CN113430130B

CN113430130B - 由新菌亚罗酵母y1耦合的复合菌剂及其制备的驴乳奶啤

Info

Publication number: CN113430130B
Application number: CN202110616523.9A
Authority: CN
Inventors: 武运; 张剑林; 殷娜; 尹丽萍; 王伟雄; 姚荣涛
Original assignee: Xinjiang Agricultural University
Current assignee: Xinjiang Ruiyuan Food Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2021-06-02
Filing date: 2021-06-02
Publication date: 2023-05-02
Anticipated expiration: 2041-06-02
Also published as: CN113430130A

Abstract

本发明公开了一种由新菌株亚罗酵母(Yarrowiasp.)Y1耦合植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)S乳获得复合菌剂及其制备的驴乳奶啤，利用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)S乳和亚罗酵母(Yarrowiasp.)Y1在低pH值活性高且热稳定性好的特点，结合二者发酵特点，将二者发酵液按照体积比1:2混合耦合获得复合菌剂，按照接种量5％接种耦合发酵制备的驴乳奶啤呈淡黄色，性状均匀，口感细腻，风味独特，泡沫丰富，酒精度为0.45％±0.03％Vol，酸度为10.5±0.23°T，是一种特征性比较突出的新的奶啤产品，对于多元化利用新疆驴乳资源具有重要的现实价值。

Description

由新菌亚罗酵母Y1耦合的复合菌剂及其制备的驴乳奶啤

技术领域

本发明属于食品科学技术领域，具体的涉及新菌株亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1耦合植物乳杆菌的复合菌剂及其制备驴乳奶啤的技术领域。

背景技术

驴乳作为一种天然的食品资源，是低脂肪、低胆固醇的食品，具有降低血脂血压、软化血管、抑制结核杆菌的作用，具有抗菌抑菌、抗癌抑癌、消炎止痛、抗疲劳、抗氧化等功效，而驴乳蛋白属于优质蛋白，包含多种生物活性成分，促进消化和吸收，增强人体免疫力，因此驴乳不仅具有较高的营养价值，更具有广泛的药用价值，因其独特的成分，自古以来就被作为滋补营养品，也是治疗和预防多种疾病的食疗佳品。

目前，国内对驴乳的开发与利用主要集中在营养特性和化学成分研究方面，对于驴乳制品的研发和利用还有待进一步拓展。驴乳业的兴起，使驴乳的生产与加工受到社会群体的密切关注，随着新疆驴产业日益发展，生鲜驴乳及其制品市场需求增多。

奶啤又称“奶香槟”，是以鲜牛奶作为原料，利用二次生物发酵技术酿制的一种高附加值、无醇(小于0.5％vol)、含二氧化碳的高级乳制饮品。针对国内奶啤生产商大多采用市售的酿酒酵母(Saccha-romyces cerevisiae)进行奶啤发酵奶啤造成产品口味雷同、品种单一、酵母馊味较重及生产工艺复杂成本偏高等问题，当前对于奶啤的研究主要集中在配方、发酵菌种等方面的改善，生产奶啤使用的乳酸菌主要是嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)或干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)等。以生鲜驴乳为原料的驴乳奶啤是一款新型具有酸奶与麦芽汁糅合后的独特风味的发酵乳饮料，现有关于驴乳奶啤的专利和文献主要集中在驴奶啤制备工艺的改进，目前关于驴乳奶啤生产还存在生产工艺复杂、产品口感不佳和发酵剂单一等问题，因此迫切需要拓展驴乳奶啤的发酵剂及优化驴奶啤制备工艺，进而改善驴奶啤口感并降低生产成本，且未见有文献和专利有关使用复合菌发酵驴乳奶啤的报道，如何提高驴乳的附加值，对带动企业和市场经济具有显著意义。

