da proteína desconhecida de T. emersonii e de swolenina de T. emersonii são representadas por SEQ ID NO: 18 e 20, respectivamente. As sequências de DNA dos genes são representadas por SEQ ID NO: 19 e 21 , respectivamente. pGBTOPEBA2 05 (Fig. 7) é representativo de pGBTOPEBA224, que compreende a proteína desconhecida de T. emersonii, e de pGBTOPEBA225, que compreende a swolenina de T. emersonii.

Os genes que codificam acetil xilano esterase (ACE) de T. emersonii e a xilanase de T. emersonii foram obtidos da biblioteca de DNAc de T. emersonii descrita na patente WO/2001/070998. pGBFINEBAl76 (Figura 8) é representativo de pGBFINEBAl93, que compreende ACE de T. emersonii e pGBFINEBAl79 que compreende xilanase de T. emersonii. As sequências de aminoácidos de ACE de T. emersonii e de xilanase de T. emersonii são representadas por SEQ ID NO: 22 e 24, respectivamente. As sequências de DNA dos genes são representadas por SEQ ID NO: 23 e 25, respectivamente.

Transformação de T. emersonii com construções que codificam (hemi)celulases

A transformação de T. emersonii com construções que codificam celulases foi conduzida conforme descrito no

EXEMPLO 5, exceto que em vez de pAN8-l, portando o marcador de seleção fleomicina, foi usado pAN7 portando o marcador de seleção higromicina B (Punt PJ, Oliver RP, Dingemanse MA, Pouwels PH, van den Hondel CA. 1987. Transformation of Aspergillus based on the hygromycin B resistance marker de 04/06/2018, pág. 131/244

116/127 from Escherichia coli. Gene. 1987; 56(1 ): 117-24. Ao todo, 19 pg de DNA foram usados para co-transformar T. emersonii: 1 pg de pAN7-l, 1 pg de cada um dos vetores pGBTOPEBA4, pGBTOPEBA8, e pGBFINEBAl76, e 2,5 pg de cada um dos vetores pGBTOPEBA205, pGBTOPEBA224, pGBTOPEBA225, pGBFINEBAl79 e PGBFINEBA193.

Testes para a obtenção de transformantes com uma atividade de celulase melhorada.

Os transformantes foram coletados das placas e ainda mais analisados, conforme descrito no EXEMPLO 5. Com bases nos resultados de SDS-PAGE e WSU, o transformante mais interessante, EBAT147-2, foi selecionado para a prpp da batelada de esporos e foi testado em uma fermentação de batelada de 10 litros (veja EXEMPLO 7).

Métodos dos exemplos 7 e 8

Ensaios de medição de proteína

1. Proteína total

O método foi uma combinação de precipitação de proteína usando ácido tricloracético (TCA) para remover substâncias perturbadoras e para permitir a determinação da concentração de proteína com a reação colorimétrica de Biuret. Na reação de Biuret, um íon de cobre (II) é reduzido a cobre (I) que forma um complexo com os átomos de nitrogênio e de carbono das ligações peptídicas em uma solução alcalina. Uma cor violeta indica a presença de proteína. A intensidade da cor, e, portanto, a absorção a 546 nm, é diretamente proporcional à concentração de proteína, de acordo com a lei de Beer-Lambert. A padronização foi conduzida usando-se BSA (Albumina sérica bovina) e o teor de proteína foi expresso em g de proteína de 04/06/2018, pág. 132/244

117/127 como equivalente de BSA/L ou mg de proteína como equivalente de BSA/mL. O teor de proteína foi calculado usando-se protocolos de cálculos padrão conhecidos na técnica, lançando-se em gráfico DO546 pela concentração de amostras com concentração conhecida, calculando-se a seguir a concentração das amostras desconhecidas usando-se a equação gerada a partir da linha de calibração.

2. Proteínas individuais usando-se análise proteômica

APEX

Materiais

O sistema LC-MS/MS consistia em um Accela e um LTQVelos de Thermo Fisher (San Jose, CA, USA) . As colunas foram adquiridas de Agilent: coluna C18 Zorbax 2,1 mm x 5 mm com partículas de 1,8 pm. Um Biofuse fresco de centrífuga Heraeus foi usado para a centrifugação de tubos eppendorf, foi usado Beckman Coulter Allegra X-15R para a centrifugação de tubos Greiner. Um termomisturador comfort de Eppendorf (Hamburg, Alemanha) foi usado para as incubações e tubos Lo-bind de Eppendorf foram usados para todos os experimentos. As buscas nas bases de dados foram conduzidas usando-se o Sorcerer 2 (SageN, San Diego, CA, USA) , motor de busca operando a Trans-Proteomics Pipeline (TPP) .

