CN108486022B - 一株抗龋病植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株抗龋病植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）K41及其应用。本发明提供的植物乳杆菌K41，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.15462，保藏日期2018年3月20日。该菌株分离至四川省南充市顺庆区延安路的农家自制泡菜，在MRS琼脂培养基上生长良好，可以抑制变异链球菌UA159菌体生长、胞外多糖形成、羟基磷灰石降解、生物膜形成，具有很好的自聚及共聚能力，对抗生素、盐、酸具有较好的耐受性，易于在口腔中定植。动物试验表明K41可以抑制大鼠牙釉质脱矿及龋病程度，应用于功能性食品，对人体健康具有非常重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株对龋病具有控制作用的植物乳酸菌及其在制备功能性食品中的应用。
背景技术
龋病，又称“虫牙”或“蛀牙”，是人类口腔常见的细菌感染性疾病，世界卫生组织已将其与肿瘤和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。世界权威医学杂志《柳叶刀》所公布的2016年全球疾病负担研究（Global Burden of Disease Study 2016, GBD）数据显示，全球恒牙龋病患病率居所有疾病首位，发病率居第二位，仅次于上呼吸道感染，乳牙龋病发病率位居第五位。2017年国家卫生计生委发布的第4次全国口腔健康流行病学普查结果显示，我国5岁儿童龋患率达70.9%，12岁儿童龋患率为34.5%；与十年前相比，5岁和12岁儿童龋患率分别上升了5.8和7.8个百分点，12岁儿童龋均为0.86颗。国务院办公厅所发布的《中国防治慢性病中长期规划（2017-2025年）》中明确指出，应加大龋病干预力度，将12岁儿童患龋率控制在30%以内。有研究表明，引起龋病主要的病原菌是链球菌，包括唾液链球菌、血液链球菌、轻型链球菌，变异链球菌等，其中变异链球菌（Streptococcus mutans）是最主要的致病菌。一方面因为变异链球菌具有很强产酸和耐酸特性，可以在口腔环境中大量生长繁殖，引起口腔pH降低；另一方面变异链球菌可以利用口腔中碳水化合物产生不溶性胞外多糖，造成大量产酸耐酸细菌的积累，形成菌斑生物膜，加快羟基磷灰石的降解及龋病的形成，很多研究表明菌斑生物膜是导致龋病的根本原因。
早期预防是控制龋病的重要环节，目前主要通过使用洗必泰、氟化物进行预防，但基于化学试剂的耐药性及儿童不爱刷牙的特点，不宜使用抗牙菌斑药物，故目前急需要提供一种可以降低龋病发生率的安全、有效、可行的方法。基于少部分乳酸菌对变异链球菌的抑制作用，所以分离筛选对变异链球菌有抑制的乳酸菌，对于预防口腔龋病具有良好的应用前景。
乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）作为一种益生菌，被美国食品药品监督管理局（FDA）和世界卫生组织（WHO）认定是对人体有利的微生物，被广泛用于食品、医药、饲料、轻工业等。但乳酸菌在口腔中的运用仍具有争议性，其中，Hasslöf.P等人通过对179名志愿者采用随机双盲试验表明早期摄入Lactobacillus paracasei F19对龋病发生、变异链球菌和乳酸菌的数量没有长期的影响； Fitzgerald等人发现嗜酸乳杆菌具有产酸耐酸能力，可以与变异链球菌产生协同作用加剧龋病的发生；然而，Hedayati-Hajikand 等人通过随机双盲试验对138名2-3的儿童进行临床试验发现，早期食用含有益生菌的咀嚼片可以减少龋病的发生；Campus等人也发现摄入3周含有Lactobacillus brevis CD2的糖果对龋病、变异链球菌数量、牙龈出血具有一定的抑制作用。
