TW201809263A - 具免疫調節機能的植物乳桿菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種具免疫調節機能的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) CNU091、含有CNU091之組成物及其用於製備活化巨噬細胞組成物之用途； CNU091係以登錄編號BCRC 910732保存於生物資源與保存研究中心(BCRC)；藉此，本發明具免疫調節機能的植物乳桿菌可達到活化巨噬細胞等具免疫調節之功效。

Description

具免疫調節機能的植物乳桿菌及其用途

本發明有關於一種具免疫調節機能的單離(isolated)植物乳桿菌CNU091(Lactobacillus plantarum ) (財團法人食品工業發展研究所之專利生物材料寄存編號為BCRC 910732)、含有CNU091之巨噬細胞活化組成物、及其用於製備活化巨噬細胞之組成物之用途。

乳酸菌 (Lactic acid bacteria) 是指利用碳水化合物進行發酵，以產生大量乳酸之細菌總稱，其特性為：(1)屬革蘭氏陽性菌；(2)不形成內孢子；(3) 厭氧、微好氧 或兼性厭氧性，大多可在有氧環境生長，但以無氧狀態生長較佳，亦有絕對厭氧者；(4) 對所代謝之葡萄糖，產生 50%以上之乳酸。一般公認的乳酸菌包含乳桿菌(Lactobacillus)、明串珠菌(Leuconostoc)、鏈球菌(Streptococcus) 及片球菌(Pediococcus)等4個屬，廣義的乳酸菌尚包括 雙歧桿菌(Bifidobacterium)與芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus)2個屬。

乳酸菌因其可做為益生菌(probiotic)，且廣泛使用於食品加工中，一直是食品工業中的重要研究對象；近年來乳酸菌被發現具有多種調節人體生理功能的功效，包含可維持腸道內菌叢之平衡、緩和乳糖不耐症、改善過敏反應、降低血脂或血中膽固醇含量等等；由於乳酸菌可以維持人體的健康狀況，故吸引相當多研究機構投入乳酸菌的開發與研究。

乳酸菌因為其棲息環境之不同而分為三種，分別為 (1)使用於酸酪乳、乳酸菌飲料及乾酪等畜產加工品的動物性來源乳酸菌 (乳源乳酸菌)；(2)生長於人及動物腸道的腸內乳酸菌；與(3)使用植物性加工品如豆乳、酒粕等植物性來源的乳酸菌。目前大多數應用於醫藥保健用途的乳酸菌為動物性來源的乳酸菌或腸內乳酸菌，應用於醫藥保健用途植物來源乳酸菌仍屬於少數。

植物來源之乳酸菌的生活環境充滿植物殺菌物質(例如單寧酸、植物鹼)，生存條件與動物源乳酸菌相比較為艱困，所以植物來源之乳酸菌對環境之適應性通常較佳，且對胃酸或腸消化液有較高的耐受性，因此較能在消化道中維持其活性。例如中華民國專利TW I371283揭示了一種具有良好耐酸性與耐膽鹽性之植物乳桿菌及其降低生物體內膽固醇與三酸甘油脂之用途。

今，發明人即是鑑於上述現有之植物來源之乳酸菌種類不多，且於醫藥保健上的應用仍不充足，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，研創出本發明。

本發明提供一種具免疫調節機能的單離植物乳桿菌CNU091 (Lactobacillus plantarum )，具活化巨噬細胞的活性，且寄存於財團法人食品工業發展研究所，其登錄編號為BCRC 910732。

本發明提供一種CNU091組成物，包含植物乳桿菌CNU091死菌、CNU091培養濾液、CNU091培養上清液、及含有CNU091之豆粉其中至少一者。

本發明提供一種包含有植物乳桿菌CNU091或CNU091組成物的巨噬細胞活化組成物。

本發明亦提供一種植物乳桿菌CNU091或CNU091組成物用於製備的巨噬細胞活化組成物之用途。

於本發明之一實施例中，本發明之植物乳桿菌CNU091具有耐酸與耐膽鹽之特性。

於本發明之一實施例中，包含有植物乳桿菌CNU091或CNU091組成物的巨噬細胞活化組成物可增強巨噬細胞之吞噬能力、促進巨噬細胞產生一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)或介白素-6(interleukin-6，IL-6)。

於本發明之一實施例中包含有植物乳桿菌CNU091或CNU091組成物的巨噬細胞活化組成物進一步抑制大腸桿菌(Escherichia coli )、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis ) 或金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )生長。

於本發明之一實施例中，包含有植物乳桿菌CNU091或CNU091組成物的巨噬細胞活化組成物可進一步改善腸道菌相。

本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。

本發明一種活化巨噬細胞之植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum )CNU091，其係以登錄編號BCRC 910732寄存於財團法人食品工業發展研究所；本發明之乳酸菌CNU091具有耐酸或膽鹽之特性。

