KR20050062495A

KR20050062495A - 알레르기 질환 예방 및 치료 기능을 가진 비피도박테리움인판티스

Info

Publication number: KR20050062495A
Application number: KR1020050047538A
Authority: KR
Inventors: 이연희; 백경수
Original assignee: (주) 피엘바이오
Priority date: 2005-06-03
Filing date: 2005-06-03
Publication date: 2005-06-23
Also published as: KR100532362B1

Abstract

본 발명은 알레르기 질환을 예방하거나 억제할 수 있는 유산균에 관한 것으로, 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 (Lactobacillus coprophilus Strain PL9001, KCCM-10245), 락토바실러스 퍼멘텀 PL9005 (Lactobacillus fermentum Strain PL9005, KCCM-10250), 락토바실러스 플랜타룸 PL9011 (Lactobacillus plantarum PL9011, KCCM-10358) 및 비피도박테리움 인판티스 PL9506 (Bifidobacterium infantis PL9506, KCCM-10406)을 제공한다. 본 발명의 균주들은 각종 알레르기 질환의 예방제 및 치료제등으로 사용할 수 있으며, 알레르기 질환 예방제 및 치료제 제조에 직접 사용되거나 첨가제로 사용될 수 있다.

Description

알레르기 질환 예방 및 치료 기능을 가진 비피도박테리움 인판티스{ Bifidobacterium infantis which prevent and/or cure allergic diseases}

본 발명은 알레르기 질환을 예방할 수 있는 유산균을 제공한다.

또한 본 발명은 알레르기 질환을 치료할 수 있는 유산균을 제공한다.

또한 본 발명은 본 유산균의 생균, 사균, 파쇄약, 배양액, 배양 추출물을 포함한 알레르기를 억제할 수 있는 식품 첨가제를 제공한다.

또한 본 발명은 알레르기 억제효과를 가진 유산균을 종균으로 사용한 항알레르기 기능을 가진 식음료를 제공한다.

또한 본 발명은 알레르기 억제효과를 가진 유산균을 함유한 화장품을 제공한다.

또한 본 발명은 알레르기 억제효과를 가진 유산균을 함유한 피부 연고제를 제공한다.

또한 본 발명은 알레르기 억제효과를 가진 유산균을 함유한 피부 부착제를 제공한다.

또한 본 발명은 알레르기 억제효과를 가진 유산균을 함유한 복용제를 제공한다.

지난 수 십년간 알레르기 질병이 증가된 것은 미생물에 대한 노출이 감소하고 음식섭취가 변화한 것과 더불어 환경의 변화에 의한 것으로 설명된다.

알레르기 질병의 발생이 증가하는 것을 막는 것이 서구사회의 건강사회에 가장 중요한 문제가 되었다. 알레르기 질병의 증가는 위생 가정 (The hygiene hypothesis)에 따르면 생활환경의 개선으로 일생초기에 미생물에 대한 노출이 감소하는 데서 기인하는 것으로 본다.

알레르기 현상에 대해 최초로 계통적 연구를 한 것은 프랑스의 생리학자인 리셰로서, 1902년 아나필락시스에 대하여 기재하고 다음 해에는 프랑스의 생리학자인 아르튀스가 아르튀스 현상(국소 아나필락시스)에 대하여 보고하였다. 리셰는 개에 말미잘의 독소를 몇 번 주사하여 일정기간이 경과한 후에 같은 독소를 재차 주사하였더니 최초에 견디었던 양보다 훨씬 적은 주사량으로 특유의 급격한 증세를 일으켜서 죽는 것을 발견하고 이 현상을 아나필락시(무방어란 뜻)라고 하였다. 처음에는 독소의 특유현상으로 생각하였으나, 그 후에 다른 종류의 단백질에서도 같은 현상이 일어나는 것을 확인하였다.

알레르기의 어원은 희랍어의 합성어로 '이색작용(異色作用)'이란 뜻이다. 즉, 어떤 종류의 감염증에 걸리거나, 세균의 생산물, 이종물질로 전처치(前處置)를 하면 생체의 반응 능력이 일정한 변화를 일으키는 데에 주목하여 그 '변화한 반응능력'을 알레르기라고 지칭하고, 생체 내에 항체가 생산되기 위해 일어나는 현상이라고 생각하였다. 리셰는 결핵의 임상에도 이 생각을 도입하여 투베르쿨린에 의한 피부반응을 결핵의 진단에 응용한 것으로도 알려져 있다.

한편, 아르튀스는 토끼에 이종단백질을 주사하여 일정기간 후에 소량의 같은 물질을 피하에 재주사하였더니 국소에 부종(浮腫)이나 괴사(壞死)를 수반하는 염증성 반응이 나타나는 것을 발견하였다. 이들의 실험적 사실에 더하여, 리셰는 사람의 두번째 종두에서는 제1회 때보다 피부반응이 빠르고 또한 강하게 나타나는 사실과, 혈청병에서는 약 1주일 후에 제1회의 증세가 나타나는데, 제2회 이후에서는 주사직후에 증세가 나타나는 등, 광범위한 임상적 관찰을 기초로 하여 알레르기의 개념을 도입한 셈이다.