发明内容

针对发酵驴乳奶啤存在口感不佳、发酵剂单一且种类少及生产工艺复杂等问题，且未见文献和专利报道采用新菌株亚罗酵母(Yarrowia sp.)，以及利用其新菌耦合后的复合菌发酵制备风味独特的新型驴乳奶啤的技术现状，本发明旨在于提供一株新菌株亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)耦合后复合菌剂发酵制备的驴乳奶啤。本发明从新疆昌吉州阜康农牧民家中采集的酸马乳中分离筛选获得一株经过微生物公认的鉴定方法证实为新菌株的亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳，其中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳经微生物公认的鉴定方法证实为常见的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，利用新菌株Y1和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)在低pH值活性高且热稳定性好的特点，结合二者耦合发酵特点，将其应用于发酵制备驴乳奶啤。当植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)发酵液和亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1发酵液按照体积比1：2混合耦合，按照5％总接种量接种耦合发酵制备的驴乳奶啤呈淡黄色，性状均匀，口感细腻，风味独特，泡沫丰富，酒精度为0.45％±0.03％Vol，酸度为10.5±0.23°T，是一种特征性比较突出的新的奶啤产品，对于多元化利用新疆驴乳资源具有重要的现实价值。

本发明具体提供一种由新菌亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1耦合的复合菌剂，复合菌剂由亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)按体积比2:1复配耦合组成。

本发明中，菌种亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1筛选分离来自新疆昌吉州阜康农牧民家中采集的酸马乳，并经过本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定及菌种的生理生化系统试验验证，证实获得的亚罗酵母范畴内属于一种典型的新菌种，该菌株亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCC No.22136，保藏日期：2021年04月06日。

上述亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1 CGMCC No.22136菌株的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

上述适合与亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1耦合复合菌剂中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳，经本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定及菌种的生理生化系统试验验证，证实筛选获得的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳属于本领域常见的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，本领域普通技术人员可以通过公众渠道购买获得，公开的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌种培养基及培养的方法适合本发明的实施。

同时，本发明进一步提供一种由新菌亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1耦合的复合菌剂发酵制备的驴乳奶啤，其制备方法具体包括如下步骤：

(1)取出保藏于-40℃超低温冰柜中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳和亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1取出，将亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1接种到专用培养液中，于28℃培养箱中培养24h，吸取10μL培养液均匀涂布于专用培养基上，并于28℃培养挑选出单菌落接种到专用培养基斜面上，于28℃培养24h后于冰柜中保藏；将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳接种于专用培养基，于37℃恒温培养箱培养24h，吸取10μL培养液于专用固体培养基上，于37.0℃下培养箱培养24h挑选出单菌落接种到固体培养基上，并放置在37.0℃条件下培养，于冰柜中保藏。

(2)将驴乳经胶体磨处理、均质处理后，于65℃杀菌25min，移至母液发酵器皿中冷却至28℃，无菌条件下将分别步骤(1)制备的植物乳杆菌菌液和亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1菌液，分别按质量体积百分比4％接种于驴乳，分别于42℃培养8h和28℃培养24h，获得各自发酵母液，4℃下保藏备用。

(3)将新鲜驴乳装入容器中，将步骤(2)所得植物乳杆菌发酵液和亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1发酵液制备的驴乳发酵母液按体积比1:2混合，按照3-12％的接种量接种，于28-34℃耦合发酵6h，获得酸驴乳，再加入3-12％蔗糖及15-55％麦芽汁，于26-34℃下混合发酵35-80h获得鲜驴乳奶啤。

(4)将步骤(3)制备的鲜驴乳奶啤采取无菌灌装，4℃条件冷藏制备获得成品驴乳奶啤。

本发明驴乳奶啤的制备方法中，所述亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1的专用培养液为15g/L胨、25g/L葡萄糖、10g/L酵母浸出粉；专用培养基为10g/L胨、20g/L葡萄糖、5g/L酵母浸出粉、14g/L琼脂。

本发明驴乳奶啤的制备方法中，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳的专用培养基为10g/L蛋白胨、牛肉浸粉8g/L、酵母浸粉4g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温(80)1g/L。

本发明驴乳奶啤的制备方法中，所述驴乳奶啤中复合菌剂的接种量为5％。

本发明驴乳奶啤的制备方法中，所述驴乳奶啤中蔗糖的添加量为6％，麦芽汁的添加量为35％。

本发明驴乳奶啤的制备方法中，所述驴乳奶啤的发酵温度为30℃，发酵时间为35h。

本发明提供一种新菌亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1作为发酵剂在发酵制备驴乳奶啤中的应用。

通过实施本发明提供的上述技术方案，获得以下有益效果：

(1)本发明提供菌株亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1经过本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定及菌种的生理生化系统试验验证，证实获得的亚罗酵母菌范畴内菌种编号为Y1属于一种典型的新菌种，进而有必要进行按照法律要求的保藏。