植物乳杆菌作为一种益生菌，被广泛应用于肉类加工和食品发酵过程中。目前植物乳杆菌的报道主要集中在对肠道，心血管疾病的研究，关于对口腔益生性的研究较少，包括：1）Yang Y, Chen W, Zhang H, et al. Probiotic characteristics ofLactobacilus plantarum HO-69 applied in oral cavity.[J]. West China Journalof Stomatology, 2008, 26(5):482-485. 该研究表明植物乳杆菌HO-69具有广谱抑制活性，且不易于龋病的形成，是口腔应用中的潜在益生菌。2）Chun C C, Chen K C, Der D P,et al. Antibacterial properties of Lactobacillus plantarum isolated fromfermented mustards against Streptococcus mutans[J]. African Journal ofMicrobiology Research, 2013, 7(40):4787-4793.该研究从传统发酵芥菜中分离出一株对变异链球菌具有抑制作用的植物乳酸杆菌B0105，当pH=4时，对变异链球菌的抑菌圈大小为16.0±0.1mm，并表明抑制物质主要是细菌素化合物。3）Guo X, Zhang J, Yang Z.Screening of Lactic Acid Bacteria for Inhibiting Oral Streptococcus mutansand Preliminary Study of Antibacterial Mechanism[J]. Food Science, 2016.试验表明植物乳杆菌K25对变异链球菌具有很强的抑菌效果，抑菌圈直径大于13.0mm，变异链球菌1.2499的最小抑菌浓度为1.25×107 CFU/mL。4）Ahn K B, Baik J E, Park O J, etal. Lactobacillus plantarum lipoteichoic acid inhibits biofilm formation ofStreptococcus mutans[J]. Plos One, 2018, 13(2):e0192694. 这项研究表明变异链球菌生物膜的抑制率与植物乳杆菌的浓度有关，且抑制率在40%～85%。基于以上报道，部分植物乳杆菌对龋病具有潜在的控制作用，但目前仅停留在体外试验，而且乳酸菌体外对龋病的控制作用并不能直接说明其在体内也有相同的效果，因而将这些菌株应用于实际生产也还有一定的距离。故通过体内外试验筛选一株对龋病具有较好控制作用的植物乳杆菌，将其应用于功能性食品领域，可以抵抗龋病的发生，具有广阔应用价值和前景。
发明内容
本发明旨在提供一株抗龋病植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）K41及其应用。
本发明通过以下技术方案实现：所述植物乳杆菌K41于2018年 3月 20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15462，保藏地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
所述植物乳杆菌K41是从四川省南充市顺庆区延安路的农家自制泡菜中分离得到。
所述植物乳杆菌K41，在MRS琼脂培养基上生长良好，菌落为乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明，触媒阴性，对菌体形态进行镜检，革兰氏染色呈阴性，杆状。
所述植物乳杆菌K41，对变异链球菌UA159的抑菌圈直径为（14.7±1.5）mm，略高于阳性对照醋酸氯己定，但无显著性差异。
所述植物乳杆菌K41，通过自聚及共聚能力试验表明，该菌株具有很强的自聚集能力，同时与变异链球菌UA159的共聚能力在4h也高达41.87 %。
所述植物乳杆菌K41，对不溶性胞外多糖、羟基磷灰石（HAP）具有很好的抑制效果，抑制率分别为90.70%、58.96%。
所述植物乳杆菌K41，与变异链球菌UA159共培养时，生物膜中UA159数量减少了93.13%，且生物膜结构变得疏松，多糖含量明显降低。
所述植物乳杆菌K41，对酸、盐、抗生素具有一定的耐受性。
所述植物乳杆菌K41，通过动物模型试验表明可以减少大鼠牙釉质的脱矿程度，控制龋病的形成。
所述植物乳杆菌K41，通过采用细菌通用引物27F和1492R对其16S rDNA进行扩增，得到有1464碱基对（bp）组成的目的基因序列，如SEQUENCE LISTING 所示。将测序得到的基因序列输入NCBI数据库进行比对，其与Genebank中的标准菌株Lactobacillus plantarumsubsp. plantarum Ni729相似率达99%，可初步鉴定该菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：