즉, 아나필락시스나 혈청병, 이른바 특이체질 등 외에, 개념이 일단 명백해진 면역현상도 포함하여 모두 항원항체반응에 의한 생체반응으로 보고, 강화된 반응 능력의 경우가 과민증(감수성 항진)으로서 아니필락시스이며, 약화된 반응 능력을 감감수성(減感受性)·무감수성 또는 면역이라고 하였다.

그러나 항원항체반응에 기인하는 생체반응은 복잡다양한 현상이며, 그 기전(機轉)에는 불명한 점이 많은 것 등의 이유로, 그 후 알레르기 또는 아토피 등 다수의 학자에 의한 정의나 용어가 발표되어 혼란이 일어났다.

현재는 항원항체반응이 생체에 미치는 영향 중에서 병적인 과정을 나타내는 것을 알레르기라고 정의하고 있다. 즉, 임상적으로는 반응성의 항진(과민성)이라는 것이 표면에 강하게 나타나기 때문에 알레르기는 과민성과 거의 같은 뜻으로 보게 되었다.

무균 동물 실험으로 장내미생물 세균총이 알레르기를 포함한 여러 가지 반응을 억제하도록 면역 시스템을 시동걸게 하는 데 중요한 역할을 하는 것이 밝혀졌다. 또한 임상 실험에서 장내의 유산균과 비피도 박테리아와 같은 유산 생산 균의 수가 적은 어린이들에서 알레르기가 높은 비율로 나타나는 것을 확인하였다. 또한 장내의 세균이 면역 아토피를 조절하는 것이 확인되었다. 한편 프로바이오틱이 첨가된 음식이 알레르기 발생과 알레르기 환자에서 아토피 발생을 억제해 준다는 증거가 있다. 최근연구에서 몇몇 유산균이 type I and II interferons 과 pro-interferon monokines (IL-12 and IL-18) 생산을 자극하는 것이 밝혀졌다. 따라서 면역조절작용의 유산균은 장내 세균총을 변화시키는 음식 첨가제(보조제)로 사용될 수 있으며 이에 의해 면역현상을 회복시키고 알레르기 반응을 촉진시키는 Th2-type을 교정시키기에 충분한 pro-T helper cell 1 (Th1) STAT-activating signals을 제공할 수 있다 (Cross ML, Gill HS. 2001. Can immunoregulatory lactic acid bacteria be used as dietary supplements to limit allergies? Int. Arch. Allergy Immunol. 2001 Jun;125(2):112-9. Review.)

임상실험에서 요구르트와 같은 발효식품을 섭취하면 아토피의 증상을 완화시킬 수 있고 또한 면역 조절에 의해 알레르기 발생을 감소시킬 수 있다는 것을 보여주었다. 유산균이 함유된 발효우유를 섭취한 경우 전체적으로 Type I 과 Type II interferons 생산을 향상시켰다. 동물실험에서 유산균은 인터페론 발현을 촉진시켰으며 알레르기원에 의해 IL-4 와 IL-5 생산되는 것을 감소시켰다. 최근 결과에서는 유산균이 pro-interferon monokines (IL-12 and IL-18)를 강력하게 유도하며 이것은 백혈구 (mononuclear phagocytes)의 표면에 있는 수용체와 세포벽의 상호 작용으로 자극을 받아 NF-kappa B 와 STAT signalling pathways에 의해 일어난다. 단 유산균에 의해 유도되는 면역 조절의 정도와 질은 스트레인에 따라 다르다 (Cross ML, Stevenson LM, Gill HS. 2001. Anti-allergy properties of fermented foods: an important immunoregulatory mechanism of lactic acid bacteria? Int Immunopharmacol 1(5):891-901).

알레르기 반응은 어린 시절 상호 발란스를 유지하는 미생물에 노출이 없어서 발생하는 것으로 생각된다. 최초의 장내 세균총의 구성이 면역 반응 형태와 정상 장내방어책 개발에 중요한 결정요인으로 생각된다. 지난 수십년간의 실험, 임상, 병리학적 연구 결과에 따르면 비병원성 장내 세균이 인체의 면역체계가 비아토픽형태로 성숙하도록 하는 데 필수적인 요인인 것을 보여주고 있다.

알레르기 질병에서 프로바이오틱의 조절 작용은 유아에서 프로바이오틱이 첨가된 음식을 주었을 경우 치료효과가 개선되거나 아토픽 엑지마 발생이 예방되어 증명되었다. 이것은 그람 음성 세균의 리포폴리사카라이드와 박테리아 DNA의 CpG가 장내 표피세포에 존재하는 Toll-like receptors를 통해 면역조절 유전자를 활성화시키는 것이다. 프로바이오틱은 또한 고분자를 분해하고 변화시켜 장내에서의 항원을 감소시키는 작용도 한다. (Kalliomaki M, Isolauri E. 2002. Pandemic of atopic diseases--a lack of microbial exposure in early infancy? Curr Drug Targets Infect Disord 2(3):193-9). 또한 프로바이오틱 음식을 제공한 경우 유아에서 종종 결핍된 장내면역조직(GALT, gut-associated lymphoid tissue)이 숙성되도록 한다. 프로바이오틱 영양은 장내 투과성을 정상화시키며 장내세균총의 발란스 맞추어 주며 장의 면역 방어 기전 (IgA)을 개선하고, 장내 염증 반응을 완화시키며 국소적이고, 전반적인 알레르기 염증의 특징인 사이토카인을 억제한다 (Miraglia del Giudice M Jr, De Luca MG, Capristo C. 2002. Probiotics and atopic dermatitis. A new strategy in atopic dermatitis.Dig Liver Dis 34 Suppl 2:S68-71). 몇몇 유산균 프로바이오틱은 알레르기 염증에 억제 영향을 가지고 있으며, 이것은 단백질 분해 작용과 면역조절작용이 관여된 것으로 생각된다(von der WT, Ibnou-Zekri N, Pfeifer A. 2002. Novel probiotics for the management of allergic inflammation. Dig Liver Dis. 34 Suppl 2:S25-8). 따라서 과학적으로 제조된 프로바이오틱과 다른 기능 요소들이 함유된 기능성 식품은 알레르기 질병의 예방과 관리를 하게 해 주는 것으로 기대되고 있다(Laiho K, Ouwehand A, Salminen S, Isolauri E. 2002. Inventing probiotic functional foods for patients with allergic disease. Ann. Allergy Asthma Immunol. 89(6 Suppl 1):75-82).

