CN115895973B - 一株副干酪乳杆菌及其在白酸汤发酵制备中的应用 - Google Patents
一株副干酪乳杆菌及其在白酸汤发酵制备中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，公开了一株副干酪乳杆菌及其在白酸汤发酵制备中的应用，该菌株分类命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，于2022年06月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022881，保藏地址：中国武汉武汉大学。研究表明，该副干酪乳杆菌STB耐受性好，对金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌性，在白酸汤发酵产品的保藏中效果显著，在降血糖、降血脂和降尿酸方面效果显著。采用该菌株发酵制备的白酸汤在不添加任何食品添加剂的情况下，其颜色依旧保持透亮，酸度适中，风味清香醇厚，感官评定得分高。
Description
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及到一株副干酪乳杆菌及其在白酸汤发酵制备中的应用。
背景技术：
(1)酸汤是苗族地区一种传统的发酵型食品，按照制作方法不同可分为红酸汤和白酸汤。红酸汤是通过辣椒发酵而成的，而白酸汤主要是以米汤为原料，由乳酸菌、酵母菌等微生物参与共同发酵而成的。苗族人食用白酸汤居多。苗族酸汤已有上千年的发展历史，以其酸味纯正、香味浓郁、口感清爽的特性受当地人民喜爱。优势菌群以及酸汤的营养成分对调节人体肠道微生态平衡，预防消化道疾病，保护人体健康具有重要的作用。
(2)高血糖、高血脂以及高尿酸等慢性疾病属于代谢综合征，是一组复杂的代谢紊乱症候群，是导致糖尿病心脑血管疾病的危险因素。因此，有必要开发一株具有“三降”功效的益生菌来预防和治疗代谢综合征，减少其造成的危害。
(3)传统的酸汤制作方式一直以来都是采用自然酿制发酵的方式，但发酵底物浓度低、发酵缓慢、周期较长、酸味较弱等问题会使酸汤质量不稳定。大部分企业都是采用传统的发酵方法，且大部分都在追求酸汤的味道，通过添加一些食品添加剂来增加酸汤的味道，忽略了酸汤的发酵过程，这就造成了酸汤的品质控制困难，经常会出现有机酸含量低、风味单一、卫生状况不符合国家标准等问题，为贵州酸汤的市场推广带来诸多弊端。
(4)由于传统白酸汤中微生物区系十分复杂，当出现操作不当等原因如掺杂一些霉菌，会导致白酸汤在发酵和贮藏时产生腐败味，不但影响了白酸汤的生产，而且对人体的健康造成了极大的威胁。因此，明晰白酸汤中的优势菌株基本特性十分必要。
(5)传统方式发酵制成的白酸汤，由于微生物菌群以及发酵条件等不明确，因此无法保证白酸汤中有益微生物的活菌数量以及是否进入人体后能有效发挥其益生功能。因此，了解酸汤发酵后的优势菌活菌数十分必要。
(6)中国专利CN110558462 A公开了一种白酸汤饮料的制备方法，其使用的是白酸汤老母原料进行发酵，但并未报道白酸汤中的优势菌群以及对其进行发酵。中国专利CN111849813A公开了一种白酸汤发酵菌剂及用其制备的白酸汤，但未报道发酵菌株的益生功效，且使用的是干酪乳杆菌和酿酒酵母的复配菌剂。
发明内容：
本发明的目的在于提供一株副干酪乳杆菌STB(Lactobacillus paracasei STB)及其在发酵制备白酸汤中的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
本发明筛选了一株副干酪乳杆菌STB，该菌株分类命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，于2022年06月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 2022881，保藏地址：中国武汉武汉大学。
该副干酪乳杆菌STB是从贵州黔东南州麻江县传统农家自制白酸汤中分离获得。该菌株经过16S rDNA测序分析鉴定为副干酪乳杆菌，并命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)STB。
上述的副干酪乳杆菌STB在降血糖、降血脂和降尿酸中的应用。
上述的副干酪乳杆菌STB在发酵制备具有降血糖、降血脂和降尿酸功效的白酸汤中的应用。
一种具有降血糖、降血脂和降尿酸功效的白酸汤发酵菌剂，该发酵菌剂中包含有上述的副干酪乳杆菌STB。
一种具有降血糖、降血脂和降尿酸功效的白酸汤的发酵制备方法，采用上述的副干酪乳杆菌STB进行发酵制备白酸汤。
