CN110184196B

CN110184196B - 一种篮状菌及其应用

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Publication number: CN110184196B
Application number: CN201910385914.7A
Authority: CN
Inventors: 常曌; 蔡文娇; 黄盼盼
Original assignee: Moon Guangzhou Biotech Co ltd
Current assignee: Moon Guangzhou Biotech Co ltd
Priority date: 2019-05-09
Filing date: 2019-05-09
Publication date: 2023-04-21
Anticipated expiration: 2039-05-09
Also published as: CN110184196A

Abstract

本发明涉及一种篮状菌及其应用。本发明的篮状菌于2018年12月6日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，登记入册编号GDMCC NO:60508，分类学名为Talaromyces sp。本发明的篮状菌具有植酸酶活性与酸性蛋白酶活性。研究表明，玉米浆经本发明的篮状菌处理后，沉淀明显减少，且上清液明显增多。并且，本发明的篮状菌还能分解玉米浆中的大分子蛋白(例如分子量为2000Da以上的蛋白)，且可以降解植酸；此外，经本发明篮状菌处理的玉米浆用作谷氨酸发酵培养基时，发酵液中谷氨酸浓度显著升高。

Description

一种篮状菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种菌及其应用，具体涉及一种篮状菌及其应用。

背景技术

玉米浆(液)是谷氨酸发酵常用的有机氮源，是玉米的亚硫酸浸泡后的浓缩液，主要成分为蛋白、氨基酸，植酸、乳酸、还原糖和灰分(以磷、钾为主)，还含有丰富的B族维生素及生长因子，通常植酸为抗营养因子、亚硫酸盐为有害因子需要去除。

玉米浆中含有丰富的磷元素，但绝大部分是以有机态的植酸形式存在，植酸的化学名称为肌醇六磷酸酯，是植物种子中肌醇和磷酸的最主要存在形式，在谷物等食用作物种子中含量高达1％～3％，占植物含磷总量的40％～70％。在玉米浸泡的过程中，大部分的植酸被溶出，但是大多数的微生物中缺乏能够分解植酸的酶，植酸中的磷元素很难被利用，因而造成磷元素的流失和浪费。同时植酸是也一种抗营养因子，未经处理会影响多种营养物质的利用，其上的磷酸基团呈负电性，具有很强的络合力，可与Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺和K⁺等金属离子及蛋白质螯合成稳定的复合物，形成不溶性盐类，从而影响微生物对多种营养物质的利用。

若可以在微生物发酵过程中将粕类培养基中的有机磷有效的水解，从而得到满足微生物发酵所需的游离磷，将不仅提高玉米浆中营养物质的利用率，也可以避免外加磷源，同时也减少了自然界中的排磷量，有利于环境保护。

植酸酶可以催化植酸分解为磷酸和肌醇，它能将磷酸基团从植酸上水解下来，将有机态的磷转变成微生物可以直接利用的游离态的无机磷，同时还破坏了植酸对Ca²⁺、Mg² ⁺、Zn²⁺等其它矿物元素强烈的亲和力，从而提高微生物对多种营养物质的利用率。

但是，植酸酶处理过后的玉米浆仍然比较粘稠，静置时不能快速分层，不利于清液发酵。此外，玉米浆中含有大量大分子蛋白与还原糖，在高温灭菌过程中会产生美拉德反应，形成不可被利用的沉淀物质，会造成原料的浪费。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种能够使玉米浆中沉淀含量显著降低、游离磷酸根释放、大分子蛋白降解的篮状菌及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种篮状菌，其该菌株为篮状菌Talaromyces sp.，保藏编号为GDMCC NO:60508。

本发明的篮状菌于2018年12月6日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，登记入册编号GDMCC NO:60508，分类学名为Talaromyces sp.，其ITS序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的篮状菌具有植酸酶活性与酸性蛋白酶活性。研究表明，玉米浆经本发明的篮状菌处理后，沉淀明显减少，且上清液明显增多。并且，本发明的篮状菌还能分解玉米浆中的大分子蛋白(例如分子量为2000Da以上的蛋白)，且可以降解植酸。

此外，经本发明篮状菌处理的玉米浆用作谷氨酸发酵培养基时，发酵液中谷氨酸浓度显著升高。可见，本发明篮状菌处理的玉米浆更有利于谷氨酸发酵。

第二方面，本发明提供了上述篮状菌在分解有机磷源或降解大分子蛋白中的应用。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述有机磷源为植酸，所述大分子蛋白的分子量为2000Da以上。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述植酸或大分子蛋白来源于玉米浆。

