KR101051362B1

KR101051362B1 - 생약재 발효산물을 포함하는 아토피성 피부염 치료 및/또는예방용 조성물

Info

Publication number: KR101051362B1
Application number: KR1020080084638A
Authority: KR
Inventors: 김정진
Original assignee: (주)콤비메드
Priority date: 2007-08-31
Filing date: 2008-08-28
Publication date: 2011-07-22
Also published as: KR20090023236A

Abstract

본 발명은 생약재의 발효물을 함유하는 아토피성 피부염 치료 ,개선, 및/또는 예방용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 조성물은 안전하고 아토피성 피부염의 치료 및/또는 예방에 유용한 효과를 가진다.

발효, 생약재, 아토피, 유산균

Description

생약재 발효산물을 포함하는 아토피성 피부염 치료 및/또는 예방용 조성물{Composition for treating and/or preventing atopic dermatitis comprising fermented herb product}

본 발명은 생약재 발효산물을 포함하는 아토피성 피부염 치료 및/또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

아토피성 피부염(atopic dermatitis)은 정상인에게는 해가 되지 않은 유발인자들에 피부가 과민반응상태를 보임으로써 만성적으로 피부에 염증이 생기는 질병이다. 즉 아토피성 피부염은 세균, 바이러스, 곰팡이 등에 의한 감염, 꽃가루 등과 같은 특정물질, 음식물, 인공적 화학물질 등에 면역 체계가 과민반응하여 발생하는 것으로 알려져 있다.

이러한 면역반응에는 T 세포가 관여하는데 T 세포가 분비하는 두 가지 유형인 Th1 사이토카인과 Th2 사이토카인의 불균형상태가 아토피성 피부염의 병리기전에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지고 있다. 대표적인 Th1 사이토카인으로는 인터페론감마 (IFN-gamma, IFN-γ)을 들 수 있으며 세포매개형 면역반응에 관여하고, Th2 사이토카인은 인터류킨-4(IL-4), IL-5, IL-13을 말하며 항체 면역반응을 담당 한다. 아토피성 피부염이나 다른 알러지 질환은 인터페론-감마(IFN-γ)의 유도능이 부족하여 상대적으로 인터루킨-4 등과 같은 Th2 사이토카인 분비가 과다 형성되는 것이 특징적이다 (Jujo K. 등, Decreased interferone gamma and increased interleukin-4 production in atopic dermatitis promotes IgE synthesis. J Allergy Clin Immunol 1992; 90: 323-31 및 Tang ML. 등, Interleukin-4 and interferone-γ production in atopic and non-atopic children with asthma. Clin Exp Allergy 1995; 25: 515-21 참조).

또한 대부분의 아토피성 피부염 환자들의 피부에는 포도상구균이 매우 많이 군집하고 있는데 대략 10⁷CFU/㎠으로서 정상인에 비해 200배나 높은 수치이다. 이러한 균 때문에 계속 면역글로불린 E(IgE)가 만들어지고, 이들 세균이 분비하는 세라미데이스(ceramidase)는 피하의 보습능력을 유지하게 하는 세라마이드(ceramide)를 분해시켜 지속적으로 가려움을 유도하기 때문에 피부염을 악화시킨다. Th2 사이토카인인 IL-4는 이들 세균이 피부에 달라붙는 것을 용이하게 하기 때문에 일단 아토피성 피부염이 시작하면 포도상구균은 겉잡을 수 없을 정도로 증식하게 된다(Donald YM. 등, Infection in atopic dermatitis. Curr Opin Pediatr 2003; 15: 399-404 및 Chos SH. 등, Preferential binding of Staphylococcus aureus to skin sites of Th2-mediated inflammation in a murine model. J Invest Dermatol 2001; 116: 658-63 참조).

