CN115011497A - 乳酸片球菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及乳酸片球菌及其应用。具体地，本发明分离出一株新的乳酸片球菌，该菌株可用于粕类的发酵。在与其他乳酸菌混合用于粕类的发酵，不仅可以增加粕类发酵酸度，且可以降低其他菌对粕类酸溶蛋白的消耗，增加发酵粕类时酸溶蛋白的含量；同时，本发明的乳酸片球菌混合发酵粕类时，与背景技术中的现有技术相比，料水比较高，可以减少烘干成本。本发明还涉及该菌株与其他乳酸菌的组合应用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域。更具体地，本发明涉及从西藏臧酥油中分离的乳酸片球菌中筛选到的一株新的乳酸片球菌。本发明还涉及所述新的乳酸片球菌的应用。
背景技术
由于鱼类资源的短缺和血浆粉同源污染的风险，利用植物源蛋白取代动物蛋白成为研发的热点。植物源蛋白包括豆粕、棉粕、花生粕、葵粕等。由于植物源蛋白存在抗营养因子和适口性差等因素，限制了植物源蛋白的使用。通过发酵的手段可有效降解植物源蛋白的抗营养因子，并可增加其适口性。
粕类发酵是利用一种或几种微生物作用于粕，在一定条件下进行发酵，经过干燥粉碎等后处理得到的产品，其生产工艺分为耗氧发酵、厌氧发酵以及分段式发酵。耗氧发酵采用耗氧菌，使用浅盘或发酵床进行发酵。该发酵模式优点为发酵周期短，抗营养因子降解明显，产品中富含大量芽孢杆菌；缺点是发酵工艺复杂，发酵过程损耗较高，产业化投资较大。厌氧发酵以厌氧菌发酵为主，结合蛋白酶的添加，该发酵模式抗营养因子和不良寡糖消除彻底，产品适口性强，同时发酵工艺简单，发酵过程损耗较低。
由于厌氧发酵低耗能、高收率、工艺简单等优点，成为粕类发酵的热点。由于厌氧发酵原料不灭菌，如何控制厌氧发酵过程中杂菌的生长较为重要，一般采用在发酵过程添加乳酸菌，起到抑制杂菌生长的作用。在既有的报道中，多采用混合乳酸菌进行发酵，近期相关研究如下：
张佳斌等人，采用不同益生菌进行发酵豆粕发酵，保加利亚乳杆菌结合嗜热链球菌两株进行发酵豆粕的发酵，料水比等于1:1.4、接种量达9%时，所得产品最低pH仅降到5左右，双菌株发酵，pH偏高酸度低，且料水比偏低，烘干成本高（张佳斌,张雪芳,李利君,肖琼,翁惠芬,倪辉,肖安风，不同益生菌固态发酵豆粕的工艺研究[J].集美大学学报(自然科学版),2018,23(03):178-186）。
吝常华等研究发酵豆粕生产工艺，以解淀粉芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母混菌进行发酵，接种量为15%、温度为31℃、料水比为1.0∶1.0，发酵时间为120 h，所得产品pH降至5.21，偏高，且料水比偏低，烘干成本偏高（吝常华,刘国华,常文环,张姝,郑爱娟,邓雪娟,蔡辉益.豆粕微生物固态发酵工艺优化及其营养物质含量变化[J].动物营养学报,2018,30(07):2749-2762）。
豆粕是主要的饲料蛋白，但由于其抗营养因子的存在，尤其是大分子抗原蛋白的存在，易导致动物消化道功能障碍，尤其是断奶的动物。通过发酵可以消除或降低抗营养因子，如将大分子抗原蛋白降解为小分子的蛋白或者肽。可以用酸溶蛋白来表示大分子抗原蛋白降解情况，酸溶蛋白越高，大分子抗原蛋白降解越完全；酸溶蛋白越低，大分子抗原蛋白降解越少。发酵豆粕的发酵方式包括厌氧发酵、好氧发酵和分段式发酵。其中耗氧发酵通过耗氧菌的生长产生的蛋白酶等降解豆粕中的抗营养因子。厌氧发酵通过添加蛋白酶降解抗原蛋白，并通过添加乳酸菌产生抑菌物质，如有机酸（通过酸度来表示）、抗菌肽等，提升发酵过程中的微生物安全性，并增加豆粕的适口性，而且此类发酵豆粕用于饲料配方中，可减少外源有机酸的添加，节约饲料成本。
本领域仍然需要能够用于粕类发酵的性能更好的微生物。
发明内容
本发明人从西藏臧酥油中筛选到一株乳酸片球菌，一方面可单独用于粕类的发酵，另一方面可与其他乳酸菌混合用于粕类的发酵，不仅可以增加粕类发酵酸度，且可以降低其他菌对粕类酸溶蛋白的消耗，增加发酵粕类时酸溶蛋白的含量。
一方面，本发明涉及乳酸片球菌菌株，其16s rDNA如SEQ ID NO:1所示。
在一个实施方案中，所述乳酸片球菌菌株是保藏号为CGMCC NO. 21508 的乳酸片球菌菌株。
在一个实施方案中，所述乳酸片球菌菌株的形式是活细菌、死细菌或其细胞组分。
在一个实施方案中，所述乳酸片球菌菌株是分离的形式。本文使用的术语“分离的”意指从其天然环境分离出来。
在一个实施方案中，所述乳酸片球菌菌株是生物纯的形式。本文使用的术语“生物纯的”是指实验室培养物形式的菌株，其基本上不含其他种类的生物。优选地，所述乳酸片球菌菌株的形式是单一生物种类的培养物。
