CN111040969B - 一种复合乳杆菌剂及其在水牛青贮饲料中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种复合乳杆菌剂及其在水牛青贮饲料中的应用，本申请的复合乳杆菌菌剂由申请人自行从农家自然发酵的饲料原料中分离中筛选分离的发酵乳杆菌xf 09#、粘膜乳杆菌xf 13#、嗜酸乳杆菌xf 32#、植物乳杆菌xf 42#组成，该复合菌剂均为同型乳酸发酵乳杆菌，具有乳酸产量高的特点，发酵过程中能快速降低pH值，形成乳杆菌发酵的优势环境，有效抑制杂菌生长，能给青贮饲料提供良好的发酵菌剂和环境，同时，乳杆菌还对肠道具有双向调节和抗腹泻的效果。

Description

一种复合乳杆菌剂及其在水牛青贮饲料中的应用
【技术领域】
本发明涉及微生物领域，特别涉及一种复合乳杆菌剂及其在水牛青贮饲料中的应用。
【背景技术】
青贮饲料是把青贮原料装入青贮容器内，在厌氧条件下，植物体上附着的乳酸菌将可溶性糖类转化成乳酸，随着乳酸的增加，青贮料的pH值下降至4.2以下时，大部分有害微生物的如腐败菌、丁酸菌等的活动受到抑制，从而长期保存青绿多汁饲料的营养价值，由于存在大量的乳酸菌和乳酸，形成了一个相对稳定的平衡状态，乳酸菌分泌乳酸可以保持饲料不受其他微生物影响而变质，同时又限制了乳酸菌的过量繁殖，乳酸菌在乳酸不足时又继续生长分泌乳酸，微生态如此循环，能够使饲料保持近十年的时间，这种方法能保证家畜常年均衡供应青绿多汁饲料；而且，乳酸菌处理过的发酵饲料含有大量的氨基酸、益生菌和消化酶，既有利于动物肠道菌群平衡，提高牲畜吸收力，还能降解饲料原料中可能存在的毒素，起到促进生长、提高饲料吸收转化率、增强免疫力等作用。
如今我国畜牧业快速发展的大背景下，个体养殖也愈发壮大，但在反刍动物饲养业中，由于成本的制约，很多个体户不添加微生物仅用废弃料堆沤制备青贮料，这种方法简单、粗放，但是获得的青贮料品质不好，而且，如果对菌群控制不当会导致益生菌不能富集形成优势菌，有效抑制杂菌生长。在个体粗放的养殖过程中，由于操作不当，氧气进入青贮窖表面，这样会面临青贮料的二次发酵问题，也就是说大量的有害微生物开始复苏，包括酵母和霉菌孢子，它们和乙酸一同进行有氧腐败，导致整体青贮料品质变坏。这些微生物利用氧气开始大量繁殖，进而引起青贮窖内温度上升，乳酸分解，pH值上升，营养价值降低最终导致粗饲料的缺乏及品质差，为此，开发青贮饲料乳酸菌添加剂是目前解决上述问题最简单有效的方法，通过对菌种的优化，提高青贮饲料的乳酸菌菌群优势能达到提高青贮饲料发酵品质的目的。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种复合乳杆菌菌剂，该菌剂所含四株乳杆菌均从农家自然发酵的饲料原料中分离而得，分离后制备成复合菌剂应用于青贮饲料的研究。研究结果表明，该菌剂所属菌均为同型发酵菌，具有很强的产乳酸能力，能起到良好发酵青贮饲料效果；本发明的研究为水牛发酵饲料的研究提供了新的种质资源和功效。
本申请的乳杆菌菌剂，为粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)xf 13#；
本申请还包括一种复合乳杆菌菌剂，复合菌剂包括发酵乳杆菌(Lactobacillusfermmentum)xf 09#、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)xf 13#、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)xf 32#、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)xf 42#。
进一步的，所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermmentum)xf 09#于2019年8月19日保藏在中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为M2019639；粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)xf 13#于2019年8月19日保藏在中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为M2019640；嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)xf 32#于2019年8月19日保藏在中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为M2019641；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)xf 42#于2019年8月19日保藏在中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为M2019642。