(2)本发明制备的驴乳奶啤色泽呈淡黄色，色泽具有与添加成分相符的特征，麦芽香味伴随着淡淡的乳香，具有与添加成分相符的色泽气味，口感及起泡性适中，无异味，组织均匀，是一种特征性比较突出的新的奶啤产品，对于多元化利用新疆驴乳资源具有重要的现实价值。

(3)本发明筛选的编号为Y1的亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1及植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，两菌株耦合发酵不产生有害物质，在低pH值时有较强活性，热稳定性佳，在发酵过程中产生以乳酸为主的有机酸，酵母产生的产物主要为酒精和二氧化碳，都可通过降低pH值来抑制腐败菌和致病菌的生长，并改善食品的风味和口感，在发酵制备驴乳奶啤中具有典型性突出的耦合复合菌剂。

(4)利用自行筛选分离驯化获得亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1及植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，经菌种活化、发酵母液制备、将酸驴乳与麦芽汁及蔗糖混合、30℃下培养35h的条件，发酵制备的驴乳奶啤色泽呈淡黄色，色泽具有与添加成分相符的特征，口感适中，风味独特，组织均匀，是一种特征性比较突出的新的奶啤产品，对于多元化利用新疆驴乳资源具有重要的现实价值。

附图说明：

图1为基于18S rDNA基因构建的亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1的系统发育树。

图2为基于16S rDNA基因构建的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳的系统发育树。

图3为驴乳奶啤在不同总接种量下的发酵特性变化图。

图4为驴乳奶啤在不同菌种比例下的发酵特性变化图。

图5为驴乳奶啤在不同发酵温度下的发酵特性变化图。

图6为驴乳奶啤在不同发酵时间下的发酵特性变化图。

图7为驴乳奶啤在不同蔗糖添加量下的发酵特性变化图。

图8为驴乳奶啤在不同麦芽汁添加量下的发酵特性变化图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。

本发明选用的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳作为常见的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)代表，采用任何常见的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)不限制本发明的实施，本发明优先采用专用设计的培养基为10g/L蛋白胨、牛肉浸粉8g/L、酵母浸粉4g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温801g/L。

本发明提供亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1的专用培养液为15g/L胨、25g/L葡萄糖、10g/L酵母浸出粉；专用培养基为10g/L胨、20g/L葡萄糖、5g/L酵母浸出粉、14g/L琼脂。

本发明选用的涉及原辅设备、材料以及选取的菌种培养基、培养方法都是本领域熟知选用的，但不因此限制本发明的实施过程，其他本领域相关性较大的相关材料及设备都可适用于本发明的实施。

实施例1：亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1及植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳的分离鉴定

(一)亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1的分离

菌株分离自新疆昌吉农牧民家中采集的酸马乳，取酸马乳100ml，置于200mL盐水中混合均匀，吸取上清液分别用无菌盐水稀释10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6五个浓度梯度。各吸取1mL稀释液涂布于专用平板培养基，于培养箱28℃培养24h，挑选单菌落接种于新的分离平板中进行纯化，重复3-4次进行纯化。纯化后的亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1接种于培养基上，28℃培养箱恒温培养3-6d后，4℃保存备用。

(2)亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1的鉴定

亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1(以下简称为“菌株Y1”)18Sr DNA基因序列测定与分析：

18Sr DNA基因序列测定：提取菌株Y1总DNA为模板进行PCR扩增，引物为以细菌18SrDNA通用引物NS1(5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')和NS8(5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3')；PCR反应体系为20μL：DNA模板1.0μL，10μmol/L 27F/1429R各1.0μL，10mmol/L dNTPs 1.5μL，10×PCR Buffer(2.5mmol/LMgCl₂)2.5μL，2.5U/μL TaqDNA聚合酶0.5μL，补足灭菌超纯水至20μL。反应条件为：95℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存；扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，由ABI公司的BigDye3.1试剂盒测序对PCR产物进行克隆测序，测序结果见SEQ ID No:1。将所得的序列结果在美国国立生物信息中心(NCBI)进行BLAST检索，选择相似性高的模式菌株作为参比菌株，利用MEGA5.0软件中的邻接法(Neighbor-joining)构建基因系统发育树，自展值(Bootstrap)500。菌株Y1的18S rDNA基因序列与Yarrowia lipolytica Stiain CBS的同源性最高，相似性为98.04％，菌株Y1的18S rDNA序列与Yarrowia lipolytica Stiain CBS的亲缘关系最近。以18S rDNA基因序列构建的系统发育树中，菌株Y1与Yarrowia lipolyticaStiain CBS菌株来源于同一分支的可靠性置信度为99％；表明菌株Y1作为微生物菌种认定新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，通过菌种的相似性和同源性的综合判定，参见附图1，经过本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定，证实获得的亚罗酵母(Yarrowia sp.)属范畴内菌种编号为亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1属于一种典型的新菌株。

