JP2021527415A

JP2021527415A - ロイコノストック属菌株を含む肝機能改善用組成物

Info

Publication number: JP2021527415A
Application number: JP2020570102A
Authority: JP
Inventors: キム，ユン−クン; ジンヨム，キュ
Original assignee: コエンバイオカンパニーリミテッド
Priority date: 2018-06-19
Filing date: 2019-06-12
Publication date: 2021-10-14
Also published as: KR20190143336A; CN112351692A; KR102283127B1

Abstract

本発明は、肝機能改善用ロイコノストックホルツアップフェルリ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｈｏｌｚａｐｆｅｌｉｉ）菌株及びその用途に関するものであり、本発明のロイコノストックホルツアップフェルリ菌株は、肝の機能を効果的に改善することができるので、機能性食品組成物を含む多様な食品組成物、薬学的組成物、動物飼料用組成物など、様々な分野に適用できるものと期待される。
【選択図】図２

Description

本発明は、ロイコノストック属菌株、その培養液、その濃縮物、又はその乾燥物を含む肝機能改善用組成物等に関するものである。

肝（ｌｉｖｅｒ）は、体内の解毒、胆汁排泄、脂質などの代謝作用、各種栄養素の貯蔵、造血又は血液凝固、循環血液量の調節など、多くの機能で重要な役割を果たしている器官の一つで、肝の機能が低下すると、多様な疾病が引き起こされる。最近発表されたところによると、韓国人の肝がんによる死亡率は１０万人当たり２３．４人で世界１位であり、慢性肝疾患の場合にも１０万人当たり２８．８人で世界３位であることが確認された。また、韓国の統計庁が発表したところによると、韓国の４０代の場合、１０万人当たり５６．１人が肝関連疾病を患っており、これは国内の死亡原因の主要原因であると発表された。代表的な肝関連疾病としては、脂肪肝、アルコール性肝炎、アルコール性肝硬変、肝がんなどがあり、最近増えつつある精神的ストレスと喫煙は、肝損傷を加重させて人体の解毒作用を抑制し、他の疾病の原因にもなる。（韓国公開特許１０−２０１６−０１０３８０３号公報）

このような肝関連疾病による弊害が大きくなるにつれ、最近では疾病治療剤の市場だけでなく、肝機能の改善につながる機能改善用製品に対する関心と消費者のニーズも高まっているのが実情である。

韓国公開特許１０−２０１６−０１０３８０３号公報

本発明は、前記のような従来技術上の問題点を解決するために案出されたものであり、ロイコノストック属菌株、その培養液、その濃縮物、又はその乾燥物を含む肝機能改善用組成物等を提供することをその目的とする。

しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、上述した課題に制限されず、言及されていない他の課題らは、以下の記載から当業界で通常の知識を有する者に明確に理解されるだろう。

本発明は、ロイコノストックホルツアップフェルリ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｈｏｌｚａｐｆｅｌｉｉ）菌株、その培養液、その濃縮物、又はその乾燥物を含む肝機能改善用食品組成物を提供する。

また、本発明は、ロイコノストックホルツアップフェルリ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｈｏｌｚａｐｆｅｌｉｉ）菌株、その培養液、その濃縮物、又はその乾燥物を有効成分として含む、肝関連疾病の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

本発明の一具体例において、前記培養液は、ロイコノストックホルツアップフェルリ由来細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）を含むことができ、これはロイコノストックホルツアップフェルリから自然に分泌されたものであることができ、又は追加で添加することができるのを特徴とする。前記細胞外小胞は、ロイコノストックホルツアップフェルリの培養液、又はロイコノストックホルツアップフェルリを含む食品、又はロイコノストックホルツアップフェルリを加熱又は超音波等により死滅させた後に獲得された上澄み液から分離することができ、自然に又は人工的に分泌されたものであり得るが、これに制限されない。

本発明の他の具体例において、前記組成物は肝関連疾病の予防又は改善効果を有することができ、前記肝関連疾病は、好ましくは血清内の連鎖状球菌の減少に関連する疾病及び／又は炎症性肝疾患に関連する疾病であり、より好ましくは肝がん、肝炎、肝硬変、肝不全等であるが、肝から誘発される疾病であれば、これに制限されない。

