KR101929115B1

KR101929115B1 - 감초 추출물 및 복분자 추출물을 함유하는 바이오필름 형성 억제용 조성물

Info

Publication number: KR101929115B1
Application number: KR1020170031368A
Authority: KR
Inventors: 김태종; 함영석
Original assignee: 국민대학교산학협력단
Priority date: 2017-03-13
Filing date: 2017-03-13
Publication date: 2018-12-13
Also published as: KR20180104500A

Abstract

본 발명은 감초 추출물 및 복분자 추출물을 함유하는 바이오필름 형성 억제용 조성물 및 구강용 조성물에 관한 것으로, 상기 감초 추출물 및 복분자 추출물의 혼합물은 각각의 단독 추출물과 비교하여 미생물의 생장, 글루코실트랜스퍼라제 활성 및 바이오필름 형성을 억제하는 효능이 현저하게 우수하기 때문에 바이오필름 형성 억제 용도 및 구강 위생 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

감초 추출물 및 복분자 추출물을 함유하는 바이오필름 형성 억제용 조성물{Composition for Preventing Biofilm Formation Containing Extract of Licorice and Extract of Rasberry}

본 발명은 감초 추출물 및 복분자 추출물을 함유하는 바이오필름 형성 억제용 조성물 및 구강용 조성물에 관한 것이다.

바이오필름(biofilm)은 생물막이라고도 불리우며, 미생물이 세포 주위에 다당체를 생산하고 이것을 매개로 인접한 미생물과 응집하여 고체나 생체 표면에 막(film)을 형성하고 있는 상태를 의미한다. 바이오필름을 형성하는 미생물은 부유 상태의 미생물보다 항생제에 대한 저항성이 1000배 이상 높으며, 바이오필름 형성은 세균성 심내막염(bacterial endocarditis), 치아 우식증(dental caries), 만성 부비동염(chronic sinusitis), 폐렴 등과 같이 여러 질병의 발병(pathogenesis)에 중요한 역할을 한다(비특허문헌 1).

치아 우식증(충치)은 구강 내의 치아 표면에 부착하고 있는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans; S. mutans)에 의하여 유발되며, S. mutans는 글루코실트랜스퍼라제(glucosyltransferase)를 분비한다. 분비된 글루코실트랜스퍼라제는 설탕(sucrose)을 포도당(glucose)과 과당(fructose)으로 분해하고, 포도당을 이용하여 글루칸(glucan)이라는 다당류를 합성한다. 생성된 글루칸은 다른 미생물들의 부착을 도와주며, 결과적으로 치아 표면에 많은 글루칸이 형성되어 바이오필름의 일종인 플라그(plaque, 치석)의 부피가 커지게 된다. 바이오필름을 형성하여 치아에 부착한 S. mutans는 위생을 위한 외부의 물리적, 화학적 처리에 대하여 저항력을 지니게 되므로 구강 내에 오래 머무를 수 있게 된다. 이처럼 완벽하게 제거되지 않은 S. mutans가 지속적으로 작용하여 구강 내에 만성 질환 및 합병증을 유발하게 된다(특허문헌 1).

본 발명자들은 선행연구에서 감초의 메탄올 추출물을 디클로로메탄으로 분획한 추출물이 벼흰잎마름병 원인균인 잔토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae) 및 장질환 원인균인 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)의 바이오필름 형성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다(특허문헌 2).

한편, 생약 추출물은 약재 고유의 맛과 향으로 인하여 고농도를 사용하였을 때 사용감이 좋지 않으며, 세포 독성 및 제조 비용이 상승하는 문제가 발생할 수 있다. 따라서 생약 추출물의 사용을 줄이더라도 제품의 고유한 맛과 향을 유지하면서 미생물의 바이오필름 형성 억제 효과를 나타내는 새로운 소재의 개발이 필요하다.

본 발명자들은 감초 추출물 및 복분자 추출물을 혼합하여 사용하는 경우 추출물 각각이 가지고 있는 바이오필름 형성 억제 능력이 현저히 증가하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

1. 대한민국 등록특허 제10-1506858호 2. 대한민국 공개특허 제10-2015-0070060호

1. http://www.intron.co.kr/sub/technologies /biofilm.php

본 발명의 일 목적은 감초 추출물 및 복분자 추출물의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 바이오필름 형성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 감초 추출물 및 복분자 추출물의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 구강용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 감초 추출물 및 복분자 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이오필름 형성 억제용 조성물을 제공한다.