本發明一種巨噬細胞活化組成物，及其用製備活化巨噬細胞組成物之用途，其係包含一植物乳桿菌CNU091或其組成物；其中植物乳桿菌CNU091或其組成物為CNU091活菌、CNU091死菌、含CNU091之豆粉、CNU091培養濾液或CNU091之培養上清液。

本發明一種植物乳桿菌CNU091或其組成物用於製備巨噬細胞活化組成物之用途，係施予一有效劑量於所需個體，以活化巨噬細胞；其中該植物乳桿菌CNU091或其組成物為CNU091活菌、CNU091死菌、含CNU091之豆粉、CNU091培養濾液或CNU091之培養上清液；其中組成物可增強巨噬細胞之吞噬能力、促進巨噬細胞產生一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)或介白素-6(interleukin-6，IL-6)，並可進一步改善腸道菌相。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

實驗一、植物來源之乳酸菌分離、純化與初步鑑定

( 一 ) 植物來源乳酸菌的分離與純化

在無菌條件下，按照10倍稀釋法，稀釋不同種類的新鮮乳酸發酵蔬菜汁，並選取適宜的濃度(稀釋倍數為10^-5 、10^-6 與10^-7 倍)。吸取上述適宜稀釋濃度的菌懸液1mL，預先注入經過滅菌的培養皿中，用滅菌後冷卻至45-50℃的MRS(含有0.5% CaCO₃ )固體培養基傾倒平板，於30℃條件下培養2-3天。挑取周圍有透明圈、形狀各異的單一菌落，在MRS平板上反復劃線純化，直到得到單一菌落；將單一菌落分別轉移到MRS斜面培養基上，做好標記，於4℃下保存。

( 二)、植物來源乳酸菌的初步鑑定

將分離純化所得到之菌落進行革蘭氏染色、鏡檢、觸酶試驗及乳酸定性試驗，並挑選出革蘭氏陽性、觸酶試驗陰性及乳酸定性試驗陽性的菌落繼續保存，並棄去不合條件之菌株。最終挑選出之菌株會以含有15%甘油之MRS培養基保存於-80℃冷凍櫃中。

接著使用BioMerieux公司生產的乳酸菌快速鑑定試劑盒API 50鑑定套組，對篩選的乳酸菌進行鑑定。挑選一定量經過活化的乳酸菌菌株，接種至API 50 CHL液體培養基中，震盪均勻；接入API 50 CHL菌種鑑定試劑條中，每個試劑條接種量為90μL；使用無菌液體石蠟封口，造成厭氧環境和防止水分蒸發，液體石蠟的添加量為每試劑條50μL；在培養盒底部的各個蜂窩狀小槽注入80μL滅菌蒸餾水，以保持培養環境的溼度；將接菌後的試劑條放入培養盒，加蓋，置於37℃條件下培養48小時；紀錄每個試劑條在24小時、48小時的顏色變化，檢測菌株對49種碳水化合物的利用情形。使用APILAB Plus自動判讀系統(BioMerieux, S.A., Marcy I’Etoile, France)對菌株進行鑑定，此系統是一種微生物鑑定判讀系統，具有高性能，且使用方便。至此步驟挑選出159株乳酸菌。

實驗二、篩選具免疫機能調節之植物來源乳酸菌

為了從上述159株乳酸菌中挑出具有免疫機能調節之植物來源乳酸菌，便測試巨噬細胞在植物來源乳酸菌或其衍生物(乳酸菌死菌體乳酸菌培養濾液)的存在下的吞噬活性、存活率、一氧化氮(Nitric Oxidide)生成、細胞激素分泌之狀況；所有檢測分析均進行至少三重複，並以「平均值±標準偏差(Mean±SD)」表示，並採用SPSS12.0軟體，進行單因子變異數(One-way ANOVA)分析，並以Dunnett’s tes比較各試驗組與對照組之間的差異，若p＜0.05則代表試驗組與對照組具有顯著差異。

處理細胞之乳酸菌及其衍生物的製備方法如下：(1)活菌菌體(Viable LAB)；將乳酸菌培養至對數期(log phase)，離心，並以PBS(Phosphate-buffered saline)緩衝液清洗菌體兩次，再離心沉澱，最後菌體以不含抗生素之新鮮DMEM完全培養液調整至菌體濃度為OD₆₀₀ ≒1.0；(2)死菌菌體(Heat-inactivated LAB)：將菌體懸浮液10mL (菌液濃度約10⁹ cells/mL)分裝置螺旋蓋的離心管，以100℃沸水作用1小時，並取部分菌液塗抹至MRS固體培養基，於37℃培養，確認殺菌效果；(3) 培養濾液(LAB-SCS)：將乳酸菌培養至對數期(log phase)，離心，並以0.22μm濾過濾菌液，並將濾液加入至95℃作用15分鐘，即為待測濾液。此外，會取MRS培養液以鹽酸(HCL)調整酸鹼值至pH4.0，作為對照組。