本発明のもう一つの具体例において、前記ロイコノストックホルツアップフェルリは、好ましくは１日の投与量が５Ｘ１０^４乃至５Ｘ１０^１０ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）／ｍＬであり得るが、投与による副作用を誘導しない投与量であれば、これに制限されない。

本発明のもう一つの具体例において、前記組成物は、好ましくはロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコックス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属などの菌株を追加で含むことができるが、食品組成物に含まれると知られている菌株であれば、これに制限されない。

本発明のもう一つの具体例において、前記組成物は食品学的に許容可能な担体又は薬学的に許容可能な担体を追加で含むことができる。

また、本発明は、ロイコノストックホルツアップフェルリ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｈｏｌｚａｐｆｅｌｉｉ）菌株、その培養液、その濃縮物、又はその乾燥物を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む肝関連疾病の治療方法を提供する。

また、本発明は、ロイコノストックホルツアップフェルリ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｈｏｌｚａｐｆｅｌｉｉ）菌株、その培養液、その濃縮物、又はその乾燥物を有効成分として含む組成物の肝関連疾病の治療用途を提供する。

本発明は、肝機能改善用ロイコノストックホルツアップフェルリ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｈｏｌｚａｐｆｅｌｉｉ）菌株及びその用途に関するものであり、本発明のロイコノストックホルツアップフェルリ菌株は、副作用無しに肝機能を効果的に改善するだけでなく、摂取を通じて炎症を効果的に減少させることができる。そのため、肝の炎症に関連する疾病を含む様々な肝疾患の予防、改善及び／又は治療効果を持つので、機能性食品組成物を含む多様な食品組成物、薬学的組成物、動物飼料用組成物など、様々な組成物への適用が可能であると期待される。

図１は、本発明の一実施形態に係る肝硬変又は肝がん患者の血清細菌メタゲノムの結果を示した図面である。図２は、本発明の一実施形態に係るロイコノストックホルツアップフェルリ菌株の肝機能改善効果を確認した結果を示した図面である。図３は、本発明の一実施形態に係るロイコノストックホルツアップフェルリ菌株の肝細胞死滅抑制効果を確認した結果を示した図面である。図４は、本発明の一実施形態に係るロイコノストックホルツアップフェルリ培養液由来細胞外小胞の細胞毒性の有無を確認した結果を示した図面である。図５は、本発明の一実施形態に係るロイコノストックホルツアップフェルリ培養液由来細胞外小胞の炎症反応を誘導するかどうかを確認した結果を示した図面である。図６は、本発明の一実施形態に係るロイコノストックホルツアップフェルリ培養液由来細胞外小胞の抗炎症効果を確認した結果を示した図面である。

本発明のロイコノストックホルツアップフェルリ菌株は、菌株の摂取又は投与を通じて体内有益菌の増加及び肝細胞死滅を抑制し、副作用無しに肝機能を効果的に改善する。それだけでなく、摂取を通じて炎症誘発を効果的に抑制し、肝関連疾病の予防又は治療効果を示すので、医薬、食品、飼料など様々な分野で効果的に使用できるものと期待される。

本明細書において、「ロイコノストックホルツアップフェルリ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｈｏｌｚａｐｆｅｌｉｉ）」とは、形態学的にグラム陽性菌であり、ロイコノストックホルツアップフェルリＣｅｂ−ｋｃ−００３として、２０１６年０４月１１日、韓国微生物保存センターにＫＣＣＭ１１８３０Ｐで寄託されており、１６ｓｒＤＮＡの結果、既存のロイコノストックホルツアップフェルリと９９％の相同性を有する。本発明のロイコノストックホルツアップフェルリは、通常、バチルス又はロイコノストック属菌株の培養方法を通じて培養することができ、培地は天然培地又は合成培地を使用することができる。培地の炭素源としては例えば、グルコース、スクロース、デキストリン、グリセロール、澱粉などが使われ、窒素源としては、ペプトン、肉類抽出物、酵母抽出物、乾燥された酵母、大豆、アンモニウム塩、ナイトレート、及びその他の有機又は無機窒素含有化合物が使用されることがあるが、このような成分に限定されるものではない。培地に含まれる無機塩としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、鉄、カリウムなどが使用されることがあるが、これらに限定されるものではない。前記炭素源、窒素源及び無機塩の成分以外に、アミノ酸、ビタミン、核酸、及びそれに関連する化合物らを培地に添加することができる。本発明の菌株は、培養温度条件は２０〜４０℃の温度範囲で１２時間乃至４日間培養することができる。また、培養培地に、黎豆、熟地黄、甘草、川、杜仲、桂皮、トウキ、石菖蒲、何首烏、側柏葉、ショウガ、柏子仁、茜草、升麻、蔓荊子などの生薬製剤、その抽出物、又はその混合物を添加して培養し、この培養物を使用することにより、本菌株の肝又は臓機能改善の効果をさらに改善することができる。

