CN113444646B - 一株产β-石竹烯的霉菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株产β‑石竹烯的霉菌及其应用，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2021424，该霉菌具有独特的产β‑石竹烯的能力，其菌落呈聚集生长、形态较大、质地疏松、外观干燥、呈现或松或紧的形状，在600倍显微镜下其顶囊为不规则大球形，其分生孢子为椭圆形。此外,其可以应用于酿酒过程中的以下任意步骤：在制曲过程中与制曲原料混合；或与经糖化、糊化的酿酒原料混合；或在发酵中后期与酿酒酒醅混合。本发明还提供了一种强化麸曲的制备方式，并且使用该曲其能够酿造出醇净、甘甜、不上头、富含β‑石竹烯的酒。

Description

一株产β-石竹烯的霉菌及其应用

技术领域

本发明属于酿酒微生物领域，具体涉及一株产β-石竹烯的霉菌及其应用。

背景技术

β-石竹烯是一种常见的半萜烯化合物，一般来源于植物和真菌的代谢过程。目前在多个领域都在研究其功能，在能源领域β-石竹烯正在被研究作为生产高密度燃料的前体，因此它被认为是下一代飞机燃料的一种重要成分。在医药领域β-石竹烯及其氧化物具有抗菌、降血脂、抗炎、抗肿瘤和杀菌活性，石竹烯也具有防龋、解痉和镇静活性，此外其衍生物还能够为一些植物提供防御而防止被昆虫所捕食。目前大规模生产β-石竹烯的方法主要有以下两种一种是从植物中提取；另一种则是通过化学合成的手段获取。然而，这两种方法都有明显的缺点，例如，植物中的β-石竹烯含量是有限的，因此低浓度和低回收率使得从植物中分离提取β-石竹烯不可行且经济效益低下，同时化学合成法又面临着复杂的工艺过程和高昂的生产成本，所以在工艺的复杂性和高成本的缺点下，化学合成的使用也受到了限制。微生物发酵合成β-石竹烯主要通过具有生长迅速，生产成本低，经济效益高的优点，因此微生物发酵生产的β-石竹烯有望成为传统方法的良好替代品。

在中国白酒领域β-石竹烯也存在于酱香、浓香和清香型成品白酒、原酒、酒醅、大曲中，特别地在药香型白酒中β-石竹烯的含量更高，近年来关于中国白酒中β-石竹烯等烯萜类化合物的研究也越来越多。霉菌是酿制中国白酒的重要微生物之一，但目前未有相关报道或专利提到产β-石竹烯的霉菌。

发明内容

本发明提供一株产β-石竹烯的霉菌及其应用，该菌株具有耐乙醇，产β-石竹烯，高产蛋白酶特性。

本发明的技术方案是，一株产β-石竹烯的霉菌，该菌株为横梗霉属，Lichtheimiaramosa K2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2021424。

进一步地，该菌株的DNA拼接序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还涉及一种强化麸曲，该麸曲中含有权利要求1或2中的霉菌。

进一步地，强化麸曲中霉菌的含量为10⁵-10⁷CFU/g；该强化麸曲采用霉菌和麸皮为原料，或者采用霉菌、麸皮及普通的麸曲为原料制备。

进一步地，该强化麸曲制备时，先将麸皮加去离子水拌匀，然后进行蒸汽灭菌，冷却至室温即为麸曲培养基；将产β-石竹烯的霉菌用无菌蒸馏水进行稀释制备成孢子悬浮液，使孢子数保持在10⁷～10⁸之间，取孢子悬浮液加入麸曲培养基，添加量为每100g培养基加9-12.5mL孢子悬浮液，25～30℃恒温箱中培养4d-6d，后干燥至恒重，得到强化麸曲。

本发明还涉及所述强化麸曲在酿酒中的应用。

本发明还涉及所述产β-石竹烯的霉菌在酿酒中的应用。

进一步地，所述酿酒为白酒酿造或黄酒酿造。

进一步地，该霉菌在制曲过程中与制曲原料混合，或与经过糖化、糊化的酿酒原料混合，或在发酵中后期与酿酒酒醅混合。

本发明还涉及所述的应用生产得到的白酒或黄酒，该白酒或黄酒中含有β-石竹烯。

本发明具备以下有益效果：

采用本发明提供的霉菌具有独特的产β-石竹烯的能力，利用该菌株进行酿酒，霉菌与酒曲混合,能够提高原酒中β-石竹烯的含量,增进香味、增强酒质，以丰富白酒的功能性和优品率。