本文使用的术语“乳酸片球菌菌株”还包括所述乳酸片球菌菌株的突变株。本文使用的术语“突变株”包括含有与SEQ ID NO:1有至少95％同一性，优选至少96％同一性，优选至少97％同一性，优选至少98％同一性，更优选至少99%同一性的核苷酸序列，而在细菌基因组的其他序列中包含突变的衍生菌株。突变株可通过基因工程技术获得，意味着有本发明的菌株遗传物质的改变或意味着有本发明菌株遗传物质与其他分子的重组。通常，为了获得这样的突变菌株，本领域技术人员可使用标准的诱变技术例如UV辐射或暴露于致诱变的化学制品。本文使用的序列“同一性”可使用本领域技术人员已知的标准技术确定。例如，同源性可使用在线的同源性算法“BLAST”程序确定，所述程序可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/公开获得。
本文使用的术语“乳酸片球菌菌株”还包括这样的菌株：其含有的核苷酸序列与亲本乳酸片球菌菌株的核苷酸序列SEQ ID NO:1有至少50、60、70、75、80、85或90％的同一性，优选至少95％、96%、97％、98％或99％的同一性。
另一方面，本发明涉及组合物，其包含上文所述的本发明的乳酸片球菌菌株作为活性成分。在一个实施方案中，所述组合物还包含选自植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌的至少一种另外的菌株作为活性成分。在一个实施方案中，所述乳酸片球菌菌株与所述选自植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌的至少一种另外的菌株是以1:9至9:1，优选1:5至5:1，最优选1:1的体积比混合的。所述组合物还可以包含干酪乳杆菌、戊糖片球菌、罗伊氏乳杆菌、德氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌等。
在一个实施方案中，本发明的组合物是生物催化剂。
另一方面，本发明涉及发酵饲料原料的方法，其包括在饲料原料中添加本发明的乳酸片球菌菌株或本发明的组合物，并且使所述乳酸片球菌菌株，或所述乳酸片球菌菌株和所述选自植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌的至少一种另外的菌株发酵所述饲料原料得到所需产物。
所述组合物还可以包含干酪乳杆菌、戊糖片球菌、罗伊氏乳杆菌、德氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌等。
另一方面，本发明涉及本发明的乳酸片球菌菌株用于提高选自植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌的至少一种另外的菌株在发酵饲料原料过程中的发酵酸度和酸溶蛋白浓度的用途。
在一个实施方案中，所述饲料原料是粕类，可以选自棕榈仁粕、椰子粕、米糠粕、豆皮、玉米皮、豆渣、玉米胚芽粕、菜籽粕、芝麻粕等，优选地，其选自豆粕、花生粕、棉粕和葵粕。
具体实施方式
本发明人从西藏臧酥油中筛选到一株乳酸片球菌，并且对其发酵性能进行了测定。经测试，发现其可用于粕类的发酵。更出乎意料的是，在与其他乳酸菌混合用于粕类的发酵时，不仅可以增加粕类发酵酸度，且可以降低其他菌对粕类酸溶蛋白的消耗，增加发酵粕类时酸溶蛋白的含量。在与其他乳酸菌，如植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌或发酵乳杆菌组合时，在增加酸度和酸溶蛋白浓度方面产生了协同效应。
本发明人还发现，当植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌互相组合时，并没有产生增加发酵过程中酸度和酸溶蛋白浓度的作用。此外，现有技术中的乳酸片球菌菌株（例如CICC 10344）在与植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌或发酵乳杆菌组合时，也没有增加期发酵过程中的酸度和酸溶蛋白浓度。因此，本发明的乳酸片球菌的作用是出乎意料的。
同时，本发明的乳酸片球菌混合发酵粕类时，与背景技术中提到的现有技术相比，料水比（50/19.8）较高，可以减少烘干成本。
以下实施例中，植物乳杆菌M为CGMCC 1.557，购自中国科学院微生物研究所；嗜酸乳杆菌03为CGMCC1.1854，购自中国科学院微生物研究所；发酵乳杆菌02为CGMCC 1.15608，购自中国科学院微生物研究所，乳酸片球菌CICC10344购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
在以下实施例中，酸度和酸溶蛋白含量，均以含有10%水分的物料计算，计算公式如下：
N=M1/(1-M2)*0.9
其中：
N为样品水分为10%条件下的酸度或酸溶蛋白；
M1为烘干后的酸度或酸溶蛋白；
M2为烘干后样品的水分，单位为%。
在以下实施例中，所用MRS液体培养基配方：蛋白胨10g、安琪酵母浸粉 5g、乙酸钠5g、吐温80 1g、七水硫酸镁 0.2g、牛肉膏 10g、葡萄糖20g、柠檬酸二铵 2g、磷酸二氢钾2g、七水硫酸锰 0.05g、水1L；所用MRS固体培养基配方：在MRS液体培养基的基础上，添加2%的琼脂。
在以下实施例中，水分检测采用GB/T6435-2006方法；酸溶蛋白检测采用GB9005.5-2010方法；酸度检测采用滴定的方式进行，具体采用GB5009.239-2016的方法进行检测。
