CN110616159B - 一种马克斯克鲁维酵母菌冻干菌粉制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种马克斯克鲁维酵母菌冻干菌粉制备方法，属于马克斯克鲁维酵母菌制品生产技术领域。所述马克思克鲁维酵母Kluyveromyces.Marxianus，保藏号为CGMCC NO.14274，菌株编号为SXJ2，保藏日期为2017年6月26日。该马克思克鲁维酵母菌冻干菌粉的制备主要包括以下步骤：a)菌种活化与增殖培养；b)收集菌体；c)预冻及真空冷冻干燥。本发明中以每100mL菌悬液添加10.5g～11.5g蔗糖、4.5g～5.5g甘露醇、15.0g～16.0g麦芽糊精、7.5g～8.5g脱脂乳粉为冻干保护剂。本发明的马克斯克鲁维酵母菌冻干菌粉是在含糖蜜、麸皮等物质的增殖培养基中进行增殖的，增殖的菌液经离心处理，加入蔗糖、甘露醇、麦芽糊精、脱脂乳粉等物质作为冻干保护剂，干燥后得到更高存活率的冻干菌粉。

Description

一种马克斯克鲁维酵母菌冻干菌粉制备方法
技术领域
本发明属于马克斯克鲁维酵母菌制品生产技术领域，涉及一种马克斯克鲁维酵母菌冻干菌粉制备方法。
背景技术
马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)是发酵生产乳制品的优质菌种，可以产生多种芳香物质，赋予乳制品独特的风味特点；产生有益于人体健康的各种酶类、维生素及其它活性成分，丰富乳制品的营养及益生功能特性。Kluyveromycesmarxianus同时还具有代谢乳糖功能，有效地将乳糖分解成半乳糖，缓解消费者乳糖不耐症。特别是部分马克斯克鲁维酵母菌菌株酒精产量低，可利用低成本的发酵底物来进行菌种生产和菌剂的制备，因此，被认为是替代酿酒酵母进行工业发酵生产含醇乳饮品的优良候选菌种，成为了越来越多研究学者眼中的新宠儿。
菌种在真空冷冻干燥时，酶的活性丧失少，并能保持菌种形态、色泽，冷冻干燥菌粉复水性好，脱水彻底，保存期长，储存运输和使用都很方便。但是，在实际的使用时，冷冻干燥过程中水的结晶、细胞的失水等情况使得菌体出现死亡或损伤，对于菌种的保存、生产使用非常不利。有报道称，菌体在无任何保护措施下冻干时会使其存活率很低，甚至低至0.1％。
在欧洲，食品安全局已将马克斯克鲁维酵母列入食品和饲料添加的安全生物制剂范围，表明了马克斯克鲁维酵母的安全性和重要价值。在国内，研究者已经认识到马克斯克鲁维酵母的商业化价值，但严重缺乏相关马克斯克鲁维酵母冻干菌粉的研究，极度不利于马克斯克鲁维酵母高活性菌剂的工业化应用。
有报道称，冻干保护剂的使用可以极大地提高菌体在真空冷冻干燥下的存活率和冻干菌粉的稳定性。不同微生物其菌种细胞适用的保护剂类型不甚相同，所以针对特定菌种及菌株优化保护剂配方，可以有效的获得高细胞活性的冻干菌剂。
目前，利用乳酸菌制作冻干菌粉的方法比较常见，而用马克思克鲁维酵母制作冻干菌粉的方法较为少见。陕西科技大学陈合等人申请的“一种嗜热链球菌冻干菌粉的制备方法”(CN 103937725 A)是利用嗜热链球菌制备冻干菌粉。汉臣氏(沈阳)儿童制品有限公司闵祥博等人申请的“一种乳双歧杆菌冻干菌粉的制备方法”(CN 109022322 A)是利用乳双歧杆菌制备冻干菌粉。上海谱莱生物技术有限公司方曙光申请的“一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的制备方法”(CN101486986B)是利用嗜酸乳杆菌制备冻干菌粉。北京农学院刘慧等人申请的“一种降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母冻干菌粉的制备方法”(CN 102524794 A)是利用马克思克鲁维酵母制备冻干菌粉，但是其冻干存活率只有65％-70％。
发明内容
