KR101492004B1 - 면역증강 활성을 가지는 비피도박테리움 인판티스 hy8401 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 - Google Patents
면역증강 활성을 가지는 비피도박테리움 인판티스 hy8401 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 면역증강 활성을 가지는 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로서, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401은 NF-κB 활성 증가 및 NO(Nitric Oxide) 생성 증가, Th1 사이토카인(Cytokine) 인 IFN-γ 생성 증가에 따른 면역증강 활성이 뛰어나 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물, 건강기능식품, 기능성 음료, 발효제품 등으로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 면역증강 활성을 가지는 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 마우스의 대식세포에서 NF-κB의 활성증가 및 NO(Nitric Oxide)의 생산을 유도함은 물론 마우스의 비장세포에서 Th1 사이토카인(cytokine) 인 IFN-γ의 생산을 유도함으로써 면역증강 활성을 가지는 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물, 건강기능식품, 기능성 음료, 발효제품에 관한 것이다.
우리 몸은 외부에서 세균이나 바이러스가 침입하면 면역기능을 작동시켜 효과적으로 제거한다. 우리 몸은 세균 감염 시 'NF-κB' 신호전달체계와 'AP-1' 신호전달체계가 면역 세포내에서 동시에 활성화돼 세균을 효과적으로 제거한다. 'NF-κB' 신호전달체계는 NO(nitric oxide)를 포함한 사이토카인(cytokine) 관련 유전자의 면역기능을 활성화시키고, 'AP-1' 신호전달체계는 세포의 움직임을 촉진시켜 세균을 잘 잡아먹게 만드는 것으로 알려져 있다.
대식세포는 면역반응에 관계하는 세포로서 면역세포의 작용을 조절하는 사이토카인을 분비하여 면역반응조절, 미생물, 항원 등을 식균작용으로 파괴, 염증반응에 관여하는 NO(Nitric Oxide) 같은 물질이나 사이토카인을 분비하여 염증반응을 조절하는 등 다양한 기능을 한다.
유산균은 인체의 소화계에서 공생하면서 섬유질과 단백질을 분해하여 인체가 중용한 영양성분을 흡수할 수 있도록 해주며, 장내 pH를 산성으로 유지하여 대장균과 같은 해로운 장내 미생물의 번식을 억제한다. 또한, 비피더스 유산균은 노화 억제작용 뿐만 아니라, 혈중 콜레스테롤 저하작용, 비타민 합성기능, 변비 치료작용, 항암 작용 및 설사 개선 작용 등의 기능도 갖고 있다고 알려졌다. 특히 유산균은 대식세포의 증식을 촉진하여 장내세균에 대한 인지 및 살균능력을 강화시키고, 면역 증강 물질을 분비하여 면역 증강효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Gabriela peridgon et al. J of food Protection 53: 404-411: 1990, Katsumasa sato et al. Microbiol Immunol. 32(7): 689-698: 1998).
비피도박테리움(Bifidobacterium)은 유산과 초산을 생성하는 간균이다. 모유영양아 장내에서 우세하게 존재하여 장내 유익작용을 한다. 대부분의 유산균은 일정한 막대 모양이나 구형의 모양이 있는 반면, 비피더스균은 환경에 따라서 모양이 변하는 성질을 지니고 있어 Y자, V자, 곤봉이나 아령형태로 매우 다양하게 존재한다. 이러한 비피도박테리움은 주로 대장 내에서 활동하여 대장내 균을 정상화시키나, 영양요구성이 매우 복잡하여 산소가 있으면 사멸하기 때문에 배양이 어렵다.