实施例一：菌体的筛选和鉴定
本发明菌株分离自西藏的臧酥油。具体步骤如下：
取1g臧酥油样品重悬于9mL灭菌生理盐水振荡均匀。吸取1mL以上液体，加入9mL灭菌生理盐水中振荡均匀，得到稀释度为10-1的稀释液。重复以上操作进行梯度稀释分别得到稀释度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的稀释液。选择稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的稀释液，取200μL分别涂布于MRS固体培养基上，每个稀释度做两个平行。以上操作在无菌条件下进行。涂布完成后于37℃恒温培养箱中培养。48h后取出平板，在无菌条件下，从平板上的单菌落中挑取直径在1~3mm之间，呈白色、灰白色或乳黄色，表面光滑或略微粗糙等具有乳酸菌特征的菌落在新的MRS固体平板上进行划线纯化，于37℃恒温培养箱中培养24h。显微镜观察，得到一株镜检为球形的菌株。利用菌液进行细菌16S rDNA的PCR扩增。扩增引物为本领域内公知的引物：
上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO:2)
下游引物1492R：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO:3)
PCR体系（50 μL）为：
PCR程序为：① 94oC 5 min；② 94oC 30 s，50 oC 30 s，72 oC 30 s，循环30次；③72oC 5 min。
PCR反应结束， PCR产物经核酸电泳分析确认后，送由生工生物工程（上海股份有限公司）进行测序。得到送测细菌的16S rDNA序列后，将序列与NCBI网站中收录的16S rDNA序列进行比对，上述分离得到的为非工程菌野生乳酸片球菌。
16S rDNA基因经测序结果如下：
TAATTGATCAGGACGTGCTTGCACTGAATGAGATTTTAACATGAAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGCAGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGTATAACAGAGAAAACCGCCTGGTTTTCTTTTAAAAGATGGCTCTGCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTGAGAGTAACTGTTCACCCAGTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTAATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATTACTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGCCAACCTAAGAGATTAGGCGTTCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAAACCGCGAGGTTTAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGG(SEQ ID NO:1)
结论：
经过筛选鉴定，从臧酥油中所筛选到的一株乳酸菌Q为乳酸片球菌。
将该菌株于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），保藏号为CGMCC NO. 21508。
实施例二：乳酸片球菌Q与植物乳杆菌M复配发酵制备发酵豆粕
乳酸菌培养：挑取乳酸片球菌Q与植物乳杆菌M单菌落分别接种到灭菌的含15mlMRS液体培养基的玻璃试管中，37℃培养16h，将培养好的菌液计数后放入4度冰箱中备用。
固体样品制备：取50g商品豆粕（来自大海粮油工业(防城港)有限公司）放于自封袋中，按照100-500U/g豆粕添加蛋白酶（碱性蛋白酶 20万U/g， 购自河南新仰韶生物酶制剂有限公司），混合均匀为a样；将1mL乳酸菌菌液和18.8g纯净水混合均匀后，倒入a样中，再次混合均匀，将袋中空气赶尽（封口留有1cm左右未封，用真空泵从未封口部位进行抽真空处理，待抽真空后，完全封口），封袋口后，样品放于40℃恒温培养箱中培养72h。培养72h后样品于65℃烘箱中烘6h后，粉碎过60目筛，进行酸溶蛋白、pH和酸度的测定，酸度采用滴定的方式进行。其中样品1为单植物乳杆菌M进行发酵豆粕的制备；样品2为乳酸片球菌Q与植物乳杆菌M按照1:9的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品3为乳酸片球菌Q与植物乳杆菌M按照1:5的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品4为乳酸片球菌Q与植物乳杆菌M按照1:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品5为乳酸片球菌Q与植物乳杆菌M按照5:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品6为乳酸片球菌Q与植物乳杆菌M按照9:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品7为单乳酸片球菌进行发酵豆粕的制备。以上所述比例混合均为体积比。