Os resultados da identificação foram processados usando-se software Absolute Protein Expression (APEX) http://pfgrc.j cvi.org/index.php/bioinformatics/apex.html, freeware para se obter quantidades de proteína.

Os tampões de LC-MS de categoria A e B, ácido fórmico a 0,1% (FA) em água e FA a 0,1% em acetonitrila respectivamente foram adquiridos de Biosolve (Valkenswaard, de 04/06/2018, pág. 133/244

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Países Baixos). Albumina sérica bovina (BSA), uréia, Iodo Acetamida (IAA) e o ácido tricloracético (TCA), solução a 6,1 N, foram adquiridos de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). A solução de TCA foi diluída 4,5 vezes para se obter uma solução de TCA a 20%. O ditiotreitol (DTT) foi adquirido de Roche Applied Science (Indianapolis IN, USA) . O ácido fórmico (FA) foi adquirido de JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA) . A tripsina de uma categoria para sequenciamento foi adquirida de Roche Applied Science (Penzberg, Alemanha).

Precipitação por TCA e digestão termomisturador.

As amostras foram cuidadosamente descongeladas e armazenadas em gelo tanto quanto possível durante a preparação das amostras. As amostras foram diluídas até uma concentração de proteínas de 5 mg/mL.

Uma amostra de cem pL e 50 pL de BSA a 0,1 mg/mL foram diluídas a 1:1 com 20% de TCA. As amostras foram incubadas a 4°C durante 30 minutos e as proteínas foram reduzidas a grânulos por centrifugação durante 10 minutos a 13000 rpm a 4°C. O sobrenadante foi removido e os grânulos foram lavados com 200 pL de acetona a -20°C. Novamente as proteínas foram granuladas por centrifugação 10 minutos a 13000 rpm a 4°C e o sobrenadante foi removido.

Os grânulos lavados foram dissolvidos em 75 pL de uréia a 8M. Esta solução foi diluída com 392,5 pL de NH4HCO3 a 100 mM. Cinco pL de DTT a 500 mM foram acrescentados e as amostras foram incubadas à temperatura ambiente dur30 minutos com agitação máxima em um As cisteínas foram alquiladas acrescentando-se 13,5 de IAA a 550 mM e por incubação à de 04/06/2018, pág. 134/244

119/127 temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação máxima em um termomisturador no escuro. A digestão foi conduzida acrescentando-se 20 pL de tripsina a 250 pg/mL a pH 3, e por incubação a 37°C de um dia para o outro com agitação máxima no termomisturador. Outros 5 pL de tripsina a 250 pg/mL a pH 3 foram acrescentados e a digestão foi continuada durante 3 horas a 37 °C para garantir que a operação tinha sido completada.

As amostras foram analisadas no sistema Accela LTQVelos (Thermo Electron).

- Coluna: coluna Agilent C18 de partículas de 1,8 pm

Gradiente de 80 minutos de 5-40% de AcN Ácido Fórmico a 0,1%

- 2 minutos 40-60% de AcN ácido fórmico a 0,1%

- Fluxo de 400 pL/minuto

- Volume de injeção: 20 pL

- Tempo de operação total incluindo injeção, lavagem da coluna e reequilíbrio 85 minutos.

- método MS: MS intensificado de 10a. ordem de dupla passada m/z 300-2000 e MS/MS nos 10 picos superiores

- A rejeição do estado de carga permitindo somente íons 2+ e 3+

- Exclusão dinâmica: repetição 1, duração de exclusão 10 segundos

Análise de dados usando Sorcerer e Spotfire

Fez-se a busca dos dados comparando com a base de dados de Talaromyces emersonii (TEMER) que foi manualmente editada para conter as sequências de padrão interno BSA. A busca na base de dados foi conduzida no Sorcerer 2, usandose TAMPÃO. A análise estatística dos dados foi conduzida de 04/06/2018, pág. 135/244

120/127 usando-se ferramentas estatísticas padrão.