基于以上生物学特征，将菌株Y1鉴定为亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1。该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏日期是2021年04月6日，保藏编号为CGMCC NO.22136。

(二)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳的鉴定

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳新疆昌吉农牧民家中采集的酸马乳。取酸马乳100ml，置于200mL盐水中混合均匀，吸取上清液分别用无菌盐水稀释10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6五个浓度梯度。各吸取1mL稀释液涂布于专用平板培养基，于培养箱35℃培养24h，根据聚落形态的不同挑取单菌落划线纯化后进行16S rDNA基因测序，提取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳总DNA为模板进行PCR扩增，引物为以细菌16S rDNA通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1429R(5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3')。PCR反应体系为20μL：DNA模板1.0μL，10μmol/L 27F/1429R各1.0μL，10mmol/L dNTPs 1.5μL，10×PCR Buffer(2.5mmol/LMgCl₂)2.5μL，2.5U/μL TaqDNA聚合酶0.5μL，补足灭菌超纯水至20μL。反应条件为：95℃预变性2min；94℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，24个循环；72℃延伸2min，4℃保存；扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，由ABI公司的BigDye3.1试剂盒测序对PCR产物进行克隆测序，测序结果见SEQ ID No:2。利用MEGA5.0软件中的邻接法(Neighbor-joining)构建16S rDNA基因系统发育树，结果参见附图2所示。结果表明，该菌株与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)pentosus strain 18791具有100％的相似性，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳与pentosus strain 18791菌株来源于同一分支的置信度为7.0％；并且系统发育树分析结果同样表明其归属于植物乳杆菌聚类，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳属于常见的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。

实施例2：亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1的生理化特性

该菌株亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1经专用培养基分离培养，再经改良专用培养基培养会产生溶钙圈进行初步筛选，将其初步界定亚罗酵母(Yarrowia sp.)属菌株；该菌株在专用培养基平板上划线培养24h，能形成菌落边缘整齐，表面光滑，正面呈圆形，侧面凸起，不透明呈乳白色具有一定粘稠性，直径0.6-3.0mm的菌落。进行革兰氏染色，结果为革兰氏阳性杆状细菌。该细菌在过氧化氢酶试验中呈阴性、接触酶呈阴性，不能够还原硝酸盐、不产生吲哚和H₂S、不运动，不发酵鼠李糖，能够在20℃生长，最高生长温度为45℃，最适生长温度30℃。根据菌株Y1的形态特征、生理生化特性进行分析，这些生理生化特性与革兰氏阳性亚罗酵母具有较大的相似性。

综合亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1的18S rDNA基因序列和同源性对比分析以及生理化试验对比的结果，本发明提供的菌株亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1与常见亚罗酵母(Yarrowia sp.)同属范围内菌种具有鲜明的区别，Y1与常见亚罗酵母(Yarrowia sp.)属于同属不同种，亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1具有亚罗酵母(Yarrowia sp.)同属内新菌种显著特性。

实施例3：新菌亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1耦合复合菌剂发酵制备的驴乳奶啤

由新菌亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1耦合的复合菌剂发酵制备的驴乳奶啤，该驴乳奶啤通过如下制备工艺制备获得：

(4)将步骤(3)制备的驴乳奶啤采取无菌灌装，4℃条件冷藏，制备成品驴乳奶啤。

实施例4：新菌亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1耦合复合菌剂发酵的驴乳奶啤工艺条件优化

本实施例在实施例3的基础上，对由新菌亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1耦合后复合菌剂发酵的驴乳奶啤制备条件优化。分别选取总接种量分别为3％、5％、7％、9％、12％，菌种比选用1∶1、1∶1.5、1.5∶1、1∶2、2∶1，发酵温度分别为26、28、30、32、34℃，发酵时间分别为20h、35h、50h、65h、80h，蔗糖加入量分别为0％、3％、6％、9％、12％，麦芽汁加入量分别为15％、25％、35％、45％、55％；测量发酵完成后驴乳奶啤的酸度及酒精度。

