CN110331104B - 一种植物乳杆菌cv10d1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CV10D1，于2018年03月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其保藏编号为CGMCCNo.15466，保存单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。还提供了植物乳杆菌CV10D1的应用，包括植物乳杆菌CV10D1活菌及其发酵液对曲霉菌和镰刀菌生长的抑制作用，以及植物乳杆菌CV10D1发酵液与壳聚糖混合作为象草青贮的添加剂，共同抑制象草青贮过程中腐败真菌的生长，也为采用微生物提高象草青贮质量提供更多的技术选择。

Description

一种植物乳杆菌CV10D1及其应用
技术领域
本发明是一种植物乳杆菌CV10D1及其应用，具体涉及植物乳杆菌CV10D1及其在越南北方象草青贮中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
象草是越南主要的牲畜饲料之一，其产量高、适应性强、易于种植，且适口性好、营养价值高，是越南畜牧业尤其是奶牛业的优良饲草。但象草供应存在明显的季节性差异，春、夏季生长旺盛，产量较高；秋、冬季则生长缓慢，产量较低。 因此，生产优质的象草青贮饲料可以平衡饲草畜牧全年生产中的供应波动，对越南奶牛业稳定增长十分重要。象草在青贮过程中容易受到腐败真菌（酵母和霉菌）的污染，从而造成青贮饲料的降解；此外，酵母和霉菌能够产生许多次级代谢产物，包括真菌毒素，这些毒素在真菌消失后仍留在青贮饲料中，对动物和人的健康造成威胁。目前对越南象草青贮的研究较少，如何在提高青贮饲料质量的同时抑制酵母、霉菌和病原体等有害菌的生长，成为了越南农业部门亟需解决的问题。
在越南北部，当地农民将盐和糖作为青贮象草的添加剂，从而有效地维持青贮饲料的营养水平并延长储存时间。然而，添加盐和糖的象草的真菌数量高于7.9 ×105 CFU.g-1，超过了动物饲料卫生标准中腐败真菌小于1×104 CFU.g-1的规定（GMP，2008）。因此，越南北方传统青贮方法不能满足青贮质量要求，有必要研发高效抑制象草腐败真菌的青贮制剂。
由于乳酸菌发酵可以与有害微生物竞争底物，产生具有抗菌活性的物质，如有机酸、蛋白质、肽、脂肪酸和其他物质，因此，在当前青贮饲料的生产和研究中，乳酸菌制剂的应用可提高青贮饲料的品质，降低饲料中的细菌、腐败真菌污染。例如“乳酸菌制剂对早籼稻青贮饲料品质的影响”，吴晓杰等，《中国农业大学报》，2005,10（3）：35-39，中记载的在早籼稻青贮饲料中接种乳酸菌添加剂后，粗蛋白（CP）含量增多，NDF和ADF含量降低，显著提高早籼稻青贮饲料的品质。以及“添加乳酸菌对大麦青贮品质及中、酸性洗涤纤维的瘤胃降解率的影响”，郭金双等，《中国畜牧杂质》，1999年第35卷第4期，中记载的在大麦青贮饲料中添加乳酸菌，可发现青贮饲料中的乳酸含量增多，pH值显著降低，氨氮含量显著减少，青贮品质有所改善。
除此之外，“添加双岐乳酸杆菌青贮象草的效果试验”，李苏新等，《广西职业技术学院学报》，2010年2月第3卷第1期，中还记载了在青贮矮象草中通过添加双岐乳酸杆菌添加剂混合物，可改善矮象草青贮的品质和青贮质量，包括青贮料粗蛋白的提高等，当然，在双岐乳酸杆菌添加剂的配制上，添加玉米粉还可使糖类物质的含量得以提高，从而为乳酸杆菌的大量繁殖创造条件，并使菌体均匀地分布于青贮料中，有利于双岐乳酸杆菌的生长繁殖和青贮料的全面发酵。
发明内容
