CN108728382B - 一株具降胆固醇及促进肠道短链脂肪酸产生能力的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
一株具降胆固醇及促进肠道短链脂肪酸产生能力的植物乳杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一株具有降胆固醇及促进肠道短链脂肪酸产生能力的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）N‑1及其应用。本发明提供的植物乳杆菌N‑1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.15463，保藏日期：2018年3月20日。该菌株分离自四川省甘孜藏族自治州稻城县木拉乡卡龙村的传统牦牛乳干酪制品，在MRS琼脂培养基上生长良好，对酸和胆盐有一定的耐受能力，对人结肠癌细胞Caco‑2黏附能力较高，降胆固醇能力强，并能显著增加肠道短链脂肪酸的产生，应用于功能性食品领域，不仅具有实际生产价值，而且对人体健康具有非常重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具降胆固醇及促进肠道短链脂肪酸产生能力的植物乳杆菌，特别涉及功能性乳酸菌及其制品生产开发领域。
背景技术
心血管疾病是人类健康和生命的头号杀手，而高胆固醇血症是引发心血管疾病的主要危险因素之一。随着饮食的西化，我国血脂异常的患病率在快速升高，逐渐接近西方国家水平，严重危害人类健康。
乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称。乳酸菌作为益生菌的一类，被美国食品和药品监督管理局（FDA）认定是高度安全的食品级微生物。乳酸菌可调节肠道菌群，具有减缓乳糖不耐症，提高机体免疫力，延缓衰老等功能。近年来，国内外大量研究表明乳酸菌在体内外都具有降低胆固醇的功效，长期食用乳酸菌及其制品可降低血清胆固醇水平，从而降低心血管疾病的发病率。
短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs），又叫挥发性脂肪酸，指碳原子数为1-6的有机脂肪酸，具有很重要的生理作用，与人类某些疾病的发生发展密切相关，可降低肠道炎症反应，促进黏液分泌，提高肠上皮屏障功能，可抑制结肠中肿瘤细胞的增殖和分化、促使肿瘤细胞凋亡等。不断有研究表明乳酸菌可以促进动物肠道短链脂肪酸的产生。
目前关于乳酸菌降胆固醇的文献报道有：1）《食品科学》2011年21期，杨琴等（2011），降胆固醇乳酸菌的筛选及对大鼠血脂的影响[J]，该研究从发酵品及肠道排泄物中分离的海氏肠球菌（Enterococcus hirae）I-2和屎肠球菌（Enterococcus faecium）R-2对MRS-CHOL培养基胆固醇降解率最高，分别是26.97 ± 0.51%和23.72 ± 0.41%，饲喂这两株菌可明显抑制高脂大鼠总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平的升高。 2）《中国食品学报》 2016年03期，吕秀红等（2016），降胆固醇乳酸菌的筛选与鉴定[J]，从传统泡菜中筛选出两株植物乳杆菌LpT1和LpT2对胆固醇的降解率分别达到49.11%和50.03%。3）《食品科学》2013年第01期，王俊国等（2013），具有胆盐水解酶活性的乳酸菌对高血脂症大鼠血脂的调节作用[J]。该研究指出将具有较高胆盐水解酶活性的发酵乳杆菌MGH13-l灌胃大鼠后，实验组血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯等含量明显低于高脂模型组，短链脂肪酸含量高于高脂模型组。
近年来，国内关于降胆固醇乳酸菌的研究逐渐增多，但仍有很多研究只关注了乳酸菌体外降胆固醇的能力，同时由于乳酸菌体内外降胆固醇的能力并不直接相关，也就是说，即使一株乳酸菌具有较强的体外降胆固醇能力，但并不能说明该乳酸菌体内降胆固醇的能力也强，因此将这些菌株应用于实际生产也还有一定的距离，因此体内试验才是评估乳酸菌降胆固醇功能的最好方式。此外，现有文献报道多侧重乳酸菌对高脂饮食动物脂代谢的研究，如公开号CN104818230 A公开了一株具有降解胆固醇功能的植物乳杆菌L01及其应用，该乳酸菌从传统泡菜中分离筛选获得，来源于传统食品，安全性较高，同时具有良好的耐酸、耐胆盐和细胞粘附性，并对维持肠道微生物菌群平衡具有一定作用，能够应用在制备发酵乳制品中，其降解胆固醇的能力强，可有效降低血清胆固醇，提高机体免疫力。同很多研究一样，该发明只关注了乳酸菌降胆固醇能力，而对其它益生作用研究较少，如短链脂肪酸等重要代谢物。虽然王俊国等（2013），“具有胆盐水解酶活性的乳酸菌对高血脂症大鼠血脂的调节作用”一文中有涉及短链脂肪酸的研究，但该菌株促进短链脂肪酸产生的能力并不高。