이러한 아토피성 피부염에 대한 표준 치료법은 면역억제제와 생체반응조절물 질 ( biological resonse modifer, BRM) 등이 있는데 면역억제제로는 스테로이드나 칼슈뉴린 억제제 계열( 타크로리무스(tacrolimus, Protopic™, 또는 피메크로리무스pimecrolimus, Elidel™)이 있으며 생체반응조절물질로는 인터페론 감마, 항히스타민 등이 대표적이다. 그러나 이들은 소염작용이 신속하나 사용을 중지시 증상이 악화되기도 하고 피부 면역계를 차단하기 때문에 도리어 세균감염의 위험을 증가시켜서 장기간 사용할 수 없으며 이로 인해 대체할 수 있는 보완제품의 필요성이 절실한 실정이다.

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 많이 사용되어 안전성이 확인된 생약재를 발효하여 이것을 아토피성 피부염의 치료에 사용하고자 하는 생약재 발효산물을 함유한 아토피성 피부염 치료 및/또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 아토피성 피부염을 치료하는 유산균을 제공하는 것이다.

보다 구체적으로 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 아토피성 피부염 질환의 특징인 Th1 사이토카인의 분비 감소를 개선하는 생약재 발효산물 및/또는 유산균을 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 결명자, 고본, 곽향, 길경, 노근, 단삼, 당귀, 맥문동, 맥아, 목향, 방풍, 백선피, 백지, 백출, 상기생, 소회향, 속단, 승마, 신곡, 육종용, 의이인, 적복령, 지모, 천궁, 천마, 천문동, 천화분, 청상자, 택사, 향부자, 현호색, 형개, 호마인 및 황금으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 생약재의 발효 산물을 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 락토코커스 락티스 KCTC11157BP 또는 락토바실러스 플란타럼 KCTC11158BP을 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 한약재 발효 산물과 상기 균주를 포함하는 아토피성 피 부염 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 한약재 발효물은 Th1 사이토카인인 IFN-γ의 분비를 증가시킴으로써 아토피성 피부염의 치료 및 예방에 유용하다.

또한 본 발명은 결명자, 고본, 곽향, 길경, 노근, 단삼, 당귀, 맥문동, 맥아, 목향, 방풍, 백선피, 백지, 백출, 상기생, 소회향, 속단, 승마, 신곡, 육종용, 의이인, 적복령, 지모, 천궁, 천마, 천문동, 천화분, 청상자, 택사, 향부자, 현호색, 형개, 호마인 및 황금으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 생약재의 발효 산물을 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 개선용 화장품을 제공한다.

또 본 발명은 락토코커스 락티스 KCTC11157BP 또는 락토바실러스 플란타럼 KCTC11158BP을 포함하는 아토피성 피부염 개선용 화장품을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기의 화장품은 제6항의 균주를 포함하는 더욱 포함하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 설명한다.

본 발명은 자연계에서 분리한 유산균주 30 여종을 배양하고 그 중 마우스 비장면역세포를 자극하여 Th1 세포의 감마인터페론 생산을 증가시키는 2종의 균주를 분리하고 API 50CHL kit(BIOMERIEUX, 프랑스) 및 여러 생리활성을 분석하여 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis CM101, KCTC11157BP), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum CM102, KCTC11158BP)로 동정하였다(도 1 참조). 이 균주를 2007년 7월 31일 대한민국 한국생명공학연구원 생물자원센터소재 유전자은행에 각각 락토코커스 락티스 CM-101(KCTC 11157BP)과 락토바실러스 플란타럼 CM-201(KCTC 11158BP)로 기탁하였다.