進行下列試驗時，若以乳酸菌活菌體進行實驗，所有的培養試劑中都不加入抗生素；若使用乳酸菌死菌體或是培養濾液進行實驗時，培養試劑中會加入抗生素，以下所有的試驗都遵照此原則進行。

( 一 ) 、巨噬細胞吞噬活性(中性紅吞噬)測試

巨噬細胞株RAW264.7於96孔培養盤預培養24小時後，移除培養液，並以PBS (Phosphate-buffered saline)緩衝液清洗兩次，加入新鮮DMEM培養液100μl /孔，再加入乳酸菌活菌體、死菌體或是培養濾液100μl /孔(約10⁹ cells/mL)，繼續培養3小時；去除上清液，加入0.075 g /100 mL中性紅-PBS(neutral-red PBS)溶液，繼續培養1小時；用37℃ PBS緩衝液清洗三次，並於培養盤中加入細胞裂解液(細胞裂解液為體積比1:1之1M醋酸/99%乙醇混合液)；於OD540下讀取吸光值。

以巨噬細胞吞噬活性(中性紅吞噬)測試，從159株植物來源乳酸菌中篩選出71株具有促進巨噬細胞吞噬活性的植物來源乳酸菌，再以此71株植物來源乳酸菌進行巨噬細胞存活測試。

( 二)、巨噬細胞存活率測試

巨噬細胞株RAW264.7於96孔培養盤預培養24小時後，移除培養液，並以PBS (Phosphate-buffered saline)緩衝液清洗兩次，加入新鮮DMEM培養液100μL /孔，再加入乳酸菌活菌體、死菌體或是培養濾液100μL /孔(約10⁹ cells/mL)；於37℃培養24-72小時，去除上清液，以 PBS緩衝液清洗兩次，加入MTT [(3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5- diphenyltetrazolium bromide)]試劑，避光反應5-10分鐘，於OD₅₉₅ 下讀取吸光值，並以處理購買自養樂多股份有限公司之L. casei Shirota之細胞為對照組，所得到的吸光值視為存活率100%，再計算各組別之存活率；此外，脂多醣(Lipopolysaccharide，LPS)為已知可活化巨噬細胞的物質，用以作為確定細胞培養以及活性正常之陽性對照組(positive control)。經細胞存活率測試，由71株乳酸菌中進一步篩選出30株兼具增進巨噬細胞吞噬能力與低細胞毒性之植物來源乳酸菌，並進一步測試此30株植物來源乳酸菌促進細胞產生一氧化氮(Nitric oxide，NO)之能力。

( 三)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)生成測試

巨噬細胞株RAW264.7於96孔培養盤預培養24小時後，移除培養液，並以PBS (Phosphate-buffered saline)緩衝液清洗兩次，加入新鮮之無酚紅DMEM完全培養液100μL /孔，再加入乳酸菌活菌體、死菌體或是培養濾液100μL /孔(約10⁹ cells/ml)；於37℃培養24小時；取上清液170μL至一新的96孔酵素免疫分析測試(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）作用盤，再加入170μL Griess試劑，室溫避光反應10分鐘，並測定其OD₅₄₀ 吸光值；以NaNO₂ 作為標準品繪製出標準曲線，並將測得之結果與標準曲線比對，計算出樣本中的NO含量。

( 四)、細胞激素(TNF-α與IL-6)生成測試

巨噬細胞株RAW264.7於96孔培養盤預培養24小時後，移除培養液，並以PBS (Phosphate-buffered saline)緩衝液清洗兩次，加入新鮮DMEM完全培養液100μL/孔，再加入乳酸菌活菌體、死菌體或是培養濾液100μL/孔(約10⁹ cells/mL)；於37℃培養24小時；收取上清液，並進行TNF-α與IL-6之酵素免疫分析測試(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA），以測定樣本中TNF-α與IL-6之含量；本測試使用Pharmingen公司之ELISA測試套組進行實驗。

經由NO生成與細胞激素生成測試，最後由30株菌中，篩出11株具有調節巨噬細胞機能之植物來源乳酸菌。此11株乳酸菌，其活菌菌體、死菌菌體以及培養濾液，其巨噬細胞吞噬能力(中性紅吞噬)測試、一氧化氮(NO)生成測試、TNF-α生成測試以及IL-6生成測試的結果分別列於表一~表四，而此11株乳酸菌對於巨噬細胞存活性率之影響請見第一圖。

表一

表二

表三

表四

實驗三、植物來源乳酸菌之16s rRNA鑑定

上述11株乳酸菌經初步測試，皆為革蘭氏陽性菌、不具運動性、觸媒反應陰性、不產生內孢子以及在好氧與厭氧環境下都會生長。為進一步了解11株乳酸菌之菌種，使用Tanner MA等人發表的16s rRNA序列分析方法(Journal of Clinical Microbiology, 1999, Volum 37, page 1863-1870)，對本發明挑選之11株菌株進行分類。