아토픽 질병은 일생의 초반기에 평형을 이루게 하는 미생물에 노출이 없어서 발생한다고 한다. 즉 장내 세균총의 초기 구성이 면역 반응형태와 정상 장내 억제 작용개발의 중요 결정인자로 생각되고 있다. 인체의 알레르기 질병에서 프로바이오틱의 조절역할은 처음 실험실 상에서 백혈구 증식과 IL-4 에 억제 효과를 보임으로써 강조되었으며, 프로바이오틱 첨가 음식이 유아의 아토피성 습진에 효과가 있었다. (Laiho K, Hoppu U, Ouwehand AC, Salminen S, Isolauri E. 2002. Probiotics: on-going research on atopic individuals. Br J Nutr 2002 88 Suppl 1:S19-27)

임상실험에서 임산부와 수유부에게 프로바이오틱을 투여한 경우 모유의 면역방어 기능을 증가시켰다. 투여하지 않은 경우 모유의 anti-inflammatory transforming growth factor beta2 (TGF-beta2)양이 1340 pg/mL [95％ CI, 978-1702 인 것에 비하여, 프로바이오틱을 투여받은 경우 2885 pg/mL [95％ CI, 1624-4146]으로 양이 증가하였다. 프로바이오틱을 투여받은 엄마의 경우 신생아의 첫 2년동안 아토픽 습진이 발달하는 것이 프라시보를 받은 엄마의 아기에 비해 상당히 감소하였다 (15％ and 47％, respectively; relative risk, 0.32 [95％ CI, 0.12-0.85]; P =.0098). 엄마의 아토피는 신생아이 아토피 습진의 위험인자이다. 프로바이오틱 처방으로 가장 덕을 보는 경우는 탯줄의 IgE 농도가 높은 경우였다. 임신 중과 수유 중 프로바이오틱을 투여하는 것은 수유하는 면역방어 효과를 증가시키는 안전하고 효과적이며 생후 첫 2년간 아토피 습진에 방어 효과를 주었다 (Rautava S, Kalliomaki M, Isolauri E. 2002.Probiotics during pregnancy and breast-feeding might confer immunomodulatory protection against atopic disease in the infant. J Allergy Clin Immunol 109(1):119-21). 친척이나 남편이 아토피 습진, 알레르기 비염, 천식이 있는 산모와 신생아에게 생후 6개월간 Lactobacillus GG를 투여한 경우 비투여군에 비해 아토피 습진의 발생이 반으로 감소하였으며 비염도 현저히 감소하였다(Kalliomaki M, Salminen S, Arvilommi H, Kero P, Koskinen P, Isolauri E. 2001. Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebo-controlled trial. Lancet 357(9262):1076-1079). Lactobacillus GG (ATCC 53103)의 경우 국소적인 항원 특정한 면역 반응 (특히 IgA)를 증가시켜 항원의 흡착을 조절하였다. 아토피 습진과 우유에 알레르기를 가진 신생아에게 가수분해된 탈지분유에 Lactobacillus GG를 첨가하거나 수유하는 엄마에게 투여하여 대변내의 fecal alpha 1-antitrypsin, tumor necrosis factor-alpha 과 eosinophil cationic protein을 장내 염증의 표지 인자로 측정하였다. Lactobacillus GG가 첨가된 가수분해된 탈지우유를 섭취한 신생아의 경우 1달간의 실험에서 아토피성 피부염이 현저히 좋아졌다. alpha 1-antitrypsin의 양이 감소하였으며 fecal tumor necrosis factor-alpha도 현저히 감소하였다. 단 fecal eosinophil cationic protein 의 양은 변화하지 않았다. 이 결과는 프로바이오틱이 아토피성 피부염과 음식알레르기를 가진 환자에서 장내 방어기전을 촉진하고, 장내 염증을 감소시켜 음식 알레르기 치료에 사용될 수 있음을 보여주었다 (Majamaa H, Isolauri E. 1997. Probiotics: a novel approach in the management of food allergy. J Allergy Clin Immunol 99(2):179-85).

현재 프로바이오틱 연구는 항알레르기 기능을 가진 특정 스트레인을 발견하는 쪽으로 진행되고 있다 (Isolauri E, Rautava S, Kalliomaki M, Kirjavainen P, Salminen S. 2002. Role of probiotics in food hypersensitivity. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2(3):263-71).