传统牦牛发酵乳制品因蕴含着丰富的乳酸菌资源而被广大科研工作者所关注。四川稻城牧民长期食用脂肪含量很高的自制干酪（酥油奶饼，其工艺独特，由未提炼酥油的牦牛乳发酵而成，不添加外源乳酸菌），但心血管疾病的发病率并不高。因此，从四川稻城传统干酪中筛选降胆固醇能力较高的乳酸菌，并通过对其体内降胆固醇能力及肠道短链脂肪酸含量进行评估，将其应用于功能性食品领域，不仅具有广阔的前景，而且对人体健康也具有非常重要的意义。
发明内容
本发明旨在提供一株具降胆固醇及促进肠道短链脂肪酸产生的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）N-1及其应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）N-1于2018年 3月 20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101），保藏编号为CGMCC NO. 15463。
所述植物乳杆菌CGMCC 15463，是从四川省甘孜藏族自治州稻城县木拉乡卡龙村的传统牦牛乳干酪（奶饼）中分离获得。
所述植物乳杆菌CGMCC 15463，在MRS琼脂培养基上生长良好，菌落为乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明，触媒阴性，对菌体形态进行镜检，革兰氏染色呈紫色，杆状。
所述植物乳杆菌CGMCC 15463，通过耐酸、耐胆盐和黏附试验表明其对酸和胆盐有一定的耐受能力，对人结肠癌细胞Caco-2黏附能力较高。
所述植物乳杆菌CGMCC 15463，在体外模拟试验中通过与不同分离菌株降胆固醇能力相比较，本发明菌株降胆固醇能力最高，达31.77%。
所述植物乳杆菌CGMCC 15463，通过动物试验表明该菌株能够降低高胆固醇血症模型大鼠血清胆固醇水平，缓解肝脏病理状况，并且能够显著增加大鼠盲肠内容物中短链脂肪酸的产生。
所述植物乳杆菌CGMCC 15463，通过采用细菌通用引物16S rDNA的27F/1492R对其基因组总DNA为模板进行PCR扩增，得到由1465碱基对（bp）组成的目的基因序列，如SEQUENCE LISTING 所示。将测序得到的基因序列输入NCBI数据库进行比对，其与Genebank中的标准菌株Lactobacillus plantarum strain MH19相似率达100%，可初步鉴定该菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：
1、本发明提供的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC 15463，分离筛选自四川省甘孜藏族自治州木拉乡卡龙村的传统牦牛乳干酪（奶饼）制品，在MRS琼脂培养基上生长良好，对酸和胆盐有一定的耐受能力，对人结肠癌细胞Caco-2黏附能力较高。
2、本发明提供的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC 15463，在体外模拟试验中通过与不同分离菌株降胆固醇能力相比较，本发明菌株降胆固醇能力最高，达31.77%，具有较强的应用潜力。
3、本发明提供的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC 15463，动物试验表明该菌株能够降低高胆固醇血症模型大鼠血清胆固醇水平，缓解肝脏病理状况，并且能够显著增加大鼠盲肠内容物中短链脂肪酸的产生，因此，应用于功能性食品领域，不仅具有实际生产价值，而且对人体健康也具有非常重要的意义。
附图说明
图1为本发明植物乳杆菌CGMCC 15463MRS琼脂培养基上的菌落形态图；
图2为本发明植物乳杆菌CGMCC 15463在光学显微镜下的细胞形态图；
图3为本发明实施例4中各组大鼠肝脏经HE染色在光学显微镜下的形态图（×200），其中A为正常组，B为HFD（模型组），C为HFD+Sta（药物组），D为HFD+N-1（植物乳杆菌CGMCC 15463组）。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。但本发明的保护范围不限于下述的实施例，凡在本发明原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，培养基中所涉及的百分比，均为质量体积比。