본 발명의 생약재 유산균 발효물의 아토피성 피부염에 대한 치료 또는 예방 효과는 여러 가지 방법으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 아토피성 피부염에 대한 효과를 평가하기 위하여 해당 유산균 발효물을 오브알부민으로 감작한 마우스 비장에서 분리한 면역세포에 처리하여 생성된 IFN-γ의 양을 대조군과 대비하여 비교 평가함으로써 유산균의 아토피성 피부염에 대한 치료 또는 예방 효과를 확인할 수 있다. 또한 아토피 피부염 증상이 있는 환자의 말초 혈액 단핵세포를 분리한 후 감소되어 있는 Th1 세포와 증강되어 있는 Th2 세포의 사이토카인의 양을 조절함으로써 아토피 증상의 치료효과를 확인할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 발효물 외에 적절한 담체, 부형제, 보조 유효 성분 등과의 혼합에 의하여 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 표준 담체를 사용하여 동결 건조시키는 등 공지된 방법을 사용하여 분말제 및 과립제로 제형화 될 수 있으며, 통상적인 정제 및 캡슐화 방법을 사용하여 정제 또는 캡슐 형태로도 제형화 될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 공지의 방법을 사용하여, 위장을 통과한 뒤 소장에 도달하여 활성 성분인 미생물이 신속하게 장내에 방출되도록 장용 피복되어 제품화될 수 있다. 본 발명의 조성물의 제형에 사용되기에 적합한 담체, 부형제 및 희석제에는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아검, 인산칼슘, 알긴산염, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 규산칼슘, 미결정셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸 및 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘, 광유 등이 포함된다. 본 발명의 조성물의 제품화를 위하여 윤활제, 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 방부제, 감미제 또는 향미제를 추가로 더 포함할 수 있다.

또 본 발명의 조성물은 아토피성 피부염의 치료 및/또는 예방을 위한 식음료, 화장품, 연고제, 경구투여 제형 등으로 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 일 실시예로 발효 생약재 분말 또는 생약재 추출물 등의 생약재 성분 이외에 여러 가지 첨가제를 함유하는 정제, 과립제, 환제, 액제, 연고제, 크림제 등의 제형으로 제제화 될 수 있다.

아토피성 피부염의 치료 효능을 평가하기 위하여 in vivo, ex vivo 또는 in vitro의 여러 가지 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 마우스의 비장세포를 분리하여 배양하되 T 세포 마이토젠(mitgogen)과 상기 생약재 발효물을 반응시켜 사이토카인 발생의 변동 정도를 측정함으로써 아토피성 피부염 치료 효능을 평가할 수도 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 아토피성 피부염 치료용 조성물에 함유되는 생약재는 여러 가지 형태로 조성물에 함유될 수 있다. 예를 들어, 생약재를 완전히 건조한 후 미세하게 분말화하여 본 발명의 조성물에 함유시킬 수도 있고 용매를 사용하여 추출한 후 이 추출물을 본 발명의 조성물에 함유시킬 수도 있다. 본 발명의 생약재를 추출하기 위한 추출방법으로는 상대적으로 낮은 온도에서 일정 시간 침출하는 냉침법, 냉침법과 유사하나 35~45℃의 온도에서 침출하는 온침법, 60~120℃의 온도에서 침출하는 가열추출법, 퍼콜레이터(percolater)를 사용하는 퍼콜레이션법, 증류냉각추출법등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 의한 상기 조성물 또는 균주는 아토피 피부염 치료약제 및 치료·예방용 건강기능식품으로 활용될 수 있으며, 용법에 따라 연고나 로션, 크림, 세안제 등의 외용제 형태를 취할 수도 있고, 경구 투여용 약제, 기능성 식품 등의 내복제 형태를 취할 수도 있다. 상기 형태의 약제, 식품 또는 화장품 등의 제조는 당업자라면 누구라도 해당 기술을 이용하여 용이하게 실시할 수 있을 이다. 또한, 이때 필요에 따라 상기 추출물 또는 조성물에 다양한 보조 생약제, 비타민, 미네랄, 식이섬유 및 기타 의약용-식품용 보조제(예컨대, 부형제, 증강제, 코팅제 등) 등을 혼합할 수 있음은 당업자에게 당연할 것이다.