따라서, 본 발명은 알레르기를 예방할 수 있는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 균주들은 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 (Lactobacillus coprophilus Strain PL9001, KCCM-10245), 락토바실러스 퍼멘텀 PL9005 (Lactobacillus fermentum Strain PL9005, KCCM-10250), 락토바실러스 플랜타룸 PL9011 (Lactobacillus plantarum Strain PL9011, KCCM-10358) 및 비피도박테리움 인판티스 PL9506 (Bifidobacterium infantis Strain PL9506, KCCM-10406)으로 이들 유산균들은 헬리코박터 피로리 성장 및 부착 억제 기능을 가진 것이 밝혀져 이미 특허 출원된 균주들로, 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 은 KCCM-10245로, 락토바실러스 퍼멘텀 PL9005 은 KCCM-10250으로, 락토바실러스 플랜타룸 PL9011은 KCCM-10358으로, 비피도박테리움 인판티스 PL9506는 KCCM-10406으로 국제기탁되었으며, 이들 균주들은 헬리코박터 피로리와 장내 세균 성장 및 장 상피 세포 부착 억제 기능을 가진 것이 밝혀졌다.

또한 본 발명은 알레르기 질환을 치료할 수 있는 유산균을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 공기 중의 각종 알레르기원에 의한 알레르기를 예방할 수 있는 유산균을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 각종 음식 알레르기원에 의한 알레르기를 예방할 수 있는 유산균을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 아토피성 피부염을 예방하거나 치료 할 수 있는 유산균을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 알레르기성 비염, 천식, 아토피성 습진등을 예방하거나 치료 할 수 있는 유산균을 제공하는 것을 목적으로 한다.

유산균은 각종 조성물로 제제화 할 수 있으며, 바람직하게는 이 조성물은 캡슐, 정제 및 분말 등의 제약 조성물 형태와 각종 식품 첨가에 용이한 형태도 바람직하다. 이러한 제제는 공지된 방법에 의해 제약상 허용되는 담체, 부형제, 용매 또는 보조제를 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 방법 및 성분은 잘 알려져 있으며, 표준 텍스트 및 매뉴얼, 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 문헌 (Remington. 1995. The Science and Practice of Pharmacy. Mack Publising Co. Easton, PA 18042, USA)에 상세히 기재되어 있다.

또한 당 업계에 일반적으로 잘 알려진 방법에 의해 정장성 박테리아를 식품으로 제조할 수도 있다.

또한 당 업계에 일반적으로 잘 알려진 방법에 의해 발효 유제품을 포함한 발효식품의 종균으로 사용하여 음식 알레르기원 감소에 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알레르기 예방제와 치료제를 제공한다.

또한 본 발명은 알레르기 예방제와 치료제를 위한 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 (Lactobacillus coprophilus Strain PL9001, KCCM-10245), 락토바실러스 퍼멘텀 PL9005 (Lactobacillus fermentum Strain PL9005, KCCM-10250), 락토바실러스 플랜타룸 PL9011 (Lactobacillus plantarum Strain PL9011, KCCM-10358) 및 비피도박테리움 인판티스 PL9506 (Bifidobacterium infantis Strain PL9506, KCCM-10406)를 제공한다.

또한 본 발명은 알레르기 예방제와 치료제를 위한 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 (KCCM-10245), 락토바실러스 퍼멘텀 PL9005 (KCCM-10250), 락토바실러스 플랜타룸 PL9011 (KCCM-10358), 비피도박테리움 인판티스 PL9506 (KCCM-10406) 중 1종이상을 1일 1-3회 1회에 1×10⁷ CFU∼1×10¹² CFU를 복용하는 알레르기 예방제와 치료용 경구 복용제를 제공한다.

또한 본 발명은 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 (Lactobacillus coprophilus Strain PL9001, KCCM-10245), 락토바실러스 퍼멘텀 PL9005 (Lactobacillus fermentum Strain PL9005, KCCM-10250), 락토바실러스 플랜타룸 PL9011 (Lactobacillus plantarum Strain PL9011, KCCM-10358) 및 비피도박테리움 인판티스 PL9506 (Bifidobacterium infantis Strain PL9506, KCCM-10406)중 한가지 이상을 포함한 알레르기 예방과 치료 목적의 기능성 화장품을 포함한 피부외용제를 제공한다.

또한 본 발명은 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 (Lactobacillus coprophilus Strain PL9001, KCCM-10245), 락토바실러스 퍼멘텀 PL9005 (Lactobacillus fermentum Strain PL9005, KCCM-10250), 락토바실러스 플랜타룸 PL9011 (Lactobacillus plantarum Strain PL9011, KCCM-10358) 및 비피도박테리움 인판티스 PL9506 (Bifidobacterium infantis Strain PL9506, KCCM-10406)중 한가지 이상을 포함한 식음료 첨가제를 제공한다.