进一步的，所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermmentum)xf 09#、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)xf 13#、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)xf 32#、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)xf 42#均从农家自然发酵的饲料原料中分离中分离而得。
本申请还包括所述复合乳杆菌菌剂的青贮饲料。
进一步的，所述青贮饲料由复合菌剂对象草和啤酒渣发酵制得。
本申请还包括所述复合乳杆菌菌剂的菌粉。
进一步的，所述菌粉制备方法为：
(1)将单一菌种接入液体的浓缩增殖培养基中进行发酵，发酵条件为42℃，厌氧发酵，48h，pH根据不同菌种设定为3.92-4.19制得高浓度发酵液；
(2)将步骤(1)含有菌种的浓缩液在5000r/min的条件下离心制得菌悬液；
(3)然后向菌悬液中添加保护剂，进行冷冻、干燥得到菌粉。
进一步的，所述浓缩增殖培养基为MRS培养基和/或灭菌水牛乳培养基。
进一步的，所述浓缩增殖培养基优选为灭菌水牛乳培养基。
本申请还包含所述复合乳杆菌菌剂、所述青贮饲料和所述菌粉在调节反刍动物肠道，降低腹泻率上的应用。
进一步的，所述反刍动物为水牛。
本发明具有以下有益效果：
1、本申请的复合乳杆菌菌剂由发酵乳杆菌(Lactobacillus fermmentum)xf 09#、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)xf 13#、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)xf 32#、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)xf 42#组成，该复合菌剂均为同型乳酸发酵乳杆菌，具有乳酸产量高的特点，发酵过程中能快速降低pH值，形成乳杆菌发酵的优势环境，有效抑制杂菌生长，给青贮饲料提供良好的发酵菌环境；同时，本申请的乳杆菌还对肠道具有良好的调节效果，经过申请人研究发现，粘膜乳杆菌具有降低肠屏障通透性、抗氧化、促进胃肠粘膜愈合的效果，其它几株乳杆菌也都有良好的抗腹泻效果，粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)xf 13#抗腹泻效果最为明显，在实验期甚至未发现有腹泻发生。
2、本申请将上述菌株制备成菌粉，用自行研发的培养基培养菌株制备菌粉能保证菌粉含有较高的活菌数，方便个体户将菌种直接应用在青贮饲料中。
【附图说明】
图1为本发明菌株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermmentum)xf 09#的镜检图；
图2为本发明菌株粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)xf 13#的镜检图；
图3为本发明菌株嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)xf 32#的镜检图；
图4为本发明菌株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)xf 42#的镜检图；
图5为本发明4个菌株的聚类分析图；
图6为本发明4个菌株24h内的产酸速率图；
图7为本发明4个菌株24h内的生长速率图。
【具体实施方式】
下面结合附图和实施例和试验对本发明作进一步说明。
实施例1：