특히 상기 조성물을 화장료 조성물에 사용하는 경우에는, 상기한 한약재의 발효물의 유효성분 외에 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함한다. 예를 들어 점증제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장품은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우 더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 500 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 한약재의 발효산물은 기존의 발효하지 않은 한약재를 사용한 것과 비교하여도 아토피성 피부염의 치료 및/또는 개선에 우수한 효과를 보였으며, 본 발명의 아토피성 피부염 치료용 조성물은 통상적으로 사용되어 안전성이 입증된 생약재를 발효하여 이용하므로 안전성도 우수하다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석돼서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.

실시예 1: 유산균의 분리 및 배양

본 발명에 사용된 유산균주는 자연계에서 분리한 미생물로 김치 및 발효 식품으로부터 아가희석 법을 이용하여 순순 분리한 미생물을 유산균 분리 배지인 LACTOBACILLI MRS BROTH (DIFCO CO.)를 이용하여 37도의 온도로 2일간 CO₂ 배양기에서 배양하며 분리하였다. 분리된 미생물은 API50CHL, Strep. kit (BIOMERIEUX, FRANCE)를 이용하여 테스트 후 유산균주에 속하는 미생물만을 선별하였다. 선별된 유산균주는 생약재와 혼합 배양하여 그 발효능이 우수한 유산균주를 선별하였으며 발효능이 우수한 유산균주들 중 발효물이 마우스 췌장 세포의 사이토카인 분비를 강하게 유도하는 2개 균주를 분리하여 락토코커스 락티스 CM101 및 락토바실러스 플란타럼 CM201로 명명하였다. 두 균주 모두 37도에서 최적 증식을 나타내었으며 편성혐기성의 특징을 보였고 당을 이용한 산생성 특성 또한 유산균주의 특징을 나타내었다(도 1).

실시예 2: 생약재의 발효

마우스 비장 세포의 인터페론 감마 생성을 촉진시키는 활성을 가진 한약재(결명자, 고본, 곽향, 길경, 노근, 단삼, 당귀, 맥문동, 맥아, 목향, 방풍, 백선피, 백지, 백출, 상기생, 소회향, 속단, 승마, 신곡, 육종용, 의이인, 적복령, 지모, 천궁, 천마, 천문동, 천화분, 청상자, 택사, 향부자, 현호색, 형개, 호마인 또는 황금) 1.5kg을 열수에서 추출하여 추출용액 6리터를 제조하였으며 이 추출용액을 동결건조기를 이용하여 생약재 건조분말을 제조하였다. 제조된 생약재 건조분말 2～5%를 함유한 용액에 MRS배지를 0.25%를 첨가하여 생약재 배지를 제조하였다. 제조된 배지를 3리터 Jar-fermentor 시스템 (KO-biotehc, 한국)을 이용하여 발효하였다. 유산균주는 CM101과 CM201을 사용하여 하루 전 배양된 유산균 배양액을 1% 첨가하였으며 37℃에서 조절 pH 6.0으로 배양하였다. 도2와 같이 혼한된 생약재를 포함한 배지에서 18～25시간에 유산균의 성장이 최적을 나타내었으며 이 시간을 발효시간으로 규정하였다. 발효 생약은 배양이 끝난 후 100℃에서 10분간 열처리하여 유산균을 비활성화하여 사용하였다.

실시예 3: 생약재의 발효물과 균주 분획 분리

실시예 2를 통하여 제조한 비활성화 발효 생약은 생약과 유산균 및 유산균 발효에 의한 생약의 변환물질이 혼합되어 있는 성분으로 발효전 생약의 인터페론 감마 증가 활성이 발효에 의하여 크게 증가한 것을 확인하였으나(도 3) 구체적인 활성 성분을 규명하고자 발효액에 대한 분획별 분석을 위하여 열처리한 발효 생약을 6,000g에서 205분간 원심분리하여 유산균체 및 불용성 물질, 발효전환된 생약물질을 분리하였다. 생약재와 유산균주 및 전체 발효생약 (T), 원심분리하여 침전된 유산균체 (P), 발효 전환된된 생약성분(S)을 구분하여 상대적인 인터페론 감마 증강효과를 비교한 결과 (도 4) 유산균체 및 발효전환된 분획 모두에서 인터페론 감마가 모두 상승되는 결과를 얻을 수 있어 본 발명에서 이용된 유산균주는 생약재를 발효하여 면역활성을 조정하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 1:마우스 비장의 면역세포의 배양