또한 본 발명은 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 (Lactobacillus coprophilus Strain PL9001, KCCM-10245), 락토바실러스 퍼멘텀 PL9005 (Lactobacillus fermentum Strain PL9005, KCCM-10250), 락토바실러스 플랜타룸 PL9011 (Lactobacillus plantarum Strain PL9011, KCCM-10358) 및 비피도박테리움 인판티스 PL9506 (Bifidobacterium infantis Strain PL9506, KCCM-10406)중 한가지 이상을 포함한 알레르기 예방과 치료 목적의 발효제품을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

[실험예 1] Passive Cutaneous Anaphylaxis (PCA) test

동물모델로서는, 마우스에서 Ovalbumin을 투여하여 전신성과민반응을 유발시킨 후 21일째 분리한 혈청을 랫트의 피부에 접종하고, 30분후 미정맥을 통해 ovalbumin을 재투여하여 작제하였다. 피부에서 일어나는 과민반응의 지표로서는 Evans blue solution을 이용하였다. 이러한 방법을 이용하여 작제한 실험동물 모델을 이용하여, 각 실험물질들이 피부과민반응에 어떠한 영향을 미치는가를 평가하였다.

재료 및 방법

시험물질

Lactobacillus confusus PL9001 (KCCM-10245), L. fermentum PL9005 (KCCM-10250), L. plantarum PL9011 (KCCM-10358), Bifidobacterium infantis PL9506 (KCCM-10406)를 동결 건조하여 차광, 밀봉 상태 하에서 냉장보관 하였다. 시험물질의 투여전 멸균PBS에 희석하여 37℃ Shaking incubator에서 1시간동안 배양하였다.

실험동물

6주령 Wister Rats 50 마리 와 6주령 BALB/c mice 3 마리를 Charles River (Japan)에서 입수하였다. 랫드는 음성 및 양성대조군 (시험물질대신 PBS를 투여한 군)을 포함하여 각각의 시험물질에 대하여 고농도 및 저농도 투여군을 설정하였는 바, 각 군당 5마리씩 공시하였다. 온도 22±3℃, 상대습도 50±10％, 환기 회수 10∼12회/hr, 조명시간 12시간 (08:00∼20:00), 조도 150∼200 lux로 통제되는 동물실에서 전 실험기간동안 사육하였으며, 음수 및 사료는 자유공급 하였다.

마우스에서 systemic anaphylaxis의 유발

마우스 3마리에 과민성 반응의 유발 물질로서 50㎕ Ovalbumin (Sigma: grade V)과 2 mg 의 Al(OH)₃ 0.2ml을 잘 혼합하여 실험 0일과 14일째에 각각 1회씩 복강내로 투여하였다.

감작된 마우스 혈청 중 IgE 측정.

실험 0일, 14일, 20일째 마우스 안와 정맥총에서 채혈하여, 2시간 냉장 보관후 3000rpm에서 20분간 원심 분리하여 혈청을 얻었다. 각각의 혈청들과 20일째에 각 개체에서 채취한 혈청을 혼합한 혈청에 대하여 Mouse IgE sandwich ELISA kit (Shibayagi, Japan)를 이용하여 발현된 IgE의 양을 측정하였다.

랫드에 실험물질의 투여

실험군에는 21일간 Lactobacillus confusus PL9001 (KCCM-10245), L. fermentum PL9005 (KCCM-10250), L. plantarum PL9011 (KCCM-10358), Bifidobacterium infantis PL9506 (KCCM-10406)를 1×10⁹CFU/ml 및 1×10⁷CFU/ml로 정량하여 1ml씩 존대(zondae)를 이용하여 1일 1회 오전 10시∼12시 사이에 경구 투여하였다.

음성 및 양성대조군에는 시험물질 대신 멸균 인산완충용액 (phosphate buffered saline, PBS)를 투여하였다.

랫드에서 피부감작과민반응 유도

3마리의 마우스에서 분리하여 합한 혈청을 PBS를 이용하여 10배로 희석하여 털을 제거한 랫드의 등부위에 각각100㎕씩 피내투여(intradermal injection)하였다. 음성대조군에는 PBS를 투여하였다. 30분 후 미정맥으로 ovalbumin 100 ㎍/0.5㎖ 과 0.5％ Evans blue solution (Sigma)를 혼합하여 투여하였다.

랫드 피부에서 ovalbumin-specific IgE 양의 측정

랫드에 피부 감작 반응을 유도한 후 2시간 후 에테르를 이용하여 안락사를 시킨 후 투여 부분의 피부조직을 각각 0.15g씩 정량 채취하였다. Evans blue를 추출하기 위해 Formamide (Sigma) 400 ㎕에 채취한 피부조직을 48시간동안 침적시킨 후 ELISA reader를 이용 650 nm에서 흡광도 (Optical Density, OD) 값을 측정하였다.

통계학적 처리

SAS의 Duncan's multiple test를 이용하여 군별 유의성을 검정하였다.

결과

체중 및 사료섭취량

Rats의 체중 및 사료 섭취량은 실험시작부터 종료 시까지 각군에서 유의적인 차이를 보이지 않고 증가 하였다.

전신과민성 반응 유발 마우스에서 혈청 IgE

Ovalbumin 투여 0일째에 비하여 20일째에는 혈청 중 IgE의 양이 8배∼10배 증가한 것이 관찰되었다. 랫드에 과민반응을 유발 시키기 위하여 시험 20일째 3마리의 마우스로부터 얻은 혈청을 혼합한 혈청의 IgE는 138.05 ng/ml로 나타났다 (표1).

