KR20130131973A - 오리나무 수피 추출물 및 유산균을 포함하는 항우식성 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오리나무 수피 추출물, 유산균, 또는 오리나무 수피 추출물 및 유산균을 포함하는 항우식성 약학 조성물, 의약외품 및 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 항우식 효능 측면에서 선정된 오리나무 수피 추출물 및 유산균을 이용함으로써 치아우식증에 있어서 중요한 역할을 하는 생물막을 억제하고, 치아우식증의 원인균주인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대한 항균력과 글루칸 형성 억제능을 발휘할 수 있으며, 이미 형성된 생물막 제거에도 유효한 효능을 발휘할 수 있다. 특히 본 발명에 이용된 오리나무 수피 추출물과 유산균은 단독으로 이용되는 경우 우수한 항우식 효능을 나타낼 뿐만 아니라, 병용되는 경우 항우식 효능에 있어서 현저한 상승 효과를 발휘하여 치아우식증의 예방 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면 안전성에 문제가 없는 오리나무 수피 추출물과 유산균을 이용함으로써 독성이나 부작용 문제를 야기하지 않고 안전성을 확보하여 다양한 분야에 적용될 수 있다.

Description

오리나무 수피 추출물 및 유산균을 포함하는 항우식성 조성물{ANTICARIOGENIC COMPOSITION COMPRISING EXTRACT OF BARK OF ALNUS JAPONICA (THUNBERG) STEUDEL}

본 발명은 항우식성 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 오리나무 수피 추출물, 유산균 또는 오리나무 수피 추출물 및 유산균을 포함하는 항우식성 조성물에 관한 것이다.

치아우식증은 현재 전 세계적으로 가장 널리 만연되고 있는 문화병의 하나로 국내의 경우도 점차 그 이환율이 높아지고 있다. 치아우식증은 임상적으로 그 발생빈도가 매우 높으며, 치료법의 발달에도 불구하고 치아의 상실을 가져오는 주된 원인이 되는 질병이다. 치아우식증의 발병 요인은 치아표면에 형성된 치태(dental plaque)인데, 치태 내의 많은 미생물들이 당질을 대사하여 유기산을 형성하고, 이것이 치아의 외막인 법랑질(enamel)을 용해하여 일어난다. 치태 형성에 가장 중요한 역할을 하는 원인균은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)라고 알려져 있다.

스트렙토코커스 뮤탄스는 첫니가 난 후에 숙주에서 콜로니를 형성하는데, 이후 치면의 피막에 부착하여, 글루코실트랜스퍼레이즈(Glucosytransferase, GTase)라는 효소를 분비하여 음식물에 포함된 수크로오스(sucrose)를 기질로 하여 글루코오스(glucose)와 프럭토오스(fructose)를 생성하고, 동시에 글루코오스 중합체인 불용성 글루칸(insoluble Glucan)을 합성한 후, 이 글루칸에 의해 구강 내 다른 미생물들이 치면에 부착함으로써 치태를 형성하게 된다. 이렇게 치태가 형성된 이후에는 물리적인 힘이나 항균성분 등에 대한 저항성이 증가하여 칫솔질에 의해 제거되지 않고 항균제의 효과가 떨어지게 된다. 따라서, 효과적인 충치 예방을 위해서는 치태 형성에 중요한 역할을 담당하는 스트렙토코커스 뮤탄스의 생육을 저해함으로써 초기에 치태 형성을 억제하는 것이 중요하다.

현재 치아우식증을 억제하기 위해 사용되고 있는 방법으로는 주로 화학적 살균제나 항생제 등이 주를 이루고 있다. 그러나, 항생제의 경우 설사, 구토 등을 포함한 신체 전반에 대한 전신적인 부작용을 일으킬 수 있고, 구강 내 내성균의 출현 및 균교대증을 유발할 수 있기 때문에 장기적인 사용이 곤란하여 단지 치료제만으로 이용될 수 있는 단점이 있다. 예를 들어, 현재 널리 사용되고 있는 항생제인 클로로헥시딘(chlorohexidin)은 고농도로 구강내에 사용하거나 혹은 저농도로 오랫동안 사용할 경우, 혀나 치아에 착색을 일으키고, 구강점막이 벗겨지거나, 미각 이상을 일으키는 등의 부작용이 발생할 수 있으며, 균교대증이 유발될 수 있는 부작용이 있고, 발암성이 있어 임산부의 경우 사용이 제한된다는 단점이 있고, 트리클로산(triclosan)의 경우, 세포독성이 높아 장기간 사용시 부작용의 우려가 높고 내성균주의 출현이라는 문제점이 있다. 따라서 부작용이 없으면서도 장기간 사용할 수 있는 안전한 치아우식 억제제의 개발이 매우 절실하다.

최근 치아우식증 발생 기전에 대한 기초적인 연구와 함께 치아우식증 예방 측면에서 매우 활발한 연구가 이루어졌다. 특히 치아우식증 예방물질의 탐색 연구는 미생물이나 녹차류, 한방재 등 각종 천연물을 대상으로 하여 새로운 탐색, 개발이 계속되고 있다.

한편, 오리나무(Alnus japonica (Thunberg) Steudel)는 자작나무과(Betulaceae)의 오리나무속(Alnus)에 속하는 낙엽교목을 말하는 것으로서, 한방에서는 오리나무의 수피를 적양이라 부른다. 오리나무는 KFDA 식품원재료 공전에 등록되어 있는 안전한 약재로서, 껍질에 5~10%의 탄닌질, 트리테르페노이드인 타락세롤, 베툴린산이 있고, 열매에는 약 10% 이상의 탄닌질, 잎에는 플라보노이드 히페로시드, 0.2%의 정유가 있다. 이와 같은 오리나무 추출물을 이용한 종래 기술로는 항염, 보습의 화장료 조성물, 숙취해소제, 항산화 및 간보호 조성물, 심장순환계 치료용 조성물, 흡연 독성 해독용 조성물 등이 있으며 주로 간질환이나 숙취해소에 관한 기술들이 보고되어 있다.

한편, 락토바실러스 플라타룸(Lactobacillus plantarum)은 한국의 전통식품인 김치 등에서 주로 분리되는 유산균으로 다양한 병원성 미생물들에 대한 항균 활성이 보고되고 있다. 또한 젖산, 아세트산 등의 유기산, 과산화수소, 박테리오신 등 여러 가지 항균 물질을 생산한다고 알려지고 있으며 이들은 식품이나 사료의 중요한 생물학적 보존제가 될 수 있다고 알려지고 있다.