一种具有降血糖、降血脂和降尿酸功效的白酸汤，采用上述的的副干酪乳杆菌STB进行发酵制备得到的。
本发明研究发现，所筛选的副干酪乳杆菌STB在降血糖、降血脂和降尿酸方面效果显著。采用该副干酪乳杆菌STB发酵白酸汤，其所采用的发酵工艺为常规发酵工艺，包括：原料清洗；浸泡；煮沸；冷却；过滤；分装；添加低聚糖；发酵；白酸汤成品。发酵后的白酸汤活菌数达到8.2×108CFU/mL。酸味适中，风味醇厚，感官评定得分高。
本发明的有益效果：
本发明筛选了一株副干酪乳杆菌STB，研究表明，副干酪乳杆菌STB在人工胃液与人工肠液中消化3h后的活菌数分别为2.7×108CFU/mL和9.7×106CFU/mL，存活率分别为75.2％和69.6％，耐受性好。副干酪乳杆菌STB抑菌圈为28.80±0.5mm，对金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌性，在白酸汤发酵产品的保藏中效果显著。副干酪乳杆菌STB对α-葡萄糖苷酶的抑制率为35.2％，具有显著的降血糖作用。副干酪乳杆菌STB在培养24h后对甘油三酯的降解率达到34.7％，具有显著的降血脂作用。副干酪乳杆菌STB对黄嘌呤氧化酶体外抑制率为47.2％，初步判断菌株的细胞代谢物中可能也含有一些活性多糖或者其他物质，对黄嘌呤氧化酶具有显著的抑制作用，从而减少尿酸的生成。
采用本发明筛选的副干酪乳杆菌STB发酵制备的白酸汤感官评定得分最高，为86.6。在不添加任何食品添加剂的情况下，其颜色依旧保持透亮，酸度适中，风味清香，具有较好的感官体验。
附图说明：
图1：副干酪乳杆菌STB的菌落形态。
图2：副干酪乳杆菌STB的细胞形态。
图3：副干酪乳杆菌STB的生长曲线图。
图4：副干酪乳杆菌STB的模拟人工耐受胃肠液。
图5：副干酪乳杆菌STB的抑菌图。
图6：副干酪乳杆菌STB的降血糖能力。
图7：副干酪乳杆菌STB的降血脂能力。
图8：副干酪乳杆菌STB的降尿酸能力。
图9：副干酪乳杆菌STB发酵白酸汤后的活菌数和pH。
图10：副干酪乳杆菌STB发酵的白酸汤产品图。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
实施例1：副干酪乳杆菌STB菌株筛选、鉴定和功能验证
本发明是从贵州黔东南州麻江县龙山镇居民自制的传统白酸汤中筛选优势菌株，16SrDNA分子生物学测序进行菌株的鉴定。并进一步结合菌株的疏水性、自聚性、模拟人工胃肠液耐受性、NaCl耐受性等特性，筛选出在胃肠转运过程中对胁迫环境适应性较强的菌株。同时，对菌株降血糖、降尿酸、降胆固醇等益生功能进行相关性初步研究，以代谢综合征为出发点筛选出对人体健康具有一定保健和医疗作用的菌株。并进一步采用优势菌种发酵白酸汤新工艺，研究酸汤在多菌系强化发酵过程中的微生物与营养成分动态变化，对其发酵特性及风味变化做出综合评价。
研究人员从贵州黔东南州麻江县传统农家自制白酸汤中分离筛选出39株菌。30株菌为乳杆菌属(Lactobacillus)、9株为酵母菌属(Saccharomyces)。其中乳杆菌属包括4株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、11株短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、13株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、1株类布氏乳杆菌(Lactobacillusparabuchneri)、1株布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)。酵母菌属为3株膜醭毕赤酵母(Pichia membranifaciens)、3株库德毕赤酵母菌(Pichia kudriavzevii)、3株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