第三方面，本发明提供了上述篮状菌在以下(a)～(c)至少一项中的应用：

(a)用于降低玉米浆中的沉淀含量；

(b)用于释放玉米浆中游离磷酸根；

(c)用于降解玉米浆中的大分子蛋白。

第四方面，本发明提供了上述篮状菌在与玉米浆组合用于制备谷氨酸发酵培养基中的应用。

第五方面，本发明提供了一种谷氨酸发酵培养基，其包括经上述篮状菌处理的玉米浆。

作为本发明所述谷氨酸发酵培养基的优选实施方式，所述谷氨酸发酵培养基还包括葡萄糖、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、豆粕水解液、FeSO₄·7H₂O、MnSO₄·7H₂O和尿素。

第六方面，本发明提供了上述篮状菌在用于发酵谷氨酸中的应用。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述应用包括以下步骤：

(1)篮状菌菌种活化：取篮状菌菌种接种于种子培养基中，恒温静置培养，进行篮状菌菌种活化，得到活化篮状菌菌种；

(2)向种子培养基中接入步骤(1)所得活化篮状菌菌种，进行摇床培养，得到菌株活化液；

(3)采用步骤(2)处理后的玉米浆配制发酵培养基，向发酵培养基中加入谷氨酸棒杆菌进行谷氨酸发酵，得到谷氨酸。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了一种具有植酸酶活性与酸性蛋白酶活性的篮状菌，该篮状菌具有以下优点：

(1)能够显著降低玉米浆中的沉淀含量，提高灭菌效果，减少管道堵塞和清理的风险；

(2)释放游离磷酸根，减少配料过程中的磷酸盐用量；

(3)加快玉米浆的沉降速度，有利于清液发酵的进行；

(4)释放可利用碳源(肌醇)，减少碳源投入成本；

(5)降解玉米浆中的大分子蛋白，使其变成小分子寡肽或氨基酸，促进发酵得率；

(6)减少消泡剂的使用。

附图说明

图1为本发明实施例2中菌种的生长曲线图；

图2为本发明实施例3中3组玉米浆离心后的效果图；

图3为本发明实施例3中3组玉米浆上清液体积测试对比结果图；

图4为本发明实施例3中3组玉米浆中沉淀质量对比结果图；

图5为本发明实施例3中玉米浆灭菌后静置观察的结果图；

图6为本发明实施例3对玉米浆上清液中各组分蛋白的分子量分布进行检测的结果图；

图7为本发明实施例3中培养基起泡时间与消泡时间测试结果图；

图8为本发明篮状菌的进化树。

图2、图3、图4和图6中的玉米浆是指未经蓝状菌或植酸酶处理的玉米浆；图5中的玉米浆培养基以及图7中的培养基均指含有未经蓝状菌或植酸酶处理的玉米浆的培养基。

具体实施方式

为更好地说明本发明目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明的篮状菌于2018年12月6日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，登记入册编号GDMCC NO:60508，分类学名为Talaromyces sp.，其ITS序列如SEQ ID NO.1所示。本发明篮状菌的进化树如图8所示。

实施例1篮状菌的获取

本发明篮状菌分离自江西桔子地土壤样品，具体获取方法如下：

(1)样品采集：在采样区内用土钻随机多点(20点)采取0–10cm表层土壤，每个样区采集3–6个土壤样品，每个样品由20铲土样混合均匀组成，样品装入自封袋中，并在自封袋封皮写上自封袋编号、采样地点、以及采样日期等。回实验室后取5克样品4℃保存或立即测量，其余样品放冷库保藏。

(2)进行篮状菌分离，分离方法为：

1)处理样品：称取土壤5g至50mL离心管中，加入45mL无菌水，用涡旋仪以最大功率混匀样品3次，每次30s。

2)梯度稀释：将5mL的样品悬液转移至无菌的50mL离心管中并加入45mL无菌水稀释10倍，震荡均匀；然后取1mL 10^-1溶液，加入无菌水9mL，得到的稀释倍数是10^-2的悬液，继续作10倍稀释得到10^-3样品悬液。