유산균이 특별한 관심을 끄는 이유는 동서양을 막론하고 식품에서 널리 이용되어 섭취되어 왔으므로 일반적으로 안전하다고 인식하는 'GRAS(generally regarded as safe)' 미생물이기 때문이다.

그러나, 아직까지 오리나무 추출물이나 유산균을 이용하여 부작용이 없으면서 장기간 사용의 안전성을 확보할 수 있는 치아우식증 치료 또는 예방 효능을 갖는 항우식성 조성물에 대한 연구는 이루어지지 않고 있는 실정이다.

본 발명자들은 오리나무 수피 추출물과 유산균이 각각 우수한 항우식 효능을 나타내며, 조합하여 이용되는 경우 항우식 효능의 상승 효과를 발휘하는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명은 생물막(biofilm) 형성을 억제하고, 치아우식 원인 균주에 대한 항균력 및 글루칸 형성 억제능을 가질 뿐 아니라, 이미 형성된 생물막 제거에도 유효한 효능을 발휘하는 오리나무 수피 추출물, 유산균, 또는 오리나무 수피 추출물 및 유산균을 포함하는 항우식성 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 측면은 오리나무 수피 추출물, 유산균, 또는 오리나무 수피 추출물 및 유산균을 포함하는 항우식성 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 일 측면은 오리나무 수피 추출물, 유산균, 또는 오리나무 수피 추출물 및 유산균을 포함하는 항우식성 의약외품을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 일 측면은 오리나무 수피 추출물, 유산균, 또는 오리나무 수피 추출물 및 유산균을 포함하는 항우식성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 측면에서 상기 유산균은 L. plantarum VITA-L03(KCTC 12177BP)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면 항우식 효능 측면에서 선정된 오리나무 수피 추출물 및 유산균을 이용함으로써 치아우식증에 있어서 중요한 역할을 하는 생물막을 억제하고, 치아우식증의 원인균주인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대한 항균력과 글루칸 형성 억제능을 발휘할 수 있으며, 이미 형성된 생물막 제거에도 유효한 효능을 발휘할 수 있다.

특히 본 발명에 이용된 오리나무 수피 추출물과 유산균은 각각 우수한 항우식 효능을 발휘할 뿐만 아니라, 병용되는 경우 항우식 효능에 있어서 현저한 상승 효과를 발휘하여 치아우식증의 예방 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면 안전성에 문제가 없는 오리나무 수피 추출물과 유산균을 이용함으로써 독성이나 부작용 문제를 야기하지 않고 안전성을 확보하여 다양한 분야에 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에서 선정된 한약소재들의 시험관내 생물막 억제능 측정 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 오리나무 수피 추출물의 항균 활성 측정 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 선정된 유산균의 시험관내 생물막 억제능 측정 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라 선정된 유산균의 글루코실트랜스퍼라제 억제 활성 측정 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따라 최종 선정된 균주(L. plantarum VITA-L03(KCTC 12177BP))의 계통분석 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 오리나무 수피 추출물과 유산균 L. plantarum VITA-L03(KCTC 12177BP) 혼합물의 항우식 활성 측정 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세히 설명하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 생물막 억제능, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대한 항균력과 글루칸 형성 억제능에 있어서 유효한 효능을 발휘하는 오리나무 수피 추출물을 이용함으로써 치아우식증에 있어서 유효한 효능을 발휘하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 이용되는 오리나무 수피 추출물은 시험관내 생물막 형성 억제능, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대한 항균 활성 및 글루칸 생산 저해능 측면에서 우수한 항우식 효능을 나타내며, 5000㎎/㎏을 상회하는 LD₅₀ 값을 나타내어 안전성이 확보될 수 있다.

이러한 오리나무 수피 추출물은 단독으로 이용되는 경우에 우수한 항우식 효능을 발휘할 뿐만 아니라, 후술하는 유산균과 병용되는 경우에 항우식 효능에 있어서 현저한 상승 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에 있어서, "오리나무 수피 추출물"은 추출용매를 이용하여 제조된 오리나무 수피 추출물뿐만 아니라, 상기 오리나무 수피 추출물에 하나 이상의 "분획화 유기용매"를 추가로 가하여 추출한 분획물도 포괄하는 의미로 사용된다.

오리나무 수피 추출물 형성에 이용되는 용매는 특히 제한되지 않으며 일반적으로 천연물 추출에 사용되는 다양한 용매가 이용될 수 있다. 예를 들어, 오리나무 수피 추출물은 열수 추출, 알코올 추출 및 주정 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 방법에 의하여 형성될 수 있다.

또한, 오리나무 수피 추출물의 분획물 형성에 이용되는 분획화 유기용매는 특별히 한정되는 것은 아니며, 통상의 유기용매를 제한 없이 사용할 수 있다.

일 형태에서, 오리나무 수피 추출물은, 증류수를 첨가하는 단계; 60~130℃, 바람직하게는 약 100℃의 온도에서 30~240분 동안, 바람직하게는 약 180분 동안 열수 추출하는 단계; 및 여과하는 단계를 거쳐 형성될 수 있다.

오리나무 수피 추출물의 농도는 1~100중량%, 바람직하게는 5~50중량%, 더욱 바람직하게는 약 20중량%일 수 있다. 오리나무 수피 추출물의 농도가 1중량% 미만인 경우에는 충분한 항우식 효능을 발휘하지 못할 우려가 있다.

한편, 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 생물막 억제능, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대한 항균력과 글루칸 형성 억제능에 있어서 유효한 효능을 발휘하는 유산균을 이용함으로써 치아우식증에 있어서 유효한 효능을 발휘하는 것을 특징으로 한다.

일 실시예에서, 본 발명에 이용되는 유산균은 L. plantarum VITA-L03(KCTC 12177BP)인 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은 전국 각지로부터 수집한 김치, 건강한 한국 성인 및 유아로부터 확보한 분변 및 타액 시료로부터 항우식 효능이 우수한 L. plantarum VITA-L03(KCTC 12177BP) 유산균주를 선별하였다. L. plantarum VITA-L03(KCTC 12177BP)는 시험관내 생물막(biofilm) 형성 억제능, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대한 항균 활성 및 글루칸 생산 저해능 측면에서 다른 균주에 비하여 월등히 우수한 항우식 효능을 갖는 것으로 나타났다.

또한, L. plantarum VITA-L03(KCTC 12177BP) 유산균주는 단독으로 이용되는 경우에 우수한 항우식 효능을 발휘할 뿐만 아니라, 전술한 오리나무 수피 추출물과 병용되는 경우에 항우식 효능에 있어서 현저한 상승 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 이러한 유산균은 'GRAS(generally regarded as safe)' 미생물이므로 안전성을 확보하면서 우수한 항우식 효능을 발휘할 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서 유산균은 배양 상등액으로 이용되거나, 또는 균체 자체로 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 전술한 오리나무 수피 추출물과 유산균을 조합하여 이용함으로써 치아우식증에 있어서 유효한 상승적인 효능을 발휘하는 것을 특징으로 한다.