이에 본 발명자들은 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) 중 마우스의 대식세포에서 NF-κB의 활성증가를 통해 NO(Nitric Oxide)의 생산을 유도함은 물론 마우스의 비장세포에서 Th1 사이토카인인 IFN-γ의 생산을 유도함으로써 면역증강 활성을 가지는 균주를 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 마우스의 대식세포에서 NF-κB의 활성증가를 통해 면역지표인 NO(Nitric Oxide)의 생산을 유도함은 물론 마우스의 비장세포에서 Th1 사이토카인인 IFN-γ의 생산을 유도함으로써 면역증강 활성을 가지는 신규한 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마우스의 대식세포에서 NF-κB의 활성증가를 통해 면역지표인 NO(Nitric Oxide)의 생산을 유도함은 물론 마우스의 비장세포에서 Th1 사이토카인인 IFN-γ의 생산을 유도함으로써 면역증강 활성을 가지는 신규한 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품을 제공하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 신균주를 분리하기 위하여 생후 7일경의 신생아에서 받은 분변을 수집한 후, 수집한 신생아의 분변 0.1g을 호기 희석액에 십진 희석하여 1.5% 한천(agar)이 포함된 BL 고체배지에 도말하여 37℃의 혐기조건에서 48시간 배양한 후 콜로니(colony)를 백금이(loop)로 취하여 새로운 BL 고체배지에 접종하고 순수 분리하였다. 순수 분리된 콜로니를 BL 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 이렇게 배양된 신생아의 분변에 있는 여러 단일 균주들 각각을 마우스의 대식세포에 처리하여 NF-κB 활성능과 일산화질소(Nitric Oxide) 생산능을 시험하여 본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 선별하였다.
이렇게 분리한 신균주의 균 Crystal violet 염색을 통해 현미경을 통해 관찰하였고, DNA를 분리하여 Bifidobacteria 16S rRNA 분석(Im3, Im26)을 통한 균 동정을 한 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.
하기의 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신균주의 16S rRNA 균주 동정결과 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium longum subsp. infantis) ATCC 15697과 가장 높은 상동성을 나타내어 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis)와 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여 본 발명자들은 이를 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401로 명명하고, 2013년 6월 10일자로 한국생명공연구원 유전자 은행(기탁번호: KCTC 12419BP)에 기탁하였다.
본 발명에 따른 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401의 특성은 다음과 같다.
1)균의 형태
비엘(BL) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 무산소 조건에서 배양했을 때 균의 특성
①세포의 형태: 부정형의 간상형 균
②운동성: 없음
③포자형성능: 없음
④그람(Gram) 염색: 양성
2)생리적 성질
①생육온도: 생장가능 생육온도 15~42℃
최적 생장온도 36~38℃
②생육 pH: 생장가능 생육 pH 4.5~8.0
최적 pH 6.5~7.0
③산소에 대한 영향: 혐기성
3)카탈라제: -
4)가스형성여부: -
6)15℃에서 생육: -
7)45℃에서 생육: +
8)인돌생산: -
9)젖산생산: +
10) Biomerieux 사의 API 20 A kit를 이용한 당 발효 실험 및 동정
당 1-10 | 사용 여부 | 당 11-19 | 사용 여부 |
1 urea | - | 11 esculine | - |
2 D-glucose | + | 12 glycerol | - |
3 D-mannitol | + | 13 D-cellobiose | - |
4 D-lactose | + | 14 D-mannose | - |
5 D-sucrose | + | 15 D-melezitose | - |
6 D-maltose | + | 16 D-rafficose | + |
7 salicin | - | 17 D-sorbitol | - |
8 D-xylose | + | 18 L-rhamnose | - |
9 L-arabinose | + | 19 D-trehalose | - |
10 gelatin | - |
한편, 본 발명의 면역증강 활성을 가지는 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 약학적 조성물은 단독 또는 약제학적으로 사용되는 부형제들과 함께 약제학적으로 통상으로 사용되는 방법에 따라 정제, 캡슐제 등과 같은 제재형태로 제제화 하여 사용될 수 있다.
사람의 경우, 통상적인 1일 투여량은 1~30mg/kg 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 실제 투여량은 투여경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 건강상태 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 한다.
물론, 본 발명의 면역증강 활성을 가지는 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 약학적 조성물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명의 면역증강 활성을 가지는 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 유효성분으로 함유하는 조성물은 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제, 발효유, 건강기능식품 등으로 사용될 수 있다. 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제 또는 건강기능식품으로 사용되는 경우, 각종 식품류, 발효유, 육류, 음료수, 초콜렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료, 비타민 복합제, 주류 및 그 밖의 건강기능식품일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 면역증강 활성을 가지는 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 유효성분으로 함유하는 발효유는 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401, 유산균 배양액, 또는 유산균 초음파 파쇄액 및 혼합과즙시럽을 일정비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 용기에 포장하여 발효유를 제조한다.