(표1-1) Anaphylaxy 유발 마우스혈청에서의 IgE 농도변화

랫드에서 피부과민성반응의 측정

과민반응을 유도하기 위하여 항원을 접종한 부위는 육안적으로 관찰하였을 때 Evans blue의 침착으로 푸른색을 띄고 있었다. 본 실험에서 Evans blue치는 ovalbumin 과 특이 IgE가 결합한 양을 측정한 것이므로 OD값이 낮을수록 시험물질이 IgE 유래의 피부과민반응이 억제된 것을 보여준다. Evans blue를 측정한 결과, 피내로 10배 희석한 마우스 혈청을 접종한 군에서는, 시험물질대신 PBS를 투여한 군에 비해 Lactobacillus confusus PL9001 고농도 투여 군을 제외한 모든 시험물질 투여 군에서 유의적인 감소를 보였다 [도 1]. Lactobacillus confusus PL9001 고농도 투여군은 유의성은 없으나 시험물질대신 PBS를 투여한 군에 비해 비해 감소하였다.

이 결과는 L. coprophilus PL9001 (KCCM-10245), Lactobacillus fermentum PL9005 (KCCM-10250), L. plantarum PL9011 (KCCM-10358), B. infantis PL9506 (KCCM-10406)은 피부과민성 반응을 억제하는 효과가 있음을 보여준다.

[실험예 2] 전신과민반응억제시험

전신 과민성 반응에는 IgE와 관련된 cytokine이 증가하는 것으로 보고되어 있다. 지금까지 보고된 바로는 전신성 과민 반응의 경우 Th2에 관련된 cytokine은 증가하고, Th1에 관련된 cytokine은 경도로 증가하거나 오히려 감소하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 실험에서는 전신성 과민 반응이 유도된 실험동물에서, 유산균들의 전신성과민반응억제 효과를 Th1/Th2 cell에서 유래하는 cytokine의 변화를 측정하여 관찰하였다.

재료 및 방법

시험물질

Lactobacillus confusus PL9001 (KCCM-10245), L. fermentum PL9005 (KCCM-10250), L. plantarum PL9011 (KCCM-10358), Bifidobacterium infantis PL9506 (KCCM-10406)를 동결 건조하여 차광, 밀봉 상태 하에서 냉장보관하였다. 시험물질의 투여 전 멸균PBS에 희석하여 37℃ Shaking incubator에서 1시간동안 배양하였다.

실험동물

6주령 BALB/C mice 50 마리를 Charles River (Japan)에서 입수하였다. 음성 및 양성 대조군을 포함하여 각각의 시험물질에 대하여 고농도 및 저농도 투여군을 설정하였는바, 각 군당 5마리씩 공시하였다. 온도 22±3℃, 상대습도 50±10％, 환기 회수 10∼12회/hr, 조명시간 12시간 (08:00∼20:00), 조도 150∼200lux로 통제되는 동물실에서 전 실험기간동안 사육하였으며, 음수 및 사료는 자유공급 하였다.

랫드에 실험물질의 투여

실험군에는 21일간 Lactobacillus confusus PL9001 (KCCM-10245), L. fermentum PL9005 (KCCM-10250), L. plantarum PL9011 (KCCM-10358), Bifidobacterium infantis PL9506 (KCCM-10406) 균주를 2×10⁹CFU/ml 및 2×10⁷CFU/ml로 정량하여 0.5 ml씩 존대를 이용하여 1일 1회 오전 10시∼12시 사이에 경구 투여하였다. 음성 및 양성대조군에는 시험물질 대신 멸균 PBS 를 투여하였다.

Systemic anaphylaxis 유발

전 실험 군에 과민성 반응의 유발 물질로서 50 ㎕ Ovalbumin (Sigma: grade V)과 2mg 의 Al(OH)₃ 0.2 ml을 잘 혼합하여 실험 0일과 14일째에 각각 1회씩 복강내 투여하였다. 음성 대조군에는 PBS 0.2 ml을 복강내 투여하였다. 시험물질의 경구투여와 중복을 피하기 위하여 18시에서 20시 사이에 투여하였다.

Cytokine 측정을 위한 비장세포의 배양

시험물질투여 종료일인 21일째 동물을 ether로 안락사시키고 비장을 무균적으로 적출하였다. 적출한 비장을 RPMI 1640 medium(Sigma) 5ml이 담긴 플라스크에서 가위로 잘게 자른 후 24 gauge needle을 통해 흡입, 배출을 반복한 다음 15 ml Falcon tube에 넣고 1700 rpm에서 15분간 원심 분리하여 상층액을 버리고 침전물에 ACK lysis buffer (Tris-NH₄Cl)를 혼입하여 적혈구를 용혈시켰다. 그 후 침전물을 PBS로 3회 세척한 후, RPMI 1640 complete medium (RPMI 1640 medium containing 10％ heat inactivated fetal calf serum, 100 U/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin)에 4×10⁶ cells/ml로 정량하여 12-well culture plate에 분주하고 ovalbumin 100 ㎍/ml 을 첨가하여 CO₂ incubator에 72시간 배양하였다. 음성대조군도 비장세포를 분리하여 ovalbumin을 첨가하여 배양하였다. 배양 후 1500rpm에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 채취하여 상용화된 IL-2, IL-5, IL-12(Bender Medsystems, Vienna) Elisa kit와 IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α , INF-γ(Chemicon International, CA, USA) Elisa kit를 이용하여 발현된 cytokines의 양을 측정하였다.