本明細書において、「培養液（ｃｕｌｔｕｒｅｂｒｏｔｈ）」とは、菌体を含む培養原液であることができ、また、培養上澄み液を除去し、又は濃縮した菌体（濃縮物）であることができる。又は、ロイコノストック菌株由来細胞外小胞を含む培養上澄み液であることができる。前記培養液の組成は、通常のロイコノストック菌株培養に必要な成分のみならず、ロイコノストック菌株の生長に相乗的に作用する成分を追加的に含むことができ、これによる組成は、当業界の通常の技術を有する者であれば容易に選択することができる。前記細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）は、様々な細菌から分泌されるナノサイズの膜でできた構造物を意味し、本発明では、ロイコノストック菌株の培養液、又はロイコノストック菌株を含む食品から分離することができ、自然に、又は人工的に分泌されたものであることができるが、これに制限されない。培養液又は食品から細胞外小胞を分離する方法は、細胞外小胞を分離することができれば、特に制限されない。例えば、遠心分離、超高速遠心分離、フィルターによるろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー、フリーフロー電気泳動、又は毛細管電気泳動などの方法、及びこれらの組み合わせを利用して細胞外小胞を分離することができ、また不純物除去のための洗浄、収得された細胞外小胞の濃縮などの過程を追加で含むことができる。

本明細書において、「組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」とは、ロイコノストックホルツアップフェルリを有効成分として含む医薬、食品、動物飼料用、薬学的、飲料用、乳酸菌製剤等であることができるが、本発明のロイコノストックホルツアップフェルリ菌株を含む組成物であれば、これに制限されない。前記医薬用組成物は、医薬部外品又は医薬的製剤であり、前記食品組成物は食品、健康食品、健康補助食品、又は健康機能性食品であることができるが、これに制限されない。

なお、菌株の状態は液状状態又は乾燥状態であることができ、乾燥方法は、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥等が可能であるが、これに制限されない。

本明細書において、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」とは、本発明に係る組成物の投与により、肝関連疾病などの疾患を抑制したり、発病を遅らせるすべての行為を意味する。

本明細書において、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、本発明に係る組成物の投与により、肝関連疾病等の症状が好転したり、有利に変更されるすべての行為を意味する。

本明細書において、「改善（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）」とは、治療される状態に関連するパラメータ、例えば症状の程度を少なくとも減少させるすべての行為を意味する。

本明細書において、「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」とは、疾病の予防又は治療を必要とする対象を意味し、具体的には、人間又は非−人間である霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット（ｒａｔ）、犬、猫、馬、牛などの哺乳類を意味する。

本発明における前記食品組成物は、各種食品類、例えば、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、乳酸菌複合剤、健康補助食品類、機能性食品類等に使用することができ、丸剤、粉末、顆粒、浸剤、錠剤、カプセル又は飲料の形態で使用することができる。このとき、食品又は飲料中の前記ロイコノストックホルツアップフェルリ菌株、その培養液、その濃縮物又はその乾燥物の量は、一般的に本発明の食品組成物の場合、全体の食品重量の０．０１乃至１５重量％で加えることができ、健康飲料組成物の場合、１００ｍＬを基準に０．０２乃至１０ｇ、好ましくは０．３乃至１ｇの割合で加えることができる。