본 명세서의 용어, '바이오필름(biofilm, 생물막)'은 미생물에 의하여 형성된 막 모양의 구조체를 의미하며, 상호 연결된 미생물 세포층 및 미생물 분비물로 이루어진 구조적 특징을 가진다. 미생물은 다당류를 생성하는 효소인 글루코실트랜스퍼라제를 세포 외부로 분비하여 외부 환경에 존재하는 당물질로부터 수용성 또는 불용성 글루칸을 형성하며, 이러한 불용성 글루칸이 지속적으로 축적되면 필름 형태의 얇은 바이오필름이 형성된다. 형성된 바이오필름은 미생물 사이의 응집에 도움을 주어 결과적으로 낭포성 섬유종(cystic fibrosis), 치아 우식증 또는 난치성 감염증 등의 질환을 유발하거나 기관이나 구조물의 손상을 일으킬 수 있으며, 카테터(catheter)와 같은 의료 기구를 오염시킬 수 있다.

본 발명의 바이오필름 형성 억제용 조성물의 유효성분으로 사용되는 복분자는 장미과 식물인 복분자딸기(Rubus coreanus)의 열매를 말하며, 약효성분으로 유기당, 당류, 비타민 C 등을 포함하고 있다. 복분자는 남자의 정력 감퇴 현상을 개선시키는 효과가 있고, 간기능 감퇴로 인한 시력 감소와 물체가 모호하게 보이는 현상을 개선시키는 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

또한, 감초는 감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer) 또는 동속식물의 뿌리와 줄기 일부를 건조시킨 약재를 말한다. 약리작용으로는 해독작용, 간염, 두드러기, 피부염 등에 효과가 있고, 진해, 거담, 근육 이완, 이뇨작용 및 항염 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

감초 및 복분자는 식품의약안전처에 공전 등재된 식용 가능한 식물이기 때문에 감초 추출물 및 복분자 추출물은 부작용 없이 안전하게 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 복분자 추출물은 글루코실트랜스퍼라제 활성 및 미생물의 바이오필름 형성을 억제할 수 있으며, 감초 추출물은 미생물의 생장 및 바이오필름 형성을 억제할 수 있다.

또한, 감초 추출물 및 복분자 추출물을 혼합하여 이용하는 경우 미생물의 생장 및 바이오필름 형성 억제 효과가 상승적으로 현저히 증가한다. 바이오필름 형성 억제 효과는 미생물의 생육, 증식을 억제하거나 사멸시키는 효과와는 무관하게 고체 표면에 들러붙는 혼합체인 바이오필름의 형성을 저해하는 효과를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 감초 추출물 및 상기 복분자 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 감초 및 복분자를 분쇄한 후 추출에 통상적으로 사용되는 용매를 각각 첨가하고, 적절한 온도와 압력으로 추출하여 감초 추출물 및 복분자 추출물을 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 용매는 정제수, 헥산, 1,3-부틸렌글리콜, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 아세톤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 용매는 정제수 또는 탄소수 1 내지 4의 알코올일 수 있다.

한편, 상기 감초 추출물 및 상기 복분자 추출물은 상술한 용매 추출법에 의한 추출물 뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예를 들어, 일정한 분자량 컷-오프(cut-off) 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시한 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함될 수 있다. 또한, 상기 감초 추출물 및 복분자 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다. 일 예로, 상기 감초 추출물 및 상기 복분자 추출물은 살균 및 분무건조 과정을 거쳐서 분말 형태로 제조될 수 있으며, 70 내지 90℃의 온도에서 10 내지 40분 동안 살균한 후, 분무건조기를 이용하여 분말 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 조성물은 상기 감초 추출물 및 상기 복분자 추출물을 부피 기준으로 5:0.5 내지 5:5의 비율로 포함할 수 있으며, 또는 상기 감초 추출물 및 상기 복분자 추출물을 부피 기준으로 5:3 내지 5:4의 비율로 포함할 수 있다. 상기 감초 추출물 및 상기 복분자 추출물의 혼합 비율은 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 조절될 수 있다.