乳酸片球菌Q与植物乳杆菌M培养结果：
固态发酵结果：
结论：乳酸片球菌Q复配植物乳杆菌M进行发酵豆粕的发酵，有利于提升发酵豆粕酸度和发酵豆粕的酸溶蛋白含量。两者产生了协同效应。
实施例三：乳酸片球菌Q与嗜酸乳杆菌03复配发酵制备发酵豆粕
乳酸菌培养：分别挑取乳酸片球菌Q与嗜酸乳杆菌03单菌落接种到灭菌的含15mlMRS液体培养基的玻璃试管中，37℃培养16h，将培养好的菌液放入4度冰箱中备用。
固体样品制备：取50g商品豆粕（来自大海粮油工业(防城港)有限公司）放于自封袋中，按照100-500U/g豆粕添加蛋白酶（碱性蛋白酶，20万U/g 购自河南新仰韶生物酶制剂有限公司），混合均匀为a样；将1mL乳酸菌菌液和18.8g纯净水混合均匀后，倒入a样中，再次混合均匀，将袋中空气赶尽，封袋口后，样品放于40℃恒温培养箱中培养72h ，培养72h后样品于65℃烘箱中烘6h后，粉碎过60目筛，进行酸溶蛋白、pH和酸度的测定，酸度采用滴定的方式进行。其中样品1为单嗜酸乳乳杆菌03进行发酵豆粕的制备；样品2为乳酸片球菌Q与嗜酸乳乳杆菌按照1:9的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品3为乳酸片球菌Q与嗜酸乳乳杆菌03按照1:5的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品4为乳酸片球菌Q与嗜酸乳乳杆菌03按照1:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品5为乳酸片球菌Q与嗜酸乳乳杆菌03按照5:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品6为乳酸片球菌Q与嗜酸乳乳杆菌03按照9:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品7为单乳酸片球菌Q进行发酵豆粕的制备。以上所述比例混合均为体积比。
乳酸片球菌Q与嗜酸乳杆菌03培养结果：
固体发酵结果：
结论：乳酸片球菌Q复配嗜酸乳杆菌03进行发酵豆粕的发酵，有利于提升发酵豆粕酸度和发酵豆粕的酸溶蛋白含量。两者产生了协同效应。
实施例四：乳酸片球菌Q与发酵乳杆菌02复配发酵制备发酵豆粕
乳酸菌培养：挑取乳酸片球菌Q与发酵乳杆菌02单菌落分别接种到灭菌的含15mlMRS液体培养基的玻璃试管中，37℃培养16h，将培养好的菌液放入4度冰箱中备用。
固体样品制备：取50g商品豆粕（来自大海粮油工业(防城港)有限公司）放于自封袋中，按照100-500U/g豆粕添加蛋白酶（碱性蛋白酶，20万U/g 购自河南新仰韶生物酶制剂有限公司），混合均匀为a样；将1mL乳酸菌菌液和18.8g纯净水混合均匀后，倒入a样中，再次混合均匀，将袋中空气赶尽，封袋口后，样品放于40℃恒温培养箱中培养72h ，培养72h后样品于65℃烘箱中烘6h后，粉碎过60目筛，进行酸溶蛋白、pH和酸度的测定，酸度采用滴定的方式进行。其中样品1为单发酵乳杆菌02进行发酵豆粕的制备；样品2为乳酸片球菌Q与发酵乳杆菌02按照1:9的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品3为乳酸片球菌Q与发酵乳杆菌02按照1:5的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品4为乳酸片球菌Q与发酵乳杆菌02按照1:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品5为乳酸片球菌Q与发酵乳杆菌02按照5:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品6为乳酸片球菌Q与发酵乳杆菌02按照9:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品7为单乳酸片球菌Q进行发酵豆粕的制备。以上所述比例混合均为体积比。
乳酸片球菌Q与发酵乳杆菌02培养结果：
固体发酵结果：
结论：乳酸片球菌Q复配发酵乳杆菌02进行发酵豆粕的发酵，有利于提升发酵豆粕酸度和发酵豆粕的酸溶蛋白含量。两者产生了协同效应。
对比例一：植物乳杆菌M与发酵乳杆菌02复配发酵制备发酵豆粕
乳酸菌培养：挑取植物乳杆菌M与发酵乳杆菌02单菌落分别接种到灭菌的含15mlMRS液体培养基的玻璃试管中，37℃培养16h，将培养好的菌液放入4度冰箱中备用。