Ensaio de Papel de Filtro (ensaio FPU2%)

A atividade de celulase foi medida em termos de unidades de filtro de papel (FPU) por mililitro no ensaio de Unidade de Papel de Filtro (ensaio FPU) da solução enzimática original (indiluída). O método foi modificado a partir do procedimento analítico de Adney e Baker (1996, Moa Laboratory Analytical Procedures-006 intitulado: Medição de atividades de celulase por Adney e Baker (1996) www.nrel.gov/biomass/analytical_procedures.html) para ser mais sensível do que o método padrão que é baseado nas diretrizes da União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC). Para os resultados quantitativos, as composições enzimáticas foram comparadas com base nas conversões significativas e iguais. 0 valor de 1,0 mg de açúcar redutor como glicose a partir de 50 mg de papel de filtro (conversão de 2% em vez do padrão internacional de 4%) em 60 minutos foi designado como o ponto de interseção para as unidades de filtro de papel para o cálculo (FPU) por IUCA. Neste procedimento, o rendimento de açúcar redutor não é uma função linear da quantidade da enzima na mistura de ensaio, não se espera que duas vezes a quantidade de enzima produza o dobro da quantidade de açúcar redutor em tempo igual. 0 procedimento do ensaio, portanto, envolvia se descobrir uma diluição do material enzimático original tal, que uma alíquota de 0,5 mL da diluição catalisasse 2% de conversão em 60 minutos, calculando-se então a atividade (em FPU2prcc/mL) do material original a partir da diluição exigida

FPU foi calculada usando-se a seguinte fórmula:

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Atividade do papel de filtro = 0,37/ ([Enzima]liberando 1,0 mg de glicose)[Unidades/mL] [Enzima] representa a proporção da solução de enzima original presente na diluição da enzima diretamente testada.

Fermentação em bateladas

Procedimento de inoculação:

conteúdo de um frasco foi acrescentado a um meio de pré-cultura: frasco de agitação de 2 litros com chicana [20 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de glicose, pH 6,8 (com KOH), 300 mL de meio, esterilizado a vapor de água durante 20 minutos a 121°C]. A pré-cultura foi conduzida durante 214-48 horas a 48°C e 200 rpm. O tempo de ser adaptado à configuração de frascos de agitação e a viabilidade dos frascos.

Procedimento de fermentação principal:

O meio foi composto por uma mistura de farinha de grãos (3%), celulose (6%) uma fonte de nitrogênio (2,5%; exemplos de fontes de nitrogênio conhecidas na técnica incluem farinha de soja, extrato de levedura, licor de infusão de milho, amônia, sais de amônio, sais nitrato), assim como uma fração de sal. A fração de sal era de acordo com WO98/37179, Tabela 1, p. 12. Desvios desta tabela foram: CaCl2.2aq a 1,0 g/L, KC1 1,8 g/L ácido cítrico, laq 0,45 g/L (agente quelante) . O meio foi esterilizado com vapor de água em uma fração. Os biorreatores foram inoculados com uma proporção de inóculo de ~10% e o volume operacional era de 10 L. O pH do processo foi controlado entre 5,0-3,0 (usando-se ácido fosfórico e amônia), sendo a temperatura de 42-52°C.

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O fluxo de ar foi mantido entre 0,5 e 1,5 vvm (volume de ar por volume de caldo por minuto) e o DOT acima de 30% da saturação com oxigênio depois da inoculação visando a agitação. Clerol foi usado como anti-espumante de um modo periódico: durante 2 segundos a cada 30 minutos para as primeiras 24 horas, em seguida durante 2 segundos a cada hora.

No fim da fase de pré-cultura as amostras forma tomadas para se verifica a contaminação, a determinação de glicose e a medição do pH. Durante a principal fermentação, as amostras foram tiradas a cada 24 horas e a seguinte análise foi conduzida: controle de contaminação, medição de pH, géis de SDS-PAGE, determinação da concentração de proteína total (método Biuret de TCA) e atividade da Unidade de Filtro de Papel (FPU2%/mL) , conforme foi descrito acima

EXEMPLO 7

FERMENTAÇÃO DO TRANSFORMANTE DE Talaromyces emersonii

QUE SOBRE-EXPRESSAVA CELULASES MÚLTIPLAS

Este exemplo descreve a fermentação de transformantes de T. emersonii.

