CN113583880A - 适用于制作广义虫草液体发酵种子液的培养基及其制备方法和培养方法 - Google Patents

适用于制作广义虫草液体发酵种子液的培养基及其制备方法和培养方法 Download PDF

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CN113583880A CN202111013853.5A CN202111013853A CN113583880A CN 113583880 A CN113583880 A CN 113583880A CN 202111013853 A CN202111013853 A CN 202111013853A CN 113583880 A CN113583880 A CN 113583880A
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Abstract

本发明公开了一种适用于制作广义虫草液体发酵种子液的培养基及其制备方法和培养方法，该培养基由1L营养液中加入青稞粉0‑5g、鱼粉0‑5g、蚕蛹粉0‑5g、牦牛奶粉0‑5g、葡萄糖0‑20g制成；所述营养液由土豆200g、大米0‑10g、燕麦0‑15g一起加水煎煮，滤出液体，定容到1L而成。采用本发明的培养基配方和培养方法获得的种子液菌丝体含量高、不成球，且培养基组分均可食用。对比常规的PDA和麦麸培养基具有一定优势，发酵时间短、工艺简单、成本低廉、安全可靠，可用于广义虫草发酵菌丝体的工业化、规模化生产；能够更大的满足市场需求，获得更多的经济效益，缓解市场对于自然资源的压力。

Description

适用于制作广义虫草液体发酵种子液的培养基及其制备方法 和培养方法
技术领域
本发明涉及虫草培养基，具体涉及一种适用于制作广义虫草液体发酵种子液的培养基及其制备方法和培养方法。
背景技术
广义虫草(以下简称虫草)是指隶属于子囊菌门(Ascomycota)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)，包括虫草科(Cordycipitaceae)、线虫草科(Ophiocordycipitaceae)全部种类以及麦角菌科(Clavicipitaceae)部分物种在内的真菌类群，其中大部分寄生昆虫，少数种类寄生蜘蛛等其他节肢动物、真菌、植物等。目前，收录于真菌名称据库网站Index Fungorum(http://www.indexfungorum.org)的世界虫草名称超过2000个，剔除同物异名和不合格发表名称，全世界报道的虫草种类也有近千种，是子囊菌中多样性较高的类群之一。
许多虫草种类具有食药用价值，如分布在青藏高原及其周边地区的珍稀食药用菌冬虫夏草[Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones&Spatafora]、分离自冬虫夏草的蝙蝠蛾拟青霉[Paecilomyces hepiali Q.T.Chen&R.Q.Daiex R.Q.Dai,X.M.Li,A.J.Shao,Shu F.Lin,J.L.Lan,Wei H.Chen&C.Y.Shen]、蛹虫草[Cordyceps militaris(L.)Fr]和广东虫草[Tolypocladium guangdongense(T.H.Li,Q.Y.Lin&B.Song)V.Papp]等。虫草富含多种有效成分如核苷类化合物、甾醇类化合物、多糖、虫草素等，同时具有抗菌、抗癌、抗血小板凝结、抗辐射、改善和提高记忆力、调节机体免疫能力、钙离子拮抗、对脑和心脏在常压缺氧下有保护、镇静、镇痛等作用。