일 형태에서, 오리나무 수피 추출물과 유산균의 중량비는 9.5:0.5 내지 5:5, 바람직하게는 9:1 내지 6:4의 범위일 수 있다. 오리나무 수피 추출물과 유산균의 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 각각의 한약재 및 유산균을 단독으로 처리한 경우에 비해 항우식 효능에 있어서 유의성이 나타나지 않을 수 있다.

상기 실시예에 따르면, 항우식 효능 측면에서 선정된 오리나무 수피 추출물과 유산균을 이용함으로써 생물막 억제능, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대한 항균력과 글루칸 형성 억제능을 발휘할 수 있으며, 이미 형성된 생물막 제거에도 유효한 효능을 발휘할 수 있어, 치아우식증의 예방 및 치료에 유효하게 이용될 수 있다.

또한, 오리나무 수피 추출물과 유산균을 조합하여 이용하는 경우, 각각을 단독으로 이용하는 경우에 비하여 항우식 효능에 있어서 현저한 상승효과를 나타낼 뿐 아니라, 독성이나 부작용을 나타내지 않아 안전성을 확보할 수 있다.

본 발명에 있어서는 이와 같은 효능을 발휘하는 오리나무 수피 추출물과 유산균을 단독으로 또는 조합하여 항우식성 약학 조성물, 항우식성 의약외품 또는 항우식성 식품 조성물 등에 광범위하게 적용할 수 있다.

본 발명의 일 측면은 오리나무 수피 추출물, 유산균 또는 오리나무 수피 추출물 및 유산균을 포함하는 항우식성 약학 조성물에 관한 것이다.

일 실시예에서, 본 발명의 항우식성 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함한다.

본 발명에 이용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 특히 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 대표적인 예로는, 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 글리세린, 아카시아 고무, 알지네이트, 칼슘포스페이트, 칼슘카보네이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일, 주사가능한 에스테르, 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우리지 등을 들 수 있다.

본 발명의 항우식성 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸, 외용제, 좌제 및 주사제로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태일 수 있다.

약학 조성물의 제제화 방법은 기술분야에 공지된 통상의 방법에 따라 수행될 수 있으며, 특히 제한되지 않는다.

본 발명의 항우식성 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 투여량은 투여 대상의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 정도, 약물의 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 적절히 선택될 수 있으나, 일반적으로 약 5~500㎎/㎏, 바람직하게는 약 100~250㎎/㎏을 1일 1~3회 투여할 수 있다.

본 발명의 항우식성 약학 조성물의 제제화 방법, 투여량, 투여 경로, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.

본 발명의 항우식성 약학 조성물은 치아우식증의 예방 및 치료에 이용될 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 항우식성 약학 조성물은 유효 성분으로 오리나무 수피 추출물, 유산균 또는 오리나무 수피 추출물 및 유산균 외에 다른 약학적 활성 성분을 함께 포함하거나, 또는 다른 유효 성분을 포함하는 약학 조성물과 혼합되어 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면은 오리나무 수피 추출물, 유산균 또는 오리나무 수피 추출물 및 유산균을 포함하는 항우식성 의약외품에 관한 것이다.

일 실시예에서, 본 발명의 항우식성 의약외품은 구강 제품일 수 있다.

구강 제품의 예는 치약, 구강 청결제, 양치액, 연고액 및 츄잉검으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항우식성 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.

일 실시예에서, 본 발명의 항우식성 의약외품은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있으며, 그 상세한 내용은 약학 조성물에 관하여 전술한 바와 같다.

본 발명의 항우식성 의약외품은 치아우식증의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 오리나무 수피 추출물, 유산균 또는 오리나무 수피 추출물 및 유산균을 포함하는 항우식성 식품 조성물에 관한 것이다.

일 실시예에서, 본 발명의 항우식성 식품 조성물은 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함한다.

본 발명에 이용될 수 있는 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제는 포도당, 과당, 말토스, 슈크로스, 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올과 같은 천연 탄수화물, 타우마틴, 스테비아 추출물 등의 천연 향미제, 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제, 착색제, 펙트산 또는 그의 염, 알긴산 또는 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산화제 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항우식성 식품 조성물은 기술분야에 공지된 통상의 방법에 따라 빵, 케이크, 쿠키, 면류 등의 밀가루 제품, 음료, 각종 유제품, 츄잉검, 캔디, 젤리, 분말, 과립, 정제, 캡슐 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

항우식성 식품 조성물 중의 오리나무 수피 추출물, 유산균 또는 오리나무 수피 추출물 및 유산균의 함량은 식품의 형태, 풍미, 맛 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01~50 중량%의 범위일 수 있다.

본 발명의 항우식성 식품 조성물의 형태, 조성 및 제조방법 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.

이와 같이 본 발명에 따른 항우식성 조성물은 생물막 억제능, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대한 항균력과 글루칸 형성 억제능에 있어서 유효한 효능을 발휘하여, 각종 약학 조성물, 의약외품, 식품 조성물 등에 적용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

1. 한약소재의 선정 및 생물막 형성 억제능 측정

(1) 선발방법

1) 한약소재의 수집

상한론, 금궤요략, 방약합편 등에 기재된 처방 및 그 처방에 포함된 단미제 등을 토대로 약 385종의 생약 자원을 수집하였다.

2) 약재 추출물의 제작

385종의 한약재에 대하여 열수 추출 및 메탄올 환류냉각추출 등의 방법을 사용하였으며, 이 추출물을 이용하여 동결 건조 시료를 제조하여 한약재의 선별을 위한 시료로 사용하였다. 동결건조 시료는 적당한 농도로 DMSO에 현탁하여 -20℃에 보관하며 사용하였으며 실험시 희석하여 사용하였다.

3) 생물막 형성 억제능 측정방법

ⅰ) 96-웰 마이크로플레이트에 인공타액(1% Hog Gastric Mucin)이 포함되어 있는 Adherence Buffer (KPO₄ 10mM/L, KCl 50mM/L, CaCl₂ 1mM/L, MgCl₂ 0.1mM/L, pH 7.0)를 200㎕씩 첨가한 후, 실온에서 교반하며 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 첨가된 용액을 모두 제거하고 건조시켰다.