本发明还提供一种强化麸曲，该强化麸曲中含产β-石竹烯的霉菌，采用此酒曲生产的酒中含有降血脂、抗炎、抗肿瘤作用的β-石竹烯，特别地对于用此曲酿造的白酒，具有醇净、甘甜、不上头的优点，用此曲酿造的黄酒中氨基酸态氮含量在0.291g/L- 0.396g/L。

附图说明

图1为本发明提供菌株在马铃薯葡萄琼脂培养基(Potato Dextrose AgarMedium)上的菌落形态图。

图2为本发明提供菌株在600倍显微镜下菌体形态图。

图3为本发明提供菌株的遗传发育树图。

图4为本发明提供菌株在发酵产物中石竹烯定性分析色谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

实施例1菌株的筛选

本发明涉及的一株产β-石竹烯的霉菌)是从湖北某酒厂的优质酒醅中分离得到的，具体实施方式如下：

准确称取优质酒醅样品25g放入含有玻璃珠的225mL无菌生理盐水中，在30℃、180r/min下震荡分散30min，从10^-1梯度稀释至10^-4,实际操作时取10^-2～10^-43个梯度,取100μL涂布至马铃薯葡萄琼脂培养基(PDA)平板各2个,30℃培养1d,之后每天挑取单菌落划线纯化培养，稳定传代6次后保藏于马铃薯葡萄琼脂培养基(PAD)斜面及甘油管中。本实施例中马铃薯葡萄琼脂培养基(PDA)组成为：马铃薯20-25份、葡萄糖15-25份、琼脂粉15-20份、水1000份、自然pH。

该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC M 2021424，保藏日期2021-4-21。经过鉴定，该菌株为横梗霉Lichtheimiaramosa K2。

微生物学形态特性：取培养好的斜面，用无菌生理盐水洗下孢子制成孢子悬液，将孢子悬液按照10倍梯度稀释，并取100μL涂布于马铃薯葡萄琼脂培养基，倒置平板，放入30℃培养箱中培养48h，观察菌落及菌丝形态特征：在PDA平板中明显能观察到该菌呈聚集生长、菌丝呈白色缠绕一起形成团，形态较大,质地疏松,外观干燥,不透明,呈现或松或紧的形状，具体如图1所示。

于600倍显微镜观察菌株的菌体、菌丝形态，菌体形态特征为：顶囊为不规则大球形，其分生孢子为椭圆形，呈现为褐色，具体见图2。

实施例2：产β-石竹烯能力验证

将霉菌斜面孢子用无菌生理盐水洗下制成10⁷～10⁸个/mL的孢子悬液，移取10mL接种于麸皮培养基中30℃、培养3d，每隔12h扣瓶一次，保证麸皮被充分打散；称取10g 经过培养后的麸皮培养基，加入90mL 1％的NaCI进行浸提，经过纱布过滤离心得到粗样。采用GC-MS对发酵样品进行定性分析证实K2菌株拥有产β-石竹烯的能力。

实施例3：K2菌株分子生物学鉴定

利用真菌DNA提取试剂盒对横梗霉K2菌株的基因组DNA进行提取纯化，随后以横梗霉菌株基因组DNA作为模板通过PCR仪扩增出18SrDNA序列。将其基因序列分别通过与NCBI的BLAST检索系统对序列相似性进行分析比较，然后用MEGA 7.0软件构建系统发育树如附图3所示。其DNA拼接序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例4：强化麸曲的制作

准确称取20份麸皮至250mL三角瓶中，加入15mL去离子水拌匀，121℃高压蒸汽灭菌20min后，取出冷却至室温；将K2菌株斜面,用5mL无菌蒸馏水洗脱至无菌250mL 锥形瓶中，通过血球板计数法计算孢子悬浮液中孢子数，通过稀释使孢子数保持在10⁷～10⁸之间；孢子悬浮液添加量为每100g培养基加12.5mL孢子悬浮液，拌匀后，将麸曲培养基置于30℃恒温箱中培养4d。培养期间，每隔12h进行一次扣瓶。经过培养4d 天，将三角瓶中麸曲置于38～40℃恒温干燥箱中，烘至恒重后，得到强化麸曲。

实施例5：小坛发酵

取3000g优质高粱没入水中10-20cm，浸泡24h，清洗七至八遍后高温蒸煮至破皮、开花，加入0.6％混合强化麸曲与酿酒曲混合比例为1:1的混合曲，搅拌均匀，26℃下糖化堆积24h，而后分别装入小坛，密封置于室温发酵7d。发酵结束后，上甑蒸馏、上甑时两边比中间略高1-2cm，采用“掐头去尾”的方法收集馏分，当原酒度数低与50度时停止接酒。即可得到一种富含β-石竹烯的白酒。原酒经固相顶空微萃取(HS-SPME)后进行GC-MS分析。