由于虫草功效显著，拥有较高的营养价值和药用价值，虫草市场的需求不断增加，但随着过度采挖和全球气候变化等影响，天然虫草的分布与数量明显萎缩，天然虫草资源面临严峻危机，亟需替代品对其进行有效的开发利用，如通过发酵开发相关虫草产品等。尽管不少文章和专利公开了虫草培养方法，但部分物种由于虫草特殊的生长环境和较长的生产周期，部分物种的大规模发酵培养仍存在菌丝体生长慢、产量低，培养时间长，成本高昂等问题。由于部分广义虫草物种对于培养基的营养成分需求较高，在PDA、麦麸等常用培养基中培养易成球，导致作为种子液生长点太少，用于后续接种发酵培养时效率较低。目前的培养基配方多存在组分过于复杂、配置步骤繁琐、食用安全性难以保障、适用于广义虫草发酵生产普遍性较低等问题。针对这种现状，优化发明得到一种广义虫草发酵种子液的培养基配方是极有意义的。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种适用于制作广义虫草液体发酵种子液的培养基，该培养基所有组分均可食用，能收获大量不成球的虫草菌丝体，适合用于培养作为广义虫草发酵用的种子液，可以有效解决后续虫草发酵培养菌丝体生长慢、产量低，培养时间较长，成本高昂等问题；同时可适用于广义虫草物种的发酵生产，普遍性高。
本发明还提供所述培养基的制备方法和培养方法。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种适用于制作广义虫草液体发酵种子液的培养基，所述培养基由1L营养液中加入青稞粉0-5g、鱼粉0-5g、蚕蛹粉0-5g、牦牛奶粉0-5g、葡萄糖0-20g；所述营养液由土豆200g、大米0-10g、燕麦0-15g一起加水煎煮，滤出液体，定容到1L形成。
作为优选，所述培养基由1L营养液中加入青稞粉2-5g、鱼粉2-5g、蚕蛹粉2-5g、牦牛奶粉2-5g、葡萄糖10-20g；所述营养液由土豆200g、大米5-10g、燕麦10-15g一起加水煎煮，滤出液体，定容到1L形成。
本发明所述的适用于制作广义虫草液体发酵种子液的培养基的制备方法，包括如下步骤：
将切至条状的土豆、大米、燕麦加水一起煎煮，水沸后滤出汁液，加水定容，再加入青稞粉、鱼粉、蚕蛹粉、牦牛奶粉、葡萄糖混匀，灭菌即可。
其中，土豆与水的重量比为1:6.5-8.5。
作为优选，所述土豆与水的重量比为1:7.5。
本发明所述的适用于制作广义虫草液体发酵种子液的培养基的培养方法，包括如下步骤：
(1)试管分离纯化：将虫草样品表面清理干净，取内部组织，进行接种及纯化，获得健壮菌丝；
(2)摇瓶培养：无菌条件下将步骤(1)获得的菌丝接入本发明所述配方培养基中，摇瓶培养，得到虫草种子液；
(3)液体培养：无菌条件下将步骤(2)的种子液接入广义虫草发酵培养的真菌通用培养基(如PDA、麦麸培养基等)，得到虫草菌丝体。
其中，步骤(1)将虫草样品表面清理干净，取内部组织，无菌条件下在麦麸斜面固体培养基上进行接种及纯化，在15-25℃条件下恒温培养5-60天后，获得健壮菌丝。
其中，步骤(2)在无菌条件下将步骤(1)获得的健壮菌丝接入本发明所述配方的培养基中，在15-25℃条件下恒温摇瓶培养，转速100-120rpm，5-20天后终止培养，得到虫草种子液，于10℃贮藏备用；
其中，步骤(3)在无菌条件下，在起始pH值4.8-7.2条件内，按体积比5-20％的接种量将虫草种子液接接种于真菌通用培养基(如PDA、麦麸培养基等)中进行培养，培养基的装瓶量为三角瓶容积的1/5-1/3。
其中，步骤(3)培养条件为在15-22℃条件下恒温培养，转速120rpm，培养5-20天，得到虫草菌丝体。