ⅱ) 본 실험에 사용한 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans)는 그람양성 통성 혐기성 세균으로 한국생명공학연구원 미생물자원센터로부터 분양받은 KCTC3065 균주를 BHI 브로스(Brain Heart Infusion broth)(BHI, Difco, USA)와 아가(Agar) 배지에 계대배양하여 실험에 사용하였다.

ⅲ) 건조된 96-웰 마이크로플레이트에 3% (w/v) 수크로오스가 포함된 BHI 브로스 180㎕를 첨가하고 S. mutans 접종액 (S. mutans를 3㎖의 BHI 브로스에서 37℃, 12시간 배양한 후 원심분리하여 상징액을 제거하고, PBS Buffer로 2회 세척한 후, Adherence Buffer를 첨가하여 2×10⁸ cfu/㎖ 농도로 조정하여 제조) 20㎕를 접종하였다. 동결건조한 한약시료는 멸균된 증류수에 25㎎/㎖의 농도로 현탁한 후, 원심분리하여 상징액 50㎕를 사용하였다. 대조군의 경우 처리물질 대신 동량의 멸균 증류수를 첨가하였다.

ⅳ) 이 후 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 각 웰에 0.2% (w/v) 크리스탈 바이올렛 용액(Crystal Violet Solution)(2% EtOH에 용해됨) 200㎕를 첨가하고 10분 동안 염색시킨 다음, 수돗물로 3회 세척 후 건조시켰다.

ⅴ) 0.5% (w/v) SDS 용액(50% EtOH에 용해됨) 250㎕를 넣고, 1시간 이상 디스테이닝(destaining) 시킨 후, 새 마이크로플레이트에 200㎕를 옮기고, 595㎚에서 흡광도를 측정하였다. 생물막 형성 억제율은 하기와 같이 계산될 수 있다.

(2) 시험관내(in vitro) 생물막 형성 억제능 실험결과

선정된 한약소재들의 시험관내 생물막 형성 억제능을 측정하여, 그 결과를 표 1 및 도 1에 나타낸다. 표 1 및 도 1로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 시험관내 생물막 형성 억제능 측정 결과 동일 농도에서 오리나무 수피의 억제능(Inhibition Activity)이 89%로 가장 우수하게 나타났다.

한약소재의 시험관내 생물막 형성 억제능

	대조군	오미자	오리나무	오리나무 수피
5㎎/㎖	0%	46%	19%	89%

2. 한약소재의 항균 활성 분석

(1) 항균 활성 분석

1) 한약재의 생장 억제(Growth Inhibition) 활성을 확인하기 위하여 스트렙토코커스 뮤탄스 균주를 BHI 브로스에 접종하여 계대배양한 후, 오리나무 수피 열수 추출물을 적정한 비율로 희석한 각각의 희석 시료에 BHI 브로스를 1:1로 혼합하였다. 대조군은 오리나무 수피 열수 추출물 대신 멸균 증류수를 혼합하였다.

2) 2회 계대배양한 S. mutans를 상기 혼합 배지에 2% 접종하여 0H와 12H에 BHI 고체배지에 도말하고, 혐기배양방법으로 36시간 배양하여 생균수를 확인하였다.

(2) 항균 활성 측정 결과

오리나무 수피의 항균 활성 실험결과를 도 2에 나타낸다. 도 2에 나타내어진 바와 같이, 5% 오리나무 수피에서 대조군 대비 약 20%의 균주만이 생존하였으며, 20% 이상의 오리나무 수피에서는 0.01% 미만의 균주들만이 생존하였다. 이로부터, 10% 오리나무 수피 추출물 처리에 의하여 약 90%의 항균 활성이 나타남을 확인할 수 있다.

3. 한약소재의 글루칸 ( Glucan ) 생산 저해능 측정

(1) 측정 방법

1) S. mutans를 BHI 브로스에 접종하여 37℃ 배양기에서 24시간 배양한 후, 4℃에서 4300rpm으로 30분간 원심분리시켜 상징액을 취하였다. 0.2㎛ 주사기 필터(Syringe Filter)로 상징액을 여과한 후, Millipore사의 Amicon Ultra Centrifugal Filter (MWCO 30 kDa, Cat. No. UFC903008)를 사용하여 조효소액을 제조하였다.

2) 한약재 열수 추출물을 물에 현탁한 후, 용매의 극성도를 고려하여 헥산(Hexane), 에틸아세테이트 (Ethylacetate), 부탄올(Butanol)로 극성이 낮은 용매에서 극성이 높은 용매로 순차적으로 계통 분획하여 각 추출물을 얻었다. 획득한 용매 분획물은 감압 회전 농축기를 사용하여 농축한 후, 25㎎/㎖ 농도로 DMSO (Dimetyl Sulfoxide)에 녹여 -20℃에 저장하였으며, 실험시 희석하여 사용하였다.

3) 글루코실트랜스퍼라제(GTase)의 활성은 수크로오스를 기질로 하여 생성된 불용성 글루칸을 분광광도계를 이용하여 측정하였다. 유리 시험관에 기질용액 (0.0625M Potassium Phosphate Buffer (pH 6.5) 1L 중 수크로오스 12.5g, NaN₃ 0.25g 함유) 800㎕, 조효소액 20㎕ 및 한약재 용매 분획물 180㎕ 첨가하여 최종 용량이 1㎖이 되도록 하였다. 대조군에는 처리물질 대신 멸균 증류수 180㎕를 첨가하였다. 시험관을 30도 정도 경사지게 하여 37℃ 배양기에서 30시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 원심분리하여 상징액을 버리고 4㎖의 증류수를 가하고, 10분간 초음파 처리하여 형성되어 있는 글루칸을 분산시켰다. 분산 직후 분광광도계로 550㎚에서 흡광도를 측정하여 각 시료의 GTase에 대한 억제율을 하기와 같이 계산하였다.

(2) 측정 결과

오리나무 수피 용매 분획물의 GTase 억제 활성의 측정 결과를 하기 표 2에 나타낸다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 오리나무 수피 분획물의 GTase 저해 활성 측정 결과, 오리나무 수피의 에틸아세테이트 층에서 약 35%의 억제 활성이 관찰되었다.

오리나무 수피 용매 분획물의 GTase 억제 활성

	오리나무 수피의 에틸아세테이트 층	오리나무 수피의 부탄올 층
GTase 억제 활성	35.7±0.19%	23.9±0.16%

* 한약재 처리 농도: 0.5㎎/㎖

4. 오리나무 수피의 안정성 실험( in vivo )

(1) 마우스를 이용한 후보 한방 생약 소재의 급성독성 실험

1) 실험 방법

ⅰ) 선정된 한방 생약 소재 오리나무 수피의 안전성에 대한 자료를 마련하기 위하여 단회 투여 독성 실험을 실시하였다. 단회 투여 독성 실험은 식품의약품안전청 고시 제2005-60호 의약품 등의 독성시험방법의 “비임상시험 관리기준”(2005년 10월 25일)에 따라 암수 ICR 마우스를 이용하여 실시하였다.