为解决越南北部地区象草青贮中真菌数量超标的问题，减少青贮发酵过程中营养物质的损失，保持青贮的营养价值，提高饲草青贮的品质，本发明提供了一种植物乳杆菌CV10D1，植物乳杆菌CV10D1的分类命名为：植物乳杆菌，拉丁学名为：Lactobacillusplantarum CV10D1，于2018年03月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其保藏编号为CGMCCNo.15466，保存单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
另，本发明还提供了植物乳杆菌CV10D1的应用，包括植物乳杆菌CV10D1活菌及其发酵液对曲霉菌和镰刀菌生长的抑制作用，以及植物乳杆菌CV10D1发酵液与壳聚糖混合作为象草青贮的添加剂，共同抑制象草青贮过程中腐败真菌的生长，也为采用微生物提高象草青贮质量提供更多的技术选择。
本发明通过下述技术方案实现：一种植物乳杆菌CV10D1，植物乳杆菌CV10D1的分类命名为：植物乳杆菌，拉丁学名为：Lactobacillus plantarum CV10D1，已于2018年03月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.15466，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
植物乳杆菌CV10D1的生化特征满足：在 12-37 ℃范围生长较好；最适生长pH为5.0 - 6.5，耐酸、耐盐能力强；在pH值为3.5、NaCl 浓度为0.04 g/mL时正常生长。
植物乳杆菌CV10D1的活菌用于抑制曲霉菌和镰刀菌的生长。
一种植物乳杆菌CV10D1发酵液，将植物乳杆菌 CV10D1培养得到的植物乳杆菌CV10D1发酵液用于抑制曲霉菌和镰刀菌的生长。
一种混合制剂，将植物乳杆菌CV10D1培养得到的植物乳杆菌CV10D1发酵液与壳聚糖溶液组成混合制剂，用于越南北方象草的青贮。
所述植物乳杆菌CV10D1发酵液的制备方法包括：将植物乳杆菌 CV10D1以5%的接种量接种到MRS液体培养基中，在34 ℃下活化培养12 h，以5 %的接种量转接至MRS液体培养基中，在34 ℃下培养24 h，将发酵原液稀释或浓缩至浓度为108 CFU/mL，置于4 ℃ 冰箱备用。
所述壳聚糖溶液的制备方法包括：取1 g壳聚糖溶于100 mL 1 %柠檬酸中，制得1%浓度的壳聚糖溶液，所述壳聚糖满足脱乙酰度 ≥ 90%，分子量=5×104。
青贮时，将新鲜饲草象草切割至1-2cm的长度，使象草与混合制剂混合均匀，采用真空封装机密封制作实验室小袋青贮真空包装，并将所有袋装青贮置于室温24-28 ℃条件下发酵。
所述植物乳杆菌CV10D1发酵液的浓度为108 CFU/mL。
所述混合制剂中壳聚糖的分子量为50 kDa、浓度为0.01g/L。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
（1）从越南象草传统青贮中筛选生长快、产酸高、抑菌效果好的乳酸菌。选取本实验室保藏的20株乳酸菌及从越南象草中分离出的14株乳酸菌对比进行抑真菌效果研究，从象草青贮分离到的CV10D1菌株抑菌活性，经形态和16S rRNA方法鉴定该菌株为Lactobacillus plantarum。
（2）从植物乳杆菌 CV10D1抑菌物质鉴定及其抑菌机理初步研究，结果表明植物乳杆菌 CV10D1的代谢产物主要为乳酸和乙酸，其抑菌机理为有机酸协同作用。采用全基因组测序分析确定植物乳杆菌 CV10D1生长快、产酸能力强的特点是由于其基因组编码多种与糖运输、代谢有关的基因及其相应的调控蛋白。进一步深入分析关于参与发酵生成乳酸、乙酸的酶相关信息后分别得到7个调控乳酸脱氢酶和1个调控酰基磷酸酶的基因。通过扫描电镜观察到菌株植物乳杆菌 CV10D1对腐败真菌镰刀菌和曲霉菌菌丝生长具有抑制作用，植物乳杆菌 CV10D1能破坏镰刀菌和曲霉菌细胞结构的完整性，通过破坏真菌的细胞壁和细胞膜，使细胞破裂、细胞质渗漏，导致细胞死亡。