实施例1
植物乳杆菌CGMCC 15463的分离、筛选及分子生物学鉴定：
1. 材料准备
奶饼样品由四川省稻城县木拉乡卡龙村提供；
通用引物对由Invitrogen公司（上海）合成，27F/1492R序列如下：
27F： AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT
MRS 液体培养基：葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，牛肉膏 10.0 g，酵母粉6.0 g，吐温80 1.0 mL，磷酸氢二钾2.0 g，柠檬酸铵2.0 g，乙酸钠 5.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，纯水1 L，pH自然（加1.5%-2.0%琼脂为固体培养基）。
2.具体方式
传统牦牛乳干酪（奶饼）样品称取10.0 g，于装有90 mL无菌水的锥形瓶中充分搅拌，然后置于摇床振荡60 min，使样品完全分散。吸取悬液，10倍梯度稀释分别涂布于MRS固体培养基上，37℃培养48 h，肉眼观察挑取不同形态和大小的单菌落，平板划线纯化3次。将纯化好的菌株保存于50%甘油中，-40℃冷冻保存备用。纯化之后的菌株，用相应的液体培养基进行增殖培养后，采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA，细菌通用引物27F/1492R扩增16S rRNA，将测得的16S rRNA序列进行NCBI BLAST比对，与Genebank中的Lactobacillus plantarum标准菌株MH19相似率达100%，初步鉴定该菌株为一株Lactobacillus plantarum，即植物乳杆菌。
将所述植物乳杆菌CGMCC 15463划线于MRS琼脂培养基上，37℃倒置培养48 h后，对菌株的菌落形态进行观察，如图1所示。
所述菌株在MRS琼脂培养基上生长良好，菌落为乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明，触媒阴性；对所述植物乳杆菌CGMCC 15463的菌体形态进行镜检，革兰氏染色呈紫色，杆状，如图2所示。
实施例2
植物乳杆菌CGMCC 15463主要发酵特征的检测
PBS缓冲液：磷酸二氢钾0.20 g，磷酸氢二钠1.15 g，氯化钠8.0 g，氯化钾 0.2 g，加入800 mL纯水搅拌溶解，浓盐酸调至相应pH值，定容至1 L。
DMEM完全培养基：DMEM原液，10%胎牛血清，1% 100 U/ml双抗。
1、耐酸试验：将活化三代的乳酸菌以1%的接种量分别接种至pH为3.5、2.5、2.0的PBS缓冲液中，37℃静置培养3 h，梯度稀释平板法测定乳酸菌活菌数。
2、耐胆盐试验：将活化三代的乳酸菌以1%的接种量分别接种至含0.1%、0.2%、0.3%的牛胆盐的MRS液体培养基中，37℃静置培养5 h，梯度稀释平板法测定乳酸菌活菌数。
耐酸和耐胆盐结果见表1。从表1可知，植物乳杆菌CGMCC 15463对酸和胆盐有一定的耐受性，可在pH 3.5和0.1%胆盐浓度下存活，存活率均大于98%，随pH值的下降和胆盐浓度的增加，活菌数逐渐减少，在pH 2.0和0.3%胆盐浓度下存活率为29.0%和52.4%。
表1 植物乳杆菌CGMCC 15463对酸和胆盐的耐受性
3、粘附试验：将传代一次浓度为1×105个/mL的Caco-2细胞接种至12孔板，37℃，5% CO2环境条件下培养至单层细胞，弃去培养液，无菌PBS缓冲液轻轻洗涤三次，加入1 mLDMEM原液和预先准备好的用DMEM悬浮的浓度约为109 CFU/mL的乳酸菌菌悬液100 μL，每株菌做三个孔，培养2 h后，弃上清，无菌PBS清洗三次，每孔加入300 μL 0.25%胰酶消化5-8min，然后加入300 μL不完全DMEM培养基（含血清不含双抗）终止消化，然后平板稀释涂布计算粘附的乳酸菌数目。
粘附率（%）=粘附乳酸菌的数目/初始接种数目×100%
结果见表2。从表2可知，植物乳杆菌CGMCC 15463对Caco-2细胞的粘附率为4.03%，即每个细胞周围可粘附约60个乳酸菌。
表2 植物乳杆菌N-1对Caco-2细胞的粘附能力
实施例3
植物乳杆菌CGMCC 15463体外降解胆固醇能力的测定
MRS-胆固醇培养基：MRS液体培养基（与实施例2相同）中添加0.1%的牛胆盐，并加入胆固醇使其终浓度为100 μg/mL。