ⅱ) 동물구입 후 약 1주일 동안 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 환기횟수 시간당 12~16회, 조명 12시간 명암주기(점등 7:00, 소등 19:00), 조도 150~300 Lx인 사육 환경하에서 검역 및 순화시키면서, 외관을 육안으로 검사한 후, 건강한 동물을 골라 실험에 사용하였다. 암수 각각의 마우스를 각 군당 5마리씩 설정하여, Cage 별 5마리씩 개별 수용하였다. 사료와 물은 자유섭취시켰으며, 사료는 실험동물용 고형사료(PMI nutrition, USA)를 공급하였다.

ⅲ) 오리나무 수피 열수 추출물의 투여용량은 5000㎎/㎏을 기준으로 공비 0.5로 1250, 2500, 5000㎎/㎏(Mouse, B.W.) 3가지 용량으로 설정하였으며, 부형제인 생리식염수로 각각의 투여 용량별로 희석하여 시험에 사용하였다. 투여 경로는 경구투여법을 이용하였으며, 동물을 하룻밤 절식시킨 후 경구투여용 일회용 존데와 주사관을 이용하여 배부 피부 고정법으로 몸체를 고정한 후 경구투여하였다.

ⅳ) 임상 증상은 투여 직후부터 6시간 동안 매시간 관찰하였으며, 그 후 14일 동안 1일 1회, 일반상태의 변화, 운동성, 외관, 자율신경 등의 일반증상 및 사망례를 관찰하였다. 체중은 입수 시, 군 분리 전 및 시험물질 투여 후 1, 3, 7, 14일에 각각 측정하였다. 실험동물을 희생시키기 전날 밤 18시간 절식시킨 후, Zoletil 50 (Virbac S.A, France)과 Xylazine Hydrochloride(바이엘 코리아 주식회사, 경기도)을 복강 내 주사하여 마취하였으며, 후대 정맥을 통한 방혈을 실시한 후, 모든 장기에 대한 육안적 병변을 관찰하였다.

2) 실험 결과

ⅰ) 오리나무 수피 열수 추출물에 대한 치사율 및 LD₅₀을 확인하여, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 오리나무 수피 추출물을 0, 1250, 2500, 5000㎎/㎏ 용량으로 경구로 단회 투여 후 14일 동안 실험동물을 관찰한 결과, 모든 암수 ICR 마우스에서 사망동물은 관찰되지 않았다. 따라서 오리나무 수피 추출물의 경우 각각의 한계용량(5000㎎/㎏/day, 2000㎎/㎏/day)까지 경구 투여하여도 사망을 관찰할 수 없어 LD₅₀ 값은 산출되지 않았다.

오리나무 수피 추출물의 단회 투여 독성 실험 결과

Group	용량(㎎/㎏)	성별	동물의 수	치사율(%)
대조군	0	수컷	5	0
		암컷	5	0
오리나무 수피	1250	수컷	5	0
		암컷	5	0
	2500	수컷	5	0
		암컷	5	0
	5000	수컷	5	0
		암컷	5	0

ⅱ) 오리나무 수피 열수 추출물을 경구로 단회 투여 후 14일 동안 실험동물을 관찰하여, 그 결과를 하기 표 4에 나타낸다. 각각 0, 1250, 2500, 5000㎎/㎏ 용량의 오리나무 수피 열수 추출물을 경구로 단회 투여 후 14일 동안 실험동물을 관찰한 결과, 실험에 사용된 모든 암수 ICR 마우스에서 보행 장애, 행동이상, 웅크림, 설사, 부종, 호흡촉박, 몸단장, 뛰어오름, 유루, 무기력증, 구토, 비루, 마비, 유연 등 시험 물질 투여와 관련된 어떠한 임상 증상의 이상 소견도 관찰되지 않았다.

오리나무 열수 추출물로 처리된 암수 ICR 마우스의 임상 증상

Group	용량(㎎/㎏)	성별	동물의 수	이상 소견의 수
대조군	0	수컷	5	0
		암컷	5	0
오리나무 수피	1250	수컷	5	0
		암컷	5	0
	2500	수컷	5	0
		암컷	5	0
	5000	수컷	5	0
		암컷	5	0

ⅲ) 오리나무 수피 열수 추출물을 각각 경구로 단회 투여 후 1, 3, 7, 14일 동안 실험동물의 체중변화를 관찰하여, 그 결과를 하기 표 5 및 6에 나타낸다. 표 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 모든 실험동물이 개시체중에 비하여 체중이 수컷의 경우 약 25% 이상, 암컷의 경우 약 10% 이상 증가하였다. 오리나무 수피 고농도 투여군(5000 ㎎/㎏)에서 체중 증가량이 감소하는 경향이 나타났으나 통계적으로 유의한 차이가 나지 않았다. 또한 투여 전(0 day), 투여 후 1, 3, 7, 14일 모두 시험물질에 의한 유의한 체중 감소 및 증가는 관찰할 수 없었다.

오리나무 열수 추출물로 처리된 수컷 ICR 마우스의 평균 체중

Group (수컷)	용량 (㎎/㎏)	체중(g)
			0일	1일	3일	7일	14일
대조군	0	평균	25.136	28.210	29.070	31.264	33.030
		표준편차	1.984	2.271	2.008	2.419	0.466
오리나무 수피	1250	평균	25.090	26.964	27.730	30.376	32.214
		표준편차	1.710	1.761	1.859	1.849	1.627
	2500	평균	25.006	27.390	28.062	30.012	32.304
		표준편차	1.348	0.625	0.565	0.647	0.644
	5000	평균	24.920	26.352	26.950	29.280	31.132
		표준편차	1.128	1.605	1.610	1.628	1.667

오리나무 열수 추출물로 처리된 암컷 ICR 마우스의 평균 체중

Group (암컷)	용량 (㎎/㎏)	체중(g)
			0일	1일	3일	7일	14일
대조군	0	평균	22.008	21.308	23.382	23.458	24.932
		표준편차	1.299	0.952	1.104	0.923	1.025
오리나무 수피	1250	평균	21.618	22.358	22.152	23.412	25.240
		표준편차	1.162	1.438	1.453	1.483	1.783
	2500	평균	21.616	22.778	22.878	23.430	25.250
		표준편차	0.875	0.889	0.891	1.172	1.433
	5000	평균	21.330	22.026	22.046	23.882	25.354
		표준편차	0.668	1.918	1.937	1.536	2.414

ⅳ) 실험 종료 후 모든 실험동물을 부검하여 주요 내부 장기의 육안적 소견을 관찰한 결과, 모든 암수 ICR 마우스에서 심장, 폐, 흉선, 간, 신장, 부신, 비장, 위, 대장, 맹장 등 주요 내부 장기에 대한 외관상의 어떠한 이상 병변도 발견되지 않았다.