（3）象草青贮抗菌剂的研发。添加了植物乳杆菌 CV10D1或混合制剂的处理组的霉菌和酵母数量均显著减少，乳酸含量升高，铵态氮浓度降低(P < 0.05)。混合抗菌剂组的粗蛋白含量高于单独添加植物乳杆菌 CV10D1组和对照组，且混合制剂组的酵母和霉菌的数量在第90天仍然小于1 × 104 CFU.g-1 象草青贮饲料，符合国际牧草中的真菌浓度标准。因此，添加植物乳杆菌 CV10D1与壳聚糖的混合制剂能够显著提高象草青贮中蛋白质含量，改善象草青贮的营养价值，提高青贮饲料的品质。
附图说明
图1为本发明植物乳杆菌CV10D1的形态图（A）。
图2为本发明植物乳杆菌CV10D1的形态图（B）。
图3为植物乳杆菌 CV10D1的生长曲线。
图4为温度对植物乳杆菌 CV10D1生长的影响。
图5为pH对植物乳杆菌 CV10D1对生长的影响。
图6为NaCl含量对植物乳杆菌CV10D1对生长的影响。
图7植物乳杆菌CV10D1 的 16S rRNA 基因扩增电泳图。
图8 乳酸菌CV10D1的系统发育树。
图9 植物乳杆菌 CV10D1 发酵液含量对曲霉菌抑菌的影响。
图10 植物乳杆菌 CV10D1 发酵液含量对镰刀菌抑菌的影响。
图11 植物乳杆菌 CV10D1 对镰刀菌菌丝的影响（A对照组）。
图12植物乳杆菌 CV10D1 对镰刀菌菌丝的影响（B实验组）。
图13植物乳杆菌 CV10D1 对曲霉菌菌丝的影响（A对照组）。
图14植物乳杆菌 CV10D1 对曲霉菌菌丝的影响（B实验组）。
图15植物乳杆菌 CV10D1 对曲霉菌菌丝的影响（C对照组）。
图16植物乳杆菌 CV10D1 对曲霉菌菌丝的影响（D实验组）。
图17 壳聚糖的分子量对假丝酵母抑制作用的影响。
图18 壳聚糖的浓度对假丝酵母抑制作用的影响。
图19象草青贮中乳酸菌数量变化（A）。
图20象草青贮中乳酸菌数量变化（B）。
图21象草青贮中霉菌数量变化（A）。
图22象草青贮中霉菌数量变化（B）。
图23象草青贮中酵母菌数量变化（A）。
图24象草青贮中酵母菌数量变化（B）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
植物乳杆菌CV10D1的分离培养、理化特征。
本实施例涉及的植物乳杆菌CV10D1筛选于越南河内市农户的青贮象草样本。
（1）植物乳杆菌CV10D1的形态特征：
通过分离纯化从越南青贮象草中筛选得到1株植物乳杆菌，将其菌编号CV10D1。CV10D1在MRS培养基（按质量配比为：牛肉膏10 g、蛋白胨10 g、酵母粉5 g、葡萄糖20 g、吐温80 1 mL、K2HPO4 2 g、乙酸钠5 g、柠檬酸铵2 g、MgSO4﹒7H2O 0.58 g、MnSO4﹒4H2O 0.25 g、琼脂15 g，加超纯水至1L，pH6.4～6.6）平板上培养48h后，可形成直径0.5～1.5 mm的菌落,菌落呈圆形，菌落表面隆起，边缘整齐，湿润，颜色为乳白色或白色不透明。经染色镜检，该菌为革兰氏阳性，菌体呈短棒状排列，见图1和图2。
（2）植物乳杆菌CV10D1的生理生化特征：
通过生长曲线检测植物乳杆菌CV10D1在2 h 后即进入对数生长期，到14 h时OD值达到最高峰，随后进入生长稳定期，见图2。通过菌体发酵液OD值的检测，菌株CV10D1在 12-37 ℃ 范围生长较好，温度小于4 ℃或者大于45 ℃时生长受抑制，见图3；最适生长pH为5.0 - 6.5，耐酸能力强，在pH值为3.5时其菌仍然能够生长，见图4；对盐的耐受性比较强，当NaCl 浓度为0.04 g/mL对该菌的生长影响不明显，见图5。
（3）植物乳杆菌CV10D1的分子鉴定结果：