本发明的目的是提供一株优质的马克斯克鲁维酵母，本发明是通过筛选、优化冻干保护剂配方以提高所述菌株冻干存活率的冻干菌粉制备方法。
本发明所述的一种马克斯克鲁维酵母菌，已于2017年6月26日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC NO.14274，菌株编号：SXJ2，建议的分类命名为：马克斯克鲁维酵母菌Kluyveromycesmarxianus。
本发明的一种马克斯克鲁维酵母菌冻干菌粉制备方法，按照下述步骤进行：
a)菌种活化与增殖培养：将马克斯克鲁维酵母菌接种到YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)液体培养基中活化，将已活化的菌种接种于增殖培养基中增殖培养，得到增殖的菌液；
b)收集菌体：取一定体积的上述增殖菌液在4℃，6000r/min的条件下离心15min后，弃去上清液，收集沉淀；相同离心条件下，将沉淀用无菌生理盐水离心洗涤2次，得菌泥；
c)干燥：将制备的菌泥用相同体积的生理盐水重悬，制成菌悬液，然后按照每100mL菌悬液添加蔗糖10.5g～11.5g、甘露醇4.5g～5.5g、麦芽糊精15.0g～16.0g、脱脂乳粉7.5g～8.5g，混合均匀后真空冷冻干燥，即得马克斯克鲁维酵母菌冻干菌粉；
所述增殖培养基配方为：用蒸馏水将麦芽汁稀释至10Brix作为基础培养基。在基础培养基中按重量比添加糖蜜2.5％～3.5％、麸皮1％～2％、CaCO3 0.1％～0.2％。
所述步骤a)中活化是指将马克斯克鲁维酵母菌接种YPD液体培养基中于28～30℃培养20～24h，再按每100mL培养基中接种3-4mL菌种的比例，接种于与上述YPD液体培养基相同的培养基中，并在相同条件下活化至第三代。
所述步骤a)中增殖培养的接种比例为每100mL增殖培养基中接种3-4mL已活化的菌种。
所述步骤a)中增殖培养是于28～30℃下培养16-18h。
所述步骤a)中YPD培养基的配方为：每1L蒸馏水中加入10g酵母提取物、20g葡萄糖、20g蛋白胨。
所述马克斯克鲁维酵母菌增殖培养基的方法，按照下述步骤进行：
首先用无菌蒸馏水将麦芽汁稀释至10Brix，制成麦芽汁基础培养基，然后加入按照重量比1.0％～1.5％称量的麸皮，煮沸后，继续小火煮30min，冷却后8层纱布过滤，得滤液，定容。按照重量比2％～3％称量的糖蜜与上述滤液均匀混合，分装于盛有按重量比0.1％～0.2％称量的CaCO3的锥形瓶中。灭菌，冷却后备用。
首先用无菌蒸馏水将麦芽汁稀释至10Brix，制成麦芽汁基础培养基；
其次在基础培养基中按照重量比加入1.0％～1.5％的麸皮，煮沸后，继续小火煮30min，冷却后8层纱布过滤，得滤液，定容；
最后在基础培养基中按照重量比加入2％～3％的糖蜜，与上述滤液均匀混合，分装于盛有按重量比0.1％～0.2％称量的CaCO3的锥形瓶中。灭菌，冷却后备用。
所述步骤b)中离心处理为0-4℃、5500-6500rpm离心15-20min。
所述步骤c)中真空冷冻干燥是在冻干机中进行20-26h。
所述步骤c)中真空冷冻干燥之前在-20℃预冻12-15h。
与现有技术相比，本发明的马克斯克鲁维酵母菌冻干菌粉是在含糖蜜、麸皮等物质的增殖培养基中进行增殖的，增殖的菌液经离心处理，加入蔗糖、甘露醇、麦芽糊精、脱脂乳粉等物质作为冻干保护剂，干燥后得到更高存活率的冻干菌粉。根据本发明制备的马克斯克鲁维酵母菌冻干菌粉可使其冻干存活率最高可达88.22％；而不添加冻干保护剂制备的马克斯克鲁维酵母菌粉冻干存活率最高仅为2.31％。本发明中蔗糖可以穿透细胞壁进入细胞，提高细胞内溶质浓度，维持细胞内外渗透压平衡，避免细胞在冻干过程中因过度脱水而皱缩；甘露醇的羟基可与菌体细胞膜蛋白质及膜磷脂上的极性基团结合形成氢键，进而稳定蛋白质及膜磷脂的结构和功能，对细胞膜起到保护作用；麦芽糊精可以通过提高物料的玻璃化转变温度，减少水分子结晶对细胞膜的损害；脱脂乳粉可以在菌体细胞表面形成一种外膜，从而保护细胞免受冻害。本发明通过优化冻干保护剂配方，获得了高活性马克斯克鲁维酵母菌冻干菌粉。