통계 처리

SAS의 Duncan's multiple test를 통해 군별 유의성을 검정하였다.

결과 및 고찰

IgE는 IL-1에 의해 자극된 Th2 cell 유래의 IL-4에 의해 증가되며, IL-5, IL-6, IL-10 등이 Th2 cell 유래 cytokine들로서 IL-4와 비슷한 기능을 한다. 한편, IL-10은 Th2 cell에서 유래하지만, 특이적으로 Th1 cell유래 cytokine을 억제하는 역할을 한다. 반면에 Th1 cell유래 cytokine 들은 IL-4를 억제하여 IgE의 생성을 감소시키며, 이러한 cytokine에는 IL-2, IL-12 그리고 INF-γ 가 있다. IL-2는 IL-12에 의해 자극되는 Th1 cell유래의 cytokine으로서 T cell, NK cell의 증식을 유도하고, IL-4를 억제하여 IgE 생성을 감소시키는 작용을 한다.

도 2A의 결과를 보면 Il-2가 양성 대조군에서는 적게 증가하고, 실험물질 투여군에서는 양성 대조군에 비해 유의적으로 많이 증가하였다. 또한 각 실험물질에서 고농도 투여군이 저농도 투여군보다 유의적으로 증가함을 보였다. 이는 각 실험물질이 IgE 생성을 억제하여, 전신과민반응을 방지하는 효과가 있는 것을 보여준다.

IL-4는 Th2 cell에서 유래하는 cytokine으로 IgE를 B cell에서 생산하게 하는 중요인자이며, IL-6, TNF-α를 감소시키는 역할을 하기도 한다. 이것은 또한 MHC Ⅱ class, APC(antigen presenting cell)의 활성을 증가시키는 작용이 있어 면역반응의 중요지표로 활용된다. 도 2B에서 IL-4는 양성대조군이 음성대조군에 비해 증가하였으며, 시험 물질 투여군은 양성대조군에 비해 유의적으로 감소하였다. 투여 농도별 차이는 유의적으로 나타나지 않았으나, 고농도 투여군이 저농도 투여군에 비해 감소하는 경향을 보였다.

IL-5는 Th2 cell에서 유래하며, IL-4를 도와 IgE 합성을 증가시키는 역할을 한다. 도 2C에서 IL-5는 음성 대조군에 비해 양성 대조군이 유의적으로 증가하였다.

IL-6은 Th2 cell에서 유래하는 cytokine으로서, IL-4 등과 비슷한 결과를 보였는데 Bifidobacterium infantis 저농도 투여군에서 양성 대조군에 비해 유의성이 없지만 감소하는 경향을 보이고 있다(도 2D).

IL-10은 Th2 cell에서 유래하며 특이적으로 Th1 cytokine 억제기능을 가지고 있다. 그래서 IL-4등과 비슷한 결과를 예상했으나, 오히려 Th1 cell에서 유래한 cytokine과 비슷하게 양성대조군에 비해서 증가하는 경향을 보이고 있다(도 2E). 이는 IL-10이 Th1 cell유래 cytokine에 대한 억제 효과를 가지고 있기 때문에, Th1 cell 유래 cytokines인 IL-2, IL-12, INF-γ 등의 증가를 더욱 억제하기 위하여 약간 상승한 것으로 생각된다.

IL-12는 Th1 cell유래의 cytokine으로 INF-γ, IL-2등의 발현을 증가시켜 IgE 생성을 억제하는 기능을 한다. 도 2F에서는 Lactobacillus confusus PL9001 (KCCM-10245), 저농도 투여군과 L. fermentum PL9005 (KCCM-10250) 고농도 투여군 만이 양성대조군에 비해 유의성있게 증가하였으나, L. plantarum PL9011 (KCCM-10358) 저농도 투여군을 제외한 나머지군에서는 유의성은 없으나 증가하는 경향을 보이고 있다.

INF-γ 는Th1 cell에서 유래하며 전신성 과민반응을 유발시 양성대조군이 음성대조군에 비해 감소하는 경향을 보였으며, 양성대조군에 비해 IL-2, IL-12등과 비슷하게 시험물질투여군에서 증가하는 경향을 보였다 (도 2G).

TNF-α는 Macrophage에서 유래하는 cytokine으로, inflammatory cell에 작용하며, 만성염증에 관여하는 인자이다. 음성 및 양성 대조군에서의 유의적인 변화는 없었으며, 시험물질투여군에서 Bifidobacterium infantis PL9506 (KCCM-10406) 투여군을 제외한 다른 유산균은 고농도 투여군에서 유의적인 감소를 보였다. Bifidobacterium infantis 저농도 투여군에서는 오히려 유의적으로 증가하였다 (도 2H). 즉 Bifidobacterium infantis PL9506 (KCCM-10406) 투여군을 제외한 다른 유산균들은 염증관련 Cytokine 감소에 효과가 있음을 제시하고 있다.