首先，培養足夠量之細菌，並抽取染色體DNA(chromosomal DNA)，以聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction，PCR)方式擴增菌株的16s rRNA基因序列，將純化後之PCR產物委託國立成功大學核酸序列定序中心進行定序，定序所得之結果將與NCBI資料庫中的已知核酸序列進行比對; 進行PCR所使用的兩條引子名稱分別為SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 2。定序以及比對分析後，所得到的菌株分類請見表五。

表五

實驗四、乳酸菌胃酸及膽鹽耐受性體外測試

食物經由口進入消化道(食道、胃、小腸、大腸、結腸、肛門)排出體外的整體時間約20-24小時，其中食物在胃停留的時間，醣類最短(約2-3小時)、脂肪最長(約6小時)；本試驗便模擬食物在胃的環境(pH=2)以及腸道的環境(膽鹽濃度=0.3%)，以及模擬食物停留在胃(3小時)以及停留在人體(24小時)的時間下，比較乳酸菌耐酸及耐膽鹽之特性。

( 一 ) 、酸性耐受性試驗

先將保存於15%甘油的MRS培養基中的乳酸菌，接種於MRS固態培養基活化，再挑選菌落接種於MRS培養液中，37℃隔夜培養，再以1%之比例接種於新鮮MRS培養液，深層培養 (37℃，培養18小時)，便可得到再活化之乳酸菌液。

配置9 mL MRS培養液，以3M鹽酸調整pH值(pH=2或pH=3)，121℃高溫高壓滅菌15分鐘後備用；取1 mL再活化之乳酸菌液，以12000 rpm離心10分鐘並去除上清液，以pH7.4之1/15M磷酸緩衝溶液清洗菌體並再離心，最後將菌體重新懸浮於磷酸緩衝溶液中；取100μL菌液加至9 mL之MRS-HCL溶液中(pH=2或pH=3)，於37℃作用3小時；以12000 rpm離心10分鐘，去除上清液並以磷酸緩衝溶液回溶菌體，塗抹於MRS固體培養基上，於37℃培養48小時之後計算菌數，詳細結果如表六所示。結果顯示大多數的菌經由pH3.0環境處理後，生長情形與對照組相比沒有太大差異；但經pH2.0環境處理，存活菌數明顯降低，菌數量僅為10¹ ~10² 菌/mL。

表六

( 二)、膽鹽耐受性試驗

配置9 mL含有0.30%或0.50%(W/V)牛膽汁(ox-gall)之MRS培養液，121℃高溫高壓滅菌15分鐘後備用；取1 mL再活化之乳酸菌液，以12000 rpm離心10分鐘並去除上清液，以pH7.4之1/15M磷酸緩衝溶液清洗菌體並再離心，最後將菌體重新懸浮於磷酸緩衝溶液中；取100μL菌液加至9 mL之0.30%或0.50%(W/V)牛膽汁(ox-gall)MRS培養液，於37℃作用24小時；以12000 rpm離心10分鐘，去除上清液並以磷酸緩衝溶液回溶菌體，塗抹於MRS固體培養基上，於37℃培養48小時之後計算菌數，詳細結果請見表七。結果顯示，不同濃度的膽鹽處理後，對多數乳酸菌的存活並無顯著影響，除了CNU040、CNU044與CNU110三株存活比L. casei Shirota略低之外、CNU145存活率與L. casei Shirota相仿外，其他菌株的存活數量都比L. casei Shirota高，存活率可達10⁸ 以上。

表七

實驗五、乳酸菌腸道吸附能力

乳酸菌若能定殖(colonization)於腸道中，可增加腸道免疫系統攝取乳酸菌的機率，故腸道定殖能力也是益生菌發揮有益作用的前提，腸道吸附力強的乳酸菌比吸附力弱的乳酸菌更能發揮其作用。實驗步驟如下：將乳酸菌隔夜培養後，取1 mL菌液以12000 rpm離心10分鐘，去除上清液後以PBS緩衝液清洗兩次，並回溶於不含抗生素之DMEM培養基中；將腸道細胞Caco-2細胞株培養至形成單層膜後，去除培養基並以PBS緩衝液清洗細胞兩次；將回溶乳酸菌之培養基加入細胞，於37℃作用3小時後，去除未吸附之乳酸菌；加入0.5 mL之胰蛋白酶(trypsin)，於37℃作用10分鐘，再將細胞懸浮液吸至微量離心管，離心後去除上清液，並將沉澱菌體以少許PBS緩衝液回溶、進行序列稀釋並塗抹於MRS培養基，於37℃隔夜培養再計算菌數，詳細的結果如表八所示；結果顯示本試驗之植物來源乳酸菌株吸附腸細胞之能力皆優於市售之L. casei Shirota。