附图说明
图1为马克斯克鲁维酵母菌Kluyveromyces marxianus的生物进化树。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
开菲尔粒的活化：将采集的开菲尔粒滤去培养液，无菌生理盐水冲洗干净后以3％(w/v)的接种比例接种于经过95℃，30min灭菌过的脱脂乳中，140rpm，28℃培养24h。循环培养6次至pH稳定。
稀释液的制备：将上述pH稳定的开菲尔培养液1mL注入9mL无菌生理盐水中，用振荡器充分振荡混匀，制成初步稀释液。取初次稀释液0.1mL注入0.9mL无菌生理盐水中，用吸管反复吹打，并用振荡器将其充分振荡混匀，使菌体均匀分布。充分上述操作，使稀释倍数达到105，作为菌种接种液备用。
菌株的分离：将上述接种液涂布于YGC培养基(酵母提取物葡萄糖氯霉素培养基)，28℃培养72h。
菌株形态学鉴定：挑取白色、菌落大、过氧化氢呈阳性、革兰氏染色菌体大的菌落。初步认定为酵母菌。
酵母菌分子生物学鉴定：将目标菌落扩大培养，用Ezup柱式真菌基因组抽提试剂盒提取其总DNA。对提取的DNA进行5.8S rDNA PCR扩增。引物为真菌通用引物：ITS1(tccgtaggtgaacctgcgg)与ITS4(tcctccgcttattgatatgc)。
PCR反应体系如表1所示：
表1 PCR反应体系
体系 用量/μL
模板DNA 2
上游引物 0.5
下游引物 0.5
Mix酶 12.5
ddH2O 9.5
PCR反应程序，见表2：
表2 PCR反应程序
取2.5μL PCR扩增产物与0.5μL 10×Loading buffer均匀混合，进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，用EB染色5min，紫外灯下观察后拍照保存，根据凝胶成像系统记录PCR扩增结果。将扩增产物送去生物公司测序，所得序列用NCBI的BLAST检索系统对比分析，并用软件MEG5.1构建生物进化树如图1所示。上述分离得到的马克斯克鲁维酵母菌，已于2017年6月26日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC NO.14274，菌株编号：SXJ2，建议的分类命名为：马克斯克鲁维酵母菌Kluyveromyces marxianus。
实施例2
a)菌种活化与增殖培养：
将马克斯克鲁维酵母菌接种YPD液体培养基中于28℃培养20～24h，再按体积比(v/v)为3％的比例接种于与上述YPD液体培养基相同的培养基中，即酶100mL培养基中接种3mL菌种，并在相同条件下活化至第三代。
向增殖培养基中接入3％(v/v)已活化的马克斯克鲁维酵母菌，于28℃下培养16h。
b)收集菌体：
然后在4℃、6000rpm离心15min，弃去上清液，获得菌泥。
c)预冻及真空冷冻干燥：
将制备的菌泥用相同体积的生理盐水重悬，制成菌悬液，然后按照每100mL菌悬液添加蔗糖10.5g、甘露醇4.5g、麦芽糊精15.0g、脱脂乳粉7.5g，混合均匀后，于-20℃预冻12h，然后放入冻干机于-56℃、5Pa下进行空冷冻干燥24h，即得马克斯克鲁维酵母菌冻干菌粉；
其冻干存活率可为88.22％(对照组为2.31％)。菌粉活菌数为6.05×108cfu/mL(对照组为1.58×107cfu/mL)
其中，马克斯克鲁维酵母菌增殖培养基的配制步骤包括：
首先用无菌蒸馏水将麦芽汁稀释至10Brix，制成麦芽汁基础培养基，然后加入按照重量比1.0％称量的麸皮，煮沸后，继续小火煮30min，冷却后8层纱布过滤，得滤液，定容。按照重量比2.5％称量的糖蜜与上述滤液均匀混合，分装于盛有按重量比0.1％称量的CaCO3的锥形瓶中，自然pH，115℃灭菌15min，冷却后备用。