本発明の食品組成物は、当業界に通常の食品添加剤、例えば、香味剤、風味剤、着色剤、充填剤、安定化剤などを含むことができる。本発明に係る食品組成物は、必須成分として、前記ロイコノストックホルツアップフェルリ菌株、その培養液、その濃縮物、又はその乾燥物以外に添加される成分には、特別な制限はなく、通常の食品のように、種々の香味剤又は天然炭水化物等を追加成分として含有することができる。前記天然炭水化物の例としては、単糖（ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、例えば、ブドウ糖、フルクトースなど；二糖（ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、例えば、マルトース、スクロースなど；多糖（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなど；のような通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウディオサイドＡ、グリチルリチン等））及び合成香味剤（サッカリン、アスパルタム等）を有利に使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍＬ当たり一般的には約１乃至２０ｇ、好ましくは約５乃至１２ｇである。

前記の他に、本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤等の風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。このような成分は、独立的に、又は組み合わせて使用することができる。このような添加剤の割合は、それほど重要ではないが、本発明の組成物１００重量部あたり０乃至約２０重量部の範囲で選択されるのが一般的である。

本明細書において、「薬学的組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」とは、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末又は飲料形態であることが特徴であり、前記薬学的組成物は、人間を対象とすることを特徴とする。前記薬学的組成物は、これらに限定されるものではないが、それぞれ通常の方法により、散剤、顆粒剤、カプセル、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射用液の形に剤形化して使用することができる。本発明の薬学的組成物は、薬剤的に許容可能な担体を含むことができる。薬剤学的に許容される担体は、経口投与時には結合剤、滑沢剤、崩解剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬学的組成物の剤形は、上述のように薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造することができる。例えば、経口投与時には錠剤、トローチ、カプセル、エリクシル（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウェハー等の形で製造することができ、注射剤の場合には、単位投与アンプル又は多数回投与の形で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放性製剤等に剤形することができる。

一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、又は鉱油などを使用することができる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などを追加で含むことができる。

本発明に係る薬学的組成物の投与経路は、これらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下又は直腸が含まれる。経口又は非経口投与が望ましい。本願に使用される用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入技術を含む。本発明の薬学的組成物はまた、直腸投与のための坐剤の形で投与されることもある。

本発明の薬学的組成物は、使用された特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、投与時間、投与経路、排泄率、薬物配合及び予防、又は治療される特定疾患の重症を含む様々な要因によって多様に変えることができる。前記薬学的組成物の投与量は、患者の状態、体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択され、１日０．０００１乃至５０ｍｇ／ｋｇ又は０．００１乃至５０ｍｇ／ｋｇに投与することができる。投与は一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。前記投与量はどんな面でも、本発明の範囲を限定するものではない。本発明に係る医薬的組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に剤形化することができる。

本発明のロイコノストックホルツアップフェルリの投与量又は摂取量は、例えば、５ｘ１０^４乃至５ｘ１０^８ＣＦＵ／ｍＬのロイコノストックホルツアップフェルリＣｅｂ−ｋｃ−００３（ＫＣＣＭ１１８３０Ｐ）菌株、好ましくは１ｘ１０^６乃至１ｘ１０^８ＣＦＵ／ｍｌのロイコノストックホルジャプフェリＣｅｂ−ｋｃ−００３（ＫＣＣＭ１１８３０Ｐ）の量で、１回当たり３０ｍＬ乃至１００ｍＬを、一日１回乃至４回投与することができる。一例において、１ｘ１０^６乃至１ｘ１０^８ＣＦＵ／ｍＬのロイコノストックホルツアップフェルリＣｅｂ−ｋｃ−００３（ＫＣＣＭ１１８３０Ｐ）の量で、１回当たり５０ｍＬを１日２回乃至４回投与することができる。より具体的には、１ｘ１０^６乃至１ｘ１０^８ＣＦＵ／ｍＬのロイコノストックホルツアップフェルリＣｅｂ−ｋｃ−００３（ＫＣＣＭ１１８３０Ｐ）の量を１回当たり５０ｍＬ乃至１００ｍＬを１日１回乃至２回投与することができる。さらに具体的には、１ｘ１０^６乃至１ｘ１０^８ＣＦＵ／ｍＬのロイコノストックホルツアップフェルリＣｅｂ−ｋｃ−００３（ＫＣＣＭ１１８３０Ｐ）を朝食前３０分に５０ｍＬ乃至１００ｍＬ１回投与し、晩食前３０分又は就寝前に５０ｍＬ乃至１００ｍＬ１回投与することができる。しかし、このような投与量又は摂取量は、個々人の体重、年齢、性別、健康状態、治療、予防又は改善しようとする主な症状、投与時間、投与方法、重症度等によって変わることができる。