采用邻苯二甲醛法将活化三代的乳酸菌按1%的接种量接种至MRS-胆固醇培养基，37℃，120 r/min 摇床培养24 h。4℃下10000 g离心 10 min，取1 mL上清液于具塞比色管，加入1 mL 33%的KOH和2 mL无水乙醇，涡旋振荡90 s，37℃水浴15 min，冷却至室温，加入2mL无菌水和3 mL正己烷，涡旋振荡60 s，静置10 min，取上层液体1 mL于新的试管65℃水浴蒸干，加入2 mL邻苯二甲醛-冰乙酸溶液（0.5 mg/mL），混匀，室温避光反应 10 min，加入1mL 浓H2SO4终止反应，静置 10 min，测其在 550nm 处OD值。
降解率＝（1-A1/A0）×100%
式中：A1为接种乳酸菌后的培养液经上述处理后的OD值；A0为未接种乳酸菌的培养液经上述处理后的 OD值。
结果：植物乳杆菌CGMCC 15463对胆固醇的降解能力为31.77%。
实施例4
植物乳杆菌CGMCC 15463体内降胆固醇及促进肠道短链脂肪酸产生作用试验
1. 实验动物及分组
8周龄SPF级SD（Sprague Dawley）雄性大鼠40只，体重185.26±4.44 g。所有大鼠基础饲料适应性喂养7 d，随机分为2组，正常组（ND）10只饲喂基础饲料，模型组30只饲喂高脂饲料（无菌基础饲料和高脂饲料均购于成都达硕生物科技有限公司）。两个月后断尾采血检测大鼠血清胆固醇（TC）及甘油三脂（TG）水平，排除因外部因素死亡及体重较轻的11只大鼠，模型组与正常组大鼠血清胆固醇含量呈显著差异（P < 0.05），表明高胆固醇模型建立成功。建模成功的大鼠按血清胆固醇含量随机分成3组：模型组Ι、药物（辛伐他汀）组Ⅱ、植物乳杆菌CGMCC 15463组Ⅲ，以及正常组Ⅳ，灌胃30天后，颈椎脱臼致死。建模成功SD大鼠分组及饲喂方式见表3。
表3 建模成功SD大鼠分组及灌胃方式
2.实验内容
1）灌胃1个月后所有大鼠禁食14 h，乙醚麻醉，摘眼球取血，室温放置2 h后转至4℃冰箱过夜，4℃ 3000 r/min离心10 min，收集血清，颈椎脱臼致死。采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定血脂指标。
2）称取肝脏组织1.0 g，加入9倍体积的匀浆介质（无水乙醇）手工匀浆数次，使组织完全匀浆化。3000 r/min离心10 min，收集上清液。测定TC和TG含量，BCA法测定蛋白浓度。
血清血脂检测结果如表4所示。从表4可知，与模型组相比，灌胃乳酸菌和辛伐他汀后，胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平有所下降，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平变化不大。其中植物乳杆菌CGMCC 15463和药物组胆固醇水平显著低于模型组（P < 0.05），且植物乳杆菌CGMCC 15463还可提高高密度脂蛋白胆固醇的含量，说明灌胃乳酸菌和辛伐他汀可降低高胆固醇血症模型大鼠的血清胆固醇，且植物乳杆菌CGMCC 15463的效果与药物组相近。
表4 大鼠血清中血脂检测结果（
± SD）
注：HFD（模型组），HFD+Sta（药物组），HFD+N-1（植物乳杆菌CGMCC 15463组），ND（正常组）
肝脏脂质检测结果如表5所示，与模型组相比，灌胃乳酸菌和辛伐他汀后，胆固醇和甘油三酯的含量均有所下降，其中药物组胆固醇含量降低最多，与模型组有显著性差异（P < 0.05），而植物乳杆菌CGMCC 15463的效果稍低于药物组（P > 0.05）。说明灌胃植物乳杆菌CGMCC 15463后，可降低高胆固醇血症血清及肝脏胆固醇水平。
表5 大鼠肝脏血脂检测结果（
± SD）
注：HFD（模型组），HFD+Sta（药物组），HFD+N-1（植物乳杆菌CGMCC 15463组），ND（正常组）
3）解剖大鼠时，肉眼观察各组大鼠肝脏外观并拍照；取肝脏左叶0.2×0.2×0.2cm3，无菌PBS清洗后置于4%多聚甲醛溶液中固定，经脱水，石蜡包埋、切片后HE染色，普通光学显微镜观察结果。
正常组大鼠肝脏表面光滑且呈暗红色，而模型组大鼠肝脏色泽变淡，肝脏体
积变大，说明高脂饲喂会使得大鼠肝组织脂肪变性，而乳酸菌和药物组肝脏色泽较模型组深，其形态较模型组有所好转，说明灌胃乳酸菌和辛伐他汀对高胆固醇血症大鼠肝脏的脂肪变性有一定的改善作用。