또한, 상기 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 상기 복분자 추출물을 0.5 내지 20 중량%, 또는 1 내지 10 중량%로 포함할 수 있으며, 감초 추출물을 0.5 내지 20 중량%, 또는 1 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 복분자 추출물 및 감초 추출물의 함량은 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 적절히 조절될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 바이오필름은 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 액티노바실러스 속(Actinobacillus sp.), 아그레가티박터 속(Aggregatibacter sp.), 포르피로모나스 속(Porphyromonas sp.), 타네렐라 속(Tannerella sp.), 트레포네마 속(Treponema sp.), 프레보텔라 속(Prevotella sp.) 및 후소박테리움 속(Fusobacterium sp.)으로 이루어진 군에서 미생물에 의하여 형성될 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 다르면 상기 미생물은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 스트렙토코커스 고르도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 스트렙토코커스 상기스(Streptococcus sanguis), 스트렙토코커스 파이오진스(Streptococcus pyogenes ), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 액티노바실러스 비스코수스(Actinobacillus viscosus), 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 타네렐라 포르시시아(Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia) 및 후소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 바이오필름은 식품의 표면 등과 같이 미생물의 생장 또는 증식이 가능한 곳에서 형성되기 때문에 이를 방지하기 위하여 본 발명에 따른 바이오필름 형성 억제용 조성물을 식품 또는 화장료 조성물로 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 감초 추출물 및 복분자 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 구강용 조성물을 제공한다.

본 명세서의 용어, '구강용 조성물'은 구강 건강상태를 개선 또는 유지하기 위하여 제조 및 시판되는 구강용 제품들에 함유될 수 있는 조성물을 의미한다. 상기 구강용 제품은 치약, 구강 세정제, 구강 청정제, 껌, 캔디류, 구강 스프레이 및 구강 양치액 등을 포함하나, 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 감초 추출물 및 복분자 추출물을 혼합하여 이용하는 경우 구강 미생물의 생장, 글루코실트랜스퍼라제의 활성 및 바이오필름 형성을 효과적으로 억제하기 때문에 상기 구강용 조성물은 치아의 프라그(plaque) 형성을 억제할 수 있다. 상기 구강용 조성물은 프라그 형성 억제 효능 이외에도 치아 우식증 예방, 구취 억제 및 구강 질환 완화 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 구강용 조성물은 감초 추출물 및 복분자 추출물을 부피 기준으로 5:0.5 내지 5:5의 비율로 포함할 수 있으며, 또는 상기 감초 추출물 및 상기 복분자 추출물을 부피 기준으로 5:3 내지 5:4의 비율로 포함할 수 있다. 상기 감초 추출물 및 상기 복분자 추출물의 혼합 비율은 구강용 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 조절될 수 있다.

또한, 상기 구강용 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 상기 복분자 추출물을 0.5 내지 20 중량%, 또는 1 내지 10 중량%로 포함할 수 있으며, 감초 추출물을 0.5 내지 20 중량%, 또는 1 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 상기 복분자 추출물 및 감초 추출물의 함량은 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 적절히 조절될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 구강 미생물은 스트렙토코커스 속, 락토바실러스 속, 액티노바실러스 속, 아그레가티박터 속, 포르피로모나스 속, 타네렐라 속, 트레포네마 속, 프레보텔라 속 및 후소박테리움 속으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 구강 미생물은 스트렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 살리바리우스, 스트렙토코커스 고르도니, 스트렙토코커스 소브리누스, 스트렙토코커스 상기스, 스트렙토코커스 파이오진스, 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 카세이, 액티노바실러스 비스코수스, 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스, 포르피로모나스 진지발리스, 타네렐라 포르시시아, 트레포네마 덴티콜라, 프레보텔라 인터메디아, 후소박테리움 뉴클레아툼으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 구강용 조성물에 사용된 감초 추출물 및 복분자 추출물은 상기 바이오필름 형성 억제용 조성물에 이용된 것과 동일한 추출 방법에 의하여 제조될 수 있다.