以下、本発明の理解を助けるために、下記の実施例を示す。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、下記の実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。

実施例１：肝関連疾病患者の血清細菌メタゲノム解析
肝関連疾病を有する患者の血清内細菌のメタゲノム解析のために、肝硬変患者９９人及び肝がん患者９４人の血清を獲得した。対照群としては、健常者９９人の血清を利用した。血清から細菌由来細胞外小胞を分離し、細胞外小胞からＤＮＡを分離するため、１０ｍＬチューブに獲得した血清を入れた後、４℃で３，５００Ｘｇで１０分間遠心分離してペレット（ｐｅｌｌｅｔ）と上澄み液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を分離し、分離されたペレットと上澄み液はそれぞれ新しい１０ｍＬチューブに添加した。上澄み液は０．２２μｍフィルターを利用して細菌と異物を除去した後に、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｆｉｌｔｅｒ５０ｋＤに移して４℃で１，５００Ｘｇで１５分間遠心分離して、５０ｋＤより小さいサイズの物質は除去した後に総容量が１０ｍＬになるように濃縮させた。そして、また０．２２μｍフィルターを利用して細菌と異物をきれいに除去した後に、Ｔｙｐｅ９０ｔｉローターを利用して４℃で１５０，０００Ｘｇで３時間超高速遠心分離を実施した。超高速遠心分離後に上澄み液は除去し、ペレットはリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で再浮遊させて保管した。その後、再浮遊したペレット１００μＬを新しいチューブに添加した後に、１００℃加熱ブロック（ｈｅａｔｂｌｏｃｋ）で加熱させ、細胞外小胞内部のＤＮＡが脂質外部に放出されるようにした。そして氷を利用して冷却した後、４℃で１０，０００Ｘｇで３０分間遠心分離して上澄み液のみを分離した後に、ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を利用して上澄み液内のＤＮＡ量を定量した。血清から分離したＤＮＡに細菌由来ＤＮＡが存在するかを確認するために、表１に記載された１６ｓｒＤＮＡプライマーを利用してポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施してＤＮＡを増幅した。

増幅されたＤＮＡは、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑｓｅｑｕｅｎｃｅｒを利用して塩基配列解析を実施し、結果はＳｔａｎｄａｒｄＦｌｏｗｇｒａｍＦｏｒｍａｔ（ＳＦＦ）ファイルで出力した。出力されたＳＦＦファイルは、ＧＳＦＬＸソフトウェア（ｖ２．９）を利用して塩基配列ファイル（ｆａｓｔａ）とヌクレオチドクオリティスコア（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｑｕａｌｉｔｙｓｃｏｒｅ）ファイルに変換し、リードの信用度評価を確認した。ウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ２０ｂｐｓ）平均ｂａｓｅｃａｌｌ正確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）が９９％未満（Ｐｈｒｅｄクオリティスコア（Ｐｈｒｅｄｑｕａｌｉｔｙｓｃｏｒｅ）＜２０）の部分を除き、リードの長さが３００ｂｐｓ以上であるものだけを用いた（Ｓｉｃｋｌｅｖｅｒｓｉｏｎ１．３３）。結果解析のために、ＵＣＬＵＳＴ及びＵＳＥＡＲＣＨを利用して塩基配列類似度に応じたクラスタリングを実施し、ＢＬＡＳＴＮ及びＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓの１６ｓｒＤＮＡ塩基配列データベース（１０８，４５３個の塩基配列）を利用して、９７％以上の塩基配列類似度を有する細菌を解析し（ＱＩＩＭＥ）、操作的分類単位（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌＴａｘｏｎｏｍｙＵｎｉｔ；ＯＴＵ）を解析した。統計解析のために、ｔ−ｔｅｓｔを利用し、各群の平均分布の割合が２倍以上異なり、ｐ値が０．０５以下の場合にして対照群と実験群で有意に異なる割合で存在する細菌を選定した。その結果は図１及び表２に示した。

図１及び表２に示すように、対照群と比較して肝関連疾病を保有している患者、すなわち、肝硬変及び肝がん患者において連鎖状球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細菌が有意に減少したことを確認した。前記の結果を通じて、血清内の連鎖状球菌細菌の減少を通じて肝関連疾病かどうかを診断できるということが確認できた。