Balb/c 마우스 비장을 분리하여 10% FBS(fetal bovine serum)와 1%의 항생제 및 항진균제가 든 RPMI1640 배지(Invitrogen, 미국)로 세척한 후 micro slide glass로 잘게 으깬 뒤 0.40 ㎛ nylon cell strainer로 여과하였다. 튜브로 옮긴 다음 1000 rpm으로 10분간 원심분리한 후에 적혈구 lysis buffer로 적혈구를 파괴 하였다. 다시 2회 원심분리를 한 후에 비장세포의 수를 트리판 블루 분석법(trypan blue assay)으로 결정하였다. 비장세포 현탁액과 트리판 블루 용액을 1:1로 혼합하여 잘 섞어준 다음 약 5분간 방치하고 트리판 블루 용액과 같은 색으로 염색이 된 죽은 세포와 전체 세포의 수를 hemocytometer로 계수하여 세포의 생존력(viability)을 결정한 후에 세포수를 1.5×10⁶/㎖로 조정하였다.

세포 수가 조정된 세포 현탁액을 0.5 ㎖씩 48 웰(well)에 시딩(seeding)한 후, PHA(Phytohemagglutinin, Sigma사, Cat. #L-8902, 미국)를 10 ㎍/㎖ 또는 anti-CD3e antibody (BD Pharmingen, 미국)를 1 ㎍/㎖씩 첨가하고 동시에 실시예 1에서 제조한 시료를 예비조사에서 얻은 최적의 농도로 첨가하였다. 48 시간 동안 배양 후 수집하고, 상등액을 원심분리한 후에 하기 사이토카인 분석 때까지 -20℃에서 보관하였다.

실험예 2: 오브알부민 감작한 마우스의 비장 면역세포 배양

8주령된 Balb/c 수컷 마우스에게 오브알부민(OVA) 알러지 감작을 유발하기 위해서 수산화알루미늄 (Al(OH)3)와 PBS를 동량으로 섞은 용액에 0.1%의 OVA를 넣은 후 7일 단위로 3회 복강내에 투여하여 감작하였다. 그후 마우스의 비장을 꺼내 5×10⁶/㎖로 조정하여 다시 OVA로 자극하고 동시에 한약, 유산균, 발효한약을 배양하였다. 72 시간 동안 배양 후 수집하고, 상등액을 원심분리한 후에 하기 사이토카인 분석 때까지 -20℃에서 보관하였다.

실험예 3: 사이토카인 분석

인터페론-감마(IFN-γ)를 측정하기 위하여 ELISA 방법을 이용하였다. 먼저, 96-웰 플레이트의 각 웰을 IFN-γ의 포획 항체(capture antibody, Pharmingen사, 미국)로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 이후 3회 세척하고, 10% FBS가 함유된 인산완충생리식염수(PBS)(블로킹 완충액)를 200 ㎕/웰 씩 넣고 상온에 1시간 동안 방치하여 블로킹하였다. 이것을 다시 3회 세척하여 블로킹 완충액을 완전히 제거한 후 블로킹 완충액에 희석한 샘플을 100 ㎕ 씩 분주한 후 상온에 2시간 동안 반응하게 하였다. 이것을 5회 세척하고 비오티닐화된 검출 항체(biotinylated detection antibody, Pharmingen사, 미국)를 넣고 1시간 상온에 배양한 후 7회 세척하였다. 이후 스트렙타비딘(streptavidin)-HRP 100 ㎕를 가하고, 30분 후에 1M H2SO4 50 ㎕를 첨가하였다. 그 후 마이크로플레이트 리더 (Tecan사, 오스트리아)로 파장 450-570 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 시료안의 인터페론 감마 농도는 농도가 알려진 스탠더드를 구입하여 광학밀도값과 스탠더드 농도간의 관계식을 구해 결정하였다. 모든 실험은 3회 반복해서 얻은 결과의 일부이다.