ⅴ) 이상의 결과로부터 오리나무 수피 열수 추출물의 LD₅₀은 암수 ICR 마우스에 있어 5000㎎/㎏을 상회할 것으로 사료된다.

5. 유산균의 수집 및 생물막 형성 억제능 측정에 의한 선발

(1) 실험 방법

1) 시료의 수집

전국 각지로부터 11종의 김치와 건강한 한국 성인 및 유아로부터 각각 8점의 분변, 24점의 타액시료를 확보하였다.

2) 유산균 분리

내산성, 내담즙산성을 가진 유산균을 분리하기 위하여 균질화한 각각의 시료 1㎖에 멸균 PBS buffer 4㎖를 첨가한 후, 인공위액(1N-염산 용액을 사용하여 pH 2.5로 조정한 MRS 브로스에 펩신 0.3%를 첨가한 용액)과 인공담즙액(담즙 0.3%를 첨가한 MRS 브로스)에 각각 순차적으로 30분간 노출시켰다. 노출 후, PBS로 1회 세척하고, 멸균 생리식염수를 사용하여 십진희석하였다. 다양한 유산균종을 분리하기 위하여 MRS, PES, m-Enterococcus 등의 한천배지에 희석액을 도말하였다. 36시간 배양 후에 형성된 단일 콜로니를 내산, 내담즙성을 갖는 균주로 판정하였으며, BCP 한천배지에서 산의 생성을 확인하여 유산균 유사 균주(Lactic Acid Bacteria-like Strain)로서 단리하였다.

3) 시험관 내 생물막 형성 억제능 측정 방법

ⅰ) 96-웰 마이크로플레이트에 인공타액(1% Hog Gastric Mucin)이 포함되어 있는 Adherence Buffer (KPO₄ 10mM/L, KCl 50mM/L, CaCl₂ 1mM/L, MgCl₂ 0.1mM/L, pH 7.0)를 200㎕씩 첨가한 후, 실온에서 교반하면서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 첨가된 용액을 모두 제거하고 건조시켰다.

ⅱ) 건조된 96-웰 마이크로플레이트에 3% (w/v) 수크로오스가 포함된 BHI Broth 180㎕를 첨가하고 S. mutans 접종액 (S. mutans를 3㎖의 BHI 브로스에서 37℃, 12시간 배양한 후 원심분리하여 상징액을 제거하고, PBS Buffer로 2회 세척한 후, Adherence Buffer를 첨가하여 2×10⁸ cfu/㎖ 농도로 조정하여 제조함) 20㎕를 접종하였다. 프로바이오틱(Probiotic) 유산균은 MRS 브로스에 2% 접종하여 배양한 것을 원심분리하여 펠렛(Pellet)을 제거하고, 배양상징액을 0.2㎛ 주사기 필터(syringe filter)로 제균한 후, Speed Vac으로 농축한 것을 50㎕씩 첨가하였다. 대조군으로는 유산균 배양상징액 대신 멸균 증류수를 사용하였다.

ⅲ) 이 후 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 각 웰에 0.2% (w/v) 크리스탈 바이올렛 용액(2% EtOH에 용해됨) 200㎕를 첨가하고, 10분 동안 염색한 후, 수돗물로 3회 세척 후 건조시켰다.

ⅳ) 0.5% (w/v) SDS 용액(50% EtOH에 용해됨) 250㎕를 가하고, 1시간 이상 디스테이닝(destaining)시킨 후, 200㎕를 새 마이크로플레이트로 옮겨, 595㎚에서 흡광도를 측정하였다. 생물막 형성 억제율은 하기와 같이 계산될 수 있다.

(2) 실험결과

유산균 유사 균주의 시험관내 생물막 형성 억제능 측정 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 몇몇 균주에서 우수한 생물막 억제능이 발휘되었으며, 이들 중 억제 정도 및 종 다양성에 따라 VITA-L03, Feh3-8, Feh3-10, Feh3-14, SUP-8, SCE-11, SOE-1, SR-16-2, SR-10-3, SR-23-1의 10종을 선정하였다.

6. 유산균의 항우식 항균 활성 분석

(1) 실험방법

항균활성 측정을 위하여 하기와 같이 페이퍼 디스크법 방법(Paper Disc Method)에 따라 실험을 수행하였다.

S. mutans를 도말한 BHI 한천배지 위에 페이퍼 디스크(Paper Disc)를 얹은 후, 유산균 배양상징액(MRS 브로스에 2% 접종하여 배양한 유산균 배양액을 원심분리 및 0.2㎛ 주사기 필터를 이용하여 제균한 용액, 본 실험에서는 적정배수로 농축하여 사용)을 50㎕씩 적하한 후, 12시간 동안 배양한 후에 생성된 투명환의 크기로 항균 활성을 측정하였다.

2) 실험 결과

선발된 유산균의 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대한 항균 활성 측정 결과를 하기 표 7에 나타낸다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 선정된 대부분의 균주에서 항균 활성을 확인하였다.

페이퍼 디스크 방법을 이용하여 측정된 각 균주의 항균 활성

no.	시료명	분리원	생육 저지환(㎜)
1	VITA-L03	김치	15
2	Feh3-8	인간 분변	11
3	Feh3-10	인간 분변	10
4	Feh3-14	인간 분변	10
5	SUP-8	인간 타액	12
6	SCE-11	인간 타액	11
7	SOE-1	인간 타액	13
8	SR-16-2	인간 타액	13
9	SR-10-3	인간 타액	15
10	SR-23-1	인간 타액	14
11	L. brevis 1	시판 유제품	-
12	L. casei 1	시판 유제품	9.5
13	L. acidophilus 1	시판 유제품	10

¹: 양성 대조군

7. 유산균의 글루칸 생산 저해능 분석

(1) 실험 방법

1) S. mutans를 BHI 브로스에 접종하여 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양한 후, 4℃에서 4300rpm으로 30분간 원심분리시켜 상징액을 취하였다. 0.2㎛ 주사기 필터에 상징액을 여과한 후, Millipore사의 Amicon Ultra Centrifugal Filter(MWCO 30 kDa, Cat. No. UFC903008)를 사용하여 조효소액을 제조하였다.