作为优选，所述起始pH值优选为5.0-7.0；所述接种量优选为10％-20％；所述培养温度优选为16-21℃，所述装瓶量为三角瓶容积的1/5-2/5。
进一步地，所述起始pH值尤其优选为5.5-6.5；所述接种量优选为10％-15％；所述培养温度优选为18-20℃，所述装瓶量为三角瓶容积的1/5-1/3，尤其优选为1/5。
利用本发明的培养基在15-25℃条件下培养5-20天，即可得到大量虫草菌丝体。利用该种子液培养基配方及培养方法，培养的广义虫草菌丝体对比传统PDA和麦麸培养基，具有生长快、产量高、不成球、安全稳定、工艺简单、成本低廉等优点，适合作为液体发酵培养时的种子液使用，可用于广义虫草发酵菌丝体的工业化、规模化生产。以蝙蝠蛾被毛孢为例，采用该培养基配方液体发酵(50mL)15天得到的种子液，虫草菌丝体和发酵液固液分离以后，用冷冻干燥的方法将菌丝体干燥，称重为2.00g，远高于PDA培养基0.20g和麦麸培养基0.31g。
机理：1、广义虫草培养基对于营养成分要求较高，传统培养基(PDA、麦麸)营养成分难以满足很多虫草物种的需求，生长缓慢，培养时间较长。2、广义虫草是一类可开发成保健品、药品的重要生物资源，基于安全性考虑，培养基原材料需安全无毒，最好使用可食用的原料，选用的葡萄糖、牦牛奶粉、青稞粉、鱼粉、蚕蛹粉、燕麦等均可食用，安全性有充分保障。3、传统培养基(PDA、麦麸等)液体培养获得的菌丝体容易成球，导致作为种子液接种生长点少，直接影响了发酵时间和产量，本发明的培养基配方所培养的虫草菌丝体不成球、生长点丰富，所以能为后续大规模发酵培养(如发酵罐等)提供优良的种子液，本发明配方中的牦牛奶粉是影响菌丝体是否起球的重要因素，其他组分也会影响菌丝体产量和生长速率。
本发明在培养方法的第(2)步采用本发明培养基用来生产种子液，由于其用量少，也不会增加成本，后续可以继续使用普通培养基进行大规模生产。
有益效果：与现有技术相比本发明具有如下优点：
本发明提供了一种全新的适用于广义虫草发酵种子液的培养基配方及其培养方法，由于大部分虫草菌早已适应动物类蛋白质的吸收，对植物蛋白利用较差，因此本发明选用特定种类和比例的蚕蛹粉，鱼粉，牦牛奶粉等作为动物蛋白来源，更有利于虫草菌丝体发酵生长。采用此培养基配方和培养方法培养的虫草菌丝体生长快、产量高、菌丝体不成球，对比常规的PDA和麦麸培养基具有一定优势。且所用时间短、工艺简单、成本低廉、安全可靠，可用于广义虫草发酵菌丝体的工业化、规模化生产；能够更大的满足市场需求，获得更多的经济效益，缓解市场对于自然资源的压力。综上所述，本发明可产生较好的社会经济效益，市场前景广阔。
附图说明
图1分离纯化获得的蝙蝠蛾被毛孢斜面培养物；
图2A采用麦麸培养基培养获得的蝙蝠蛾被毛孢菌丝体状态(培养20天)；
图2B采用本专利培养基培养获得的蝙蝠蛾被毛孢菌丝体状态(培养15天)。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明中的原料和试剂如无特殊说明，均为商业化市售。
本发明采用常规的蝙蝠蛾被毛孢、虫草棒束孢、老君山线虫草，均为野生型的菌株，通过ITS分子鉴定并与NCBI数据库比对鉴定无误。
实施例1
1、用于蝙蝠蛾被毛孢发酵种子液生产的培养基的制备：
将切至条状的土豆200g、大米8g、燕麦12g一起加去离子水煎煮，土豆与水的重量比为1:7.5，水沸后纱布过滤，滤出汁液，定容到1L，加葡萄糖20g、青稞粉3g、鱼粉3g、蚕蛹粉3g、牦牛奶粉3g混匀，在121℃、103kPa条件下，灭菌20min即可。
2、采用如上所述的发酵种子液培养基进行蝙蝠蛾被毛孢发酵培养，包括以下步骤：