本实施例的复合乳杆菌菌剂，包括2019年8月19日保藏于中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心的4株乳杆菌：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermmentum)xf 09#，保藏编号为M2019639；粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)xf 13#，保藏编号为M2019640；嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)xf 32#，保藏编号为M2019641；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)xf 42#，保藏编号为M2019642。
1、材料与试剂：
发酵饲料样品：取自广西灵山某个体奶水牛养殖农场，混合样本用无菌娃哈哈纯净水瓶封装，常温保存，当天送达实验室。
MRS培养基(改良MRS培养基基础)：广东环凯微生物科技有限公司；M17固体培养基：青岛日水生物技术有限公司；MRS肉汤培养基：广东凯环微生物科技有限公司；G1060革兰氏染色试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；天根磁珠法动物组织基因组DNA提取试剂盒：北京雅安达生物技术有限公司；PCR扩增试剂：吉泰克2X高效PCRmix(含染料)；30％过氧化氢：天津市科密欧化学试剂有限公司；氯化钠：成都金山化学试剂有限公司；碳酸钙(CaCO3)：西安裕华生物科科技有限公司；葡萄糖：上海依赫生物科技有限公司，以上试剂均为分析纯。
2、仪器与设备：
尼康ECLIPSE 50i型正置生物显微镜：日本Nikon公司；DYCP-31DN DNA型电泳槽、DYY-5型稳压电泳仪：北京六一仪器厂；HIRAYAMA灭菌器(日本)；DK-8D型电热恒温水槽：上海一恒科学仪器有限公司；FR980型凝胶成像仪：上海复日科技仪器有限公司；DNA自动化提取仪器：KingFisherTM Flex Purification System；2720型聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)仪：美国应用生物系统公司；SPX-150型生化培养箱：北京科伟永兴仪器有限公司；SW-CJ-1F型超净工作台：苏州苏洁净化设备有限公司；HC-2518R型冷冻高速离心机：北京京立离心机有限公司。
3、分离方法：
取混合均匀的发酵饲料样品10g溶解于90mL 0.85％无菌生理盐水中，在涡旋仪上充分混匀，梯度稀释成10-1～10-6浓度的样品稀释液。分别取各稀释度的样液200μL，用无菌玻璃刮铲均匀涂布于含CaCO3的MRS培养基和M17培养基平板上，于37℃培养30h。挑取肉眼可见、单个、有溶钙圈的菌落进行划线，反复分离、纯化，取纯化后典型菌落进行革兰氏染色镜检。凡是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株初步认定为乳酸菌。选取革兰氏染色结果阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株，分别接种于灭菌的MRS肉汤培养基中增殖培养24h，将菌株编号，于4℃冰箱中保存备用。
将分离所得的乳酸菌(培养24h种子菌液)按7％(体积分数)接种于新的MRS肉汤培养基中，于37℃下300r/min摇床培养24h，每隔3h检测一次各乳酸菌发酵液的pH值，每株菌共计8个取样点，每菌株重复测3次，取平均值，同时测定其在OD600nm下的吸光度值。以无菌MRS肉汤培养基为空白，以培养时间为横坐标，以菌株发酵液pH值、OD600nm吸光值为纵坐标绘制产酸速率曲线和生长曲线。
挑选纯化后的菌株接种于MRS灭菌肉汤养基中，进行革兰氏染色镜检，在生化显微镜下观察菌体形态特征。同时进行过氧化氢酶试验、发酵葡萄糖产气试验，同时考察菌株在不同pH(3.0、4.0、5.0、7.5)及不同温度(20℃、30℃、35℃、40℃、45℃)条件下的生长情况。
本试验从农家自然发酵饲料样品中共分离出10株乳酸菌(菌株编号：SL9、SL13、SL31、SL32、SL38、SL41、SL42、SL56、SL60、SL84)，大部分菌落在MRS平板上呈乳白色、圆形，中央隆起，表面光滑湿润，边缘整齐，周边有溶钙圈。各菌株经革兰氏染色均呈阳性，过氧化氢酶反应均为阴性，其发酵葡萄糖产气、不同pH值、不同温度生长试验见表1。由表1可知，除SL31和SL60，其它菌均可在pH3.0～7.5和20～45℃条件下生长良好。SL9、SL13、SL32、SL42为同型发酵，SL31、SL38、SL41、SL56、SL60、SL84为异型发酵，具体见表1：