Dois transformantes primários descritos no EXEMPLO 5, transformante 20 (EBAT142-10 e transformante 64 (EBAT147-1) e um transformante secundário do EXEMPLO 6, EBAT147-2 foram testados em um fermentador de produção de 10 litros em forma de fermentação em bateladas em condições que induziam a celulases. Como controles foram testadas as cepas vazias

FBG-142 e FBG-147.

No fim da fermentação, TCA-Biuret e atividade de celulase (FPU) foram determinadas (Tabela 4).

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Tabela 4. Resultados de TCA-biuret e a medição da atividade de FPU dos sobrenadantes de transformantes de T.

emersonii e de cepas de células hospedeiras vazias cultivadas em um fermentador de produção de 10 litros.

Cepa	Tempo (h)	Proteína de TCA Biuret (mg/mL)	FPU2%/mL	atividade específica da mistura (FPU/MG)
FBG-142	97	16, 4		15, 8	0,96
EBAT142-1	93	15, 7		20,9	1,33
FBG-147	95	17,4		17,3	0,99
EBAT147-1	93	19,1		21,6	1,13
EBAT147-2	93	19, 9		25	1,26

Os resultados claramente demonstraram que os transformantes de T. emersonii apresentavam uma atividade de celulase aumentada em comparação com as cepas vazias hospedeiras. O transformante EBAT142-1, que expressa todas as quatro celulases (cepa20 na Figura 9) , apresentou uma melhora de 1,32 vezes em atividade de celulase em comparação com a hospedeira FBG-142 vazia. O transformante EBAT147-1 que expressou tres celulases (cepa 64 na Figura

9) mostrou um aumento de 1,25 vezes em atividade de celulase em comparação com a hospedeira FBG147 vazia. O transformante secundário, EBAT147-2 em que os níveis de CBHI e de BG foram ainda mais aumentados em comparação com a cepa hospedeira EBAT147-1 e no qual a acetil xilano esterase estava sobre-expressa (veja EXEMPLO 8) apresentou um aumento ainda maior em atividade de celulase: EBAT147-2 produziu 1,16 vezes mais atividade de celulase em comparação com a cepa genitora EBAT147-1 e um aumento de

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1,44 vezes em comparação com a cepa hospedeira FBG-147 vazia.

Além disso, a atividade de celulase por mg de proteína foi aumentada em transformantes em comparação com a cepa hospedeira vazia. Na cepa hospedeira vazia foi observado < 1 FPU/mg de proteína, ao passo que os transformantes primários todos apresentavam >1,1 FPU/mg de proteína. 0 trmmsecundário ΕΒΑΊΊ47-2 também apresentou um aumento adicional de 1,11 veze na atividade de celulase por mg de proteína em comparação com o transformante primário EBAT147-1. Resumindo, os resultados sugerem que a fração de celulases no sobrenadante de transformantes foi aumentado.

O experimento tem uma forte indicação de que é possível se aumentar a atividade de celulase além da produção da celulase endógena por T. emersonii pela sobreexpressão de celulases de T. emersonii. Além disso, uma segunda transformação de um transformante melhorado mostrou um aumento adicional em atividade de celulase.

EXEMPLO 8

ANÁLISE PROTEÔMICA DE TRANSFORMANTES DE Talaromyces emersonii QUE EXPRESSAVAM MÚLTIPLAS CELULASES

Este exemplo descreve a caracterização do transformante primário EBAT147-1 e o transformante secundário EBAT147'2 para níveis aumentados de celulases sobre-expressas, conforme determinada por análise proteômica.

Os sobrenadantes de fermentações em bateladas de 10 litros de FBG-147 e dos transformantes EBAT147-1 e EBAT1472 (veja o EXEMPLO 7) foram analisados usando-se análise proteômica APEX. As quantidades relativas de celulases, de 04/06/2018, pág. 140/244

125/127 hemicelulases e proteínas acessórias são mostradas na

Tabela 5.