固体样品制备：取50g商品豆粕（来自大海粮油工业(防城港)有限公司）放于自封袋中，按照100-500U/g豆粕添加蛋白酶（碱性蛋白酶，20万U/g 购自河南新仰韶生物酶制剂有限公司），混合均匀为a样；将1mL乳酸菌菌液和18.8g纯净水混合均匀后，倒入a样中，再次混合均匀，将袋中空气赶尽，封袋口后，样品放于40℃恒温培养箱中培养72h ，培养72h后样品于65℃烘箱中烘6h后，粉碎过60目筛，进行酸溶蛋白、pH和酸度的测定，酸度采用滴定的方式进行。其中样品1为单植物乳杆菌M进行发酵豆粕的制备；样品2为发酵乳杆菌02与植物乳杆菌M按照1:9的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品3为发酵乳杆菌02与植物乳杆菌M按照1:5的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品4为发酵乳杆菌02与植物乳杆菌M按照1:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品5为发酵乳杆菌02与植物乳杆菌M按照5:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品6 为发酵乳杆菌02与植物乳杆菌M按照9:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品7为单发酵乳杆菌02发酵豆粕的制备。以上所述比例混合均为体积比。
植物乳杆菌M与发酵乳杆菌02培养结果：
固体发酵结果：
结论：植物乳杆菌M与发酵乳杆菌02复配进行发酵豆粕的发酵，对发酵豆粕的酸度和酸溶蛋白无显著影响。
对比例二：嗜酸乳杆菌03与植物乳杆菌M复配发酵制备发酵豆粕
乳酸菌培养：挑取嗜酸乳杆菌03与植物乳杆菌M单菌落分别接种到灭菌的含15mlMRS液体培养基的玻璃试管中，37℃培养16h，将培养好的菌液放入4度冰箱中备用。
固体样品制备：取50g商品豆粕（来自大海粮油工业(防城港)有限公司）放于自封袋中，按照100-500U/g豆粕添加蛋白酶（碱性蛋白酶，20万U/g 购自河南新仰韶生物酶制剂有限公司），混合均匀为a样；将1mL乳酸菌菌液和18.8g纯净水混合均匀后，倒入a样中，再次混合均匀，将袋中空气赶尽，封袋口后，样品放于40℃恒温培养箱中培养72h ，培养72h后样品于65℃烘箱中烘6h后，粉碎过60目筛，进行酸溶蛋白、pH和酸度的测定，酸度采用滴定的方式进行。其中样品1为嗜酸乳杆菌03进行发酵豆粕的制备；样品2为植物乳杆菌M与嗜酸乳杆菌03按照1:9的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品3为植物乳杆菌M与嗜酸乳杆菌03按照1:5的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品4为植物乳杆菌M与嗜酸乳杆菌03按照1:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品5为为植物乳杆菌M与嗜酸乳杆菌03按照5:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品6为植物乳杆菌M与嗜酸乳杆菌03按照9:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品7为单植物乳杆菌M发酵豆粕的制备。以上所述比例混合均为体积比。
嗜酸乳杆菌03与植物乳杆菌M培养结果：
固体发酵结果：
结论：嗜酸乳杆菌03与植物乳杆菌M复配进行发酵豆粕的发酵，对发酵豆粕的酸度和酸溶蛋白无显著影响。
对比例三：嗜酸乳杆菌03与发酵乳杆菌02复配发酵制备发酵豆粕
乳酸菌培养：挑取嗜酸乳杆菌03与发酵乳杆菌02单菌落分别接种到灭菌的含15mlMRS液体培养基的玻璃试管中，37℃培养16h，将培养好的菌液放入4度冰箱中备用。
固体样品制备：取50g商品豆粕（来自大海粮油工业(防城港)有限公司）放于自封袋中，按照100-500U/g豆粕添加蛋白酶（碱性蛋白酶，20万U/g 购自河南新仰韶生物酶制剂有限公司），混合均匀为a样；将1mL乳酸菌菌液和18.8g纯净水混合均匀后，倒入a样中，再次混合均匀，将袋中空气赶尽，封袋口后，样品放于40℃恒温培养箱中培养72h ，培养72h后样品于65℃烘箱中烘6h后，粉碎过60目筛，进行酸溶蛋白、pH和酸度的测定，酸度采用滴定的方式进行。其中样品1为嗜酸乳杆菌03进行发酵豆粕的制备；样品2为发酵乳杆菌02与嗜酸乳杆菌03按照1:9的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品3为发酵乳杆菌02与嗜酸乳杆菌03按照1:5的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品4为发酵乳杆菌02与嗜酸乳杆菌03按照1:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品5为发酵乳杆菌02与嗜酸乳杆菌03按照5:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品6为发酵乳杆菌02与嗜酸乳杆菌03按照9:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品7为发酵乳杆菌02发酵豆粕的制备。以上所述比例混合均为体积比。