또한, 면역증강 활성을 가지는 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료는 혼합과즙시럽, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401 및 물을 일정한 비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 기능성 음료를 제조한다.
또한, 면역증강 활성을 가지는 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품은 상기 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 포함하는 것 이외에 영양보조 성분으로 비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드, 올리고당 등이 첨가될 수 있으며 여타의 식품 첨가물이 첨가되어도 무방하다.
본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401은 NF-κB 활성 증가 및 일산화질수(NO) 생성 증가, Th1 사이토카인(Cytokine) 인 IFN-γ 생성 증가에 따른 면역증강 활성이 뛰어나 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물, 건강기능식품, 기능성 음료, 발효제품 등으로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401의 마우스 대식세포에서 NF-κB 활성 증가 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401의 마우스 대식세포에서 NO(Nitric Oxide) 생성 증가 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401의 마우스의 비장세포에서 IFN-γ 생성 증가 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401의 마우스 대식세포에서 NO(Nitric Oxide) 생성 증가 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401의 마우스의 비장세포에서 IFN-γ 생성 증가 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.
<실시예 1>
비피도박테리움
인판티스
(
Bifidobacterium
infantis
)
HY8401
을 포함한 동결건조분말 제조
본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401 2 X 109 의 균수를 BL 액체 배지에 접종하고, 배양기에서 혐기 조건 하에서 37℃에서 24시간 동안 정치배양(batch culture)하였다. 이것을 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 균체를 세척한 후 다시 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 수거한 균체는 보존제인 탈지분유 분말과 1:1의 중량비로 섞어 동결건조하여 분말을 제조하였다.
한편, 본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401은 상기와 같이 동결건조된 분말 형태 또는 배양물 형태로 제공될 수 있다.
<실시예 2>
비피도박테리움 인판티스(
Bifidobacterium infantis
) HY8401을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 제조
액제의 제조
상기 실시예 1의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 포함한 동결건조 분말 100㎎, 이성화당 10g, 만니톨 5g을 통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
캡슐제의 제조
상기 실시예 1의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 포함한 동결건조분말 100㎎에 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎, 스테아린산 마그네슘 2㎎을 완전히 혼합한 후 약전 제제총칙 중 캡슐제 제조방법에 따라 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<실시예 3>
비피도박테리움 인판티스(
Bifidobacterium infantis
) HY8401을 유효성분으로 함유하는 발효유의 제조
본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 유효성분으로 함유하는 발효유를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 유산균 배양액은 원유 95.36중량%와 탈지분유(또는 혼합분유) 4.6중량%를교반하여 15℃에서의 비중은 1.0473~1.0475, 적정산도는 0.200~0.220%, pH는 6.55~6.70, 20℃에서의 브릭스(Brix0)는 16.3~16.5% 정도가 되도록 혼합하였다. 혼합 후에 이를 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)하고 40℃로 냉각한 뒤, 스트렙토코커스 써모필러스균과 유당분해효소(Valley laboratory, USA)를 각기 0.02중량%씩 첨가하고 6시간 동안 배양하여 BCP배지에서의 총 유산균 수가 1.0 X 109cfu/㎖이상, 적정산도가 0.89~0.91%, pH는 4.55~4.65가 되도록 하여 제조하였다. 그런 다음, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 5중량%, 혼합과즙농축액 56Brix0 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다. 그런 다음, 상기 유산균배양액 69.5중량%와 상기 실시예 1의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 포함한 동결건조분말 0.1중량% 및 상기 혼합과즙시럽 30.4중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 유효성분으로 함유하는 발효유를 제조하였다.
<실시예 4>
비피도박테리움 인판티스(
Bifidobacterium infantis
) HY8401을 유효성분으로 함유하는 야채주스의 제조
본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 유효성분으로 함유하는 야채주스를 제조하는 방법은 다음과 같다.