실험예 1과 2의 결과에 나타났듯이 본 발명의 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 (KCCM-10245), 락토바실러스 퍼멘텀 PL9005 (KCCM-10250), 락토바실러스 프랜타룸 PL9011 (KCCM-10358) 및 비피도박테리아 인판티스 PL9506 (KCCM-10406)은 두 가지 동물실험 모두에서 알레르기 억제 효과가 있는 것으로 입증되었다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 코프로필러스 PL9001 (KCCM-10245), 락토바실러스 퍼멘텀 PL9005 (KCCM-10250), 락토바실러스 프랜타룸 PL9011 (KCCM-10358) 및 비피도박테리아 인판티스 PL9506 (KCCM-10406)은 피부 알레르기, 음식 알레르기와 전신 알레르기 및 알레르기성 질환을 예방 혹은 치료할 수 있다. 또한 본 발명의 PL 균주, PL 균주 파쇄물, 또는 PL 균주 배양여액은 예방 및 치료하는 용도로 사용할 수 있으며, PL 균주 및 PL 균주 배양여액은 아토피성 습진, 알레르기성 비염, 피부염을 포함한 모든 알레르기 관련 질환 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있다. 또한 본 균주들을 이용한 발효식품은 음식 알레르기 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있다.

도 1. 랫드 피부 조직 내 침착된 Evans blue의 농도. 음성대조군(NST)은 21일간 PBS경구투여하고, 혈청감작시 PBS를 피내투여하였다. 양성대조군(PST)은 21일간 PBS를 경구투여하고, Anaphylaxis를 유발시킨 마우스의 혈청을 피내 투여하였다. 고농도군(H) 및 저농도(L)투여군은 Lactobacillus confusus PL9001 (KCCM-10245), L. fermentum PL9005 (KCCM-10250), L. plantarum PL9011 (KCCM-10358), Bifidobacterium infantis PL9508 (KCCM-10406) 균주를 각각 1×10⁹CFU/ml, 1×10⁷CFU/ml 씩 21일간 투여하고, Anaphylaxis를 유발시킨 마우스의 혈청을 피내 투여하였다. 막대그래프위의 각 영문은 각각 유의적으로 다름을 의미한다. p＜0.05

도 2. 비장 세포 배양 상층액에서의 IL-2(A), IL-4(B), IL-5(C), IL-6(D), IL-10(E), IL-12(F), INF-γ(G), TNF-α(H) 발현 농도. 음성대조군(NST)은 21일간 PBS 0.5ml를 경구투여하고 0일, 14일째에 PBS 0.2ml을 복강내투여하였으며 21일째 비장세포를 분리하여, 100㎕/㎖ OA와 함께 72시간 배양하였다. 양성대조군(PST)은 21일간 PBS 0.5ml를 경구투여하고 0일, 14일째에 OA 0.2ml을 복강내투여하였으며 21일째 비장세포를 분리하여, 100㎕/㎖ OA와 함께 72시간 배양하였다. 고농도군(H) 및 저농도(L)투여군은 Lactobacillus confusus PL9001 (KCCM-10245), L. fermentum PL9005 (KCCM-10250), L. plantarum PL9011 (KCCM-10358), Bifidobacterium infantis PL9508 (KCCM-10406)균주를 각각 (H) 1×109CFU/ml, (L) 1×107CFU/ml 씩 21일간투여하고, 0일, 14일째에 OA 0.2ml 복강내투여 후 21일째에 비장세포를 분리하여, 100㎕/㎖ OA와 함께 72시간 배양하였다. 막대그래프위의 각 영문은 각각 유의적으로 다름을 의미한다. p＜0.05

Claims

알레르기 억제 효과를 가지는 비피도박테리움 인판티스 PL9506 (Bifidobacterium infantis Strain PL9506, KCCM-10406)인 것을 특징으로 하는 유산균.
제 1항에 있어서, 상기 유산균은 생균, 건조균 및 사균을 특징으로 하는 유산균.
비피도박테리움 인판티스 PL9506 (Bifidobacterium infantis Strain PL9506, KCCM-10406) 을 포함하는 것을 특징으로 하는 알레르기 예방제 또는 완화제.
제 3항에 있어서, 상기 질환은 알레르기성 비염, 알레르기성 피부염, 아토피성 습진, 천식, 음식 알레르기를 포함한 알레르기 관련 질환 예방제 또는 완화제.
비피도박테리움 인판티스 PL9506 (Bifidobacterium infantis Strain PL9506, KCCM-10406) 을 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부인 사람을 위한 화장품.
비피도박테리움 인판티스 PL9506 (Bifidobacterium infantis Strain PL9506, KCCM-10406) 을 포함하는 알레르기성 비염, 알레르기성 피부염, 아토피성 습진, 천식, 음식 알레르기를 포함한 알레르기 관련 질환 예방 또는 완화를 위한 식품 첨가제.
제 6항에 있어서, 상기 식품 첨가제는 요구르트, 이유식, 유제품(우유, 두유등), 치즈, 김치 등 식품 또는 음료에 사용되는 것을 특징으로 하는 식품 첨가제.
비피도박테리움 인판티스 PL9506 (Bifidobacterium infantis Strain PL9506, KCCM-10406)을 유제품 제조의 종균으로 사용하여 유제품의 알레르기원을 감소시키도록 제조되어진 발효식품.
비피도박테리움 인판티스 PL 9506 (Bifidobacterium infantis Strain PL9506, KCCM-10406)을 곡물발효의 종균으로 사용하여 곡물제품의 알레르기원을 감소시키도록 제조되어진 식품.