3)涂布平板：在超净工作台内用移液枪吸取200μL稀释好的且震荡均匀的土壤悬浮液分别加入到凝固好的1/4PDA、pH3PDA培养基平板上，然后加入10–15颗灭菌的进口玻璃珠，摇晃平板使其涂布均匀。

4)晾干平板：由内而外摆放并打开平板，以超净台最大工作风速吹干平板，晾干后收起待用。

5)收板：从外向内依次将平板盖上，将玻璃珠回收至专用瓶子，将平板用封口膜封好，倒置于25℃恒温培养箱进行黑暗培养。

6)真菌的培养观察记录：培养至3d左右开始观察平板，注意查看是否有污染，并作好相关记录。

7)真菌分离和纯化：从开始培养的那天起，每天观察一次平板，根据平板上菌落的生长情况，及时用无菌牙签选择性挑出真菌单菌落至新的PDA培养基平板上，倒置于25℃环境进行黑暗培养，纯化的平板可以保存至4周左右。培养过程中观察生长状况，若分离出多个不同的菌落，则在适宜培养基上划线接种，如此反复直到纯化出目的菌落。

8)真菌保存：在超净工作台用无菌手术刀将分离得到的真菌切成小块，转移至装有1mL 25％无菌甘油的冻存管中，于-80℃条件下保存。

9)真菌鉴定：用热裂解法快速提取真菌基因组DNA，即在超净工作台内用灭菌牙签挑取少量新生菌丝，放入无菌的96孔板中，加入50μL的裂解缓冲液，于PCR仪中95℃煮30min，取2μLDNA样品加入PCR体系中，于基因扩增仪扩增后测序。PCR体系：2×MasterMix12.0μL，ddH₂O 10.8μL，ITS4 10μM 0.6μL，ITS5 10μM 0.6μL，DMSO 1.0μL。扩增条件：预变性94℃5min；变性94℃45s，退火55℃45s，延伸72℃1min，变性至延伸进行35个循环；延伸72℃10min。

本实施例所获得的真菌的ITS序列如SEQ ID NO.1所示，由此鉴定其为篮状菌。

实施例2谷氨酸发酵

本实施例采用将本发明篮状菌处理玉米浆，将经处理的玉米浆用于谷氨酸发酵，同时与未经处理的玉米浆以及经植酸酶处理的玉米浆用于谷氨酸发酵进行了比较。本实施例谷氨酸发酵包括以下步骤：

(1)篮状菌培养

将存储在冰箱的蓝状菌接种在PDA固体培养基上，于28℃环境下黑暗培养5d，等生长到表型单一菌落时，再利用无菌接种针挑取孢子至PDB培养基中扩大培养。

(2)玉米浆处理

将6份相同的玉米浆分为3个组别，每个组别中的两份玉米浆均经相同处理或均不作任何处理。第一组中的两份玉米浆(编号为Tank 1和Tank 2)均不进行任何处理，第二组中的两份玉米浆均采用1％植酸酶进行处理(编号为Tank 3和Tank 4)，第三组中的两份玉米浆均采用1％本发明篮状菌进行处理(编号为Tank 5和Tank 6)；

(3)发酵培养基的配置

谷氨酸发酵种子培养基(ATCC13032)的组成组分为：葡萄糖22.0g/L，尿素8.0g/L，硫酸镁0.4g/L，K₂HPO₄1.0g/L，玉米浆20.0g/L，酵母抽提物10.0g/L,FeSO₄·7H₂O8ppm，MnSO₄·7H₂O 8ppm，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L,消泡剂0.2g/L,丁二酸0.5g/L,28％氨水调pH至7.0。其配制方法为：按照配比，将各种原料称量好，溶解完全配成150mL种子培养基。121℃20min灭菌。

发酵培养基的组成组分为：葡萄糖50.0g/L,KH₂PO₄4.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，玉米浆35.0g/L，豆粕水解液7.5g/L，FeSO₄·7H₂O 10ppm，MnSO₄·7H₂O 10ppm，尿素4g/L，28％氨水调pH为7.0(发酵培养基分别含有步骤(2)的6份玉米浆，实验组称取步骤(2)所述经处理的玉米浆)。其配制方法为：按照配比，将各种原料称量好，溶解完全配成1.5L发酵培养基。准备6个5L Applikon BioBundle玻璃罐生物反应器，按照步骤1进行编号和分装，121℃20min灭菌。