Tabela 5. Comparação dos níveis relativos de celulase (APEX) da cepa FBG-147 de T. emersonii e do transformante primário EBAT147-1 e do transformante secundário EBAT147-2. Expressos em % de proteína total conforme determinado por

APEX

Enzima/Proteína	FBG-147	EBAT147-1	EBAT147-2
CBH I	8,9±0,4	12,5±l,0*	16,3±4,7*
CBH II	7,3±1,2	8,5±2,0	7,7±3,2
EG	l,5±0,7	1,4±0,7	1,0±0,6
EG/CEA	3,9±0,9	5,6±0,8*	5,0±0,9*
EG/CEB	2,l±0,9	2,1±1,1	2,l±0,1
BG	0,9±0,1	l,5±0,0*	2,4±0,3=|=
Xilanase	3,5±0,l	3,2±0,5	2,7±0,5
Acetil xilano esterase	11,1±3,7	5,3±3,2	12,6±4,3f
EG/Família 61	8,6±1,5	9,5±6,5	8,1±1,9
Proteína semelhante a swolenina	1,4±0,4	1,0±0,4	l,0±0,2
Proteína desconhecida	3,4±1,5	3,3±1,3	3,9±0,8
Total Ib	36±1	40±6,7	48±1,8*
Total IIC	51±3	54±3,8	63±5,7*
Protease	l,8±0,3	1,1±1,7	n. d
Quitinase	0,4±0,2	0,3±0,4	0,l±0,1

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FPU₂%/mL

17,3

21, ^a Sobrenadantes de fermentações em bateladas Eschweiler de 10 litros de aproximadamente 95 horas foram submetidos a análise APEX. Todos os valores são expressos em porcentagens das proteínas detectadas. Os valores marcados com um asterisco indicam níveis que varia estatisticamente de modo significativo entre FBG-147 e as cepas descendentes (valor p b 0,05 no teste T de Student, de dois lados, variância desigual). Os valores assinalados com um =|= indicam níveis que se alteram estatisticamente de modo significativo entre EBAT147-1 e a cepa descendente (valor p b 0,05 no teste T de Student, de dois lados, variância desigual) . Os níveis de TEC em forma de FPU2%/mL das fermentações de bateladas é mostrado embaixo.

^b O teor de celulase total (conforme determinado por

APEX, expresso em forma de % de proteína detectada por análise de proteômica de APEX) , a soma de CBH I, CBH II, EG, EG/CEA, EG/CEG, BG, EG/família 61 (conforme descrito no pedido de patente européia EP 10167771.4), proteína semelhante a swolenina (conforme descrita no pedido de patente européia EP10167764.2) relacionadas na Tabela 5.

^c O teor total de celulases e xilanases (conforme determinado por APEX, expresso em % da proteína detectada por análise proteômica APEX): Total de celulase (% de proteína detectada por análise proteômica APEX) conforme definida acima em ^b + xilanase + acetil xilano esterase, relacionada na Tabela 5.

Os resultados mostram claramente que 3 celulases foram significativamente sobre-expressas no transformante EBAT147-1 em comparação com FBG-147: CBH I expressa a

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127/127 partir do plasmídeo pGBTOPEBA205 e BG expressa a partir do plasmídeo pGBTOPEBA4 foram ainda mais aumentadas em comparação com o transformante primário EBAT147-1, e, além disso, acetil xilano esterase expressa a partir do plasmídeo pGBFINEBAl93 estava sobre-expressa.

O teor total de celulase relacionado na Tabela 5 mostrou que a fração de celulases na quantidade total da proteína detectada está aumentada nos transformantes.

O experimento dá fortes indicações de que celulases de T. emersonii podem ser sobre-expressas pela transformação de T. emersonii com uma multiplicidade de cassetes de expressão que codificam celulases, e os níveis de celulases podem ser ainda mais elevados por uma segunda transformação de um transformante primário. Os resultados explicam o aumento da atividade de celulase dos transformantes descritos no EXEMPLO 6. Além disso, a fração de celulases na quantidade de total de proteína secretada produzida por T. emersonii pode ser aumentada por pela sobre-expressão de celulases, o que está de acordo com um aumento da atividade de celulase por mg de proteína observado nos transformantes (EXEMPLO 6).