以植物乳杆菌CV10D1基因组DNA为模板，利用细菌16S rDNA序列引物（27F、1492R）进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序分析。分别将上下游测序结果的5‘端减去50bp，取其后750bp可信区域进行序列拼接，获得948bp的拼接结果，如SEQ ID No：1 所示，植物乳杆菌CV10D1的16SrDNA序列PCR产物电泳结果见图6。测序工作委托英潍捷基（上海）贸易有限公司完成。根据GeneBank序列同源性比较，植物乳杆菌CV10D1与 植物乳杆菌strain 32（GenBank登录号为MH681604.1）同源最接近，该菌株的16S rDNA序列系统进化树见图7。此外，用 VITEK MS基质辅助激光解析飞行时间质谱鉴定该菌株Lactobacillus plantarum，结合其形态特征、生理生化特性结果、同源性分析及质谱鉴定，初步将该菌鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
实施例2：
植物乳杆菌 CV10D1的活菌对镰刀菌和曲霉菌生长的抑制作用：
（1）植物乳杆菌CV10D1活菌对镰刀菌和曲霉菌生长的抑制作用：采用双层平板对峙培养法，用血球计数板计数CV10D1菌落数，用无菌水将培养液梯度稀释为101 、102、103、104、105 CFU/mL，取培养液100 µL与20 ml MRS培养基混匀，倒平板，于34 ℃静置培养48 h。倒入PDA琼脂培养基中（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g），将6 mm指示菌菌块接入，28℃恒温培养箱培养4天，采用十字交叉法测量菌体的直径。当平板中菌数为101CFU/mL时，植物乳杆菌CV10D1对两种真菌均有一定抑制效果，当平板中菌数为102CFU/mL时，对镰刀菌和曲霉菌的抑制率分别为87.31和50.52 %，当平板中菌数为104CFU/mL时，两种真菌完全受到抑制，见表1。
表1 植物乳杆菌CV10D1 菌数对镰刀菌和曲霉菌抑制率
Figure DEST_PATH_IMAGE001
注：不同字母表示同一组内的显著性差异（P < 0.05）。
（2）植物乳杆菌CV10D1上清发酵液对镰刀菌和曲霉菌菌丝的抑制作用：取菌株CV10D1发酵上清液加入PDA培养基，使PDA培养基中植物乳杆菌CV10D1发酵液终浓度分别为5、10、15、20、25、30、40 %，以纯PDA培养基为对照。取供试菌株，用直径6 mm的打孔器截取菌块，再将指示菌块接到PDA培养基中央，28 ℃恒温培养箱培养4天，采用十字交叉法测量菌体的直径，并计算面积，求出抑菌率。结果表明，当植物乳杆菌CV10D1发酵上清液含量为5 %时，对两种霉菌有明显抑菌效果，分别为55.32和34.13 % 。随着发酵上清液含量升高，抑菌效果越强。当发酵液含量为40 % 时，对曲霉菌的抑制作用达到84.45 %，见图8；而在发酵液含量为30 % 时镰刀菌完全受抑制，见图9。说明植物乳杆菌CV10D1的发酵上清液对两种真菌有明显抑菌效果。
（3）植物乳杆菌CV10D1对镰刀菌和曲霉菌生长形态的影响：
菌丝制备：用双层平板分别培养镰刀菌，曲霉菌，植物乳杆菌CV10D1和镰刀菌， 植物乳杆菌CV10D1和曲霉菌，同时将0.5×0.5 mm的盖玻片斜插入培养基中，观测其生长状态，待扫描电镜制备样品时使用。
样品处理：将镰刀菌和曲霉菌菌丝的盖玻片用 3.5 %（v/v）的戊二醛室温固定24h，用pH 6.8磷酸缓冲液冲洗5 次，每次间隔20 min，后用系列乙醇（浓度为30、50、70、80、90、95、100 %）进行梯度脱水，每次间隔15 min，其中100 %乙醇脱水3次，每次30 min，CO2临界点干燥、粘样、镀膜后扫描电镜下观察、拍照。 如图11和图12所示，镰刀菌丝表面饱满光滑，拉伸性好，菌丝均匀，线条光滑。而加CV10D1的镰刀菌菌丝出现塌陷，中空，部分菌丝透明，其内的细胞质有漏痕，菌丝上分支越来越少。如图13至图16所示，曲霉菌菌丝光滑，边缘饱满，孢子梗饱满，孢子呈圆球形，生长于孢子梗上。而加植物乳杆菌CV10D1的曲霉菌菌丝生长出现畸形，呈念珠形或者塌陷或出现膨大，孢子梗边缘不规整，孢子黏在一起，且干瘪，不光滑饱满。