表八

實驗六、乳酸菌培養上清液的抑菌測試

( 一 ) 、抑菌圈試驗

將再活化之乳酸菌菌液0.1 mL接種於10 mL滅菌的MRS液體培養基中，於37℃下培養20小時；再取此培養液0.5 mL接種入50 mL滅菌的MRS液體培養基，於37℃下培養20小時，以20% HCl調整菌液酸鹼值至pH2.0，再以轉速13000 rmp，於4℃離心10分鐘，即獲得培養上清液。

參考Schoster(2013)等之洋菜擴散法(agar well diffusion method)，進行抑菌圈測試：將二次活化之病原菌菌液，以體積比1%之比例皆種至適當之培養液，37℃震盪(100 rpm)培養20小時；調整菌體懸浮液濃度至10⁷ CFU/ mL，塗抹至定量20 mL之洋菜膠培養基上；在無菌狀態下於培養基上打洞(洞徑約8mm-10mm)，取20 μL之乳酸菌培養上清液，加至上述已塗滿病原菌之洋菜膠培養基之孔洞中，於37℃恆溫培養至少14小時後測量抑菌圈之大小，抑菌圈之型態如第二圖所呈現的透明圓圈，當透明圓圈的直徑越大，表示測試物的抑菌效果越好。本試驗使用之病原菌為大腸桿菌(Escherichia coli ，BCRC 10675)、腸炎沙門氏菌SE07(Salmonella enteritidis ，ATCC 13880)與金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ，BCRC 13829)，其中大腸桿菌及腸炎沙門氏菌為革蘭氏陰性菌，培養液或洋菜膠培養基為LB(Luria-Bertani)培養基；金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，培養液或洋菜膠培養基為TSB(Tryptic Soy Broth)培養基。

表九為抑菌圈試驗之試驗結果，由結果可知(1)CNU088、CNU091與CNU145的抑制大腸桿菌的能力顯著優於L. casei Shirota，CNU019、CNU044與CNU052的抑制能力則與L. casei Shirota無明顯差異；(2)CNU052、CNU088、CNU091及CNU145之抑制金黃色葡萄球菌的能力與L. casei Shirota無顯著差異，其他株菌的抑制能力皆遜於L. casei Shirota；(3)除了CNU042、CNU044及CNU046抑制腸炎沙門氏菌的能力略遜於L. casei Shirota外，其餘菌株抑制腸炎沙門氏菌的能力皆優於或是與L. casei Shirota無顯著差異。

而試驗中之MRS培養基(negative control)未出現抑菌環，表示抑菌的現象是因為乳酸菌生長過程中產生之代謝物/分泌物所導致，常見者有乳酸、二乙醯(diacetyl)或細菌素(bacteriocin)；乳酸可降低環境pH值、二乙醯會妨礙革蘭氏陰性菌利用精胺酸、而細菌素則會同時抑制革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌。

表九

( 二)、抑菌曲線試驗

乳酸菌經活化培養24小時，以轉速12000 rmp，離心10分鐘，上清液以孔徑0.22μm之濾膜過濾，所濾液以不同方式處理，分為三組(1) SCS(未處理)、(2) SCS-heated(濾液於100℃加熱15分鐘)與 (3)SCS-pH7.0(濾液酸鹼值調整至pH7.0)三組。

病原菌經活化培養24小時，以轉速12000 rpm離心10分鐘；去除上清液並以PBS緩衝液清洗菌體、離心；菌體沉澱以PBS緩衝液回溶至10⁸ CFU/ mL備用；將上述不同處理之乳酸菌培養上清液與病原菌(大腸桿菌 BCRC 10675、金黃色葡糖球菌 BCRC 13829與腸炎沙門氏菌 BCRC 10744)，以體積比1:1混合培養4小時，並每隔1小時測定菌數；MRS培養液為陰性對照組(negative control)。第三圖為乳酸菌CNU091的上清培養液對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌與金黃色葡萄球菌的抑菌曲線圖，由圖可知未處理(SCS)與熱處理(SCS-heated)之培養液皆能抑制三株菌生長，但SCS-pH7.0幾乎不具有任何抗菌力(抑菌曲線與MRS培養基相似)；此外，CNU091培養液對於金黃色葡糖球菌的抑菌效果遜於抑制大腸桿菌或是腸炎沙門氏菌，此結果與抑菌圈之試驗結果具有一致性。

實驗七、植物乳桿菌CNU091對腸道菌相之影響

(一)、菌粉製備

菌種活化，接1%菌液至豆粉培養基 (1% Soy podwer, 1% soy peptone, 3% glucose, 0.02 % MgSO₄ , 0.04 % MnSO₄ , 0.1% NaH₂ PO₄ , 0.1% Sodium citrate) ，於培養37℃震盪培養(100 rpm)24 Hour；以轉速8000 rpm離心菌液20 min，去除上清液；將沉澱菌體與保護劑回溶充分混勻，預凍於-80℃後，進行冷凍乾燥步驟；測量菌數並於4℃存放。