研究人员经过进一步筛选获得植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)STB1、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)STB9b、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)STB3a、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)STB13、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)STB14b(2)和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)STB。经过对比最终筛选了一株副干酪乳杆菌STB，该菌株分类命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，于2022年06月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022881，保藏地址：中国武汉武汉大学。
该副干酪乳杆菌STB菌株经过16S rDNA测序分析鉴定为副干酪乳杆菌(菌株STB的16S rDNA如SEQ ID NO.1所示)，并命名为副干酪乳杆菌STB。
(1)筛菌方法：
白酸汤样品来源于贵州省黔东南州麻江县龙山镇居民自制的白酸汤，发酵期为5d左右。预先在实验室准备500mL的无菌容器，采样时舀取酸汤加入到无菌容器中，旋紧无菌容器盖并用封口膜封口，做好标记，迅速置于低温采样箱中寄回实验室。存放在4℃冰箱，并尽快进行乳酸菌的分离、纯化试验。用0.85％无菌生理盐水依次将样品梯度稀释成不同梯度的菌悬液后涂布于MRS固体培养基上进行培养。培养结束后观察菌落形态，挑取菌落颜色、大小、光滑度以及色泽等不同的单菌落进行划线培养。重复划线2-3次后，挑取单菌落对其进行革兰氏染色，并使用显微镜观察其颜色和形态。显微镜观察细胞形态一致，革兰氏染色为阳性且接触酶反应为阴性的无芽孢菌株可初步判定为乳酸菌属。重复上述划线培养和显微镜观察的步骤，直至分离得到纯化的菌株。镜检得到纯培养物后，挑取对应的单菌落，对其进行活化培养，随后将菌液与80％甘油(v/v)等体积混匀，置于-20℃冰箱保藏。同时，对所得菌株进行16S rDNA测序，所得序列通过与GenBank数据库对比得出STB为副干酪乳杆菌。
(2)鉴定方法：
吸取1mL冻藏且活化好的菌液于4500rpm离心10min，收集沉淀，TE缓冲液洗涤两次再重悬，并用溶菌酶裂解细胞，加入氯仿/异戊醇等萃取核酸DNA，乙醇洗涤两次，挥干，TE缓冲液重悬得菌株DNA模板。
采用细菌通用的引物进行PCR扩增：
16S上游引物(27F)序列:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
16S下游引物(1492R)序列:5’-GGCTACCTTGTTACGACT-3’
PCR反应体系(21μL)：2μLDNA模版，10μL 2×Rapid Taq Master Mix，1.6μL引物(10mM)，7.4μL ddH2O。
PCR扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，共计30次循环，最后72℃延伸10min，16℃保温1h。
PCR电泳：制胶：1.0％琼脂糖，0.25g琼脂加25mL TAE溶液，微波加热溶解后再加入2.5μL DNA变性剂，摇匀至溶液呈微红色。将其倒入电泳槽中，待凝固后，拔出齿梳。
点样：在PE手套上加6×Loading Buffer(1.50μL/滴)，吸取5μL PCR产物与其混匀，再吸取5mL混匀后的样液加入到齿孔中。
电泳：点样后设定电泳条件为电压140V，电流300mA，20min。
PCR产物经电泳检测后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，序列经过拼接后得到完整的序列信息；所得序列提交至GenBank数据库，在Blast上与已有细菌的16SrDNA基因进行比对；将所得乳酸菌和醋酸菌序列提交到EzBioCloud数据库，进行相似性搜索，找出与所得基因序列同源性最高的已知菌种，结果显示：所得菌株为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。
(3)活化方式：
需要进行2次活化，按照4％(v/v)的接种量将副干酪乳杆菌STB接种于液体培养基MRS中，于37℃培养箱中静置培养12-18h，为一活。从一活发酵液中取200μL至5mL MRS液体培养基中，于37℃培养箱中静置培养12-18h，为二活。
(4)副干酪乳杆菌STB的基本形态特征：
该菌株在MRS培养基平板中呈现乳白色，形状为圆形，表面有光泽。单菌落直径约为0.6-1mm。菌体形态为短杆状。菌落形态和菌体形态见图1与图2。
(5)副干酪乳杆菌STB在MRS液体培养基中的生长特性：