2) 글루코실트랜스퍼라제의 활성은 수크로오스를 기질로 하여 생성된 불용성 글루칸을 분광광도계를 이용하여 측정하였다. 유리 시험관에 기질용액(0.0625M Potassium Phosphate Buffer (pH 6.5) 1L 중 수크로오스 12.5g, NaN₃ 0.25g 함유) 800㎕, 조효소액 20㎕ 및 농축 유산균 배양 상징액 180㎕ 첨가하여 최종 용량이 1㎖가 되도록 하였다. 대조군에는 처리물질 대신 증류수 180㎕를 첨가하였다. 시험관을 30도 정도 경사지게 하여 37℃ 배양기에서 30시간 동안 반응시켰다. 반응 후 원심분리하여 상징액을 버린 후, 4㎖의 증류수를 가하고 10분간 초음파 처리하여 형성되어 있는 글루칸을 분산시켰다. 분산 직후 분광광도계로 550㎚에서 흡광도를 측정하여 각 시료의 GTase에 대한 억제율을 하기와 같이 계산하였다.

(2) 실험 결과

선발된 유산균에 대한 GTase 억제능 측정 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4에 나타내어진 바와 같이, SOE-1 및 VITA-L03의 활성이 가장 높았다. 생물막 형성 억제능이 우수했던 일부 프로바이오틱 유산균 분리주의 경우 GTase 억제능이 낮은 것은, 주로 항균 활성에 의하여 생물막의 생성이 저해된 것으로 사료된다.

7. 선발된 유산균의 계통학적 분석

(1) 계통학적 분석 방법

: 16S rDNA 염기서열을 이용하여 하기와 같이 선발된 유산균의 계통학적 분석을 수행하였다.

1) 균체를 회수하고 100㎕ STES buffer (0.4 M NaCl, 0.2 M Tris-HCl (pH 7.6), 0.01 M EDTA, 1% SDS)에 현탁하였다.

2) 현탁액에 유리 비드를 첨가하고 세포를 파쇄하기 위하여 Micro tube mixer MT-360(TOMY) 를 이용하여 5분간 강하게 교반하였다.

3) 세포 파쇄 후, 페놀 추출을 실시하고, 상등액에 RNase A 5㎕를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다.

4) 반응 후, 페놀 추출을 다시 실시하고, 에탄올 침전을 실시하여 DNA를 회수하였다.

5) 16S rDNA는 PCR 방법을 통하여 증폭하였으며 사용된 프라이머는 아래와 같다

포워드 프라이머(Forward primer) 5'-GA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' (E. coli numbering system, positions 9 - 27)

리버스 프라이머(Reverse primer) 5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3' (E. coli numbering system, positions 1,492 - 1,510)

6) PCR 반응의 조건은 아래와 같이 실시하였다.

: 총 30 사이클로, 각 사이클은 변성(Denaturation)을 위하여 94℃에서 60초, 어닐링(Annealing)을 위하여 50℃에서 60초, 확장(Extension)을 위하여 72℃에서 90초로 실시하였다.

7) 분리 균주의 16S rDNA 염기서열은 관련된 Genus를 대표하는 비교 균주의 염기서열과 함께 CLUSTAL W Software Program을 이용하여 정렬하였다.

8) Evolutionary Distance Materices는 Kimura Two Parameter 방법에 근거하여 작성하였고, PHYLIP Package version 3.572가 제공하는 Neighbour - Joining Method Tool을 이용하여 계통수를 작성하였다.

(2) 실험결과

16S rDNA를 이용한 계통분석 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5로부터, 최종 선정된 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)과 근연 관계를 형성하고 있음을 알 수 있었다.

8. 오리나무 수피 추출물과 유산균 혼합 조성물의 항우식 효능 상승효과

(1) 실험 방법

1) 오리나무 수피 추출물과 유산균 조성물의 항우식 효능 상승효과를 탐색하기 위해 Artificial biofilm assay(Alviano et al., 2008)를 실시하였다. 항우식 항균 활성이 99.9%이상 나타난 20% 오리나무 수피 추출물과 모든 항우식 활성이 가장 뛰어났던 VITA-L03를 적정 비율로 혼합하여 실험에 사용하였다.

2) BHI 한천 배지에 0.22㎛ 멤브레인 디스크(membrane disks)(Millipore, 13㎜ 직경)를 올려놓고, S. mutans 배양액 20㎕를 점적시키고, 37℃에서 48시간 동안 배양하여 생물막을 형성시켰다.

3) 오리피 추출물과 유산균 상등액을 적정 비율로 혼합한 시료를 준비하고, 시료를 생리식염수에 적정 비율로 희석하여 50㎖ 튜브에 5㎖씩 분주하였다. 대조군으로는 생리식염수를 사용하였다.

4) 생물막이 형성된 멤브레인 디스크를 멸균된 핀셋으로 떼어내어 상기 50㎖ 튜브에 넣고, 37℃에서 1시간 동안 진탕배양하였다.

5) 멤브레인 디스크를 증류수로 세척하여 비부착 세균과 잔여물을 제거한 후, 10㎖의 멸균 생리식염수를 넣고, 볼텍스 믹서(vortex mixer)로 교반하여 멤브레인 디스크로부터 생물막을 떨어뜨렸다.

6) 상기 균현탁액을 십진희석하고, 100㎕를 BHI 한천배지에 도말한 후, 37℃에서 48시간 동안 배양하여 생균수를 측정하였다.

(2) 실험 결과

오리나무 수피 추출물과 VITA-L03 혼합 조성물의 항우식 효능 측정 결과를 도 6에 나타낸다. 도 6에 나타내어진 바와 같이, Artificial biofilm assay를 실시한 결과 오리나무 수피 추출물과 VITA-L03 배양 상등액 시료를 각각 단독으로 처리했을 때보다, 9:1, 8:2, 7:3 및 6:4의 비율로 혼합한 시료를 처리했을 때 생물막 제거율이 약 3~4배 정도 유의하게 증가하여 상기 혼합 조성물에서 항우식 효능의 상승효과가 있음을 확인하였다. 특히 9:1 및 8:2 혼합 시료로 처리했을 때 S. mutans균 생존율은 7.0% 및 7.7%로, 항우식 효능의 상승효과가 가장 크게 나타났다. 그러나 상대적으로 VITA-L03 배양 상등액의 비율이 증가될수록 항우식 효능의 상승효과는 감소되어, 5:5 비율로 혼합한 시료를 처리했을 때 생물막 제거율은 VITA-L03을 단독으로 처리했을 때와 유의성이 없었다.