( 二)、實驗動物飼養方法

自樂斯科生物科技公司購買35隻10週齡之雄性Wistar 試驗鼠，經一週環境適應期後，隨機分成5組(每組7隻)進行試驗。本功能性實驗步驟及方法乃參照行政院衛生福利部公佈之健康食品功效評估之「對腸胃道功能改善」之「改善腸內細菌菌相」評估方法進行。測試樣品製備後存放於 4 ℃ 冷藏櫃，以維持風味及成份之有效性；每天給予實驗鼠新鮮樣品，並將前一日剩餘之飼料丟棄，以確保每天成份之穩定性。5個組別依序為對照組(Control)，正控制組 (Casei, 管餵L. Casei, 1× 10¹¹ CFU/kg bw)，以及實驗組3組，分別管餵三種不同劑量之植物乳桿菌CNU091，分別為CNU091_L組(低劑量組：4× 10⁹ CFU/kg-體重)、CNU091_M組(中劑量組：2×10¹⁰ CFU/kg-體重)、CNU091_H組(高劑量組：1× 10¹¹ CFU/kg-體重)，動物飼養條件為溫度 24°C ± 1°C，相對濕度 55 ± 5%，12 小時晝夜循環(光照時間為 AM 8:00 ~ PM 20:00)；實驗期間，實驗鼠可自由攝取水和基礎飼料，每兩天記錄飼料剩餘量及實驗鼠體重；開始管餵後，每2週收集糞便進行菌相分析，用以評估腸道狀況，並作為判斷實驗終止時間的依據；30天後將實驗鼠禁食 18 小時，再以CO₂ 窒息法犧牲實驗鼠，採集空腸、盲腸糞便以進行相關分析。本研究之動物試驗經嘉南藥理大學動物實驗管理小組審核通過。實驗結果以SAS JMP 5.1 統計軟體進行One-way ANOVA變異數分析，並以Tukey HSD 做顯著性差異比較 (P＜0.05)。

( 三)、實驗鼠體重、食物攝取量與餵食效率之變化

實驗開始後每兩日記錄實驗鼠之體重與飼料剩餘量，以計算實驗鼠的攝食量與消化吸收率；表十為實驗鼠的最初體重、最終體重、每日體重增加量、每日食物攝取量及餵食效率之資料，數值以「平均值±標準差 (mean ±SD)」呈現；餵食效率(FE)之計算方式為「(每日增加體重/ 每日食物攝取量) X 100%」。結果顯示整個飼養過程中，所有的實驗鼠皆維持健康和一定的活動力，適應期的實驗鼠體重落在410-450公克之間，實驗開始後第三週體重上升到450-500公克之間，最終體重落在500-540公克之間(請參見第四圖)；實驗鼠每日食物攝取量約30-33公克，每日體重增加量約在1.8-2.3公克之間，餵食效率在6-7公克之間。此外，在整個實驗當中，各組別實驗鼠的最初體重、最終體重、每日體重增加量、每日食物攝取量及餵食效率皆無顯著差異 (P＞0.05)，且每日體重增加量、每日食物攝取量及餵食效率將不會影響植物乳桿菌CNU091改善腸內細菌菌相功能評估的效果。

表十

( 四)、細菌性分析

配置0.85％ 氯化鈉(NaCl)稀釋液，並分裝入試管中(9 mL稀釋液/管)，滅菌後將蓋子鎖緊，靜置冷卻。採用按摩方式收集試驗鼠的糞便於密閉容器內(維持厭氧狀態)，在無菌操作台，取 1公克糞便加入含 9 mL無菌厭氧稀釋液之試管中(內含 5 粒玻璃珠)，以試管震盪器混合，再以稀釋液進行序列稀釋(以10倍為稀釋單位)，取50μL稀釋10⁴ 和10⁵ 之稀釋糞液，均勻塗抹至BIM-25(Bifidobacteria iodoacetate medium–25)培養基與TSC(Tryptose-sulfite-D-cycloserine)洋菜膠培養基表面；將塗抹稀釋糞液的培養皿裝入袋子並加入厭氧包，倒置於厭氧操作箱中37 ℃ 培養3天後，計數菌落數。菌落之計數，依照美國FDA發行的BAM(Bacteriological Analytical Manual)標準流程檢測，上述數據經統計分析後，若盲腸或糞便的雙歧桿菌(Bifidobacteria )明顯增加，以及產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens )減少或無明顯變化者，則稱之具改善腸內細菌相功能。