본 발명의 구강용 조성물은 유효성분으로서 감초 추출물 및 복분자 추출물을 포함하는 이외에 구강용 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 약효성분, 연마제, 습윤제, 결합제, 기포제, 감미제, 방부제, 향미제, 색소, 용제, 증백제, 가용화제 또는 pH 조정제를 포함할 수 있다.

약효성분은 충치 예방, 치주질환 예방, 치은염 예방, 구취 제거 등의 효과를 위한 것으로 불화물, 염화아연, 클로르헥시딘, 아미노카프론산, 트라넥사민산, 염화세틸피리디움, 염화피리독신, 트리클로산, 초산토코페롤, 일불소인산나트륨 등을 포함하나, 이에 제한되지 아니하며 이들을 단독으로 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물에 함유되는 감초 추출물 및 복분자 추출물은 한약재로 이용되는 천연 추출물로, 상기 감초 추출물 및 복분자 추출물의 혼합물은 각각의 단독 추출물과 비교하여 미생물의 생장, 글루코실트랜스퍼라제 활성 및 바이오필름 형성을 억제하는 효능이 현저하게 우수하기 때문에 바이오필름 형성 억제 용도 및 구강 위생 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 감초 50% 에탄올 추출물 및 복분자 열수 추출물 혼합물이 스트렙토코커스 뮤탄스 GS-5의 생장에 미치는 영향을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 감초 50% 에탄올 추출물 및 복분자 열수 추출물 혼합물의 혼합 비율에 따른 바이오필름 형성 억제 효능을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 감초 50% 에탄올 추출물 및 복분자 50% 에탄올 추출물 혼합물이 스트렙토코커스 뮤탄스 GS-5의 생장에 미치는 영향을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 감초 50% 에탄올 추출물 및 복분자 50% 에탄올 추출물 혼합물의 혼합 비율에 따른 바이오필름 형성 억제 효능을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 감초 50% 에탄올 추출물 및 복분자 열수 추출물 혼합물의 글루코실트랜스퍼라제 활성 억제 효능을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 감초 50% 에탄올 추출물 및 복분자 50% 에탄올 추출물 혼합물의 글루코실트랜스퍼라제 활성 억제 효능을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 감초 추출물 및 복분자 추출물의 제조

1-1: 복분자 추출물의 제조

복분자(국내산)는 경동시장 내의 지운당한약국(대한민국, 서울)에서 구입하여 1 ㎜ 이하의 크기로 분쇄하였다. 분쇄한 복분자에 각각의 용매(물 또는 50% 에탄올)를 첨가하였으며, 복분자와 용매의 양은 1:10 비율(복분자 1 g당 용매 10 ㎖)로 하였다. 에탄올을 용매로 이용한 경우 50℃ 항온 수조에서 추출하였고, 물을 용매로 이용한 경우 열수(100℃)에서 3시간 동안 추출하였다. 이후 여과지를 사용하여 추출물을 1차 여과하고, 여과된 1차 추출물의 양을 측정하였다. 측정 결과 복분자 열수 추출물의 경우 추출 수율은 24.4%이고, 추출물 농도는 4.88 g/L였다. 복분자 열수 추출물은 추가적인 처리 없이 효소 활성 억제 능력 측정에 사용하였다.

50% 에탄올 추출물은 감압 회전 농축기를 이용하여 여과된 1차 추출물에서 에탄올을 증발시켰다. 다음으로 최종 10%의 양이 남을 때까지 추출물을 농축시킨 후 감소한 추출물의 부피만큼 물을 첨가하였다. 원심분리를 통하여 물에 용해되지 않는 고형분을 제거하고, 상등액만을 취하여 글루코실트랜스퍼라제 활성 억제 능력 측정을 위한 시료로 사용하였다. 복분자 50% 에탄올 추출물의 추출 수율 14%이고, 추출물 농도 2.8 g/L이다. 복분자 열수 추출물 및 50% 에탄올 추출물은 시린지 필터(syringe filter; 0.20 ㎛ pore size)로 여과하여 실험에 이용하였다.