1、本发明提供的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum K41，分离筛选自四川省南充市顺庆区延安路农家自制泡菜，在MRS琼脂培养基上生长良好，对变异链球菌UA159菌体的生长，胞外多糖的形成、羟基磷灰石的降解、生物膜的形成具有很好的抑制作用。
2、本发明提供的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum K41，具有很好的自聚及共聚能力，对抗生素、盐、酸具有较好的耐受性，在恶劣的口腔环境中具有较好的存活能力，易于在口腔中定植。
3、本发明提供的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum K41，动物试验表明该菌株对大鼠牙釉质的脱矿及龋坏程度都具有很好的抑制控制作用。同时与工业菌株共同使用时也具有良好抑制效果，将其应用于功能性食品领域，有利于控制龋病发生，具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1为植物乳杆菌K41在MRS琼脂培养基上的菌落形态图；
图2为植物乳杆菌K41抑制变异链球菌UA159生物膜形成的扫描电镜图（A、D、G为1000×，B、E、H为5000×，C、F、I为20000×），
其中A、B、C为UA159单独形成的生物膜，D、E、F为K41单独形成的生物膜，G、H、I为UA159和K41混合培养时形成的生物膜结构；
图3为植物乳杆菌K41抑制变异链球菌UA159生物膜形成的激光共聚焦显微镜图，其中A为UA159单独形成的生物膜，B为K41单独形成的生物膜，C为UA159和K41混合培养时形成的生物膜结构；
图4 为大鼠牙齿的Micro-CT扫描结果示意图，其中B为模型组，C为阳性对照组，D为K41处理组，E为K41＋工业菌株ABY-8（科汉森直投式酸奶发酵菌种）处理组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。但本发明的保护范围不限于下述的实施例，凡在本发明原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
以下为本发明实施例中所涉及的培养基：
一、MRS 液体培养基：葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉6.0g，吐温80 1.0mL，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，纯水1L，pH自然（加1.5%-2.0%琼脂为固体培养基）。
二、BHI固体培养基：胰蛋白胨10.0g，牛心浸出液17.5g，氯化钠5g，磷酸氢二钠2.5g，葡萄糖2g，纯水1L，调节pH至7.4±0.2（加1.5%-2.0%琼脂为固体培养基）。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。培养基中所涉及的百分比，均为质量体积比。
实施例1 植物乳杆菌K41的分离、筛选及分子生物学鉴定
1.材料准备
样品采集于四川省南充市顺庆区延安路农家自制泡菜；
通用引物对由Invitrogen公司（上海）合成，27F/1492R序列如下：
27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT
PBS 缓冲液：磷酸二氢钾 0.20g，磷酸氢二钠1.15g，氯化钠 8.0g，氯化钾 0.2g，加入 800mL 纯水搅拌溶解，浓盐酸调至相应pH值，定容至1L。
2. 分离筛选对变异链球菌有抑制作用的植物乳酸菌及其分子生物学鉴定
将采集的样品剪碎后称取1g，放入9mL无菌水中。充分震荡后，10倍稀释涂布于MRS固体培养基中，37℃培养48h。肉眼观察，挑取培养基中不同形态大小的单菌落，纯化3次。通过革兰氏染色初步确定为乳酸菌，并将纯化的菌株50%甘油保存于-40℃冰箱备用。