(1)复合菌剂接种量步长的建立及发酵控制点分析

本试验在其他条件相同的基础上，考察复合菌剂接种量对发酵驴乳奶啤性能的影响，具体测试结果参见附图3。由附图3数据可知，总接种量梯度的不同对驴乳奶啤酒精度的影响趋势较大，当复合菌剂的接种量在3％-7％时，驴乳奶啤的酸度增长趋势较快，当接种量为7％-12％时，驴乳奶啤的酸度增长趋势较小。同时，随着复合菌剂接种量的增加，驴乳奶啤的酒精度呈现先升后降的趋势，当复合菌剂的总接种量为5％时，驴乳奶啤的酒精度为0.42％vol，此时酸度达到10.5°T。因此确定复合菌剂的接种量为5％作为初始Simplex试验点，对应步长为2。

(2)复合菌剂中菌种比例步长的建立及发酵控制点分析

本试验主要考察复合菌剂中菌株Y1发酵液与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)S乳发酵液不同比例对驴乳奶啤酸度和酒精度的影响，具体数据参见附图4所示。由附图4数据可知，复合菌剂中两种菌株发酵液比例不同，对驴乳奶啤的酒精度有一定影响。随菌株Y1发酵液比例的增高，驴乳奶啤的酒精度呈上升趋势；而随植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳发酵液比例的增高呈降低趋势。驴乳奶啤的酸度的变化趋势与酒精度的变化趋势相反，驴乳奶啤的酸度随菌株Y1发酵液比例的增高呈现下降趋势，随随植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳发酵液比例的增高呈现上升趋势。当菌株Y1发酵液与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳发酵液体积比为2:1时，驴乳奶啤的酒精度最高为0.45％vol，酸度最低为9.4°T。因此确定复合菌剂中菌株Y1发酵液与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳发酵液体积比为2:1。

(3)驴乳奶啤发酵温度步长的建立及发酵控制点分析

本试验考察驴乳奶啤发酵温度对驴乳奶啤发酵性能的影响，具体数据参见附图5。由附图5数据可知，驴乳奶啤的酒精度随发酵温度的增加呈先增加后迅速降低的趋势，当发酵温度增至30℃时，驴乳奶啤的酒精度达到峰点为0.44％vol，此时酸度伴有缓慢升高趋势，这可能是乳酸菌在26～34℃内生长特性良好，使得植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)S乳产酸能力有所提高，驴乳奶啤发酵环境特性发生变化，从而影响酵母菌Y1的生长，造成驴乳奶啤的酒精度有所下降。因此确定驴乳奶啤的发酵温度30℃作为初步Simplex的初始试验点，对应步长2。

(4)驴乳奶啤发酵时间步长的建立及发酵控制点分析

本试验考察发酵时间对驴乳奶啤性能的影响，具体结果参见附图6。由附图6数据可知，驴乳奶啤的酒精度随发酵时间的增加呈先升高后明显趋于平稳的趋势，而酸度随着发酵时间的增加呈先逐渐上升后伴有小幅降低的趋势。当发酵时间20h时，驴乳奶啤的酒精度为0.03％vol，趋近于0；当发酵时间20～35h时，驴乳奶啤的酒精度及酸度随发酵时间的增加呈逐渐上升趋势；当发酵时间为35～80h时，驴乳奶啤的酒精度呈先缓慢降低后缓慢上升整体平稳趋势，而酸度随发酵时间的增加先小幅降低后逐渐趋于稳定。因此确定发酵时间35h作为Simplex的初始试验点，对应步长15。

(5)驴乳奶啤蔗糖添加量步长的建立及发酵控制点分析

蔗糖能够为酵母菌的生长提供碳源物质，不同梯度蔗糖量的加入会对驴乳奶啤发酵过程中酵母的发酵性能产生较大的影响，本试验主要考察蔗糖添加量对驴乳奶啤性能的影响，结果参见图7，由附图7数据可知，驴乳奶啤的酒精度随蔗糖添加量的增加呈逐渐上升的趋势。当蔗糖添加量为6％时，驴乳奶啤的酒精度达到峰值，表明条件利于酵母发酵。因此，选择蔗糖添加量6％作为Simplex的初始试验点，对应步长3。