表1发酵饲料中乳酸菌生理生化结果
Figure BDA0002340256690000051
Figure BDA0002340256690000061
注：“+”表示阳性、生长；“－”表示阴性、不生长或生长不明显。
申请人选择上述菌株的4株同型发酵菌株(SL9、SL13、SL32、SL42)进行后续鉴定研究。
4、上述菌株的形态鉴定如下：
对菌株进行形态鉴定：将上述菌株(SL9、SL13、SL32、SL42)的菌落在MRS平板上均呈乳白色、圆形，中央隆起，表面光滑湿润，边缘整齐，周边有溶钙圈。将分离纯化后的乳酸菌株进行革兰氏染色、镜检，具体如图1-4所示：显微镜下大部分菌株的形态特征较为相似，均呈现长短不一的杆状，成对、成链或单个存在，不运动，无芽胞；各菌株经革兰氏染色均呈阳性。
5、上述菌株的菌株16S rDNA鉴定情况如下：
将分离纯化后的增殖菌液，取2ml，10000r/min沉淀菌体，弃上清液，加入200μL组织消化液CHA和20μL Proteinase K，吹打混匀，转移至96孔样品板，使用天根磁珠法动物组织基因组DNA提取试剂盒对菌株DNA进行自动化仪器提取，具体步骤参照试剂盒说明书。
PCR扩增条件：使用天一辉远“吉泰克2X高效PCRmix(含染料)”进行PCR扩增，反应体系：2×高效PCR Mix(含染料)1×25μL，正向引物(10pmol/2μl)0.2μM 1μL，反正引物(10pmol/2μl)0.2μM 1μL，模板DNA1，ddH2O 2To 50μL。反应条件：94℃预变性2min，94℃变性10s，55～65℃退火30s，72℃延伸60s/kb，35个循环；72℃终延伸5min。将乳酸菌基因PCR扩增成功的电泳目的条带片段回收，送天一辉远科技有限公司测序，将测序结果在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)数据库进行比对分析。
结果显示：
经16SrRNA基因测序，将测序结果拼接并输入GenBank数据库，利用BLAST程序与NCBI核酸数据库中的公开序列进行比对分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)，并运用MEGA6.0软件以Neighbor-Joining方法构建系统发育树，结果如图5所示：菌株9、13、32、42分别与发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、粘膜乳杆菌(lactobacillusmucosae)、嗜酵乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)处于同一分支族群，同源性均达99％以上，故这四株菌依次被鉴定：SL9为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、SL13为粘膜乳杆菌(lactobacillus mucosae)、SL32为嗜酵乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、SL42为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)。
6、上述菌株的产酸能力和生长速率测定：
对上述4株菌株：(SL9、SL13、SL32、SL42)进行产酸能力和生长速率测定：按接种原始菌液24h后MRS肉汤培养基的pH最低值和OD600nm最高值为筛选条件，来研究这4株菌的产酸能力，挑选产酸能力最强的菌株，其24小时内的产酸速率和生长速率如图6、图7所示：
由图6可知，所有乳酸菌株在MRS肉汤培养基中的代谢较快，都能很快进入分裂期，产生大量的LA(乳酸)。随着发酵时间的延长，4株乳酸菌的pH值也在迅速降低。发酵至15h时，SL42(植物乳杆菌)发酵液的pH值稍有缓和，其次是SL32(嗜酸乳杆菌)，而SL9(发酵乳杆菌)和SL13(粘膜乳杆菌)发酵液的pH值还在不断下降，直至21～24h时，SL13(粘膜乳杆菌)的pH值基本稳定，其它菌的pH值仍呈下降趋势。发酵24h时，SL32(嗜酸乳杆菌)的pH值最低，为3.57。在整个发酵过程中，四株菌的产酸能力依次为：SL32(嗜酸乳杆菌)＞SL42(植物乳杆菌)＞SL9(发酵乳杆菌)＞SL13(粘膜乳杆菌)。