実施例２：ロイコノストックホルツアップフェルリ菌株の粉末及び培養液製造
ロイコノストックホルツアップフェルリ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｈｏｌｚａｐｆｅｌｉｉ）菌株の腸又は肝機能の改善能を確認するために、韓国微生物保存センターに寄託されているロイコノストックホルツアップフェルリＣｅｂ−ｋｃ−００３（ＫＣＣＭ１１８３０Ｐ）菌株の分譲を受け、３％塩化ナトリウムが添加されたＢＨＩ固体培地で培養した。ロイコノストックホルツアップフェルリの粉末は、培養された菌株を凍結乾燥して製造し、培養液製造のためには精製水１００Ｌにデキストロース２ｋｇ、全脂粉乳１．５ｋｇ、及び酵母抽出液０．０５ｋｇを添加した後、１２１℃で１５乃至３０分間高温及び高圧で滅菌した後に、室温で冷却した。そして、ロイコノストックホルツアップフェルリＣｅｂ−ｋｃ−００３菌株を無菌状態で０．２乃至０．４Ｌ接種した後、３５℃内外で２乃至３日間培養して、ロイコノストックホルツアップフェルリ培養液を製造した。

実施例３：ロイコノストックホルツアップフェルリ菌株の肝機能改善効果確認
ロイコノストックホルツアップフェルリ菌株の肝機能改善効果を確認するために、合計２０名（男性８名及び女性１２名）の志願者を募集した。志願者の平均年齢は３２．０±５．４歳で、男性の平均年齢は３１．８±３．６歳（２６歳乃至３７歳）、女性の平均年齢は３２．２±６．３歳（２１歳乃至４７歳）であった。対象者にはロイコノストックホルツアップフェルリＣｅｂ−ｋｃ−００３菌株培養液を１Ｘ１０^６乃至１Ｘ１０^８ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）／ｍＬになるように、計４週間１日２回、毎日経口投与した。そして、実施例１と同一の方法により、臨床試験開始当日（摂取前）と４週間後（摂取後）に支援者の血清を採取し、血清内に含まれている連鎖状球菌の変化を確認した。その結果は、図２及び表３に示した。

図２及び表３に示すように、ロイコノストック菌株摂取後に肝硬変及び肝がんのバイオマーカーである連鎖状球菌の数が有意に増加していることを確認した。前記の結果を通じて、ロイコノストック菌株の摂取により肝疾患である肝硬変、肝がん等の誘発を抑制することができるだけでなく、体内有益菌の増加により肝関連疾病の症状を予防、改善及び／又は抑制することができるということを確認した。

また、追加的に肝機能改善効果を確認するために、血液中の肝関連疾病の指標であるアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ａｓｐａｒｔａｔｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＳＴ）の数値を確認した。アスパラギン酸アミノ基転移酵素は肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）に存在し、細胞が壊死すると血中に流出して血液中の数値が増加するようになる。その結果は、図３に示した。

図３に示すように、アスパラギン酸アミノ基転移酵素の数値が摂取前には３４．４±２２．８ＩＵ／Ｌであったが、摂取後には２１．７±８．２ＩＵ／Ｌと有意に減少したことを確認した。前記結果を通じて、ロイコノストック菌株の摂取により肝細胞死滅を減少させることができ、これを通じて、肝関連疾病を予防できることを確認することができた。

また、前記ロイコノストックホルツアップフェルリ菌株以外に追加でロイコノストックメセンテロイデスＫＣＣＭ１１８２７Ｐ、ラクトバチルスサケイＫＣＣＭ１１８４１Ｐ、エンテロコッカスフェシウムＫＣＣＭ１１９０９Ｐ、ブレビバチルスレウスゼリＫＣＣＭ１１９１１Ｐ、及びラクトバチルスファーメンタムＫＣＣＭ１１９１０Ｐを含む混合菌株培養液を同一に志願者２０人に４週間１日２回経口投与し、血清内に含まれている細菌の変化を確認した。その結果、ロイコノストックホルツアップフェルリ菌株の単独投与時と比較して、血清内の連鎖状球菌の数がさらに増加したことが確認できた。