菌株分子生物学鉴定：采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA，细菌通用引物27F/1492R扩增16S rRNA，将测得的16S rRNA序列进行NCBI BLAST比对。
对UA159生长的抑制：调节活化3次的UA159及K41调节OD600至1，100倍稀释UA159（链球菌制剂）后，取1mL接入200mL 冷却至45℃左右的BHI固体培养基中，充分混匀后倒入无菌平板中，凝固后固定牛津杯，取200µL K41悬液于牛津杯中，以不含菌液的MRS培养基为空白对照，醋酸氯己定为阳性对照，每组3个重复。37℃培养24h后，取出牛津杯，采用十字交叉法测量抑菌圈直径，最终以抑菌圈的有无及大小评价抑菌活性。
试验结果，将K41的16S rRNA序列进行NCBI BLAST比对，与Genebank中的Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Ni729相似率达99%，可初步鉴定该菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
将所述植物乳杆菌K41划线于MRS琼脂培养基上，37℃倒置培养48h后，对菌株的菌落形态进行观察，结果如图1所示。所述菌株在MRS琼脂培养基上生长良好，菌落为乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明，触媒阴性。
L.plantarumK41对变异链球菌的抑菌圈直径为（14.7±1.5）mm，略高于阳性对照（14.2±1.9）mm，表明对变异链球菌具有较好的抑制效果。
实施例2 植物乳杆菌K41的聚集能力试验
1）自聚集试验：将K41和UA159于37℃过夜培养后，8000r/min离心10min，弃上清收集菌体。用PBS缓冲液（同实施例1）将菌体洗涤2次后重悬，调整菌悬液的吸光值OD600为0.6±0.02（A0）。取2mL菌悬液于室温下培养静置，每间隔1h 测定上清液的OD600（At），共测定4h，每组3个重复。
自聚集能力=（A0-At）/ A0×100%
2）共聚集试验：变异链球菌和乳酸菌悬液的制备方法同自聚能力试验，取1mL乳酸菌悬液（Ax）与1mL变异链球菌（Ay）充分混合后，室温下培养静置，每间隔1h 测定上清液的OD600（A（x+y）），共测定4h，每组3个重复。
共聚集能力= [（Ax+Ay）– 2×A（x+y）] / (Ax+Ay）×100
试验结果如表1所示，由表1可见，植物乳杆菌K41具有很强的自聚集及共聚集能力，且随着时间的增加，聚集能力不断加强，在4h时，自聚集能力为31.01%，而共聚集能力高达41.87%。
表1 植物乳杆菌K41在不同时间的聚集能力
实施例3 植物乳杆菌K41抑制胞外多糖试验
调节活化三代的UA159及K41菌悬液至OD600=1±0.02，以2%的接种量接种UA159于含2%（w/v）蔗糖的BHI 液体培养基，加入等体积K41菌悬液充分混合，以不含菌液的MRS培养基为空白对照，37℃培养24h，每组3个重复。使用蒽酮-硫酸法测定胞外多糖的含量，用葡萄糖做标准曲线，进而从标准曲线中计算胞外多糖含量。
试验结果表明：植物乳杆菌K41可以显著抑制变异链球菌胞外多糖的形成，其中对可溶性胞外多糖的抑制率为44.06%，对不可溶性胞外多糖的抑制率为90.70%。
实施例4 植物乳杆菌K41抑制羟基磷灰石降解试验
将1mL BHI液体培养基及MRS液体培养基加入含有50mg羟基磷灰石的24孔板中，接种25µL UA159和K41菌悬液，充分混匀后培养24h，以不含菌液的MRS培养基为对照，采用邻甲苯酚比色法测定菌液中钙离子的含量，每组3个重复。其中抑制率=试验组/对照组×100%。
试验结果表明，对照组Ca＋的释放量为16.99µg/mL，K41菌悬液处理后Ca＋的释放量为6.22µg/mL，抑制率为63.39%。
实施例5 植物乳杆菌K41对生物膜形成的抑制作用试验
1、微生物数量的变化