1-2: 감초 추출물의 제조

용매로 50% 에탄올을 이용하여 실시예 1-1과 동일한 방법으로 1차 추출물을 제조하고, 여과된 1차 추출물을 감압 회전 농축기를 이용하여 분무 건조하였다(추출 수율 19.5%). 감초 50% 에탄올 추출물 분말 5 ㎎을 증류수 1 ㎖에 용해시킨 후 원심분리를 통하여 물에 용해되지 않는 고형분을 제거하고, 상등액만을 취하여 실험에 이용하였다.

실시예 2: 감초 추출물 및 복분자 추출물 혼합물의 S. mutans GS -5 생장 및 바이오필름 생성 억제 효능 측정

스트렙토코커스 뮤탄스 GS-5(Streptococcus mutans GS-5; 이하 S. mutans GS-5로 표기함) 균주는 LG생활건강 기술연구원(대전, 대한민국)에서 분양받아 BHI 배지(Brain Heart Infusion medium, Bacto^TM,BD Biosciences)에서 배양하였다. S. mutans GS-5 배양에 이용한 배지의 조성을 하기 표 1 및 표 2에 기재하였다.

BHI 배지 (100 ㎖)	Brain Heart Infusion	3.7 g
	(agar)	1.5 g
	물	up to 100 ㎖

BHI + 1% sucrose 배지 (100 ㎖)	Brain Heart Infusion	3.7 g
	sucrose	1.0 g
	물	up to 100 ㎖

S. mutans GS-5를 BHI 플레이트(agar plate)에 도말(streaking)한 후 37℃에서 2일 동안 배양하였다. 플레이트에서 단일 군집(single colony)을 하나 취하여 BHI 배지 2.5 ㎖에 접종하고, 37℃에서 1일 동안 정치배양(stationary culture)하였다.

96-웰 폴리비닐 클로라이드(polyvinyl chloride, PVC) 마이크로플레이트에 5 ㎎/㎖ 농도의 감초 50% 에탄올 추출물을 5 ㎕씩 분주하고, 4.88 ㎎/㎖ 농도의 복분자 열수 또는 2.8 ㎎/㎖ 농도의 50% 에탄올 추출물은 비율에 맞게 0.5, 1, 2, 3, 4 및 5 ㎕씩 분주하였다. 1% 설탕을 함유하는 BHI 배지를 추가로 분주하여 최종 부피를 100 ㎕로 맞추었다.

다음으로 각각의 웰에 상기 정치배양한 S. mutans GS-5를 OD₆₀₀이 0.05가 되도록 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 OD₅₉₅에서 흡광도(optical density, OD; absorbance)를 측정하여 S. mutans GS-5의 생장 정도를 확인하고, 플레이트에서 배양액을 제거한 후 증류수로 3번 부드럽게 세척하였다. 이후 바이오필름을 염색하기 위하여 각각의 웰에 1% 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 용액 100 ㎕를 분주하여 15분 동안 상온에서 방치하였다. 15분 후 증류수로 3번 세척하고, 크리스탈 바이올렛을 용출시키기 위하여 95% 에탄올 100 ㎕를 첨가하여 15분 동안 방치하였다. 이후 바이오필름의 양을 정량하기 위하여 마이크로플레이트 리더(Microplate reader)를 이용하여 OD₅₉₅에서 흡광도를 측정하였다.

측정 결과, 도 1에 나타난 것과 같이 감초 50% 에탄올 추출물을 단독으로 처리한 경우 S. mutans GS-5 생장이 현저하게 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 복분자 열수 추출물을 단독으로 처리한 경우 생장 억제 효과는 확인할 수 없었다. 그러나 감초 50% 에탄올 추출물 및 복분자 열수 추출물을 5:0.5 내지 5:5의 부피비로 혼합한 경우 S. mutans GS-5의 생장 억제 효과가 상승적으로 증가하였으며, 감초 50% 에탄올 추출물 및 복분자 열수 추출물을 1:1의 비율로 혼합하였을 때 약 95%의 생장 억제 효과가 나타나는 것을 알 수 있었다.

또한, 도 3에 나타난 것과 같이 감초 50% 에탄올 추출물 및 복분자 50% 에탄올 추출물을 혼합한 경우 생장 억제 효과가 현저하게 증가하였으며, 감초 50% 에탄올 추출물 및 복분자 50% 에탄올 추출물을 1:1의 비율로 혼합하였을 때 약 92%의 생장 억제 효과가 나타나는 것을 알 수 있었다.