고구마, 단호박 등의 혼합야채즙 1.7중량%, 당근즙 52중량%, 토마토즙 42중량%, 시금치즙 1중량%, 양상추즙 2중량%, 셀러리즙 1중량%, 무수구연산 0.2중량%, 상기 실시예 1의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 포함한 동결건조분말 0.1중량%를 배합기에서 균일하게 혼합한 후 살균기를 이용하여 85~97℃에서 살균하여 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 유효성분으로 하는 야채주스를 제조하였다.
<실시예 5>
비피도박테리움 인판티스(
Bifidobacterium infantis
) HY8401을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료의 제조
본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 2.5중량%, 갈색설탕 2.5중량%, 혼합과즙농축액 56Brixㅀ 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
그리고, 상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 30.4중량%와 상기 실시예 1의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 포함한 동결건조분말 0.1중량% 및 나머지 정제수 69.5중량% 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 이를 유리병, 페트병 등 소포장 용기에 포장하여 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하였다.
<실시예 6>
비피도박테리움 인판티스(
Bifidobacterium infantis
) HY8401을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품의 제조
상기 실시예 1의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 포함한 동결건조 분말 0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기 실시예 1의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 포함한 동결건조 분말 100중량부에 대하여 10중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10중량부를 첨가, 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.
<시험예 1>
비피도박테리움
인판티스
(
Bifidobacterium
infantis
)
HY8401
의
NF
-κB 활성 증가 효능 측정
1-1. 세포 준비
293-hTLR4A-HA cell(Invivogen)을 DMEM(GIBCO), 10% FBS(GIBCO), 1X Antibiotic-Antimycotic(GIBCO), 1X Blasticidin(Invivogen)을 혼합한 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃에서 배양하였다.
1-2. 비피도박테리움 인판티스( Bifidobacterium infantis ) HY8401 시료 준비
(1)본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 BL 액체배지에 접종하여 37℃에서 20시간 혐기배양 하였다. 상기 배양액을 3,000rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 균체를 얻은 후 멸균된 PBS 완충용액을 이용하여 3회 세척하였다. 그런 다음, 균체를 다시 멸균된 PBS 완충용액에 현탁한 후 흡광도를 측정하여 OD600=1.0으로 조절한 후 현탁액을 100℃에서 20분간 살균처리 하였다. 이렇게 사멸된 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401 균을 3,000rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 균체를 얻은 후 멸균된 PBS 완충용액 1㎖에 현탁하여 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401 균 현탁액을 제조하여 시료를 준비하였다.
(2)락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY14-3, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY35-1, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY45-1 각각에 대하여도 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 20시간 배양한 후, 상기 (1)의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401 균 현탁액 제조방법과 동일한 방법으로 시료를 준비하였다.
1-3. 비피도박테리움 인판티스( Bifidobacterium infantis ) HY8401의 NF-κB 활성 증가 측정
(1)본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401의 NF-κB 활성 증가 효능을 측정하기 위하여, TLR 4(Toll-like receptor 4) 신호 전달에 의한 NF-κB의 핵 내 도입 및 전사활성을 간접적으로 측정하였다.
상기 1-1의 293-hTLR4A-HA(Invivogen) 세포는 TLR4 유전자를 HEK-293 세포에 도입한 것으로 TLR4를 통한 신호 전달에 의한 NF-κB의 핵 내 도입 및 전사활성을 간접적으로 측정하기 위해 10㎠ 세포배양접시에서 배양하였다. 또한, NK-κB의 핵 내 도입 및 전사활성을 간접적으로 측정하기 위해 NK-κB 결합 부분을 가진 Luciferase 발현 플리스미드 pNiFty-Luc(Invivogen)라는 reporter DNA를 상기 배양된 293-hTLR4A-HA 세포에 형질주입(transfection)시켰다. 형질주입을 위해 pNiFty-Luc과 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 각각 Opti-MEM Medium에 희석하여 동량으로 섞어 293-hTLR4A-HA(Invivogen) 세포와 함께 배양하였다. 6시간 후 배지를 갈아주고 형질주입된 293-hTLR4A-HA 세포를 균일하게 96-well plate(Corning Incorporated 3603)로 옮긴 후, 18시간을 배양하였다. 1㎍/㎖의 TLR4 agonist(E. coli LPS, invitrogen) 및 상기 1-2의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401(105bacteria/㎕) 1㎕를 상기 293-hTLR4A-HA 세포에 처리하여 6시간 동안 배양하였다.