( 四-1)、萃取純化糞便DNA

以有機溶劑萃取純化法萃取糞便中之DNA，步驟為：秤取糞便樣品0.25 公克，加入750μL SDS溶劑，於65℃加熱 10分鐘，高速震盪10分鐘，將細胞溶解；以轉速13000 g 離心1分鐘，保留上清液，並加入1200μl 高濃度的鹽溶液，混合均勻；吸取650μL混合液加入一含有二氧化矽膜之收集管 ，以轉速13000 g 離心1分鐘，使 DNA結合到二氧化矽膜上；加入500μL乙醇將殘留的鹽類和其他污染物洗滌，以轉速13000 g 離心1分鐘，去除濾液；加入100μL TE buffer至二氧化矽膜上，以轉速13000 g 離心1分鐘，回溶結合於二氧化矽膜上之DNA，並將DNA儲存於 - 20℃。

( 四-2)、即時定量聚合酶連鎖反應(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，Q-PCR )

將待測樣本(萃取自實驗鼠糞便之DNA)8 μL、正反向引子各0.5 μL、SYBR Green Master Matrix 10 μL與純水1 μL混合均勻後，進行Q-PCR，反應條件為：95℃-10分鐘進行1個循環；95℃-15秒、60℃-1分鐘，進行40個循環；反應完成後觀察CT值(Cycle threshold)的變化，CT值越低表示DNA含量越高，CT值越高代表示DNA含量越低。檢測雙歧桿菌之引子為SEQ ID NO: 3與SEQ ID NO: 4，檢測產氣莢膜梭菌之引子為SEQ ID NO:5與SEQ ID NO: 6。

表十一-表十三依序為實驗後第0、2、4與5週，實驗鼠糞便中雙歧桿菌與產氣莢膜梭菌之相對含量結果，計算方式為「雙歧桿菌 / (雙歧桿菌+產氣莢膜梭菌 )」；結果顯示，第0週時，各組糞便中雙歧桿菌與產氣莢膜梭菌 之相對含量約在47.69% - 50.52%；至第2週，各組糞便雙歧桿菌與產氣莢膜梭菌之相對含量約為49.70% - 59.18%；實驗第4週，各組糞便中雙歧桿菌與產氣莢膜梭菌之相對含量約為47.38% - 57.42%。實驗第0、2、4週時，各組糞便中雙歧桿菌與產氣莢膜梭菌之相對含量雖然沒有統計上之顯著差異，但於第2、第4週之Casei組與各實驗組(CNU091組)之雙歧桿菌與產氣莢膜梭菌相對含量已有高於對照組 (control) 的趨勢。

表十一

表十二

表十三

表十四為實驗後第5週，實驗鼠糞便中雙歧桿菌與產氣莢膜梭菌 之相對含量結果。實驗鼠的糞便中，控制組的雙歧桿菌與產氣莢膜梭菌之相對含量約為52.35%，而各實驗組中之雙歧桿菌與產氣莢膜梭菌之相對含量皆以高於60%，其中高劑量組(CNU091_H) 顯著高於控制組和Casei組(P＜0.05)，亦高於CNU091_M組和CNU091_L組，但CNU091_H、CNU091_M與CNU091_L三組間並無顯著性差異。

表十四

表十五為實驗後第5週，實驗鼠盲腸之糞便中雙歧桿菌與產氣莢膜梭菌之相對含量結果；CNU091_H組的 雙歧桿菌與產氣莢膜梭菌相對含量約為 70.57%，顯著高於控制組的雙歧桿菌與產氣莢膜梭菌相對含量(50.19%)(P ＜0.05)；CNU091_H組的 雙歧桿菌與產氣莢膜梭菌相對含量亦高於Casei 組、CNU091_ L組和CNU091_M組，但此四組間並無顯著性差異。

表十五

為提高實驗結果可信度，以及菌群分析檢測的局限值，同時檢測盲腸糞便中雙歧桿菌和產氣莢膜梭菌的DNA相對含量(Amount of DNA inBifidobacteria /Cl. Perfringens )，並以CT 值做為評估指標，詳細結果請參見表十六；CT值越低代表DNA含量越高，CT值越高代表DNA含量越低。結果顯示CNU091_H(高劑量組) 的CT值顯著低於控制組 (P＜0.05)，且略低於Casei組，顯示管餵高劑量(1× 10¹¹ CFU/kg-體重)植物乳桿菌CNU091於豆粉培養基中發酵後產物後，其腸道雙歧桿菌之DNA相對含量顯著高於產氣莢膜梭菌。