본 발명에서 유의성 검증은 SPSS 11.0을 이용하여 independent T test로 결정하였다.

상기 전술한 실험에 의해 측정된 IFN-γ의 분비량 중 치료 효과 평가에 대한 결과를 도 3 이하에서 나타내었다 하기 도면들에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 한약재의 발효산물들과 유산균들은 대조군과 대비하여 IFN-γ의 분비량을 증가시킨다는 것을 알 수 있고 이러한 결과로부터 본 발명의 발효 한약재들과 관련 유산균들이 아토피성 피부염의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다는 것을 알 수 있다.

실험예 4: 아토피성 피부염의 치료효과 평가

<연고의 제조>

아토피성 피부염의 치료효과 평가를 위하여 다음과 같이 본 발명의 조성물을 함유하는 연고를 제조하였다. 백색바셀린 250 g 및 스테아릴알코올 200 g을 수욕 중에서 가온 용융, 혼합하여 75℃로 하고, 이것에 파라옥시안식향산메칠 1 g, 파라옥시안식향산프로필 1 g, 프로필렌글리콜 120 g, 모노스테아린산글리세린 10 g, 폴리옥시에칠렌경화피마자유 40 g 및 본 발명의 실시예에서 제조한 본 발명 발효 생약재의 동결건조 가루 5 g을 넣고 약 75℃로 가온하여 제조한 적당량의 정제수를 첨가하고 강하게 교반하였다. 전체 무게를 1000 g으로 한 후 다시 한번 강하게 교반하여 유액으로 만든 다음 냉각하고 굳을 때까지 교반하였다.

<아토피성 피부명의 치료효과 평가>

전술한 바와 같이 제조한 본 발명의 조성물을 함유하는 연고를 6～8개월 동안 시험부위에 바르게 한 후 아토피성 피부염이 개선되는 정도를 평가하였다(도 6).

환자들은 유아에서부터 어린이, 청소년 그리고 성년까지 다양한 군을 실험하였으며, 각각의 사진결과에서 나타나는 바와 같이, 본 발명의 조성물들은 아토피성 피부염의 치료 및/또는 개선에 탁월한 효능이 있음을 알 수 있다.

도 1은 본 발명에서 제공하는 유산균주인 CM101(a)과 CM201(b)의 탄수화물 이용성에 관한 특징과 API50CHL kit 분석을 통한 동정결과를 나타낸 것임.

도 2는 발효조를 이용하여 생약발효시의 유산균의 증시상태를 나타낸 도면임

도 3a는 마우스 비장세포를 1× 10⁶/well에 접종한 후 LP균이나 한약으로 발효한 L균을 1.0 × 10 ⁵ (□), 5.0 × 10 ⁵ (▨), 1.0 × 10 ⁶ (■)씩 처리하여 48시간 배양하여 그 상등액의 IFN-γ을 ELISA방법으로 측정하였다. 각 숫자는 발효한약을 나타낸다(1: 형개, 2: 당귀, 3: 의이인, 4: 지모, 5: 곽향, 6: 천문동, 7: 택사, 8: 고본, 9:결명자, 10: 천궁). 1번에서 10번의 모든 샘플은 p <0.05로 통계적으로 유의하였다 ( 그림엔 표시하지 않음). 동량의 균끼리 비교했을 때 4번 지모발효의 1.0 × 10 ⁵샘플과 6번 천문동발효의 1.0 × 10 ⁵, 5 × 10 ⁵샘플, 8번 고본발효의 1.0 × 10 ⁵, 5.0 × 10 ⁵샘플에서만 IFN-γ.가 해당되는 수의 LP균보다 낮게 나오고 나머지 이하 모든 샘플은 IFN-γ가 높게 나왔다.