(1)将蝙蝠蛾被毛孢虫草样品表面清理干净，取内部组织，无菌条件下在麦麸斜面固体培养基上进行接种及纯化，纯化后于麦麸培养基18℃恒温培养40天获得健壮菌丝(图1)；
(2)无菌条件下将步骤(1)获得的菌丝取黄豆大小接入步骤1中制备的50mL配方的培养基中，在18℃条件下恒温摇瓶培养，转速120rpm，15天后终止培养，得到虫草种子液(菌丝体状态如图2B所示)，于10℃贮藏备用；
(3)在无菌条件下，起始pH值5.6，按体积比10％的接种量将蝙蝠蛾被毛孢种子液接种于传统培养基(麦麸培养基)中，培养基接种比例1/5，在18℃，120rpm，培养15天，得到蝙蝠蛾被毛孢菌丝体。将所得的蝙蝠蛾被毛孢菌丝体提取DNA，对其ITS(核糖体转录间隔区)片段进行PCR扩增并测序，采用蝙蝠蛾被毛孢专用分子数据库进行比较分析，分析结果表明本方法培养得到的菌丝体为蝙蝠蛾被毛孢菌丝体。
从本发明的图2中可以看出，步骤(2)中采用传统培养基如麦麸或者PDA液体培养获得的菌丝体容易成球(图2A)，导致作为种子液接种生长点少，直接影响了发酵时间和产量，本发明的培养基配方所培养的虫草菌丝体不成球(图2B)、生长点丰富，所以能为后续大规模发酵培养(如发酵罐等)提供优良的种子液。
采用实施例1的步骤(2)中培养基配方液体培养(50mL)15天，虫草菌丝体和发酵液固液分离以后，用冷冻干燥的方法将菌丝体干燥，称重为2.00g。显著高于步骤(2)在同样培养条件下替换采用PDA培养基的0.20g和麦麸培养基的0.31g获得的菌丝体产量。
对比例1
对比例1中采用实施例1中相同的配方和培养方法，不同之处在于，配方中不含牦牛奶粉，步骤(2)得到虫草种子液中菌丝体容易成球。
此外，其他组分如青稞粉鱼粉、蚕蛹粉也会影响菌丝体产量和生长速率。
实施例2
1、用于虫草棒束孢发酵种子液生产的培养基的制备：
将切至条状的土豆200g、大米7g、燕麦12g一起加去离子水煎煮，土豆与水的重量比为1:7.5，水沸后纱布过滤，滤出汁液，定容到1L，加葡萄糖20g、青稞粉4g、鱼粉4g、蚕蛹粉4g、牦牛奶粉4g混匀，在121℃、103kPa条件下，灭菌20min即可。
2、采用如上所述的发酵种子液培养基进行虫草棒束孢发酵培养，包括以下步骤：
(1)将虫草样品表面清理干净，取内部组织，无菌条件下在麦麸斜面固体培养基上进行接种及纯化，纯化后于麦麸培养基25℃恒温培养40天获得健壮菌丝；
(2)无菌条件下将步骤(1)获得的菌丝取黄豆大小接入步骤1中制备的50mL配方的培养基中，在25℃条件下恒温摇瓶培养，转速120rpm，5天后终止培养，即为虫草种子液，于10℃贮藏备用；
(3)在无菌条件下，起始pH值5.8，按体积比10％的接种量将虫草棒束孢种子液接种传统培养基(麦麸培养基)中，培养基装瓶量为三角瓶容积的1/5，在25℃，120rpm，培养5天，得到虫草棒束孢菌丝体。将所得的虫草棒束孢菌丝体提取DNA，对其ITS(核糖体转录间隔区)片段进行PCR扩增并测序，采用虫草棒束孢专用分子数据库进行比较分析，分析结果表明本方法培养得到的菌丝体为虫草棒束孢菌丝体；
采用实施例2的步骤(2)中该培养基配方液体发酵(50mL)5天，虫草菌丝体和发酵液固液分离以后，用冷冻干燥的方法将菌丝体干燥，称重为3.01g。并显著高于步骤(2)在同样的培养条件下替换采用高于PDA培养基的2.12g和麦麸培养基的2.34g。
实施例3
1、用于老君山线虫草发酵种子液生产的培养基的制备：
将切至条状的土豆200g、大米6g、燕麦12g一起加去离子水煎煮，土豆与水的重量比为1:7.5，水沸后纱布过滤，滤出汁液，定容到1L，加葡萄糖20g、青稞粉3g、鱼粉3g、蚕蛹粉4g、牦牛奶粉4g混匀，在121℃、103kPa条件下，灭菌20min即可。