将K41和UA159过夜培养，10倍倍比稀释后培养2-3h至OD600为0.5 ± 0.02。将1mL含2%（w/v）蔗糖及0.5%（w/v）MES缓冲液的BHI培养基与等体积MRS培养基加入24孔板中，接种20µL乳酸菌和变异链球菌，充分混合，37℃培养24h，吸掉上清液，PBS洗涤3次后，重悬于1mL PBS缓冲液，使用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测微生物数量的变化。将过夜培养的标准菌株UA159、K41菌悬液及1mL生物膜重悬液离心沉淀后，去上清，用PBS缓冲液洗涤3次，加入20µg/mL溶菌酶37℃处理2h，根据QIAamp DNA Mini Kit试剂盒操作步骤提取基因组DNA。使用BioDrop μLite紫外可见分光光度计测定DNA浓度和纯度，当A260/A280为1.8-2.0，表明纯度合格。将UA159及K41进行10倍比稀释。稀释后的标准菌株和生物膜重悬液DNA进行qPCR试验，其中植物乳杆菌K41及UA159的特异性引物见表2，将稀释后的标准菌株制成浓度与循环阈值（Ct值）之间的标准曲线，从而计算生物膜中UA159、K41的微生物数量。
表2 植物乳杆菌K41及变异链球菌UA159引物明细
试验结果表明，植物乳杆菌单独培养时细菌总数为（1.24×109±3.54×108）CFU，与变异链球菌共培养时细菌总数为（1.06×109±3.24×108）CFU相比，两者之间无显著性差异（P＜0.05），表明变异链球菌不影响植物乳杆菌生物膜的形成。同时变异链球菌单独培养时细菌数为（2.25×109±8.09×108）CFU，植物乳杆菌处理后变异链球菌数量为（1.55×108±1.84×107）CFU，表明在生物膜试验中，植物乳杆菌对变异链球菌的抑制率为93.11 %。
2、扫描电子显微镜（SEM）
将K41和UA159 过夜培养，10倍稀释后培养2-3h至OD600为0.5 ± 0.02。将圆形玻片放入24孔板中，加入1mL含2%（w/v）蔗糖及0.5%（w/v）MES缓冲液的BHI培养基与等体积MRS培养基，接种20µL乳酸菌和变异链球菌，充分混合，37℃培养24h。用镊子和针夹出玻片，PBS清洗去除表面游离的菌体后放入新的24孔板，加入1mL 2.5%戊二醛过夜固定生物膜。吸去戊二醛并用PBS清洗两次，用不同梯度的乙醇（30%，40%，50%，60%，70%，80%，85%，90%，95%，100%）脱水15min。最后一次脱水后4℃可保存数天，镜检。
试验结果如图2所示，UA159单独培养时被大量的胞外多糖包裹，形成致密的网状结构，当混合培养后发现结构变得比较疏松，胞外多糖含量明显减少，同时生物膜中细菌多为杆状结构，表明K41抑制了UA159生物膜的形成。
3、激光共聚焦显微镜（CLSM）
将K41和UA159 过夜培养，10倍稀释后培养2-3h至OD600为0.5 ± 0.02。将圆形玻片放入24孔板中，加入1mL 含2%（w/v）蔗糖及0.5%（w/v）MES缓冲液的BHI培养基及1mL MRS培养基，接种20µL乳酸菌和变异链球菌后，避光加入1µL Alexa Fluor 647充分混合，37℃避光培养24h。将圆形玻片从24孔板中取出后，使用PBS轻轻漂洗，滤纸吸干多余的水分后加入50µL SYTO 9染料，避光条件放放置15min，使用PBS轻轻漂洗，滤纸吸干多余的染料后置于载玻片上，使用激光共聚焦显微镜观察。
试验结果如图3所示，UA159单独培养时形成的生物膜最厚，其次是UA159与K41混合培养，K41单独培养时生物膜最薄，同时与UA159单独培养时相比，UA159与K41混合培养后胞外多糖含量明显降低，表明K41抑制了变异链球菌生物膜及胞外多糖的形成。
实施例6 植物乳杆菌K41对口腔环境的耐受性试验
1、对抗生素的耐受性
试验采用滤纸片法研究K41对浓度为1g/mL，3g/mL，9g/mL，27g/mL，81g/mL的万古霉素、庆大霉素、萘啶酮酸、氯霉素、四环素、青霉素、红霉素的耐受性。将活化后的K41调节至OD600=1.0±0.1，稀释100倍后，取1mL接入200mL冷却至45℃左右的 BHI固体培养基中，充分混匀后倒入平板中，凝固后放入滤纸片，取100μL抗生素轻滴于滤纸片中，37℃培养24h，根据抑菌圈的直径大小评价乳酸菌对不同浓度抗生素的耐受性。
试验结果表明，K41对浓度不高于27g/mL的抗生素具有很强的耐受性，无抑菌圈生成，当浓度为81g/mL时，对青霉素和红霉素敏感，而对其余6中抗生素仍无抑菌圈生成。
2、对酸、盐的耐受性
将活化的K41以3%的接种量接种至pH为3、4、5、6的MRS液体培养基为试验组，以pH为7的MRS液体培养基为对照组。37℃静置培养24h，10倍倍比稀释测定乳酸菌活菌数，菌株存活率=试验组/对照组×100%。