도 3b는 마우스 비장세포를 1.0 × 10 ⁶ /well에 접종한 후 발효전과 발효후 상태를 동결건조하여 동일농도를 PHA와 함께 48시간 배양하여 그 상등액의 IFN-gamma을 ELISA방법으로 측정하였다. 그림에서 (F)는 발효 후를 의미한다. 당귀는 발효 전이 더 우수한 효과를 보였으며 나머지는 발효후에 IFN-γ를 유도하는 힘이 강하게 나타났다.

도 4a는 마우스 비장세포를 1× 10⁶/well에 접종한 후 LP균, 한약으로 발효한 LP균(LP-T-I0), 발효한 한약을 원심분리하여 얻은 세포(LP-P-I0) 및 상등액 (LP-S-I0), 한약을 처리하고 48시간 배양하여 그 상등액의 IFN-gamma을 ELISA방법으로 측정하였다. 발효산물의 분획과 한약 농도는 예비조사에서 최적의 값을 얻은 것으로 정하였으며 발효물전체(T)와 세포(P)에는 균수를 표시하였다. 도 4a에서 I0는 백출, 황금, 맥문동이 동일 양 들어간 조성물을 나타내고, LP는 락토바실러스 플란타럼을 나타낸다, *: p<0.05,

도 4b 이하에서는 LP균과 각 개별 한약재 발효군 그리고 그 한약재 발효군의 효과를 비교하기 위하여 마우스 비장세포를 1× 10⁶/well에 접종한 후 LP균, 한약으로 발효한 LP균(T), 발효한 한약을 원심분리하여 얻은 세포(P)를 처리하여 48시간 배양 후 그 상등액의 IFN-γ을 ELISA방법으로 측정하였다. 발효산물의 분획과 한약 농도는 예비조사에서 최적의 값을 얻은 것으로 정하였으며 발효물전체(T)와 세포(P)에는 균수를 표시하였다. LP는 락토바실러스 플란타럼을 나타낸다, *: p<0.05 , 그림에서 4b는 백출, 4c는 황금, 4d는 맥문동, 4e는 질경, 4f는 작약 그리고 4g는 지황을 각각 나타낸다.

도 5a는 마우스 비장세포를 1× 10 ⁶/well에 접종한 후 SL균, 한약으로 발효한 SL균(SL-T-I0), 발효한 한약을 원심분리하여 얻은 세포(SL-P-I0) 및 상등액(SL-S-I0), 한약(I0)을 처리하고 48시간 배양하여 그 상등액의 IFN-gamma을 ELISA방법으로 측정하였다. 발효 산물의 분획과 한약 농도는 예비조사에서 최적의 값을 얻은 것으로 정하였으며 발효물 전체(T)와 세포(P)에는 균수를 표시하였다. 도 5a에서 I0는 백출, 황금, 맥문동이 동일 양 들어간 조성물을 나타내고, SL은 락토코커스 락티스를 나타낸다, *: p<0.05 *:

도 5b 이하에서는 SL균과 각 개별 한약재 발효군 그리고 그 한약재 발효군의 효과를 비교하기 위하여 마우스 비장세포를 1× 10 ⁶/well에 접종한 후 SL균, 한약으로 발효한 SL균(T), 발효한 한약을 원심분리하여 얻은 세포(P)를 처리하여 48시간 배양후 그 상등액의 IFN-γ을 ELISA방법으로 측정하였다. 발효 산물의 분획과 한약 농도는 예비조사에서 최적의 값을 얻은 것으로 정하였으며 발효물 전체(T)와 세포(P)에는 균수를 표시하였다. 도 5b 등에서 SL은 락토코커스 락티스를 나타낸다, *: p<0.05, 그림에서 5b는 백출, 5c는 맥문동, 5d는 질경, 5e는 작약 그리고 5f는 지황을 각각 나타낸다.