実施例４：ロイコノストックホルツアップフェルリ培養液由来細胞外小胞の抗炎症効果確認
４．１．ロイコノストックホルツアップフェルリ培養液由来細胞外小胞の細胞毒性確認
ロイコノストックホルツアップフェルリ培養液由来細胞外小胞の細胞毒性を確認するために、実施例２と同一の方法で準備されたロイコノストックホルツアップフェルリＣｅｂ−ｋｃ−００３菌株培養液を準備した。そして、空隙の大きさが０．４５μｍであるＢｏｔｔｌｅＴｏｐＶａｃｕｕｍＦｉｌｔｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を利用して、培養液から細胞が除去された上澄み液を獲得した。獲得した上澄み液は、また０．２２μｍＢｏｔｔｌｅＴｏｐＶａｃｕｕｍＦｉｌｔｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を通過させて上澄み液に残っている細胞の残余物は除去し、ロイコノストックホルツアップフェルリ培養液由来細胞外小胞を分離した。分離した細胞外小胞は、リン酸緩衝生理食塩水を利用して、０．０１、０．１、１及び１０μｇ／ｍＬの濃度で製造した後に、マウス腹腔大食細胞（Ｒａｗ２６４．７）に処理し、１２時間培養した後に、細胞生存率（ｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を測定した。細胞生存率は培養された細胞をトリパンブルーで染色した後に、Ｎｅｕｂａｕｅｒｃｈａｍｂｅｒを利用して、生きている細胞の数を測定し、陰性対照群の生きている細胞数に対する百分率として細胞生存率を計算した。陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；ＮＣ）には、リン酸緩衝生理食塩水を添加して培養し、陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；ＰＣ）には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）由来細胞外小胞（Ｅ．ｃｏｌｉＥＶ）１μｇ／ｍＬを添加して培養した。細胞外小胞を分離するためには、大腸菌をＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地に接種して、３７℃で２００ｒｐｍに２４時間培養した。そして、空隙の大きさが０．４５μｍであるＢｏｔｔｌｅＴｏｐＶａｃｕｕｍＦｉｌｔｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を利用して細胞が除去された上澄み液を獲得した。獲得した上澄み液は、また０．２２μｍＢｏｔｔｌｅＴｏｐＶａｃｕｕｍＦｉｌｔｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を通過させて上澄み液に残っている細胞の残りは除去し、大腸菌の細胞外小胞を分離して準備した。その結果は図４に示した。

図４に示すように、ロイコノストックホルツアップフェルリ培養液由来細胞外小胞は、高濃度でも細胞毒性を示さず、安定して使用できることを確認した。

４．２．ロイコノストックホルツアップフェルリ由来細胞外小胞の炎症反応誘導確認
ロイコノストックホルツアップフェルリ培養液由来細胞外小胞が細胞の炎症反応を誘導するかどうかを確認するために、実施例４．１と同一の方法で準備されたロイコノストックホルツアップフェルリ培養液由来細胞外小胞をリン酸緩衝生理食塩水を利用して、０．０１、０．１、１及び１０μｇ／ｍＬの濃度で製造した後に、Ｒａｗ２６４．７細胞株に処理し、１２時間培養した後に炎症性サイトカインであるＩＬ−６及びＴＮＦ−αの分泌量をＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）を利用して確認した。陰性対照群には、リン酸緩衝生理食塩水を添加して培養し、陽性対照群には、大腸菌由来細胞外小胞（Ｅ．ｃｏｌｉＥＶ）１μｇ／ｍＬを添加して培養した。その結果は図５に示した。

図５に示すように、陽性対照群である大腸菌由来細胞外小胞はＲａｗ２６４．７細胞株の炎症性サイトカインの分泌量を著しく増加させたが、ロイコノストックホルツアップフェルリ培養液由来細胞外小胞の場合には、１０μｇ／ｍＬの高濃度で処理した場合にのみ若干増加することを確認した。