2、采用如上所述的发酵种子液培养基进行老君山线虫草发酵培养，包括以下步骤：
(1)将虫草样品表面清理干净，取内部组织，无菌条件下在麦麸斜面固体培养基上进行接种及纯化，纯化后于麦麸培养基20℃恒温培养培养60天以上获得健壮菌丝；
(2)无菌条件下将步骤(1)获得的菌丝取黄豆大小接入步骤1中制备的50mL配方的培养基中，在20℃条件下恒温摇瓶培养，转速120rpm，20天后终止培养，即为虫草种子液，于10℃贮藏备用；
(3)在无菌条件下，起始pH值6.0，按体积比10％的接种量将老君山线虫草种子液接种于传统培养基(麦麸)中，培养基装瓶量为三角瓶容积的1/5，在20℃，120rpm，培养20天，得到老君山线虫草菌丝体。将所得的老君山线虫草菌丝体提取DNA，对其ITS(核糖体转录间隔区)片段进行PCR扩增并测序，采用老君山线虫草专用分子数据库进行比较分析，分析结果表明本方法培养得到的菌丝体为老君山线虫草菌丝体。
采用实施例3的步骤(2)该培养基配方液体发酵(50mL)20天，虫草菌丝体和发酵液固液分离以后，用冷冻干燥的方法将菌丝体干燥，称重为1.30g，并显著高于步骤(2)在同样的培养条件下替换采用PDA培养基的0.21g和麦麸培养基的0.23g。
实施例4
1、用于蝙蝠蛾被毛孢发酵种子液生产的培养基的制备：
将切至条状的土豆200g、大米5g、燕麦10g一起加去离子水煎煮，土豆与水的重量比为1:6.5，水沸后纱布过滤，滤出汁液，定容到1L，加葡萄糖10g、青稞粉2g、鱼粉2g、蚕蛹粉2g、牦牛奶粉3g混匀，在121℃、103kPa条件下，灭菌20min即可。
2、采用如上所述的发酵种子液培养基进行蝙蝠蛾被毛孢发酵培养，包括以下步骤：
(1)将蝙蝠蛾被毛孢虫草样品表面清理干净，取内部组织，无菌条件下在麦麸斜面固体培养基上进行接种及纯化，纯化后于麦麸培养基18℃恒温培养40天获得健壮菌丝；
(2)无菌条件下将步骤(1)获得的菌丝取黄豆大小接入步骤1中制备的50mL配方的培养基中，在18℃条件下恒温摇瓶培养，转速120rpm，5天后终止培养，得到虫草种子液，于10℃贮藏备用；
(3)在无菌条件下，起始pH值4.8，按体积比5％的接种量将蝙蝠蛾被毛孢种子液接种于传统培养基(麦麸培养基)中，培养基接种比例1/5，在18℃，120rpm，培养20天，得到蝙蝠蛾被毛孢菌丝体。将所得的蝙蝠蛾被毛孢菌丝体提取DNA，对其ITS(核糖体转录间隔区)片段进行PCR扩增并测序，采用蝙蝠蛾被毛孢专用分子数据库进行比较分析，分析结果表明本方法培养得到的菌丝体为蝙蝠蛾被毛孢菌丝体。
实施例5
1、用于蝙蝠蛾被毛孢发酵种子液生产的培养基的制备：
将切至条状的土豆200g、大米10g、燕麦15g一起加去离子水煎煮，土豆与水的重量比为1:8.5，水沸后纱布过滤，滤出汁液，定容到1L，加葡萄糖20g、青稞粉5g、鱼粉5g、蚕蛹粉5g、牦牛奶粉5g混匀，在121℃、103kPa条件下，灭菌20min即可。
2、采用如上所述的发酵种子液培养基进行蝙蝠蛾被毛孢发酵培养，包括以下步骤：
(1)将蝙蝠蛾被毛孢虫草样品表面清理干净，取内部组织，无菌条件下在麦麸斜面固体培养基上进行接种及纯化，纯化后于麦麸培养基18℃恒温培养40天获得健壮菌丝；
(2)无菌条件下将步骤(1)获得的菌丝取黄豆大小接入步骤1中制备的50mL配方的培养基中，在18℃条件下恒温摇瓶培养，转速120rpm，20天后终止培养，得到虫草种子液(菌丝体状态如图2B所示)，于10℃贮藏备用；