(6)驴乳奶啤麦芽汁添加量步长的建立及发酵控制点分析

麦芽汁的添加量可提升驴乳奶啤的风味，同时也可以为酵母的生长和发酵提供碳源，本试验考察驴乳奶啤麦芽汁添加量对驴乳奶啤性能的影响，具体数据参见附图8。由附图8数据可知，当麦芽汁添加量为15％～35％时，驴乳奶啤的酒精度随着添加量的增加呈逐渐上升趋势，当麦芽汁添加量为35％～55％时，驴乳奶啤的酒精度呈先下降后趋于稳定态势，而酸度随添加量的增加呈现先降低后升高再趋于稳定趋势。因此，选取麦芽汁添加量为35％作为Simplex的初始试验点。

实施例5：驴乳奶啤Simplex法优化发酵关键控制点结果分析

本实施例在实施例3的基础上，通过long系数表构造各初始单纯形的顶点，选择对发酵影响相对较大的四种因素(A接种总量、B发酵温度、C发酵时间、D蔗糖添加量)确定对应步长分别为2、2、15和3，初步建立驴乳奶啤Simplex的条件。在表1Long系数表的基础上建立表2初始Simplex设计表。

表1：Long系数表

因素	A	B	C	D
					1	0.0	0.0	0.0	0.0
2	1.0	0.0	0.0	0.0
					3	0.5	0.9	0.0	0.0
4	0.5	0.3	0.8	0.0
					5	0.5	0.3	0.2	0.8

表2：初始驴乳奶啤单纯形设计

因素	A	B	C	D
					1	4	28	35	6
2	6	28	35	6
					3	5	30	35	6
4	5	29	47	6
					5	5	29	38	8

在上述初形Simplex模型建立的基础上，通过逐次淘汰的方法进行Simplex推进实验，在去除旧试验点的同时，确定新试验点。若试验条件在n-1次推进中未被排除，则试验关键点在该点收敛。新实验点计算如下：

新试验点＝(1+a)×(留下各试验点的坐标和/n)-a×排除点的坐标式(1)

在初始Simplex中的不同组合采取酸度、酒精度测定，在此基础上，通过式(1)计算驴乳奶啤Simplex推进的新试验点，进行驴乳奶啤发酵控制关键点的推进试验设计，递推试验设计见表3。

表3：驴乳奶啤发酵控制关键点递推试验设计

通过表2作为试验组，测定其对应驴乳奶啤酸度、酒精度，进行初始Simplex试验。测定结果参见表4。

表4：驴乳奶啤初始Simplex结果

序号	酸度	酒精度
			1	10.2±0.09	0.35±0.04
2	11.1±0.14	0.42±0.06
			3	10.5±0.23	0.45±0.03
4	11.8±0.18	0.39±0.07
			5	10.7±0.11	0.41±0.08

由表5数据可知，驴乳奶啤发酵控制关键点的初始Simplex以驴乳奶啤的酸度及酒精度作为考核指标时，其排序由大到小为：3＞2＞5＞4＞1。即初始最佳发酵工艺参数为:接种总量5％(S乳∶菌株Y1＝1∶2)，发酵温度30℃，发酵时间35h，蔗糖添加量6％及麦芽汁添加量35％。在此条件下得到驴乳奶啤的酒精度为0.45％±0.03％vol，酸度为10.5±0.23°T，较其他组合口感佳。

以初始Simplex试验结果可以看出，试验评价最低为4号，因此去除4试验点，再根据公式(1)进行新试验点的递推，再测定新试验点条件下驴乳奶啤的酸度及酒精度，综合评判新递推情况下具有收敛性的试验组合，具体数据参见表5。

表5：Simplex的递推试验结果

序号	酸度	酒精度
			6	10.8±0.15	0.40±0.08
7	10.5±0.21	0.42±0.05
			8	10.4±0.16	0.44±0.09
9	12.1±0.12	0.38±0.04

由表5数据可知，驴乳奶啤的酸度与酒精度均影响驴乳奶啤发酵特性，选取酒精度较高的试验点作为最优试验点。根据驴乳奶啤的酸度、酒精度可以看出影响驴乳奶啤发酵控制参数的推进实验序号从大到小为：8＞7＞6＞9。即推进最佳发酵控制参数为：接种总量5％(S乳：菌株Y1＝1：2)，发酵温度30℃，发酵时间35h，蔗糖添加量6％及麦芽汁添加量35％。在此条件下得到0.45％±0.03％vol，酸度10.5±0.23°T。递推试验经过n-1组单纯形，即进行四组递推试验的综合评判，3号试验结果仍未被排除，综合评判结果与初始单纯形结果最为接近并达到最优，表明最佳递推试验收敛点的最优组为3号试验组。