实施例3
a)菌种活化与增殖培养：
将马克斯克鲁维酵母菌接种YPD液体培养基中于30℃培养20～24h，再按体积比(v/v)为3％的比例接种于与上述YPD液体培养基相同的培养基中，即酶100mL培养基中接种3mL菌种，并在相同条件下活化至第三代。
向增殖培养基中接入3.5％(v/v)已活化的马克斯克鲁维酵母菌，于30℃下培养16h。
b)收集菌体：然后在4℃、5500rpm离心20min，弃去上清液，获得菌泥。
c)预冻及真空冷冻干燥：
将制备的菌泥用相同体积的生理盐水重悬，制成菌悬液，然后按照每100mL菌悬液添加蔗糖11.5g、甘露醇5.5g、麦芽糊精16.0g、脱脂乳粉8.5g，混合均匀后，于-20℃预冻14h，然后放入冻干机于-56℃、5Pa下进行空冷冻干燥24h，即得马克斯克鲁维酵母菌冻干菌粉；
其冻干存活率可为85.46％(对照组为2.07％)。菌粉活菌数为5.81×108cfu/mL(对照组为1.41×107cfu/mL)
其中，马克斯克鲁维酵母菌增殖培养基的配制步骤包括：
首先用无菌蒸馏水将麦芽汁稀释至10Brix，制成麦芽汁基础培养基，然后加入按照重量比1.5％称量的麸皮，煮沸后，继续小火煮30min，冷却后8层纱布过滤，得滤液，定容。按照重量比2.5％称量的糖蜜与上述滤液均匀混合，分装于盛有按重量比0.15％称量的CaCO3的锥形瓶中，自然pH，115℃灭菌15min，冷却后备用。

Claims (1)

1.一种马克斯克鲁维酵母菌冻干菌粉制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：
a)菌种活化与增殖培养：将马克斯克鲁维酵母菌接种到YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)液体培养基中活化，将已活化的菌种接种于增殖培养基中增殖培养，得到增殖的菌液；
b)收集菌体：取一定体积的上述增殖菌液在4℃，6000r/min的条件下离心15min后，弃去上清液，收集沉淀；相同离心条件下，将沉淀用无菌生理盐水离心洗涤2次，得菌泥；
c)干燥：将制备的菌泥用相同体积的生理盐水重悬，制成菌悬液，然后按照每100mL菌悬液添加蔗糖10.5g～11.5g、甘露醇4.5g～5.5g、麦芽糊精15.0g～16.0g、脱脂乳粉7.5g～8.5g，混合均匀后真空冷冻干燥，即得马克斯克鲁维酵母菌冻干菌粉；
所述增殖培养基配方为：用蒸馏水将麦芽汁稀释至10Brix作为基础培养基；在基础培养基中按重量比添加糖蜜2.5％～3.5％、麸皮1％～2％、CaCO3 0.1％～0.2％；
所述步骤a)中活化是指将马克斯克鲁维酵母菌接种YPD液体培养基中于28～30℃培养20～24h，再按每100mL培养基中接种3-4mL菌种的比例，接种于与上述YPD液体培养基相同的培养基中，并在相同条件下活化至第三代；
所述步骤a)中增殖培养的接种比例为每100mL增殖培养基中接种3-4mL已活化的菌种；
所述步骤a)中增殖培养是于28～30℃下培养16-18h；
所述步骤a)中YPD培养基的配方为：每1L蒸馏水中加入10g酵母提取物、20g葡萄糖、20g蛋白胨；
所述步骤b)中离心处理为0-4℃、5500-6500rpm离心15-20min；
所述步骤c)中真空冷冻干燥是在冻干机中进行20-26h；
所述步骤c)中真空冷冻干燥之前在-20℃预冻12-15h；
所述的一种马克斯克鲁维酵母菌，保藏号：CGMCC NO.14274，建议的分类命名为：马克斯克鲁维酵母菌Kluyveromyces marxianus。
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