바이오필름 형성 억제와 관련하여, 도 2에 나타난 것과 같이 감초 50% 에탄올 추출물을 단독으로 처리한 경우 약 35% 정도 바이오필름 형성이 억제되었다. 복분자 열수 추출물을 단독으로 처리한 경우 약 19% 정도 억제되었으며, 감초 50% 에탄올 추출물 및 복분자 열수 추출물을 혼합하는 경우 바이오필름 형성 억제 효과가 현저하게 증가하였다. 다만, 복분자 열수 추출물의 혼합 비율에 따른 차이는 없었으며, 평균 약 80%의 바이오필름 형성 억제 효과가 나타나는 것을 확인하였다.

또한, 도 4에 나타난 것과 같이 감초 50% 에탄올 추출물 및 복분자 50% 에탄올 추출물을 혼합한 경우 각각의 추출물을 단독으로 처리한 경우보다 바이오필름 형성 억제 효과가 증가하였으며, 복분자 추출물의 혼합 비율이 증가할수록 바이오필름 형성 억제 효과도 상승적으로 증가하였다. 감초 50% 에탄올 추출물을 단독 처리한 경우 약 27%, 복분자 50% 에탄올 추출물을 단독 처리한 경우 약 28% 정도 바이오필름 형성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 감초 추출물 및 복분자 추출물을 5:4 비율로 혼합한 경우 약 68%, 5:5 비율로 혼합하였을 때 약 63%의 바이오필름 형성 억제 효과를 확인할 수 있었다.

상기 실험 결과를 통하여 감초 추출물 및 복분자 추출물을 혼합하여 사용하는 경우 S. mutans GS-5의 생장 억제 효과 및 바이오필름 형성 억제 효과가 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 효과는 감초 50% 에탄올 추출물과 복분자 열수 추출물을 혼합한 경우 더 우수하였다.

실시예 3: 감초 추출물 및 복분자 추출물 혼합물의 글루코실트랜스퍼라제 활성 억제 효능 측정

3-1: S. mutans GS -5에서 글루코실트랜스퍼라제 효소 생산 및 분리

S. mutans는 글루코실트랜스퍼라제(glucosyltransferase, 이하 GTase로 표기함)를 세포 외부로 분비하기 때문에 GTase를 수득하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

S. mutans GS-5를 BHI 액체배지(BHI broth) 40 ㎖에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 분광광도계(Spectrophotometer)로 600 nm에서 흡광도(optical density, OD; absorbance)를 측정하고, 새로운 BHI 액체배지 1 L에 OD₆₀₀이 0.05가 되도록 접종하였다. 새로운 BHI 액체배지에서 S. mutans GS-5를 24시간 동안 배양하여 GTase를 생산하도록 하였다.

24시간 후에 1,500 x 10 g의 조건으로 4℃에서 10분 동안 배양액을 원심분리하여 GTase가 포함된 상등액을 수거하였다. 단백질을 침전시키기 위하여 수거한 상등액을 냉장보관(4℃)한 95% 에탄올과 1:1의 비율로 혼합하고, 24시간 동안 4℃ 냉장고에서 반응시켰다. 다음으로 1,500 x 10 g의 조건으로 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고, 침전된 단백질만을 수거하였다. 수거한 단백질을 60 mM 칼륨 인산 완충용액(potassium phosphate buffer; pH 6.8) 10 ㎖를 이용하여 다시 용해시킨 후 세척하고, 상기와 동일한 조건으로 원심분리하였다. 이후 상등액을 제거하고 침전물을 다시 60 mM 칼륨 인산 완충용액 10 ㎖에 용해시킨 후 1 ㎖씩 분주하여 -20℃에 보관하였다.

3-2: 감초 추출물 및 복분자 추출물 혼합물의 GTase 활성 억제 능력 측정

상기 실시예 3-1에서 분리한 GTase를 이용하여 감초 추출물 및 복분자 추출물 혼합물의 효소 활성 억제 능력을 측정하였다.