实施例6：本发明驴乳奶啤与市售奶啤的感官评价试验

本实施例在实施例3-5的基础上，对本发明提供的一种复合菌剂发酵制备的驴乳奶啤与市售奶啤进行感官评价比较。市售常见的奶啤包括天润奶啤(以下简称“奶啤1”)、佳丽奶啤(以下简称“奶啤2”)、伯尔尼马奶啤(以下简称“奶啤3”)、瑞源新疆奶啤(以下简称“奶啤4”)与本发明实施例5最优条件制备的驴乳奶啤(以下简称“奶啤5”)进行感官评价试验。由20名从事相关专业的人士组成感官评价小组，分别从奶啤的色泽、风味、滋味、组织形态，4个指标进行感官综合评价，具体评价指标参见表6，每组三次，取平均值，评价结果参见表7。

表6：本发明驴乳奶啤与市售驴乳奶啤感官评价标准

表7：本发明驴乳奶啤与市售奶啤感官评价对比

	奶啤1	奶啤2	奶啤3	奶啤4	奶啤5
						1	82	87	85	82	81
2	84	80	86	81	87
						3	85	87	86	80	92
4	86	81	87	94	83
						5	91	91	79	93	86
6	80	87	82	87	87
						7	83	84	86	86	88
8	93	91	82	82	86
						9	84	86	87	86	86
10	91	79	87	87	84
						11	86	82	86	92	91
12	90	81	85	80	90
						13	81	86	91	86	76
14	89	84	85	88	93
						15	83	83	86	85	96
16	91	83	88	84	86
						17	82	85	86	85	91
18	81	88	81	91	92
						19	90	84	83	84	87
20	88	83	85	82	87
						平均分	86.0	84.6	85.2	85.8	87.5

由表7数据可知，本发明提供的驴乳奶啤平均分最高为87.5分，表明本发明采用亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1与植物乳杆菌S乳获得复合菌剂适合于发酵驴乳奶啤，制备的驴乳奶啤是一种口感细腻绵润、性状均匀、具有酸奶与麦芽汁糅合后的独特风味的发酵乳饮料，对于改善驴乳奶啤的口感不佳、发酵剂单一且种类少等有主要的意义。

实施例7：本发明驴乳奶啤性能检验试验

本实施例在实施例5的基础上，对本发明提供的复合菌剂发酵制备驴乳奶啤按照国标GB19302-2010进行检验，结果参见表8：

表8：本发明驴乳奶啤性能测试

由表8数据可知，本发明实施例5制备的复合菌剂发酵制备的驴乳奶啤符合GB19302-2010微生物指标检测要求，表明本发明提供的新菌株Y1与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)S乳获得的复合菌剂用于制备驴乳奶啤具有制备工艺简单，产品活菌数高，且富含蛋白质及多种氨基酸物质，解决了驴乳奶啤存在口感不佳、发酵剂单一且种类少及生产工艺复杂等问题，且未见文献和专利报道有关复合菌发酵驴乳奶啤的问题，为拓展驴乳奶啤发酵的菌剂和驴乳深加工提供了数据支持。

以上试验表明，本发明从新疆昌吉州阜康农牧民家中采集的酸马乳中分离筛选获得一株新菌株亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)耦合，利用新菌株Y1和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)在低pH值活性高且热稳定性好的特点，结合二者耦合发酵特点，将其发酵应用于制备驴乳奶啤。当植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)发酵液和亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1发酵液按照体积比1：2混合，按照5％接种量接种耦合发酵制备的驴乳奶啤呈淡黄色，性状均匀，口感细腻，风味独特，泡沫丰富，酒精度为0.45％±0.03％Vol，酸度为10.5±0.23°T，是一种特征性比较突出的新的奶啤产品，对于多元化利用新疆驴乳资源具有重要的现实价值。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110> 新疆农业大学

武运

<120> 由新菌亚罗酵母Y1耦合的复合菌剂及其制备的驴乳奶啤

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1475

<212> DNA

<213> 亚罗酵母(Yarrowia sp.)