（4）植物乳杆菌CV10D1发酵液中的抑菌活性分析：
探究不同发酵时间（6、12、24、36、48 h）、不同发酵温度（60、80、100、120 ℃）、不同蛋白酶（胃蛋白酶和蛋白酶 K）、过氧化氢酶、不同发酵初始pH（2.5、3、4、5、6、7）对抑菌活性的影响，且通过HPLC检测发酵上清液中乳酸和乙酸含量，（参照SN/T 2007-2007、GB/T5009.157-2003的方法。结果显示，植物乳杆菌 CV10D1发酵液抑制曲霉菌和镰刀菌活性受到 pH 值的影响（表2），主要抑菌成分是乙酸和乳酸（表3）。
表2 pH值对植物乳杆菌 CV10D1发酵液中的抑菌物质活性的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表3植物乳杆菌 CV10D1发酵上清液中主要有机酸含量
Figure DEST_PATH_IMAGE003
（5）植物乳杆菌CV10D1基因组测序、组装及基因组注释：
采用第二代高通量测序技术，对质检合格的DNA样品构建插入片段为400 bp的片段，进行PE 150（pair-end）测序，最终获得植物乳杆菌植物乳杆菌 CV10D1全基因组序列。通过Illumina Hiseq×10平台技术并使用SOAP de novo组装软件进行序列组装，得到植物乳杆菌 CV10D1基因组大小为3，141，904 bp，GC含量 44.61 %，共28个Scaffolds，33个Contigs，组装结果统计信息见表 4。得到植物乳杆菌CV10D1基因组中的基因信息分类以及通过GO、KEGG 和COG数据库比对注释结果中发现植物乳杆菌 CV10D1基因组中大量基因与碳水化合物运输与代谢有关。阐明产代谢该菌株抑菌物质的相关功能基因发现共有53个与多种糖类相关的PTS转运系统，关于参与发酵生成乳酸、乙酸的酶相关信息我们得到7个基因调控 乳酸脱氢酶及1个酰基磷酸酶。以上基因的潜在功能可能会为植物乳杆菌 CV10D在复杂的环境如象草青贮可利用多种糖类取得竞争性和产酸能力的优势。
表4 植物乳杆菌 CV10D1基因组信息
Figure DEST_PATH_IMAGE004
实施例3：
使用植物乳杆菌CV10D1与壳聚糖在越南北方象草青贮中的应用。
（1）样品制备
乳酸菌发酵原液的制备：将植物乳杆菌 CV10D1接种到MRS液体培养基中（接种量为5 %），在34 ℃下活化培养12 h，以5 %的接种量转接至新鲜的MRS液体培养基中，在34 ℃下培养24 h，将发酵原液稀释或浓缩至浓度为108 CFU/mL，置于4 ℃ 冰箱备用
壳聚糖溶液的制备：取1 g壳聚糖 （脱乙酰度 ≥ 90%，分子量=5×104）溶于100mL 1 %柠檬酸中，制得1 %浓度的壳聚糖溶液。
腐败霉菌的制备：分离到的指示菌，如青霉菌等，于PDA平板培养基28 ℃培养2-7天，直至孢子生成。用生理盐水冲洗平板，收集于无菌三角瓶中，用磁力揽拌器揽拌均匀，采用血球计数板计数，将孢子浓度调制为108CFU/ mL，备用。
青贮的制备：将新鲜饲草象草切割长度为1-2 cm，分成六等份，样品类型如表5所示。象草与添加剂混合均匀后，采用真空封装机密封制作实验室小袋青贮真空包装，所有袋装青贮置于室温24-28 ℃条件下发酵。
表5 象草青贮的类型
Figure DEST_PATH_IMAGE005
（2）壳聚糖抑制假丝酵母活性的研究
分子量对壳聚糖抑菌活性的影响：将分子量为100、70、50、30 kDa的壳聚糖分别加入PDA培养基，将热带假丝酵母接种至液体培养基中。培养12h后采用分光光度器检测结果。结果表明4个分子量的壳聚糖对假丝酵母均有抑制作用（P < 0.05），分子量为50 kDa时抑制假丝酵母作用最强（P < 0.05），见图12。