발현되는 NF-κB의 양을 측정하기 위하여 Bright-GloTM Luciferase Assay System(Promega)을 이용하였는데, 상기 배양된 96-well plate에 100㎕의 루시퍼레이즈(luciferase) 완충용액을 넣어주고 2분간 상온에서 배양하였다. 배양이 완료된 후 Luminometer(Synergy HT, Bio-Tek)를 통하여 발광(Luminoscence)양을 측정하였다.
(2)상기 1-2의 각각의 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY14-3, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY35-1, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY45-1 시료를 사용하는 것을 제외하고는 상기 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401과 동일한 방법으로 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY14-3, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY35-1, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY45-1 각각에 대하여 NF-κB의 활성 증가 정도를 측정하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 가로축에는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY14-3, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY35-1, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY45-1, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 각각 'HY14-3', 'HY35-1', 'HY45-1', 'HY8401'로 하여 표시하였다.
'C'는 LPS 대신 물을 처리한 정상 대조군을 나타내며,
'LPS'는 TLR4 agonist인 LPS를 처리한 양성 대조군을 나타낸다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401은 NF-kB의 활성 증가율이 약 2.5배로 나타나 NF-κB의 활성 증가 효능이 우수함을 알 수 있었다.
<시험예 2>
비피도박테리움 인판티스(
Bifidobacterium infantis
) HY8401의 마우스 대식세포주에서 NO(Nitric Oxide) 생성 증가 효과 측정
본 발명의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401의 면역 증강 효과를 확인하기 위해 마우스의 대식세포주에서 염증반응물질 NO(Nitric Oxide)의 생성 증가를 측정하였다.
(1)마우스 유래의 대식세포주인 RAW 264.7을 한국세포주 은행에서 구입하여 사용하였으며, 우태아혈청(fetal bovine serum, 26140-079. 제조원: Gibco) 10%, 페니실린 100U/㎖ 및 스트렙토마이신 100ug/㎖을 포함한 DMEM 배지를 포함한 24 well plate에 5 x 105개의 RAW 264.7 세포를 접종하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2, 습윤조건 하에서 배양하였다. 상기 RAW 264.7 세포에서 NO(Nitric Oxide)를 유도하기 위하여 LPS(Lipopolysaccharide) 1㎍/㎖ 및 상기 1-2의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401(105bacteria/㎕) 1㎕를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 발현되는 NO(Nitric Oxide)의 양을 측정하기 위하여, 상기 배양된 배지에 그리스 시약을 배지:그리스 시약을 1:1의 중량비율로 혼합하고 상온에서 10분간 방치 후 흡광도 측정기로 파장 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
(2)상기 1-2의 각각의 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY14-3, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY35-1, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY45-1 시료를 사용하는 것을 제외하고는 상기 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401과 동일한 방법으로 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY14-3, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY35-1, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY45-1 각각에 대하여 NO(Nitric Oxide)의 생성 증가 정도를 측정하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2의 가로축에는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY14-3, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY35-1, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY45-1, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401을 각각 'HY14-3', 'HY35-1', 'HY45-1', 'HY8401'로 하여 표시하였다.
'C'는 LPS 대신 물을 처리한 정상 대조군을 나타내며,
'LPS'는 TLR4 agonist인 LPS를 처리한 양성 대조군을 나타낸다.
<시험예 3>
비피도박테리움 인판티스(
Bifidobacterium infantis
) HY8401의 마우스 비장세포에서 T
h
1 면역 증강 효과 측정
마우스 비장세포에서 T helper cell 1(Th1) 사이토카인(cytokine)인 IFN-γ를 측정함으로써 Th1 면역 증강 효과를 확인하였다.