菌株活化后以4％(v/v)接种量接种于50mL锥形瓶中的MRS液体培养基中，并将其放置于37℃恒温培养箱中静置培养48h，期间每4-6h取样一次，观察不同时间培养液的pH值变化。以活菌数CFU/mL来表示菌株在不同培养时间的活菌数情况，绘制其生长曲线。结果显示该菌株在MRS液体培养基中生长速度较快，对数期在4-12h。活菌数最高达到5.56×109CFU/mL。产酸能力强，发酵后的酸汤pH达到3.9，具有主发酵剂应用潜力(图3)。
(6)MRS液体培养基中的副干酪乳杆菌STB对模拟人工胃肠液的耐受性：
菌液培养1d后，吸取1mL4500rpm，4℃，5min离心，弃上清，加入1mL 0.85％生理盐水进行重悬两次，分别各取100μL菌悬液于1mL人工胃液和人工肠液中混合均匀，于37℃恒温培养0h和3h取样，进行梯度稀释涂布。以活菌数CFU/mL来表示菌株的存活情况。结果显示副干酪乳杆菌STB在人工胃液与人工肠液中消化3h后的活菌数分别为2.7×108CFU/mL和9.7×106CFU/mL，存活率分别为75.2％和69.6％，耐受性较好(图4)。
(7)副干酪乳杆菌STB的抑菌性：
菌株活化1d后，取50mL 4500rpm，4℃，5min离心，取上清液旋蒸浓缩10倍，调pH至6.6，采用双层琼脂平板扩散法进行实验，然后向其孔中注入150μL浓缩液，以未接菌的MRS液体培养基浓缩液为空白对照。正置4℃冰箱10-12h后于37℃培养3-5h，测量菌株的抑菌圈直径。结果显示副干酪乳杆菌STB抑菌圈为28.80±0.5mm，对金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌性，且抑菌能力均高于其余试验菌株即植物乳杆菌STB1、短乳杆菌STB3a及副干酪乳杆菌STB14b(2)，在白酸汤发酵产品的保藏中具有显著的效果(图5)。
表1排酸后发酵液的抑菌直径大小Table1 The diameter of inhibition zoneof fermentation broth after removing acid
注：“-”代表无抑菌圈，不同字母表示同一列中差异显著(p<0.05)。
Note:“-”stands for no bacteriostatic zone,different letters indicatesignificant differences in the same column(p<0.05).
(8)副干酪乳杆菌STB的降血糖(对α-葡萄糖苷酶的抑制能力)能力：
取25μL PNPG底物和25μL的样品混匀后37℃培养箱避光反应10min，再加入50μLα-葡萄糖苷酶溶液，混合均匀后于37℃培养箱避光反应30min。随后加入100μL Na2CO3快速终止反应，测定405nm处的吸光度。以阿卡波糖为阳性对照。
抑制率(％)＝[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100
公式中：A1：含α-葡萄糖苷酶溶液但不加样品(用PBS缓冲液代替)的吸光度；
A2：不含α-葡萄糖苷酶溶液也不含样品(用PBS缓冲液代替)的吸光度；
A3：既含α-葡萄糖苷酶溶液也含样品的吸光度；
A4：不含α-葡萄糖苷酶溶液(用PBS缓冲液代替)的吸光度；
结果表明，副干酪乳杆菌STB对α-葡萄糖苷酶的抑制率为35.2％，远高于其余两株菌即植物乳杆菌STB1与短乳杆菌STB3a，具有显著的降血糖作用，为预防和辅助治疗糖尿病提供一定的研究基础(图6)。
(9)副干酪乳杆菌STB的降血脂能力：
用异丙醇将甘油三酯溶解，配成质量浓度为4mg/mL的甘油三酯标准溶液。于MRS液体培养基中加入2％(v/v)的甘油三酯标准溶液。以10％(v/v)的接菌量加入菌液，以加有甘油三酯标准溶液但未接菌的MRS液体培养基作为空白对照，并分别于37℃恒温培养6h、12h、24h后分别从MRS发酵液中吸取2mL至离心管中，4℃、4500rpm、5min离心，取1mL上清，加入4mL异丙醇，混合均匀后60℃水浴2min。加入1g氧化铝，充分振荡2min后4℃、4500rpm、5min离心，收集上清即为抽提液。取1mL抽提液与0.1mL KOH溶液充分混匀后，60℃水浴10min，加入0.5mL氧化剂和0.25mL显色剂，充分混匀后，于60℃水浴20min。取出反应管，待冷却后以空白管为对照，于420nm处测定吸光度。
甘油三脂含量(mg/100mL)＝(A1/A0)×200
公式中：A1：含有抽提液的测定管吸光度；
A0：不含有抽提液的测定管吸光度(用含有甘油三酯标准溶液的MRS液体培养基代替)；
结果表明，副干酪乳杆菌STB在培养24h后对甘油三酯的降解率达到34.7％，远高于其余两株菌即短乳杆菌STB13与副干酪乳杆菌STB14b(2)的降解率，具有显著的降血脂作用(图7)。