9. 제조예

하기 제조예에서, "유효 성분"으로는 하기 3종의 시료를 사용하였다:

ⅰ) 상기 1. 내지 3.에서 제조된 오리나무 수피 추출물;

ⅱ) 상기 5. 및 6.에서 제조된 VITA-L03 배양 상등액 또는 균체; 및

ⅲ) 상기 8.에서 제조된 오리나무 수피 추출물과, VITA-L03 배양 상등액 또는 균체의 8:2 혼합 시료.

(1) 주사제

유효 성분: 100 ㎎

소듐 메타비설파이트: 3.0 ㎎

메틸파라벤: 0.8 ㎎

프로필파라벤: 0.1 ㎎

주사용 멸균증류수: 적량

상기 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2 ㎖가 되도록 제조하여, 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

(2) 정제

유효 성분: 200 ㎎

감자 전분: 100 ㎎

락토오스: 100 ㎎

콜로이드성 규산: 16 ㎎

스테아린산 마그네슘: 적량

통상의 정제 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하고 타정하고 정제를 제조하였다.

(3) 캡슐제

유효 성분: 100 ㎎

유당: 50 ㎎

전분: 50 ㎎

탈크: 2 ㎎

스테아린산 마그네슘: 적량

통상의 캡슐 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

(4) 환제

유효 성분: 120 ㎎

옥수수 전분: 100 ㎎

멸균 증류수: 적량

상기 성분을 혼합하고, 통상의 환제 제조방법에 따라 적절한 크기를 갖는 구형으로 제환하여 환제를 제조하였다.

(5) 구강 케어용 의약외품

1) 치약

유효 성분: 20중량%

글리세린: 6중량%

사카린나트륨: 0.1중량%

실리카: 7중량%

침강 탄산칼슘: 39중량%

라우릴황산나트륨: 2중량%

멘톨: 0.4중량%

박하유: 0.1중량%

정제수: 잔량

상기 성분을 혼합하고, 통상의 치약 제조방법에 따라 치약을 제조하였다.

2) 기타

상기 유효 성분(상기 1. 내지 3.에서 제조된 오리나무 수피 추출물; 상기 5. 및 6.에서 제조된 VITA-L03 배양 상등액 또는 균체; 및 상기 8.에서 제조된 오리나무 수피 추출물과, VITA-L03 배양 상등액 또는 균체의 8:2 혼합 시료) 적당량을 각종 구강 청결제, 양치액, 연고제 또는 츄잉검인 구강 케어 제품에 첨가하여 구강 케어용 의약외품을 제조하였다.

(6) 식품

1) 밀가루 식품의 제조

상기 유효 성분(상기 1. 내지 3.에서 제조된 오리나무 수피 추출물; 상기 5. 및 6.에서 제조된 VITA-L03 배양 상등액 또는 균체; 및 상기 8.에서 제조된 오리나무 수피 추출물과, VITA-L03 배양 상등액 또는 균체의 8:2 혼합 시료) 적당량이 첨가된 밀가루를 이용하여 빵, 케이크, 쿠키 및 면류와 같은 식품을 제조하였다.

2) 음료의 제조

올리고당(2%), 액상과당(0.5%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%) 등의 음료 재료에 상기 유효 성분(상기 1. 내지 3.에서 제조된 오리나무 수피 추출물; 상기 5. 및 6.에서 제조된 VITA-L03 배양 상등액 또는 균체; 및 상기 8.에서 제조된 오리나무 수피 추출물과, VITA-L03 배양 상등액 또는 균체의 8:2 혼합 시료)을 적량 혼합하여, 살균함으로써 음료를 제조하였다.

한국생명공학연구원 KCTC12177BP 20120327

Claims (23)

1. 오리나무 수피 추출물을 포함하는 항우식성 약학 조성물.
   
2. 유산균을 포함하는 항우식성 약학 조성물.
   
3. 오리나무 수피 추출물 및 유산균을 포함하는 항우식성 약학 조성물.
   
4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
   상기 유산균은 L. plantarum VITA-L03(KCTC 12177BP)인 것을 특징으로 하는
   항우식성 약학 조성물.
   
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 오리나무 수피 추출물의 농도는 1~100중량%인 것을 특징으로 하는
   항우식성 약학 조성물.
   
6. 제3항에 있어서,
   상기 오리나무 수피 추출물과 상기 유산균의 중량비는 9.5:0.5 내지 5:5의 범위인 것을 특징으로 하는
   항우식성 약학 조성물.
   
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는
   항우식성 약학 조성물.
   
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   치아우식증의 치료 또는 예방에 이용되는 것을 특징으로 하는
   항우식성 약학 조성물.
   
9. 오리나무 수피 추출물을 포함하는 항우식성 의약외품.
   
10. 유산균을 포함하는 항우식성 의약외품.
    
11. 오리나무 수피 추출물 및 유산균을 포함하는 항우식성 의약외품.
    
12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 유산균은 L. plantarum VITA-L03(KCTC 12177BP)인 것을 특징으로 하는
    항우식성 의약외품.
    
13. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 오리나무 수피 추출물의 농도는 1~100중량%인 것을 특징으로 하는
    항우식성 의약외품.
    
14. 제11항에 있어서,
    상기 오리나무 수피 추출물과 상기 유산균의 중량비는 9.5:0.5 내지 5:5의 범위인 것을 특징으로 하는
    항우식성 의약외품.
    
15. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항우식성 의약외품은 치약, 구강 청결제, 양치액, 연고액 및 츄잉검으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태인 것을 특징으로 하는
    항우식성 의약외품.
    
16. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    치아우식증의 치료 또는 예방에 이용되는 것을 특징으로 하는
    항우식성 의약외품.
    
17. 오리나무 수피 추출물을 포함하는 항우식성 식품 조성물.
    
18. 유산균을 포함하는 항우식성 식품 조성물.
    
19. 오리나무 수피 추출물 및 유산균을 포함하는 항우식성 식품 조성물.
    
20. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    상기 유산균은 L. plantarum VITA-L03(KCTC 12177BP)인 것을 특징으로 하는
    항우식성 식품 조성물.
    
21. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 오리나무 수피 추출물의 농도는 1~100중량%인 것을 특징으로 하는
    항우식성 식품 조성물.
    
22. 제19항에 있어서,
    상기 오리나무 수피 추출물과 상기 유산균의 중량비는 9.5:0.5 내지 5:5의 범위인 것을 특징으로 하는
    항우식성 식품 조성물.
    
23. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는
    항우식성 식품 조성물.

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