表十六

( 五)、實驗鼠空腸(jejunum)病理切片

以蘇木精–伊紅(Hematoxylin-Eosin，H＆E )染色觀察空腸病理切片，做出準確及完整的病理診斷。本次實驗取空腸經福馬林固定，石蠟包埋，切片和水化後，以H＆E染色方法可以清晰地顯示出許多不同的結構，細胞核為藍黑色，細胞漿為粉紅色，並藉由切片觀察空腸的絨毛(villus)長度與隱窩(crypt)深度，染色結果請參見第五圖；第五圖為放大倍數400倍後之光學顯微鏡照相結果，觀察到市售乳酸菌(L. Casei Shirota)、CNU091_L、CNU019_M與CNU091_H組的空腸型態(尤其是腸絨毛型態)無太大差異，但對照組(Control)有出現部分絨毛退化之情形(箭頭所指之處)。表十七為根據切片染色結果，觀察實驗鼠空腸的絨毛長度與隱窩深度及結構變化之統整結果，顯示對照組與Casei組的絨毛長度顯著短於所有試驗組 (CNU091_L、 CNU091_M與 CNU091_H組)。此外，對照組與CNU091_H的隱窩深度顯著低於其他組；絨毛長度與隱窩深度的比值如下：對照組為2.70，Casei組為2.47，CNU091_ L組為3.00，CNU091_M組為3.14，CNU091_H組為3.83；而CNU091_H 絨毛長度與隱窩深度的比值顯著優於控制組與Casei組，亦高於CNU091_L組與CNU091_M組。以上結果顯示攝取CNU091能有效提升空腸絨毛長度與隱窩深度，改善空腸生理結構。

表十七

由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：

1. 本發明之植物乳桿菌CNU091係由植物發酵物分離所得，具備有耐酸性與耐膽鹽之特質，更易存活於腸道細胞當中。

2. 本發明之植物乳桿菌CNU091，具有活化巨噬細胞之能力，但又不會造成細胞大量死亡，是一種理想的免疫調節劑。

3. 本發明之植物乳桿菌CNU091能抑制大腸桿菌、沙門氏腸炎菌以及金黃色葡萄球菌生長，有助於維持腸道健康。

4. 本發明之植物乳桿菌CNU091能提高腸道雙歧桿菌與產氣莢膜梭菌的相對含量， 具有改善腸道菌相之能力。

5. 本發明之植物乳桿菌CNU091能有效提升空腸絨毛長度與隱窩深度，改善空腸生理結構

6. 本發明之植物乳桿菌CNU091之活菌、死菌或培養上清液都具有調節巨噬細胞之功效，提升其利用於產業之廣泛性。

綜上所述，本發明具免疫調節機能的本土植物乳桿菌CNU091，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

無

第一圖：細胞處理乳酸菌後之存活率圖。

第二圖：抑菌環測試示意圖。

第三圖：CNU091上清培養液對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌之抑菌曲線圖。

第四圖：實驗鼠之體重變化圖。

第五圖：實驗鼠空腸之病理切片與H&E染色圖。

國內寄存資訊

財團法人食品工業發展研究所

105年6月17日

BCRC 910732

＜110＞ 嘉南藥理大學 ＜120＞ 具免疫調節機能的植物乳桿菌及其用途 ＜160＞ 6 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜223＞ PCR引子 ＜400＞ 1 agagtttgat cmtggctcag 20 ＜210＞ 2 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜223＞ PCR引子 ＜400＞ 2 ggytaccttg ttacgactt 19 ＜210＞ 3 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜223＞ PCR引子 ＜400＞ 3 gggtggtaat gccggatg 18 ＜210＞ 4 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜223＞ PCR引子 ＜400＞ 4 taagccatgg actttcacac c 21 ＜210＞ 5 ＜211＞ 17 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜223＞ PCR引子 ＜400＞ 5 atgcaagtcg agcgakg 17 ＜210＞ 6 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜223＞ PCR引子 ＜400＞ 6 tatgcggtat tatycctt 18

Claims (10)

1. 一種具免疫調節機能的單離(isolated)植物乳桿菌CNU091 (Lactobacillus plantarum )，係活化巨噬細胞，且以登錄編號BCRC 910732寄存於財團法人食品工業發展研究所。
2. 如申請專利範圍第1項所述之單離植物乳桿菌CNU091，係為活菌或死菌。
3. 如申請專利範圍第1項所述之單離植物乳桿菌CNU091，係耐酸或膽鹽之乳酸菌。
4. 一種CNU091組成物，係包含如申請專利範圍第1項所述之單離植物乳桿菌CNU091、培養濾液、培養上清液及豆粉其中至少一者。
5. 如申請專利範圍第4項所述之CNU091組成物，其中該單離植物乳桿菌CNU091係為活菌或死菌。
6. 一種如申請專利範圍第1項所述之單離植物乳桿菌CNU091用於製備巨噬細胞活化組成物之用途，其係施予一有效劑量之該單離植物乳桿菌CNU091於所需個體，以活化巨噬細胞。
7. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該單離植物乳桿菌CNU091係為活菌或死菌。
8. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該組成物係增強巨噬細胞之吞噬能力、促進巨噬細胞產生一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)或介白素-6(interleukin-6，IL-6)。
9. 如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該組成物係進一步改善腸道菌相。
10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該組成物係抑制大腸桿菌(Escherichia coli )、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis ) 或金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )生長。