４．３．ロイコノストックホルツアップフェルリ由来細胞外小胞の抗炎症効果を確認
ロイコノストックホルツアップフェルリ培養液由来細胞外小胞の抗炎症効果を確認するために、実施例４．１と同一の方法で準備されたロイコノストックホルツアップフェルリ培養液由来細胞外小胞を、リン酸緩衝生理食塩水を利用して、０．０１、０．１、１及び１０μｇ／ｍＬの濃度で製造し、Ｒａｗ２６４．７細胞株に処理して１２時間培養した後に、大腸菌由来細胞外小胞を１μｇ／ｍＬの濃度で追加で処理し、６時間培養し、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの分泌量を、ＥＬＩＳＡを利用して確認した。対照群（Ｃｏｎｔ）には、既に抗炎症効果を示すと知られているＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ由来細胞外小胞１μｇ／ｍＬを利用して同一の方法で実験を行った。その結果は図６に示した。

図６に示すように、ロイコノストックホルツアップフェルリ培養液由来細胞外小胞の前処理は炎症性反応を効果的に予防及び抑制することができることを確認した。

前記の結果を通じて、本発明のロイコノストックホルツアップフェルリ菌株は細胞毒性を示さないので、安定的に使用できるだけでなく、肝機能改善効果を通じて関連疾病の誘発を効果的に予防又は抑制できるということが確認した。また、ロイコノストックホルツアップフェルリ菌株、培養液又は培養液由来細胞外小胞の摂取は、肝の炎症誘発を効果的に予防できるため、肝炎、肝硬変、肝がん等の炎症性肝疾患の発病率を著しく下げることができることを確認した。また、ロイコノストックホルツアップフェルリ菌株の他に、既に知られている他の効能を持つ物質、化合物、菌株などの混合を通じて、さらに改善された効果を獲得することができることを確認した。

前記述べた本発明の説明は例示のためのものであり、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形に容易に変形可能であることが理解できるだろう。したがって、以前記述した実施例らは、すべての面で例示的なものであり、限定的でないことを理解しなければならない。

本発明は、肝機能改善用ロイコノストックホルツアップフェルリ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｈｏｌｚａｐｆｅｌｉｉ）菌株及びその用途に関するものであり、本発明のロイコノストックホルツアップフェルリ菌株は、副作用無しに肝機能を効果的に改善するだけでなく、摂取を通じて炎症を効果的に減少させることができるため、肝炎症関連疾病を含む様々な肝疾患の予防、改善及び／又は治療に幅広く使用することができる。

Claims

ロイコノストックホルツアップフェルリ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｈｏｌｚａｐｆｅｌｉｉ）菌株、その培養液、その濃縮物、又はその乾燥物を含む、肝機能改善用食品組成物。
前記培養液は、ロイコノストックホルツアップフェルリ由来細胞外小胞を含むことを特徴とする、請求項１に記載の食品組成物。
組成物は、肝関連疾病の予防効果を有することを特徴とする、請求項１に記載の食品組成物。
前記肝関連疾病は、血清内の連鎖状球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｏｃｃｕｓ）細菌の減少又は炎症性肝疾患に関連する疾病であることを特徴とする、請求項３に記載の食品組成物。
前記疾病は、肝炎、肝がん、肝硬変、又は肝不全であることを特徴とする、請求項４に記載の食品組成物。
組成物は、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコックス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌株を追加で含む、請求項１に記載の食品組成物。
ロイコノストックホルツアップフェルリ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｒｏｌｚａｐｆｅｌｉｉ）菌株、その培養液、その濃縮物、又はその乾燥物を含む、肝関連疾病の予防又は治療用薬学的組成物。
前記培養液は、ロイコノストックホルツアップフェルリ由来細胞外小胞を含むことを特徴とする、請求項７に記載の薬学的組成物。
前記肝関連疾病は、血清内の連鎖状球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｏｃｃｕｓ）細菌の減少又は炎症性肝疾患に関連する疾病であることを特徴とする、請求項７に記載の薬学的組成物。
前記疾病は、肝炎、肝がん、肝硬変、又は肝不全であることを特徴とする、請求項９に記載の薬学的組成物。
ロイコノストックホルツアップフェルリ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｈｏｌｚａｐｆｅｌｉｉ）菌株、その培養液、その濃縮物、又はその乾燥物を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、肝関連疾病の予防、改善又は治療の方法。
ロイコノストックホルツアップフェルリ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｈｏｌｚａｐｆｅｌｉｉ）菌株、その培養液、その濃縮物、又はその乾燥物を有効成分として含む、組成物の肝関連疾病の予防、改善又は治療の用途。