Balb/C 체중 20~21g(6 주령) 마우스 암컷을 (주)중앙동물실험에서 구입하여 실험에 사용하였다. 모든 준비는 무균 환경에서 실시하였다. 상기 구입한 마우스를 일산화탄소로 안락사 시킨 후 부검하여, 비장을 적출하고 미리 준비해 둔 두 개의 슬라이드 글라스를 이용하여 비장세포를 분리하였다. 상기 분리된 비장세포를 1500rpm으로 5분간 원심분리 후 상층액은 버리고 탭핑 후 RBC 라이시스 버퍼(Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, USA)를 0.75㎖ 넣고 1분간 반응 후 RPMI 1640 배양액(HyClone Laboratories, Inc.; Logan, UT, USA)을 이용하여 3회 세척하여 비장세포를 얻었다.
IFN-γ 측정을 위해서 분리한 비장세포 2 ⅹ 106 세포/㎖을 24 well 플레이트에서 콘카나발린 A(Con A)(Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, USA) 1㎍/㎖로 자극하고 상기 1-2의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401(106 bacteria/㎕) 20㎕를 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 상기 48시간 동안 배양 후 상층액을 모아 IFN-γ의 농도를 Mouse CytoSet Kit(Invitrogen, CA, USA)로 sandwich ELISA를 측정하였고, 표준곡선을 그려 농도를 계산하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다.
'ConA'는 콘카나발린 A 만을 처리한 양성대조군을 나타낸다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 비피도박테리움 인판티스 HY8401은 IFN-γ의 생성이 대조군 대비 약 3.5배로 증가하여, Th1 면역증강 효능이 우수함을 알 수 있었다.
Claims (13)
- 삭제
- 마우스의 대식세포에서 면역지표인 NF-κB 활성 및 NO(Nitric Oxide) 생성을 유도함으로써 면역증강 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401(기탁번호 : KCTC 12419BP).
- 마우스의 비장세포에서 IFN-γ(inerferon-γ) 생성을 유도함으로써 면역증강 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401(기탁번호 : KCTC 12419BP).
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제2항 또는 제3항의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401(기탁번호 : KCTC 12419BP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 기능성 음료.
- 삭제
- 제2항 또는 제3항의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401(기탁번호 : KCTC 12419BP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 건강기능식품.
- 삭제
- 제2항 또는 제3항의 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) HY8401(기탁번호 : KCTC 12419BP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 발효제품.
- 삭제
- 제11항에 있어서,
상기 발효제품은 발효유 또는 야채주스인 것을 특징으로 하는 발효제품.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20130110656A KR101492004B1 (ko) | 2013-09-13 | 2013-09-13 | 면역증강 활성을 가지는 비피도박테리움 인판티스 hy8401 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20130110656A KR101492004B1 (ko) | 2013-09-13 | 2013-09-13 | 면역증강 활성을 가지는 비피도박테리움 인판티스 hy8401 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 |
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KR20130110656A KR101492004B1 (ko) | 2013-09-13 | 2013-09-13 | 면역증강 활성을 가지는 비피도박테리움 인판티스 hy8401 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2021235486A1 (ja) * | 2020-05-22 | 2021-11-25 | 森永乳業株式会社 | 腸管発達促進用組成物、肺機能改善用組成物および免疫機能向上用組成物 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20050062495A (ko) * | 2005-06-03 | 2005-06-23 | (주) 피엘바이오 | 알레르기 질환 예방 및 치료 기능을 가진 비피도박테리움인판티스 |
KR20050080629A (ko) * | 2004-02-10 | 2005-08-17 | 매일유업주식회사 | 비피도박테리움 인팬티스 Maeil-K9 유래의 세포성분함유 추출물 및 이를 함유하는 위암 및 대장암의 예방용및 치료용 조성물 |
-
2013
- 2013-09-13 KR KR20130110656A patent/KR101492004B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
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KR20050080629A (ko) * | 2004-02-10 | 2005-08-17 | 매일유업주식회사 | 비피도박테리움 인팬티스 Maeil-K9 유래의 세포성분함유 추출물 및 이를 함유하는 위암 및 대장암의 예방용및 치료용 조성물 |
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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Microbiol. Immunol., Vol.32, pp.689-698(1998.) * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2021235486A1 (ja) * | 2020-05-22 | 2021-11-25 | 森永乳業株式会社 | 腸管発達促進用組成物、肺機能改善用組成物および免疫機能向上用組成物 |
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