由图7可知，随着培养时间的延长，不同菌株的OD值都呈快速上升趋势，至24h时，菌体生长量基本都达到最大值。根据数据可知，这三株菌均具有较强的产酸能力，在整个发酵过程中，SL32(嗜酸乳杆菌)和SL42(植物乳杆菌)生长趋势基本相同，发酵6～21h时成指数倍增加，OD值较相近，15～24h时，SL9(发酵乳杆菌)生长速率明显上升，SL13(粘膜乳杆菌)在发酵21～24h时，生长速率趋于平缓，至24h时SL32(嗜酸乳杆菌)的生长速率最快。综合pH最低值和OD600nm最高值，可以看出SL32(嗜酸乳杆菌)的生长及产酸能力最强。
实施例2：
后续实施例均基于实施例1筛选出并保藏的菌株来制备菌粉，为了简化描述，将上述保藏的微生物发酵乳杆菌(Lactobacillus fermmentum)xf 09#，简称为SL9；粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)xf 13#，简称为SL13；嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)xf 32#，简称为SL32；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)xf 42#，简称为SL42；
本实施例采用实施例1的菌株来研制菌粉，具体方法如下：
(1)将单一菌种按照10g/kg的接种量接入液体的浓缩增殖培养基中进行发酵，发酵条件为42℃，厌氧发酵，48h，pH根据不同菌种设定为3.92-4.19(具体如表2所示)制得高浓度发酵液；
(2)将步骤(1)含有菌种的浓缩液在5000r/min的条件下离心制得菌悬液；
(3)然后向菌悬液中添加保护剂，进行冷冻、干燥得到菌粉。
上述步骤(1)的浓缩增殖培养基分为MRS肉汤培养基或灭菌水牛乳培养基。
其中，MRS肉汤培养基的制备方法为：将蛋白胨10g、牛肉膏粉5g、酵母膏粉4g葡萄糖20g、吐温-80 1.0ml、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、柠檬酸三铵2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、琼脂15g，混匀后加水补至1L，121℃灭菌20min，调节pH浓度为6.2±0.2。
水牛乳培养基为：将直接灭菌后的水牛乳做为增殖培养基。
保护剂为：85％无脂奶粉、5％海藻糖、6％谷氨酸钠、4％甘油。
上述培养基(MRS肉汤培养基)和灭菌水牛乳除了培养基不同和pH条件不同，其它条件完全一致；经申请人测定，步骤(3)菌粉的有效活菌数如表2所示：
表2 MRS培养基和水牛乳培养基制备的菌粉对活菌数影响
Figure BDA0002340256690000081
从上表可知，不同培养基活化后得到的乳酸菌粉活菌数差别很大，水牛乳培养基能起到提高菌粉有效活菌数的作用。
实施例3：
采用实施例2水牛乳培养基制备的菌粉制备青贮饲料，具体方法为：
将上述乳杆菌按照表3(青贮饲料益生菌菌株选择表)的组合制备发酵青贮饲料，制备方法为：将新鲜象草切短至2cm左右与啤酒糟按照质量比为3:7混合，然后按照10mg/kg的接种量接种乳酸菌菌剂，每袋500g，用真空封口机抽真空和密封，室温条件下避光贮存，发酵45d制得，测定相应指标。
表3青贮饲料益生菌菌株选择
组别 益生菌
组1 发酵乳杆菌xf09#(SL9)
组2 粘膜乳杆菌xf13#(SL13)
组3 嗜酸乳杆菌xf32#(SL32)
组4 植物乳杆菌xf42#(SL42)
组5 发酵乳杆菌xf09#：粘膜乳杆菌xf13#：嗜酸乳杆菌xf32#：植物乳杆菌xf42#＝1:1:1:1
组6 市售乳酸菌菌剂(惠乐农)活性乳酸菌冻干粉植物青贮剂
组7 不用微生物，直接采用新鲜象草和啤酒糟按3:7青贮
注：组5为质量比。
青贮发酵实验结束后对饲料品质进行评价，具体如下：
1、感官评定：
感官评定参考我国农业部1996年发布的《青贮饲料质量评定标准(试行)》进行，具体见表4：
表4感官评价标准
Figure BDA0002340256690000091