(3)在无菌条件下，起始pH值7.2，按体积比10％的接种量将蝙蝠蛾被毛孢种子液接种于传统培养基(麦麸培养基)中，培养基接种比例1/5，在18℃，120rpm，培养5天，得到蝙蝠蛾被毛孢菌丝体。将所得的蝙蝠蛾被毛孢菌丝体提取DNA，对其ITS(核糖体转录间隔区)片段进行PCR扩增并测序，采用蝙蝠蛾被毛孢专用分子数据库进行比较分析，分析结果表明本方法培养得到的菌丝体为蝙蝠蛾被毛孢菌丝体。

Claims (10)

1.一种适用于制作广义虫草液体发酵种子液的培养基，其特征在于，所述培养基由1L营养液中加入青稞粉0-5g、鱼粉0-5g、蚕蛹粉0-5g、牦牛奶粉0-5g、葡萄糖0-20g；所述营养液由土豆200g、大米0-10g、燕麦0-15g一起加水煎煮，滤出液体，定容到1L形成。
2.根据权利要求1所述的适用于制作广义虫草液体发酵种子液的培养基，其特征在于，所述培养基由1L营养液中加入青稞粉2-5g、鱼粉2-5g、蚕蛹粉2-5g、牦牛奶粉2-5g、葡萄糖10-20g；所述营养液由土豆200g、大米5-10g、燕麦10-15g一起加水煎煮，滤出液体，定容到1L形成。
3.一种权利要求1或2所述的适用于制作广义虫草液体发酵种子液的培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将切至条状的土豆、大米、燕麦加水一起煎煮，水沸后滤出汁液，加水定容，再加入青稞粉、鱼粉、蚕蛹粉、牦牛奶粉、葡萄糖混匀，灭菌即可。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，土豆与水的重量比为1:6.5-8.5。
5.一种利用权利要求1或者2所述的适用于制作广义虫草液体发酵种子液的培养基的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)试管分离纯化：将虫草样品表面清理干净，取内部组织，进行接种及纯化，获得健壮菌丝；
(2)摇瓶培养：无菌条件下将步骤(1)获得的菌丝接入权利要求1或者2所述的适用于广义虫草发酵种子液的培养基中，摇瓶培养，得到虫草种子液；
(3)液体培养：无菌条件下将步骤(2)的种子液接入真菌通用培养基中进行培养，得到虫草菌丝体。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)将虫草样品表面清理干净，取内部组织，无菌条件下在麦麸斜面固体培养基上进行接种及纯化，纯化后于15-25℃条件下在恒温培养箱中培养5-60天后，获得健壮菌丝。
7.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)在无菌条件下将步骤(1)获得的健壮菌丝接入适用于制作广义虫草液体发酵种子液的培养基，在15-25℃条件下恒温摇瓶培养，转速100-120rpm，5-20天后终止培养，得到虫草种子液，贮藏备用。
8.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)在无菌条件下，在起始pH值4.8-7.2条件内，按体积比5-20％的接种量将虫草种子液接入真菌通用培养基中培养，培养基的装瓶量为三角瓶容积的1/5-1/3。
9.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)中真菌通用培养基包括PDA或麦麸培养基。
10.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)培养条件为在15-22℃条件下恒温培养5-20天，得到虫草菌丝体。
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