<400> 1

tcattaaatc agttatcgtt tatttgatag ttttctacat ggataaccgt gataacttca 60

gaactaatac atgacagcct tctggcgtat atattagata caaaccaaca gtatggtgat 120

tcataatatc ttgtcgaacc gatcttcggt gtatcattca aatttctgcc ctatcaactg 180

tcgatggtag gatcgtggcc taccatggta acaacgggta acggggaatc agggttctat 240

tccggagagg gagcctgaga aacggctacc acatccaagg aaggcagcag gcgcgcaaat 300

tacccaatcc tgacacaggg aggtagtgac aatatataac gatccggggc tctttgagtt 360

tcggaattgg aatgagtaca atttaaacac cttaacgagg aacaattgga gggcaagtct 420

ggtgccagca gccgcggtaa ttccagctcc aatagcgtat attaatgttg ttgcagttaa 480

aaagctcgta gttgaaattg ggcgggctat tagtttaggc cgcttcagga agaacttctt 540

ccagttactt tgaaaaaatt agagtgttca acgcaggttt cgcctgaata tattagcatg 600

gaataacata acacgacgag ggtccatttt gttggcttgc aaacccacgt aatgattaat 660

agggacagtc gggggcgtca gtattgtgtt gtcagaggtg aaattcttgg atttacacaa 720

gactaactac tgcgaaaggc attcgccaag gatgtattca ttaatcaaga acgaaagtta 780

ggggatcaaa gatgatcaga taccgtcgta gtcttaaccg taaactatgc cgactgagaa 840

tgggtaccgc ttatacggta tccgcgctct acgagaaatc aaagtgatca ggttctgggg 900

ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag gaattgacgg aagggcacca ccaggagtgg 960

agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg gaaactcacc aggtccagac acaataagga 1020

ttgacagatt gatagctctt tcttgatttt gtgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt 1080

ggtggagtga tttgtctgct taattgcgat aacgaacgag accttgacct actaaatagc 1140

tctacttgcg attgcaggta gctagcttct tagagggact atctattaca agtagatgga 1200

agttcgaggc aataacaggt ctgtgatgcc cttagacgtt ctgggccgca cgcgcgctac 1260

actgacggag ccagcgagtc gaccaagccc gagagggcta ggtaatcttg tgaaactccg 1320

tcgtgctggg gatagagcat tgcaattatt gctcttcaac gaggaattcc tagtaagcgc 1380

aagtcatcag cttgcgttga ttacgtccct gccctttgta cacaccgccc gtcgctacta 1440

ccgattgaat ggtttagtga gaccttggga gggcg 1475

<210> 2

<211> 1361

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)

<400> 2

ggtattgatt ggtgcttgca tcatgattta catttgagtg agtggcgaac tggtgagtaa 60

cacgtgggaa acctgcccag aagcggggga taacacctgg aaacagatgc taataccgca 120

taacaacttg gaccgcatgg tccgagtttg aaagatggct tcggctatca cttttggatg 180

gtcccgcggc gtattagcta gatggtgggg taacggctca ccatggcaat gatacgtagc 240

cgacctgaga gggtaatcgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag 300

gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg aaagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg 360

aagaagggtt tcggctcgta aaactctgtt gttaaagaag aacatatctg agagtaactg 420

ttcaggtatt gacggtattt aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480

taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt 540

ttttaagtct gatgtgaaag ccttcggctc aaccgaagaa gtgcatcgga aactgggaaa 600

cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg 660

gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagt 720

atgggtagca aacaggatta gataccctgg tagtccatac cgtaaacgat gaatgctaag 780

tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc agctaacgca ttaagcattc cgcctgggga 840

gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 900

tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatac tatgcaaatc 960

taagagatta gacgttccct tcggggacat ggatacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020

tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatt atcagttgcc 1080

agcattaagt tgggcactct ggtgagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140

acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggatggtaca 1200

acgagttgcg aactcgcgag agtaagctaa tctcttaaag ccattctcag ttcggattgt 1260

aggctgcaac tcgcctacat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1320

gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca c 1361

Claims

1.一种由新菌亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)耦合的复合菌剂，其特征在于，所述亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1的保藏号为：CGMCC No.22136。

2.一种如权利要求1所述的由新菌亚罗酵母(Yarrowia sp.)Y1与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)耦合的复合菌剂作为发酵剂在发酵制备驴乳奶啤中的应用。