嗜酸乳杆菌03与发酵乳杆菌02培养结果：
固体发酵结果：
结论：嗜酸乳杆菌03与发酵乳杆菌02复配进行发酵豆粕的发酵，对发酵豆粕的酸度和酸溶蛋白无显著影响。
对比例四：购买乳酸片球菌CICC 10344分别与发酵乳杆菌02、植物乳杆菌M、嗜酸乳杆菌03进行复配制备发酵豆粕
乳酸菌培养：挑取乳酸片球菌M、发酵乳杆菌02、植物乳杆菌M、嗜酸乳杆菌03单菌落分别接种到灭菌的含15ml MRS液体培养基的玻璃试管中，37℃培养16h，将培养好的菌液放入4度冰箱中备用。
固体样品制备：取50g商品豆粕（来自大海粮油工业(防城港)有限公司）放于自封袋中，按照100-500U/g豆粕添加蛋白酶（碱性蛋白酶，20万U/g 购自河南新仰韶生物酶制剂有限公司），混合均匀为a样；将1mL乳酸菌菌液和18.8g纯净水混合均匀后，倒入a样中，再次混合均匀，将袋中空气赶尽，封袋口后，样品放于40℃恒温培养箱中培养72h ，培养72h后样品于65℃烘箱中烘6h后，粉碎过60目筛，进行酸溶蛋白、pH和酸度的测定，酸度采用滴定的方式进行。其中样品1为乳酸片球菌CICC 10344进行发酵豆粕的制备；样品2为乳酸片球菌CICC 10344和发酵乳杆菌02按照1:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品3为发酵乳杆菌02单菌制备发酵豆粕的样品；4为乳酸片球菌CICC 10344和植物乳杆菌M按照1:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品5 为单植物乳杆菌M进行制备发酵豆粕样品；样品6为乳酸片球菌CICC 10344和嗜酸乳杆菌03 1:1的比例混合后进行发酵豆粕的制备；样品7为单嗜酸乳杆菌03进行制备发酵豆粕的样品。以上所述比例混合均为体积比。
各乳酸菌培养结果：
固体发酵结果：
结论：乳酸片球菌CICC 10344与其他乳酸菌复配进行发酵豆粕的制备，对发酵豆粕的酸度和酸溶蛋白无显著影响。
<110> 丰益（上海）生物技术研发中心有限公司
<120> 乳酸片球菌及其应用
<130> CPCH2062875N
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1399
<212> DNA
<213> 乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）
<400> 1
taattgatca ggacgtgctt gcactgaatg agattttaac atgaagtgag tggcggacgg 60
gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcccagaa gcaggggata acacctggaa acagatgcta 120
ataccgtata acagagaaaa ccgcctggtt ttcttttaaa agatggctct gctatcactt 180
ctggatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcgatgat 240
gcgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact gagacacggc ccagactcct 300
acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgcaa gtctgatgga gcaacgccgc 360
gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaag ctctgttgtt aaagaagaac gtgggtgaga 420
gtaactgttc acccagtgac ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 480
gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca 540
ggcggtcttt taagtctaat gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg cattggaaac 600
tgggagactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag 660
atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct 720
cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgatgat 780
tactaagtgt tggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta agtaatccgc 840
ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaagaattg acgggggccc gcacaagcgg 900
tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcttct 960
gccaacctaa gagattaggc gttcccttcg gggacagaat gacaggtggt gcatggttgt 1020
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattact 1080
agttgccagc attcagttgg gcactctagt gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1140
ggggacgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga 1200
tggtacaacg agtcgcgaaa ccgcgaggtt tagctaatct cttaaaacca ttctcagttc 1260
ggactgtagg ctgcaactcg cctacacgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca 1320
tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg 1380
taacacccaa agccggtgg 1399
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
tacggytacc ttgttacgac tt 22
Claims (10)
1. 乳酸片球菌菌株，其包含与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性，优选至少99%同一性的核苷酸序列，最优选地，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
2. 权利要求1的乳酸片球菌菌株，其是保藏号为CGMCC NO. 21508的乳酸片球菌菌株。
3.权利要求1的乳酸片球菌菌株，其是重组菌株。
4.组合物，其包含权利要求1-3的任一项的乳酸片球菌菌株。
5.权利要求4的组合物，其还包含选自植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌的至少一种另外的菌株。
6.权利要求5的组合物，其中所述乳酸片球菌菌株与所述选自植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌的至少一种另外的菌株是以1:9至9:1，优选1:5至5:1，最优选1:1的体积比混合的。
7.权利要求4-6的任一项的组合物，其是生物催化剂。
8.发酵饲料原料的方法，其包括在饲料原料中添加权利要求1-3的任一项的乳酸片球菌菌株或权利要求4-7的任一项的组合物，并且使所述乳酸片球菌菌株，或所述乳酸片球菌菌株和所述选自植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌的至少一种另外的菌株发酵所述饲料原料得到所需产物。
9.权利要求8的方法，其中所述饲料原料是粕类，优选地，其选自豆粕、花生粕、棉粕和葵粕。
10.权利要求1-3的任一项的乳酸片球菌菌株用于提高选自植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌的至少一种另外的菌株在发酵饲料原料，优选粕类过程中的发酵酸度和酸溶蛋白浓度的用途。
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|---|---|---|---|---|
| CN115011498A (zh) * | 2021-03-05 | 2022-09-06 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 耐高温耐高糖的乳酸片球菌 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104388345A (zh) * | 2014-11-05 | 2015-03-04 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 一株乳酸片球菌新菌株及其用途 |
| CN107034163A (zh) * | 2017-05-23 | 2017-08-11 | 北京市农林科学院 | 一种新型乳酸片球菌及其应用 |
-
2021
- 2021-03-05 CN CN202110244663.8A patent/CN115011497A/zh active Pending
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