GTase는 설탕을 포도당으로 분해하고, 포도당을 글루칸으로 전환시키기 때문에 효소 반응을 위한 기질로 설탕이 포함된 60 mM 칼륨 인산 완충용액(1.25% 설탕 및 0.025% NaN₃ 포함, pH 6.8)을 이용하였다. 구체적인 효소 반응 조건을 하기 표 3에 기재하였으며, 37℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 power 4에서 5초 동안 부착된 글루칸을 풀어주었다. 1,500 x 10 g 조건으로 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고, 침전물에 증류수 200 ㎕를 첨가하였다. 초음파 분쇄기를 이용하여 power 4에서 3초 동안 소니케이션(sonication)을 실시하여 침전물을 다시 풀어주었다. 96-웰 폴리스티렌 마이크로플레이트(96-well polystyrene microplate)에 200 ㎕씩 분주하고, 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 흡광도 540 ㎚에서 혼탁도를 측정하여 생성된 글루칸의 양을 측정하였다.

(단위: ㎕)	5:0	5:0.5	5:1	5:2	5:3	5:4	5:5	0:5
기질	800	800	800	800	800	800	800	800
효소	50	50	50	50	50	50	50	50
감초 추출물	50	50	50	50	50	50	50	0
복분자 추출물	0	5	10	20	30	40	50	50
증류수	100	95	90	80	70	60	50	100

그 결과, 도 5 및 도 6에 나타난 것과 같이 감초 추출물을 단독으로 사용하였을 때 GTase 활성 억제 효과가 거의 없었으며, 복분자 추출물을 단독으로 처리하였을 때 열수 추출물은 약 25%, 50% 에탄올 추출물은 약 35%의 GTase 활성 억제 효과를 나타내었다. 감초 추출물 및 복분자 추출물을 혼합한 경우 복분자 추출물을 단독으로 처리한 경우와 비교하여 활성의 차이가 거의 없었다.

상기 실험 결과는 감초 추출물 및 복분자 추출물의 혼합물이 GTase 활성을 억제하는 이외에 다른 방법을 통하여 바이오필름 생성을 억제할 수 있음을 의미한다.

실시예 2 및 실시예 3의 결과를 통하여 감초 추출물 및 복분자 추출물을 혼합하여 사용하는 것이 추출물 각각을 단독으로 사용하는 경우와 비교하여 미생물 생장, 글루코실트랜스퍼라제 활성 및 바이오필름 형성을 억제하는 효능이 상승적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

감초 추출물 및 복분자 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이오필름 형성 억제용 조성물로서, 상기 감초 추출물은 에탄올을 용매로 하여 추출된 것이고, 상기 복분자 열매 추출물은 정제수를 용매로 하여 추출된 것인 바이오필름 형성 억제용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 감초 추출물 및 상기 복분자 열매 추출물은 부피 기준으로 5:0.5 내지 5:5의 비율인 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 바이오필름은 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 액티노바실러스 속(Actinobacillus sp.), 아그레가티박터 속(Aggregatibacter sp.), 포르피로모나스 속(Porphyromonas sp.), 타네렐라 속(Tannerella sp.), 트레포네마 속(Treponema sp.), 프레보텔라 속(Prevotella sp.) 및 후소박테리움 속(Fusobacterium sp.)으로 이루어진 군에서 선택되는 미생물에 의하여 형성된 것인 조성물.
제4항에 있어서, 상기 미생물은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 스트렙토코커스 고르도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 스트렙토코커스 상기스(Streptococcus sanguis), 스트렙토코커스 파이오진스(Streptococcus pyogenes ), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 액티노바실러스 비스코수스(Actinobacillus viscosus), 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 타네렐라 포르시시아(Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia) 및 후소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
감초 추출물 및 복분자 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 치아의 플라그 형성 억제용 구강 조성물로서, 상기 감초 추출물은 에탄올을 용매로 하여 추출된 것이고, 상기 복분자 열매 추출물은 정제수를 용매로 하여 추출된 것인 치아의 플라그 형성 억제용 조성물.
삭제
제6항에 있어서, 상기 감초 추출물 및 상기 복분자 열매 추출물은 부피 기준으로 5:0.5 내지 5:5의 비율인 것인 조성물.
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