浓度对壳聚糖抑菌作用的影响：选取终浓度分别为0.005、0.01、0.02 g/L的壳聚糖检测假丝酵母的生长量。在培养12 h后在620 nm测定假丝酵母的生长量。从图中可以看出所有测试浓度的壳聚糖处理组均能有效抑制假丝酵母的生长（P < 0.05）。浓度为0.01g/L时壳聚糖很好的抑菌效果，在浓度为0.02 g/L时，与浓度0.01 g/L 没有显著差异（P >0.05），见图13。
（3）感官评价方法
感官评价在青贮饲料中是最常见检测品质快速的方法。利用德国DLG评分标准。不同处理组对象草青贮发酵品质的感官评定结果见表6。从表3可知，评分等级较高的组是处理组1、2、3、4组，评为2级尚好。该组有微弱的丁酸臭味，较强的酸味，莲叶结构保存一般，色泽上略有变色。空白组和对照组组得分较低，评为3级中等，其中对照组组得分最差，打开真空袋，有很强的霉味和丁酸味，色泽呈墨绿色，莲叶发黑腐烂。
表6 不同添加剂对象草青贮发酵品质的感官评定得分
Figure RE-945428DEST_PATH_IMAGE006
（4）微生物数量的测定
乳酸菌数量的测定参照GB 4789.35-2010的方法。在青贮前期（第3-7天），添加乳酸菌和壳聚糖的处理组中，乳酸菌数量显著高于空白组和对照组（P < 0.05），添加乳酸菌剂可以扩大青贮原料中乳酸菌数量，促进乳酸菌的快速繁殖，产生大量乳酸使 pH降低，从而抑制有害物质丁酸和氨态氮的产生，达到长期保存的目的。除第 14 天外，其他天数处理组和空白组对照组差异显著（P < 0.05），说明添加乳酸菌与否对象草青贮的影响显著，见图19和图20。
酵母菌、霉菌数量的测定参照GB 478915-2010的方法。在青贮前中末期（第3、7、14、28、60、90天），添加乳酸菌及壳聚糖混合制剂的处理组中，霉菌数量均显著低于对照组（P < 0.05）均能够完全抑制青贮28天内霉菌的生长（图21和图22），酵母菌数量均显著低于对照组（P < 0.05），且混合制剂组酵母菌数量最低，说明添加混合制剂可以抑制象草青贮前期、中期酵母菌生长（图23和图24）。
（5）理化性质的测定
用pH计测定滤液的pH值，测定参照GB/T 27500-2011；水分的测定参照GB/T 6435-2006；采用凯氏定氮法测定粗蛋白、氨态氮含量，参照GB 5009.5-2010；酸性洗涤纤维含量的测定利用ANKOM系统，参照GB/T 5009.10-2003；用热稳定淀粉酶处理混合均匀的裹包青贮样品，利用纤维分析仪测定中性洗涤纤维含量，参照GB/T 5009.88-2008；采用HPLC测定乳酸含量，参照GB/T 5009.157-2003。添加植物乳杆菌 CV10D1与壳聚糖象草青贮 60 天后，所有实验组的水分无显著差异（P < 0.05）。在含有与未含有腐败霉菌的象草青贮中添加植物乳杆菌 CV10D1与壳聚糖混合制剂，粗蛋白含量均高于单独添加植物乳杆菌 CV10D1组和对照组（P < 0.05），表明添加混合制剂能稳定饲草中蛋白质含量；添加乳酸菌与壳聚糖组的铵态氮含量均显著（P < 0.05） 低于对照与空白组。粗蛋白和铵态氮指标说明添加植物乳杆菌 CV10D1与壳聚糖能够改善青贮象草的营养价值，提高饲草象草的青贮品质。各组中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量未受到处理的显著影响（P > 0.05）。有机酸的组分类型和含量可以直接反映出青贮发酵过程的好坏，其中最重要的是乳酸和乙酸，乳酸所占比例越高，青贮效果越好。本实验空白组和对照组乳酸含量仅分别为3.15、3.12 g/kg DM，而添加L. plantarum CV10D1组乳酸含量分别为8.9和8.74 g/kg DM。这也与接种 L.plantarum CV10D1后象草青贮的pH值 （P < 0.05） 显著降低相吻合。乙酸含量在添加L.plantarum CV10D1与壳聚糖的两个处理组中均显著低于空白组和对照组（P < 0.05），见表7。因此，复合添加植物乳杆菌 CV10D1与壳聚糖能够稳定象草中蛋白质含量，保持象草青贮的营养价值，提高象草青贮的品质。