完成青贮后开袋并分别从色泽、气味和质地、pH和水分五个方面进行感官评价打分，发现组1-5的感官评价均为优等品质，组6为良好品质，组6的酸味较组1-5更浓烈一些，这可能是由于本申请的益生菌均为同型发酵益生菌，产出的乳酸具有酵香味。组7品质为劣等，而且有腐败味，这是因为啤酒糟中含有一定量酵母，乳酸菌短时间内无法形成优势菌，导致乳酸和乳酸菌优势循环无法形成，发酵品质差。
2、其它品质项目分析：
开封后立即称取青贮样品35g于250ml广口瓶，加150ml蒸馏水密封置于4℃冰箱24h后经两层纱布过滤后，一部分滤液用便携式pH计测定pH；另一部分保存于－20℃冰箱中，用于测定乳酸、乙酸、丁酸、氨态氮；每组做10个平行，取平均值，测试结果如表5：
表5青贮饲料品质分析
项目 pH 乳酸(mmol.kg<sup>-1</sup>) 乙酸(mmol.kg<sup>-1</sup>) 丁酸(mmol.kg<sup>-1</sup>) NH<sub>3</sub>-N(mmol.kg<sup>-1</sup>)
组1 4.05 132.32 74.32 11.02 13.25
组2 4.12 166.15 53.25 9.02 14.25
组3 4.11 123.25 63.25 12.36 15.26
组4 4.03 136.25 77.36 11.36 14.03
组5 3.87 225.21 57.25 16.36 9.25
组6 4.32 83.25 124.25 56.32 32.25
组7 6.25 18.36 83.03 37.25 151.36
从上表可看出，本申请筛选出来的菌株(SL9、SL13、SL32、SL42)均能提高饲料的乳酸含量，降低乙酸、丁酸和和氨态氮含量。
3、乳杆菌剂对青贮饲料品质的影响：
采用常规方法测定样品粗蛋白、灰分、中性洗涤纤维NDF和酸性洗涤纤维ADF；具体测定结果如表6所示：
表6不同粗饲料营养水平(风干基础)(％)
组别 粗蛋白 灰分 NDF ADF
组1 18.65 6.34 52.31 29.57
组2 19.07 5.13 53.64 28.14
组3 19.35 5.07 53.14 29.04
组4 19.64 5.36 52.87 28.95
组5 22.01 4.31 51.29 29.07
组6 18.64 6.28 52.14 28.78
组7 12.36 12.36 63.25 36.25
从上表可见，本申请的益生菌和市售乳酸菌相比对中性洗涤纤维NDF和酸性洗涤纤维无影响，可提高饲料的粗蛋白含量，降低灰分含量。
实施例4：
采用实施例3的饲料对水牛进行饲喂，
广西水牛研究所种牛场，试验设计：试验时间为2个月，本试验采取随机配对原则，试验牛为三品杂奶水牛(本地水牛×尼里﹣拉菲水牛×摩拉水牛)将70头奶水牛，随机分为实验组和对照组，每组10头奶水牛，按照如下的饲养配方进行喂养实验：
实验组1：采用表3中的组1青贮饲料直接饲喂；
实验组2：采用表3中的组2青贮饲料直接饲喂；
实验组3：采用表3中的组3青贮饲料直接饲喂；
实验组4：采用表3中的组4青贮饲料直接饲喂；
实验组5：采用表3中的组5青贮饲料直接饲喂；
实验组6：采用表3中的组6青贮饲料直接饲喂；
对照组：采用表3中的组7青贮饲料直接饲喂。
饲喂10天后，计算各组奶水牛的粪便干物质增加量；饲喂30天后，计算各组的产奶量；饲喂60天后，计算各组的日平均增重量；观察奶水牛的外观并记录，通过观察并记录实验期发生腹泻的牛头/次，并计算腹泻发病率；其中，干物质增加量、产奶量和日平均增重量计算公式如下：
Figure BDA0002340256690000111
Figure BDA0002340256690000112
Figure BDA0002340256690000113
腹泻发病率计算方法为，统计实验期奶水牛的腹泻发生次数：发生1次腹泻记为1，发生2次腹泻记为2，实验期结束后，用发生腹泻的次数除以样本基数：60(天)×10(头)，计算腹泻发病率；具体实验结果见表7：
表7养殖实验结果
Figure BDA0002340256690000114
Figure BDA0002340256690000121
上表可知，实验组2和实验组5的干物质增加量明显低于实验组1和实验组3-4和对照组，说明本申请的复合菌剂能有效降低粪便干物质含量，提高奶水牛的消化能力，在几个优势菌中粘膜乳杆菌xf13#(SL13)的效果最好；几个菌剂复合使用效果最佳；实验组2和实验组5的产奶量和日平均增重明显高于实验组1和实验组3-4和对照组；说明本申请的复合菌剂能有效提高奶水牛的产奶量和增加奶水牛体重，在几个优势菌中粘膜乳杆菌xf13#(SL13)的效果最好；几个菌剂复合使用效果最佳；而在外观中实验组1-6均无明显差别；而实验组2和实验组5的腹泻发病率显著低于实验组1和实验组3-4和对照组；甚至达到没有腹泻发生，说明本申请的益生菌能有效保护肠道粘膜，降低腹泻发病率的发生，在几个优势菌中粘膜乳杆菌xf13#(SL13)对肠道的调节效果最好。