(4)菌种活化：取斜面保藏菌种1～2环接种于装有篮状菌种子培养基的斜面试管中，31～33℃恒温静置培养24h；

(5)种子培养

向己灭菌的谷氨酸棒杆菌种子培养基中接入活化菌种，31～33℃摇床培养130rpm16h，得谷氨酸棒杆菌种子液。

(6)谷氨酸发酵

设置参数：空气流量2L/min，温度30-32℃，通过流加氨水将pH值控制在6.9-7.1之间。按照发酵培养基的体积比为10％的比例，将步骤(5)所述种子液接入至步骤(3)所述发酵培养基中；发酵温度控制在30～32℃；以28％氨水控制pH在6.8～7.0之间，转速150-300rpm，跟溶氧值联动，当溶氧值低于5％时，转速上升，最高限度为300rpm。初始通气量为2g/L,当溶氧值降至5％，则加大通气量至4g/L,流加葡萄糖速率为随着控制通气量为2～10L/min,每隔1h，用斐林试剂法测定发酵培养基中的残糖浓度，当浓度低于0.5％，通过流加葡萄糖液的方式进行补充，按体积换算，补充至浓度1.5％。葡萄糖液浓度为50％w/w,随培养基一起配置，灭菌。前8h每2h取样测OD值，之后每h取样，发酵周期为24h。菌种的生长曲线如图1所示。由图1可见，经处理玉米浆组成的培养基，菌体生长速度明显较快，能更快达到平稳期。

(7)谷氨酸发酵得率测定

测量谷氨酸发酵液中的谷氨酸浓度，收集发酵液至eppendorf离心管，离心参数12000rpm，5min,取上清稀释后用SBA-40C葡萄糖-谷氨酸生物传感分析仪进行测量，结果如表1所示。

表1

由表1可见，经本发明篮状菌处理的玉米浆用于谷氨酸发酵，发酵液中谷氨酸浓度显著上升。

实施例3

本实施例考察了本发明篮状菌对玉米浆的影响。

1.沉淀分析

取玉米浆，搅拌均匀后，分为3组，每组取150mL，3个重复，各组玉米浆分别经表2所示处理。将玉米浆经以上步骤处理后，室温下磁力搅拌(200rpm)6小时。将上述不同处理的玉米浆，每组3×45mL,经同一幅度的旋涡震荡处理后后静置，计算不同液体明显分层所需时间。精确称取45mL玉米浆，装入50mL离心管,3000rpm 10min。离心后的效果图如2所示。由图2可见，经植酸酶与篮状菌处理后的玉米浆，沉淀明显减少。另测上清体积后，弃上清，离心管40℃烘至绝干，测量沉淀质量；上清液体积测试对比结果如图3所示，烘干后沉淀质量对比结果如图4所示。由此可见，未经处理的玉米浆沉淀较多，经植酸酶处理后的沉淀有所减少，而经过篮状菌处理过后的玉米浆，沉淀是最少的。而上清液的体积则正好相反。

表2

组别	添加
		1	无
2	植酸酶(1％添加量)
		3	篮状菌(1％添加量)

2.培养基灭菌效果测定

将玉米浆分为3个组别，第一组中的玉米浆不进行任何处理，第二组中的玉米浆采用1％植酸酶进行处理，第三组中的玉米浆采用1％本发明篮状菌进行处理。分别采用3个组别的玉米浆按照以下浓度配置培养基：葡萄糖50.0g/L,KH₂PO₄4.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，玉米浆35.0g/L，豆粕水解液7.5g/L，FeSO₄·7H₂O 10ppm，MnSO₄·7H₂O 10ppm，尿素4g/L，28％氨水调pH为7.0(实验组称取步骤1所述经处理的玉米浆)。

然后按450mL体积配置后121℃20min灭菌后，静置观察，观察结果如图5所示。由图5可以很明显看出，经篮状菌和植酸酶处理过后的玉米浆所配置的培养基，其灭菌后的沉淀较普通玉米浆配置的培养基较少，而篮状菌处理的玉米浆所配置的培养基灭菌后液体更澄清，且没有发现薄膜状沉淀，薄膜状沉淀初步估计是玉米浆中的蛋白与糖在高温下发生的反应所形成的。