为了说明本发明的有益性，采用不添加强化麸曲的普通酿酒曲作为对照。GC-MS测定时，通过对比NIST数据库进行检索定性分析，再利用已知含量的内标物2-乙基丁酸、叔戊醇、乙酸正戊酯结合峰面积归一法对各组分定量，检测结果见表1。

表1应用HS-SPME法测定挥发性成分含量

注：---表示不含有该类物质

实施例6：

黄酒制作

1)制作酒母：取优质大米500.0g，加水浸泡12h，108℃-110℃蒸煮15-20min，淋冷后加入6‰经粉碎的强化麸曲，培菌2d后加入500ml水发酵5d得到酒母。

2)黄酒制作：取大米5000g，加水浸泡12h，108℃-110℃蒸煮15-20min，自然摊冷加入制作好的酒母，发酵14d，过滤澄清1d，90℃灭菌30min，灌装，即可得到一种甘甜，不上头，氨基酸态氮含量达0.291g/L-0.396g/L，同时含有β-石竹烯的优质黄酒。

SEQ ID NO.1

<110> 湖北稻花香酒业股份有限公司

<120> 一株产β-石竹烯的霉菌及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 784

<212> DNA

<213> 横梗霉（Lichtheimiaramosa )

<400> 1

aaccactagt tggggtctct tcccctctag tagttcctca cagttttgtg caaagtcggg 60

tcaacttggt tggctctgcc ttgtgctgta gatctggttg ttggcataga gaccctcctt 120

ttaggagact tgtgccacta ctaagatcta ggctgcttga aaagagaaga tgtatggacc 180

cttctttcag gagacctacg tctttgaagt caaagcaagc aaggcaagcc tttggggctc 240

tagtattaac tatccccaaa ggtgtttatt cttctcgtgt aaaccatgat gtacgaaaaa 300

gttagttgtt aacttaaaaa caactcttgg caatggatct cttggttctc gcatcgatga 360

agagcgtagc aaagtgcgat aattattgcg acttgcattc atagcgaatc atcgagttct 420

cgaacgcatc ttgcgcctag tagtcaatct actaggcaca gttgtttcag tatctgcaac 480

taccaatcag ttcaacttgg ttctttgaac ctaagcgagc tggaaatggg cttgtgttga 540

tggcattcag ttgctgtcat ggccttaaat acatttagtc ctaggcaatt ggctttagtc 600

atttgccgga tgtagactct agagtgcctg aagagcaacg acttggttag tgagttcata 660

attccaagtc aatcagtctc ttcttgaact aggtcttaat ctttacggac tagtgagagg 720

atctaacttg ggtcttctct tgaacaaact cacatctaga tctgaaatca actgagatca 780

cccg 784

Claims (10)

1.一株产β-石竹烯的霉菌，其特征在于，该菌株为横梗霉属，Lichtheimia ramosa K2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2021424。

2.根据权利要求1所述的产β-石竹烯的霉菌，其特征在于：该菌株的DNA序列如SEQ IDNO.1所示。

3.一种强化麸曲，其特征在于：该麸曲中含有权利要求1或2中的霉菌。

4.根据权利要求3所述的强化麸曲，其特征在于：强化麸曲中霉菌的含量为10⁵-10⁷CFU/g；该强化麸曲采用霉菌和麸皮为原料，或者采用霉菌、麸皮及普通的麸曲为原料制备。

5.根据权利要求3所述的强化麸曲，其特征在于：该强化麸曲制备时，先将麸皮加去离子水拌匀，然后进行蒸汽灭菌，冷却至室温即为麸曲培养基；将产β-石竹烯的霉菌用无菌蒸馏水进行稀释制备成孢子悬浮液，使孢子数保持在10⁷~10⁸之间，取孢子悬浮液加入麸曲培养基，添加量为每100g培养基加9-12.5 mL孢子悬浮液，25~30℃恒温箱中培养4d-6d，后干燥至恒重，得到强化麸曲。

6.权利要求3~5任意一项所述强化麸曲在酿酒中的应用。

7.权利要求1或2所述产β-石竹烯的霉菌在酿酒中的应用。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述酿酒为白酒酿造或黄酒酿造。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：该霉菌在制曲过程中与制曲原料混合，或与经过糖化、糊化的酿酒原料混合，或在发酵中后期与酿酒酒醅混合。

10.根据权利要求8所述的应用得到的白酒或黄酒，该白酒或黄酒中含有β-石竹烯。

Images