将活化的K41以3%的接种量接种至NaCl质量分数为0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、8.0%的MRS液体培养基为试验组，以不加NaCl的MRS为对照组。37℃静置培养24h，10倍倍比稀释测定乳酸菌活菌数，菌株存活率=试验组/对照组×100%。
试验结果表明，当pH=6时，存活率为98.02%，与对照无显著性差异，当pH≥5，存活率也高达73.09%，但当pH≤4时，存活率小于24.22%。同时当盐含量不高于4.0%时，K41的存活率93.81%，当浓度为8.0%时，存活率为4.12%。因口腔环境的pH一般不低于5，盐含量一般不高于4.0%，故K41对恶劣的口腔环境具有一定的耐受性。
实施例7 动物模型试验
1. 试验动物及分组
试验使用了40只不含雌性的Sprague Dawley大鼠，重量60±5g，17龄。前三天，给大鼠的饮用水中添加0.1％羧苄青霉素，0.1％氯霉素和4,000U/ml青霉素。第4天时随机取8只作为空白组，其余32只连续3天用S. mutans UA159（108CFU/ml）处理，构建龋病模型。在24日龄时检查龋病模型是否构建成功，并将龋病模型构建成功的32只大鼠随机分成4组。分组及处理方法详见表3，自第24天起每组在20s内，每天使用沾有处理液的口腔拭子涂抹大鼠牙齿。每周记录其体重变化情况，处理5周后，通过脊椎脱臼处死。
表3 动物模型的试验分组
注：ABY-8为科汉森直投式发酵酸奶菌种，K41与ABY-8以1:1的质量比例进行处理。
2. 试验内容
1）微生物计数
将上颌骨中的左颌夹在5.0mL154mM的无菌PBS缓冲液中并超声处理以除去在牙齿表面上形成的生物膜。用PBS稀释生物膜悬浮液，并将稀释物涂布在唾液琼脂（Difco）检测变异链球菌的数量，Rogosa检测植物乳杆菌的数量，使用BHI培养基检测细菌总数。试验结果如表4所示，4组中变异链球菌数量虽无显著性差异，但建模组中变异链球菌在口腔微生物中所占比例明显高于其他3组，利于龋病的发生；K41处理组和K41＋ABY-8处理组的乳酸菌数量显著高于建模组，说明K41可以在口腔内定植，利于发挥其口腔益生性；D组和E组K41处理组和K41＋ABY-8处理组的菌落总数显著高于建模组，说明植物乳杆菌K41处理后对口腔中的微生物结构具有一定的影响。
表4 大鼠口腔中的微生物变化情况
2）微CT分析
使用锥束微CT系统对每组5颗右上颚进行扫描。扫描参数设置为70kV和200μA。扫描后，重建上颌骨的三维图像，计算第一磨牙的牙釉质体积和矿物质密度。
扫描结果如图4所示，建模组第一颗牙有明显的龋洞发生，且建模组牙釉质密度较小，表明处理组对牙釉质脱矿及龋洞的形成有抑制作用。通过重建大鼠第一颗牙进而分析牙密度，试验结果如表5，从表中可以看出处理组的牙密度高于建模组，但无显著性差异，分析原因可能是动物模型个体差异大，每组选取五只样品太少，导致结果无显著性差异。
表5 大鼠牙釉质密度及体积变化
3）激光荧光强度评估
因为Micro-CT中牙密度的试验结果无显著性差异，每组取8只大鼠的左上牙和左下牙进行DIAGNOdent计分，检测其脱矿程度。使用装有裂隙探针（标号为1.002.6967，KaVo，Biberach，Germany）的DIAGNOdent pen（2190型）对左侧颚的一个牙齿的8个光滑表面和3个窝沟面进行检测，在所述情况下，仪器显示的峰值为表面的最终数据。当使用DIAGNOdentpen诊断光滑面脱矿程度时，0≤峰值≤7，表明牙釉质正常，无脱矿产生； 7＜峰值≤15，表明大鼠牙齿发生轻度脱矿；峰值＞15，表明牙齿严重脱矿。而诊断窝沟面脱矿程度时，0≤峰值≤12，表明牙釉质正常；12＜峰值≤25，轻度脱矿；峰值＞25，严重脱矿。
光滑面的脱矿程度如表6所示，从表中可以看出，建模中正常牙齿面的数量为65个光滑面，显著低于其他3组，同时轻度脱矿和重度脱矿面为54个和9个，又显著高于其余3组，说明阳性对照和植物乳杆菌K41处理后显著降低了龋坏程度，其中K41＋ABY-8处理组正常的光滑面最多，为105个，表明添加工业菌株（ABY-8）后对龋病仍具有很好的抑制作用。同理，窝沟面的脱矿程度如表7所示，虽然轻度脱矿无显著性差异，但是建模组重度脱矿的窝沟面显著高于其余3组，同时，而正常的窝沟面低于其他3组，与K41和K41＋ABY-8处理组存在显著性差异。综上所述，植物乳杆菌处理K41可以抑制龋坏的发生，同时具有潜在的商业价值。