3.游离磷酸根的测定

将玉米浆分为3个组别，第一组中的玉米浆不进行任何处理，第二组中的玉米浆采用1％植酸酶进行处理，第三组中的玉米浆采用1％本发明篮状菌进行处理。将3个组别的玉米浆12000rpm离心10min，取上清，采取HJ 593-2010水质单质磷的测定磷钼蓝分光光度法测量玉米浆中的游离磷含量：将离心得到的上清液100μL加入50mL的容量瓶后，先加入25mL的去离子水，用胶头滴管加2滴2,4-二硝基酚指示剂，再加5mL钼锑抗显色剂，最后用去离子水定容，混匀，静置0.5h之后，测定OD值，并计算游离磷含量，结果如表3所示。经换算，经过篮状菌处理的玉米浆，其游离磷含量有较大提升。

表3

	游离磷(g/L)
		玉米浆	4.34
经植酸酶处理	7.44
		经篮状菌处理	9.65

4.分子量分布测定

将步骤3中的上清液，稀释到干物含量2‰，过0.22μm的滤膜，采用国标海洋鱼低聚肽粉(GB/T 22729-2008)所述方法对上述玉米浆上清液中的各组分蛋白的分子量分布进行检测，结果如图6所示。由图6可见，在篮状菌的处理下，玉米浆中的小分子肽所占百分比大幅度上升，而其他分子量段的蛋白含量，如>2000Da的蛋白含量则明显减少。这说明篮状菌的加入改善了玉米浆中的蛋白的分子量。

5.起泡-消泡实验

取一1000mL塑料量筒，从量筒底部的侧面钻一个孔，插入气泡石，同时从顶部深入IKA搅拌桨。倒入培养基(同本实施例培养基灭菌效果测定过程中采用的培养基)100mL后，同时打开搅拌桨与气泡石的开关，模仿发酵罐中的通气和搅拌，搅拌速度150rpm,通气量2L/min,当泡沫上升至1000mL刻度时同时关闭搅拌桨与气泡石的开关，让气泡自然消解，同时记录下起泡时长(t1)。当气泡最终完全消解后，记录下消泡时长(t2)。往复6次，取平均值。起泡时长与消泡时长反映了培养基起泡的难易度。结果如图7所示。由图7可见，经本发明蓝状菌处理的培养基，起泡时间较长，消泡时间较短，由此可见，本发明蓝状菌可减少消泡剂的使用。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 慕恩(广州)生物科技有限公司

<120> 一种篮状菌及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 520

<212> DNA

<213> Talaromyces sp.

<400> 1

cgagtacact acccgttccg taggtgaacc tgcggaagga tcattaccga gtgcgggccc 60

ccgcggccca acctcccacc cttgtctcta tacacctgtt gctttggcgg gcccaccggg 120

gccacctggt cgccggggga cgctcgtccc cgggcccgtg cccgccggag cgccctgtga 180

accctgatga agatgggctg tctgagtaca atgaaaattg tcaaaacttt caacaatgga 240

tctcttggtt ccggcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca 300

gaattccgtg aatcatcgaa tctttgaacg cacattgcgc cccctggcat tccggggggc 360

atgcctgtcc gagcgtcatt tctgccctca agcgcggctt gtgtgttggg tgtggtcccc 420

ccggggacct gcccgaaagg cagcggcgac gtccgtctgg tcctcgagcg tatggggctc 480

tgtcactcgc tcgggaagga cctgcggggg ttggtcacca 520

Claims

1. 一种篮状菌，其特征在于，该菌株为篮状菌Talaromyces sp.，已于2018年12月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:60508。

2. 如权利要求1所述篮状菌在分解有机磷源或降解大分子蛋白中的应用；所述有机磷源为植酸；所述大分子蛋白的分子量为2000 Da以上；所述植酸或大分子蛋白来源于玉米浆。

3.如权利要求1所述篮状菌在以下（a）~（d）至少一项中的应用：

（a）用于降低玉米浆中的沉淀含量；

（b）用于释放玉米浆中游离磷酸根；

（c）用于降解玉米浆中的大分子蛋白；

（d）制备用于发酵谷氨酸的玉米浆。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）篮状菌菌种活化：取篮状菌菌种接种于种子培养基中，恒温静置培养，进行篮状菌菌种活化，得到活化篮状菌菌种；

（2）向玉米浆中接入步骤（1）所得活化篮状菌菌种，进行反应；

（3）采用步骤（2）处理后的玉米浆配制发酵培养基，向发酵培养基中加入谷氨酸棒杆菌进行谷氨酸发酵，得到谷氨酸。