도 6은 마우스 비장세포를 1× 10 ⁶/well에 접종한 후 한약과 LP균으로 발효하여 얻은 상등액(LP(S)), SL균으로 발효하여 얻은 상등액(SL(S))을 농도별로 처리하여 48시간 배양후 그 상등액의 IFN-γ을 ELISA방법으로 측정하였다. 도 6은 가장 대표적인 한약재로 지황을 선택하여 실험한 결과이다. SD는 작아서 표시되지 않았다.

도 7은 오브알부민을 마우스에 일주일 단위로 3회 복강주사하여 감작시킨 후 마우스의 비장세포를 5× 10 ⁶/well 농도로 접종한 후 유산균, 한약, 발효한약과 함께 오브알부민으로 72시간 재감작해서 얻은 상등액의 IFN-γ을 ELISA방법으로 측 정하였다. 발효한약을 처리한 비장세포만이 IFN-γ를 유의성있게 증가하였다.

도 8a에서 j는 본 발명의 발효 한약재를 실험예 3과 같이 제조하여서 외용제로 사용한 사진임, 사진에서 a는 지모와 황금 발효물 각각, b는 백출, 황금, 맥문동 발효물 각각, c와 d는 백출, 황금 및 맥문동의 혼합 발효물(I0), e는 황금과 맥문동의 혼합 발효물, f는 백출과 황금의 혼합 발효물, g는 백출과 황금의 혼합 발효물, h는 백출, 황금 및 질경의 혼합발효물, i는 백출과 맥문동의 혼합발효물, 그리고 j는 백출, 황금 및 맥문동의 혼합 발효물의 상등액으로 처리한 결과이다.

Claims

형개, 의이인, 지모, 곽향, 천문동, 택사, 고본, 천궁, 백출, 황금, 맥문동, 길경, 작약, 지황으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 생약재의 발효 산물을 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 아토피성 피부염 치료용 조성물은 락토코커서 락티스(기탁번호 KCTC 11157BP) 또는 락토바실러스 플란타럼(기탁번호 KCTC 11158BP)에서 선택되는 균주를 더욱 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 아토피성 피부염 치료는 Th2 사이토카인의 분비량에 대비하여 Th1 사이토카인의 분비량을 향상시키는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 치료용 조성물.
형개, 의이인, 지모, 곽향, 천문동, 택사, 고본, 천궁, 백출, 황금, 맥문동, 길경, 작약, 지황으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 생약재에서 얻어진 건조분말에 배지를 첨가하여 생약재 배지를 제조하는 단계;

상기 제조된 생약재 배지에 락토코커서 락티스(기탁번호 KCTC 11157BP) 또는 락토바실러스 플란타럼(기탁번호 KCTC 11158BP)에서 선택되는 균주 배양액을 첨가시켜 상기 생약재의 발효 성분을 얻는 단계를 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제조하는 방법.
형개, 의이인, 지모, 곽향, 천문동, 택사, 고본, 천궁, 백출, 황금, 맥문동, 길경, 작약, 지황으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 생약재의 발효 산물을 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 개선용 화장품.
제 5항에 있어서, 상기 화장품은 락토코커서 락티스(기탁번호 KCTC 11157BP) 또는 락토바실러스 플란타럼(기탁번호 KCTC 11158BP)에서 선택되는 균주를 더욱 포함하는 아토피성 피부염 개선용 화장품.
제 4항에 있어서, 상기 생약재의 발효 성분을 얻는 단계 이후에 상기 균주를 열처리에 의해 비활성화시키는 단계와, 열처리된 발효 성분을 원심분리하여 상기 균주에 의해 발효된 생약 물질을 상기 균체 및 불용성 물질로부터 분리하는 단계를 더욱 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제조하는 방법.