表6 DIAGNOdent诊断光滑面脱矿程度
注：“*”表示处理组与建模组存在差异显著性，即P＜0.05；“**”表示处理组与建模组存在差异极显著，即P＜0.01。
表7 DIAGNOdent诊断窝沟面脱矿程度
注：“*”表示处理组与建模组存在差异显著性，即P＜0.05；“**”表示处理组与建模组存在差异极显著，即P＜0.01。
4）Keyes计分
将颌骨置于0.4％的murexide溶液中染色12小时，然后用蒸馏水冲洗晾干。使用超薄金刚砂盘（0.2mm）沿上颌骨矢状面对上颌骨和下颌磨牙进行半切割。臼齿通过龋病诊断进行评估并根据Keyes方法用立体显微镜评分。
试验每组选取7只大鼠的上下左右四颗牙进行keyes计分检测牙齿的龋坏程度，将龋病进展划分为釉质层（E级）、牙本质浅层（Ds级）、牙本质中层（Dm级）和牙本质深层（Dx级），其中E级记分反映龋损广度，Ds、Dm、Dx级记分反映龋损的牙本质深度，两者共同反映了龋损的严重程度。表8为光滑面中颊侧和舌侧的Keyes计分，分数越高表明龋坏程度越严重。大鼠光滑面的龋坏程度均在釉质层（E级），同时从表中可以看出建模组颊侧和舌侧的分数显著高于其他3组，K41处理组的龋坏程度与阳性对照组无显著性差异，表明K41对龋病的发生具有很好的抑制作用。大鼠牙齿剖面Keyes计分的结果如表9所示，从表中可以看出只有K41＋ABY-8组一个剖面出现了Dx，分析原因可能是动物模型存在个体差异。此外，建模组中的E，Ds，Dm的分数均显著高于其余3组，表明处理组对龋病具有很好的抑制作用。本研究阳性对照选用的是具有广泛抑菌作用的醋酸洗必泰，大量研究表明洗必泰对龋病具有很好的抑制作用，而试验中植物乳杆菌K41、植物乳杆菌K41＋ABY-8处理后与阳性对照无显著性差异，表明植物乳杆菌K41对龋坏的抑制作用较好，具有潜在的商业价值。
表8 光滑面的Keyes计分
注：“*”表示处理组与建模组存在差异显著性，即P＜0.05；“**”表示处理组与建模组存在差异极显著，即P＜0.01。
表9 剖面的Keyes计分
注：“*”表示处理组与建模组存在差异显著性，即P＜0.05；“**”表示处理组与建模组存在差异极显著，即P＜0.01。
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<213> 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）
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ttaccccacc gactttgggt gttacaaact ctcatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg 60
cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta ctagcgattc cgacttcatg 120
taggcgagtt gcagcctaca atccgaactg agaatggctt taagagatta gcttactctc 180
gcgagttcgc aactcgttgt accatccatt gtagcacgtg tgtagcccag gtcataaggg 240
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aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc tgtatccatg tccccgaagg 420
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Claims (2)
1.植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）K41，于2018年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 15462。
2.如权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No. 15462的植物乳杆菌K41在制备抗龋病的功能性食品中的应用。
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