各组大鼠肝脏病理切片经HE染色，在普通光学显微镜下进行观察的结果如图3所示。饲喂正常饲料的大鼠肝组织色泽正常，细胞排列整齐，未见脂肪变性。与正常组相比，饲喂高脂饲料的大鼠肝组织出现不同程度的脂肪变性，尤其是模型组肝组织脂肪变性最严重，出现体积较大且很密集的脂肪空泡，同时可见肝细胞坏死，细胞核形状发生改变。灌胃乳酸菌和辛伐他汀后病理情况有所好转，表现为脂肪空泡体积和数量有所减少，坏死细胞数量减少，植物乳杆菌CGMCC 15463组效果与药物组相近。
4）盲肠内容物SCFAs的提取：称取解冻后的样品0.70 g于15 mL离心管中，加入5mL无菌超纯水涡旋振荡3 min，使样品分散。10000 r/min离心8 min，取上清用0.45 μm水相滤膜过滤；取2.0 mL滤液于新的15 mL离心管，加入200 μL 50%的浓硫酸，混匀，再加入2.0mL乙醚，涡旋振荡30 s，10000 r/min离心5 min，取上层液体备用。
色谱条件：采用EC(TM)-WAX毛细管色谱柱，FID检测器进行检测。120℃保持3 min，以20℃/min速率升温至200℃，保持9 min，不分流自动进样器进样，进样量1 μL。
标准曲线的绘制：取乙酸，丙酸，异丁酸，正丁酸，异戊酸和正戊酸溶液各50 μL于10 mL容量瓶中，乙醚定容，混合溶液浓度为5 mL/L。将以上溶液乙醚梯度稀释，使终浓度分别为10，30，50，100，200 μL/mL。得到各浓度对应的色谱峰面积，以峰面积为纵坐标，以乙酸、丙酸、正丁酸等的含量为横坐标绘制标准曲线。各标品的标准曲线如表6所示，其相关系数均大于0.999，符合实验要求。每组实验大鼠随机取三只，测定肠道内容物中这六种短链脂肪酸的含量，结果如表7所示。从表7可知，灌胃植物乳杆菌CGMCC 15463，盲肠内容物中的乙酸，丙酸，正丁酸，异丁酸，正戊酸和异戊酸的含量均显著高于模型对照组（P < 0.05），说明灌胃乳酸菌对高脂饮食大鼠肠道中这六种短链脂肪酸的产生有很强的促进作用。灌胃植物乳杆菌CGMCC 15463效果优于药物组，尤其在乙酸、正丁酸和正戊酸的产生上与其余几组具极显著差异（P < 0.01），其含量分别高于模型组47.77%、54.04%和4.33%。以上结果表明，灌胃植物乳杆菌CGMCC 15463对肠道短链脂肪酸的产生有很强的作用，有一定的益生效益。
表6 六种短链脂肪酸标准曲线
表7 各组大鼠肠道内容物中六种短链脂肪酸的含量（
± SD）
注：HFD（模型组），HFD+Sta（药物组），HFD+N-1（植物乳杆菌CGMCC 15463组）
以上实验结果进一步表明，本发明提供的植物乳杆菌CGMCC 15463能有效降低高胆固醇血症大鼠血清胆固醇含量，缓解肝脏组织病变，促进肠道短链脂肪酸的产生，且效果明显，将其应用于功能性食品领域，不仅具有广阔的前景，而且对人体健康十分有益。
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<120> 一株具有降胆固醇及促进肠道短链脂肪酸产生能力的植物乳杆菌及其应用
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atttacattt gagtgagtgg cgaactggtg agtaacacgt gggaaacctg cccagaagcg 120
ggggataaca cctggaaaca gatgctaata ccgcataaca acttggaccg catggtccga 180
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ggacgaaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc tcgtaaaact 420
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cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt gaaagccttc 600
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Claims (2)
1.植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）N-1，于2018年 3月 20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 15463。
2.如权利要求1所述的保藏编号为CGMCC NO.15463的植物乳杆菌N-1在制备具有降胆固醇及促进肠道短链脂肪酸产生能力的功能性食品中的应用。
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