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1/4

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo para a produção de um transformante de Talaromyces, CARACTERIZADO por compreender as etapas de:

   (a) prover um ou mais cassetes de expressão capazes de produzir um ou mais polipeptídeos de interesse e compreendendo um ou mais polinucleotídeos de interesse codificando para celulase e pelo menos um promotor para a expressão do polinucleotídeo;

   (b) prover um marcador de seleção incluído no cassete de expressão de (a) ou incluído em um polinucleotídeo dedicado de marcador de seleção;

   (c) transfectar um hospedeiro de Talaromyces com o um ou mais cassetes de expressão provenientes de (a) e/ou com o marcador de seleção proveniente de (b);

   (d) selecionar um transformante de Talaromyces que contém dois ou mais genes recombinantes capazes de expressar celulase, e (e) isolar o transformante de Talaromyces.
2. 2. Transformante de Talaromyces, CARACTERIZADO por abrigar dois ou mais genes recombinantes capazes de expressar celulase, capazes de produzir celulase ma ausência de indutor de celulase em um meio de glicose, tendo uma atividade de celulase de 2 Unidades de Palha de

   Trigo (WSU)/mL ou mais em um sobrenadante ou caldo diluído 16 vezes ou mais, e que pode ser obtido como definido na reivindicação 1.
3. 3. Transformante de Talaromyces, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO por ter uma atividade de endoglucanase de 50 WBCU/mL ou mais.
4. 4. Transformante de Talaromyces, de acordo com a de 04/06/2018, pág. 144/244

   2/4 reivindicação 2 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que os dois ou mais genes capazes de expressar celulase incluem gene de celobioidrolase, endoglucanase e/ou betaglicosidase.
5. 5. Transformante de Talaromyces, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais genes estão integrados ao genoma do transformante de Talaromyces.
6. 6. Transformante de Talaromyces, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o transformante de Talaromyces é isento de marcador.
7. 7. Processo para a produção de uma composição polipeptídica compreendendo uma ou mais celulases, CARACTERIZADO por compreender as etapas de:

   prover um ou mais cassetes de expressão capazes de produzir um ou mais polipeptideos de interesse e compreendendo um ou mais polinucleotídeos de interesse que codificam para celulase e pelo menos um promotor para a expressão do polinucleotideo;

   prover um marcador de seleção incluído no cassete de expressão de (a) ou incluído em um polinucleotideo dedicado do marcador de seleção;

   transfectar um hospedeiro de Talaromyces com o um ou mais cassetes de expressão proveniente de (a) e/ou com o marcador de seleção proveniente de b);

   selecionar um transformante de Talaromyces que contenha dois ou mais genes recombinantes capazes de expressar celulase; e produzir a composição polipeptídica através da de 04/06/2018, pág. 145/244

   3/4 cultura do transformante de Talaromyces em um meio de cultura adequado em que um indutor de celulase está ausente.
8. 8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que na etapa (a) são providos dois ou mais cassetes de expressão, tres ou mais cassetes de expressão ou quatro ou mais cassetes de expressão.
9. 9. Processo para a sacarificação de material lignocelulósico, CARACTERIZADO pelo fato de que o material lignocelulósico que foi previamente tratado é colocado em contato com transformante de Talaromyces como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 6, e em que são produzidos um ou mais açúcares.
10. 10. Processo para a preparação de um produto de fermentação, incluindo aminoácidos, vitaminas, produtos farmacêuticos, suplementos de ração animal, produtos químicos especiais, matérias primas químicas, plásticos, solventes, combustíveis, ou outros polímeros orgânicos, ácido lático, etanol, etanol combustível ou produtos químicos, plásticos, tais como ácido succínico e (bio)combustíveis, incluindo combustíveis líquidos sintéticos de etanol, metanol, butanol e biogas, CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais açúcares produzidos pelo processo como definido na reivindicação 9 são fermentados com um microorganismo de fermentação, de preferência, levedura, para produzir o produto de fermentação.
11. 11. Processo para a produção de um transformante múltiplo de Talaromyces, CARACTERIZADO pelo fato de que em uma primeira transformação como definida na reivindicação de 04/06/2018, pág. 146/244

    4/4

    1, o transformante de Talaromyces isolado na etapa (e) de uma primeira transformação é usado como hospedeiro de Talaromyces e é transformado em uma segunda transformação como definida na reivindicação 1 e na etapa (e) da segunda

    5 transformação um transformante múltiplo de Talaromyces é isolado.
12. 12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que na primeira transformação é usado um marcador de seleção diferente do da segunda

    10 transformação.

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    1 2 3 4 5 6 7 Β 9 1011 12 βΜΒΒΒΒΒοΜΒΒΒΙ

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