综上，本申请的乳杆菌复合菌剂发酵pH低，能快速形成乳酸菌发酵的优势环境，抑制杂菌生长，快速形成优势菌群从而提高对饲料的青贮能力；且优势菌中，粘膜乳杆菌xf13#(SL13)对肠道的调节效果最好，能起到良好的调节肠道的作用。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (8)

1.复合乳杆菌菌剂，其特征在于，所述菌剂包括发酵乳杆菌（Lactobacillusfermmentum） xf 09#、粘膜乳杆菌（Lactobacillus mucosae） xf 13#、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）xf 32#、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）xf 42#；
所述发酵乳杆菌（Lactobacillus fermmentum） xf 09#于2019年8月19日保藏在中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为M2019639；粘膜乳杆菌（Lactobacillus mucosae） xf 13#于2019年8月19日保藏在中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为M2019640；嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）xf 32#于2019年8月19日保藏在中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为M2019641；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）xf 42#于2019年8月19日保藏在中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为M2019642。
2.包含权利要求1所述复合乳杆菌菌剂的青贮饲料。
3.根据权利要求2所述青贮饲料，其特征在于，所述青贮饲料由象草和啤酒渣的混合物经复合菌剂发酵制得。
4.包含权利要求1所述复合乳杆菌菌剂的菌粉。
5.根据权利要求4所述菌粉，其特征在于，所述菌粉制备方法为：
（1）将单一菌种接入液体的浓缩增殖培养基中进行发酵，发酵条件为42℃，厌氧发酵，48h，pH根据不同菌种设定为3.92-4.19制得高浓度发酵液；
（2）将步骤（1）含有菌种的浓缩液在5000r/min的条件下离心制得菌悬液；
（3）然后向菌悬液中添加保护剂，进行冷冻干燥得到菌粉。
6.根据权利要求5所述菌粉，其特征在于，所述浓缩增殖培养基为MRS培养基或灭菌水牛乳培养基。
7.根据权利要求6所述菌粉，其特征在于，所述浓缩增殖培养基为水牛乳培养基。
8.包含权利要求1所述复合乳杆菌菌剂、权利要求2所述青贮饲料或权利要求4所述菌粉在制备调节水牛肠道，降低腹泻率相关药物上的应用。
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Assignee: Xingye County Jufeng Planting and Breeding Professional Cooperative

Assignor: GUANGXI ZHUANG AUTONOMOUS REGION BUFFALO INSTITUTE

Contract record no.: X2023980045684

Denomination of invention: A Compound Lactobacillus Agent and Its Application in Water Buffalo Silage Feed

Granted publication date: 20211130

License type: Common License

Record date: 20231106