表7 不同添加剂对象草青贮中第60天理化性质的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE008
CP = crude protein; DM = dry matter; ADF = acid detergent fiber; NDF= neutral detergent fiber; LA = lactic acid; AA = acetic acid
SEQ ID No：1
ATGCTATACTGCAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAACATGGGGTTTAATTCCAAGCTAC。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CV10D1，其特征在于：植物乳杆菌CV10D1的分类命名为：植物乳杆菌，拉丁学名为：Lactobacillus plantarum，已于2018年03月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.15466，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CV10D1在抑制曲霉菌和镰刀菌中的应用，其特征在于：植物乳杆菌CV10D1的活菌及其上清发酵液用于抑制曲霉菌（Aspergillus sp.）和镰刀菌（Fusarium sp.）的生长。
3.根据权利要求1所述一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CV10D1在抑制曲霉菌和镰刀菌中的应用，其特征在于：将植物乳杆菌 CV10D1培养得到的植物乳杆菌CV10D1发酵液用于抑制曲霉菌（Aspergillus sp.）和镰刀菌（Fusarium sp.）的生长。
4.根据权利要求1所述一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CV10D1在越南北方象草的青贮中的应用，其特征在于：将植物乳杆菌CV10D1培养得到的植物乳杆菌CV10D1发酵液与壳聚糖溶液组成混合制剂，用于越南北方象草的青贮。
5.根据权利要求4所述一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CV10D1在越南北方象草的青贮中的应用，其特征在于：所述植物乳杆菌CV10D1发酵液的制备方法包括：将植物乳杆菌CV10D1以5%的接种量接种到MRS液体培养基中，在34 ℃下活化培养12 h，以5 %的接种量转接至MRS液体培养基中，在34 ℃下培养24 h，将发酵原液稀释或浓缩至浓度为108CFU/mL，置于4 ℃冰箱备用。
6.根据权利要求4所述一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CV10D1在越南北方象草的青贮中的应用，其特征在于：青贮时，将新鲜饲草象草切割至1-2cm的长度，使象草与混合制剂混合均匀，采用真空封装机密封制作实验室小袋青贮真空包装，并将所有袋装青贮置于室温24-28 ℃条件下发酵。
7.根据权利要求4中所述的一种混合制剂，其特征在于：所述壳聚糖溶液的制备方法包括：取1 g壳聚糖溶于100 mL 1 %柠檬酸中，制得1 %浓度的壳聚糖溶液，所述壳聚糖满足脱乙酰度≥ 90%，分子量=5×104。
8.根据权利要求4中所述的一种混合制剂，其特征在于：所述植物乳杆菌CV10D1发酵液的浓度为108 CFU/mL。
9.根据权利要求4中所述的一种混合制剂，其特征在于：所述混合制剂中壳聚糖的分子量为50 kDa、浓度为0.01g/L。
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