(10)副干酪乳杆菌STB的降尿酸(对黄嘌呤氧化酶体外抑制率)能力：
菌株活化后取2mL于4℃、4500rpm离心5min弃上清，PBS缓冲液重悬两次，调节菌液浓度109CFU/mL，于37℃培养箱中静置12h，4℃、10000rpm离心10min，收集上清液。向96孔板中依次加入50μL的PBS缓冲液、样品溶液、0.2U/L黄嘌呤氧化酶，37℃避光10min，再加入100μL的1.0mmol/L黄嘌呤溶液，295nm处测吸光度值，每隔30s记录一次，共计6min，取前后值相差最少的数值为A值。试验平行三次。以别嘌呤醇为阳性对照。
抑制率(％)＝[1-(C-D)/(A-B)]×100
公式中：A：含有黄嘌呤氧化酶溶液但不含样品(用PBS缓冲液代替)的吸光度；
B：不含黄嘌呤氧化酶溶液和样品(用PBS缓冲液代替)的吸光度；
C：含有黄嘌呤氧化酶溶液和样品的吸光度；
D：含有样品但不含黄嘌呤氧化酶溶液(用PBS缓冲液代替)的吸光度；
结果显示，副干酪乳杆菌STB对黄嘌呤氧化酶体外抑制率为47.2％，远高于其余两株菌即短乳杆菌STB3a与植物乳杆菌STB9b的抑制率，初步判断菌株的细胞代谢物中可能也含有一些活性多糖或者其他物质，对黄嘌呤氧化酶具有显著的抑制作用，从而减少尿酸的生成(图8)。
综上所述，本发明所筛选的副干酪乳杆菌STB对金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌性，且具有显著的降血糖(对α-葡萄糖苷酶的抑制能力)、降血脂能力和降尿酸的能力。
实施例2：副干酪乳杆菌STB发酵白酸汤
(1)副干酪乳杆菌STB发酵制备白酸汤的工艺：
a.原料预处理：选优质大米、糯米且质量比例为2：1，清洗去杂后，原料与水占比为1.5％(w/w)，常温浸泡10h左右，至米粒完全软化。
b.煮沸：沸腾后20min停止加热，保证米汤不要太过粘稠，影响菌株发酵。
c.冷却：待米汤冷却至室温后在超净台进行后续工艺操作。
d.过滤分装：用无菌纱布进行过滤，并分装至发酵瓶中。
e.添加低聚果糖：按照0.2g/mL配制高浓度糖液，在超净工作台无菌操作下过0.45μm滤膜，按照4％的添加量分别添加至米汤中。
h.接菌：菌株活化三次后，取4mL菌液在4500rpm、4℃、5min条件下离心，弃上清。用0.85％生理盐水重悬菌泥两次，并在超净台调节菌液浓度至109CFU/mL。
i.发酵：将接菌后的米汤放置37℃培养箱中进行发酵4d。
(2)副干酪乳杆菌STB发酵白酸汤后的活菌数和pH测定：
实验方法同上述生长曲线一致，只是样品换成发酵后的白酸汤，其余操作一致。结果显示，白酸汤发酵至第2d时活菌数达到最高，为7.4×109CFU/mL，pH降至3.27。具有较好的发酵特性(图9)。
(3)副干酪乳杆菌STB发酵白酸汤后的感官评定：
采用模糊数学综合评价法对不同菌株复配发酵得到的酸汤进行感官评价。感官评价人员共10人，分别对发酵前后的酸汤在色泽、口感、质地以及香气方面评分。详细的感官评定结果可见表2。
表2发酵酸汤的模糊数学综合评判结果Table 2Different sour soupcomprehensive evaluation results of fuzzy mathematics
结果显示，采用本发明筛选的副干酪乳杆菌STB发酵的白酸汤感官评定得分最高，为86.6。在不添加任何食品添加剂的情况下，其颜色依旧保持透亮，酸度适中，风味清香，具有较好的感官体验(图10)。
Claims (6)
1.一株副干酪乳杆菌STB，该菌株分类命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)，于2022年06月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2022881，保藏地址：中国武汉武汉大学。
2.权利要求1所述的副干酪乳杆菌STB在制备降血糖、降血脂和降尿酸产品中的应用。
3.权利要求1所述的副干酪乳杆菌STB在发酵制备白酸汤中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的白酸汤具有降血糖、降血脂和降尿酸的功效。
5.一种具有降血糖、降血脂和降尿酸功效的白酸汤发酵菌剂，其特征在于，该发酵菌剂中包含有权利要求1所述的副干酪乳杆菌STB。
6.一种具有降血糖、降血脂和降尿酸功效的白酸汤的发酵制备方法，其特征在于，采用权利要求1所述的副干酪乳杆菌STB进行发酵制备白酸汤。
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