WO2019245223A1 - 류코노스톡속 균주를 포함하는 간 기능 개선용 조성물 - Google Patents

류코노스톡속 균주를 포함하는 간 기능 개선용 조성물 Download PDF

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WO2019245223A1
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disease
culture
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김윤근
염규진
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving liver function, including a leukonostock strain, a culture thereof, a concentrate thereof, or a dried product thereof.
  • the liver is an organ that plays an important role in many functions such as detoxification of the body, excretion of bile, metabolism of lipids, storage of various nutrients, hematopoietic or blood coagulation, and regulation of circulating blood volume.
  • Various diseases are caused. According to the latest announcement, the number of deaths from liver cancer among Koreans is the world's number one with 23.4 deaths per 100,000 people, and in the case of chronic liver disease, 28.8 deaths per 100,000 people ranks third in the world.
  • 56.1 people per 100,000 people in Korea in their 40s have liver-related diseases, which is the main cause of death in Korea.
  • Representative liver diseases include fatty liver, alcoholic hepatitis, alcoholic cirrhosis, liver cancer, etc.
  • the recent increase in mental stress and smoking can cause liver damage and inhibit detoxification of the human body, causing other diseases. Patent 10-2016-0103803).
  • the present invention has been made to solve the problems of the prior art as described above, to provide a composition for improving liver function, including the Leukonostok strain, its culture solution, its concentrate, or its dry matter. do.
  • the present invention is Leuconostoc holzapfelii ) provides a food composition for improving liver function, comprising a strain, a culture thereof, a concentrate thereof, or a dried product thereof.
  • the present invention is Leuconostoc ( Leuconostoc) holzapfelii ) Provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of liver-related diseases, comprising a strain, culture thereof, concentrate thereof, or dried product thereof as an active ingredient.
  • the culture may include an extracellular vesicle derived from leuconosstock holzafeli, which may be naturally secreted from leuconosstock holzafeli, or additionally It can be characterized by.
  • the extracellular vesicles can be separated from the culture solution of Leukonostock Holzafel, or food containing Leuconostock Holzafel, or the supernatant obtained after killing the Leukonostock Holzafel by heating or ultrasonic, etc., and naturally Or may be secreted artificially, but is not limited thereto.
  • the composition may have a prophylactic or ameliorating effect of a liver related disease, wherein the liver related disease is preferably a disease and / or inflammatory liver disease associated with a reduction in streptococci in serum. It is a disease associated with, more preferably liver cancer, hepatitis, cirrhosis, liver failure, and the like, or any disease that can be caused in the liver is not limited thereto.
  • the leuconosstock holzapelli may preferably have a daily dosage of 5 X 10 4 to 5 X 10 10 colony forming unit (CFU) / mL. Any dosage that may not be induced is not limited thereto.
  • the composition is preferably of the genus Leuconostoc, Lactobacillus (Lactobacillus), Enterococcus, Brevibacillus (Brevibacillus), Lactococcus (Lactococcus) ), Propionibacterium (Propionibacterium), Bifidobacterium (Bifidobacterium), and the like may further include a strain, but is not limited to any strain known to be included in the food composition.
  • the composition may further comprise a food acceptable carrier or a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also provides a method for treating liver-related diseases comprising administering to a subject a composition comprising a Leuconostoc holzapfelii strain, a culture thereof, a concentrate thereof, or a dried product thereof as an active ingredient. do.
  • the present invention provides a therapeutic use of liver-related diseases of the composition comprising a Leuconostoc holzapfelii strain, its culture, its concentrate, or its dried product as an active ingredient.
  • the present invention relates to a strain of Leukonostoc holzapfelii for improving liver function and its use, wherein the strain of Leukonostok holzapfelii of the present invention can effectively improve liver function without side effects as well as inflammation through ingestion. It can effectively reduce the effects of various liver diseases, including liver inflammation-related diseases, and has the effect of applying to a variety of compositions, such as various food compositions, pharmaceutical compositions, animal feed compositions, including functional food compositions It is expected to be possible.
  • FIG. 1 is a view showing the serum bacterial metagenome results of liver cirrhosis or liver cancer patients according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a view showing the results of confirming the effect of improving the liver function of the leukonostock holzapelli strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a view showing the results of confirming the inhibitory effect of liver cell death of the leukonostock holzapelli strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a view showing the results of confirming the cytotoxicity of the extracellular vesicles derived from the leukonostock Holzafelley culture medium according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a view showing the results confirming whether the induction of the inflammatory response of the extracellular vesicles derived from the leukonostock Holzafelley culture medium according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 is a view showing the results of confirming the anti-inflammatory effect of the extracellular vesicles derived from leukonostock Holzafelley culture medium according to an embodiment of the present invention.
  • the leukonostock holzafeli strain of the present invention inhibits the increase of beneficial bacteria in the body and the death of liver cells through ingestion or administration of the strain, thereby effectively improving liver function without side effects, and effectively inhibiting the induction of inflammation through ingestion. Since it exhibits a prophylactic or therapeutic effect of a related disease, it is expected to be effectively used in various fields such as medicine, food, feed and the like.
  • Leuconostoc holzapfelii is a morphologically Gram-positive bacterium and is Leukonostok Holzapfelii Ceb-kc-003, deposited as KCCM11830P at the Korea Microbiological Conservation Center on April 11, 2016. As a result of 16s rDNA, it has 99% homology with the existing leukonostock holzafel.
  • the leuconosstock holzapellelli of the present invention can be cultured through a culturing method of a strain of genus Bacillus or leuconosstock, and the medium may be a natural medium or a synthetic medium.
  • the carbon source of the medium for example, glucose, sucrose, dextrin, glycerol, starch and the like can be used, and as the nitrogen source, peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, soybean, ammonium salt, nitrate and other Organic or inorganic nitrogen containing compounds may be used, but are not limited to these components.
  • an inorganic salt included in the medium magnesium, manganese, calcium, iron, potassium, etc. may be used, but is not limited thereto.
  • amino acids, vitamins, nucleic acids and related compounds may be added to the medium.
  • the strain of the present invention may be cultured for 12 hours to 4 days in the temperature range of 20 ⁇ 40 °C.
  • herbal cultures, extracts, or mixtures thereof are added to the culture medium, such as mouse eye bean, ripe kohwang, licorice, cheonggung, tofu, cinnamon, donkey, spearmint, sessau, white leaf, ginger, white porcelain, cheoncho, horseback riding, mandrel, etc.
  • the culture medium such as mouse eye bean, ripe kohwang, licorice, cheonggung, tofu, cinnamon, donkey, spearmint, sessau, white leaf, ginger, white porcelain, cheoncho, horseback riding, mandrel, etc.
  • the "culture broth” may be a culture stock solution including cells, and may also be a cell (concentrate) from which the culture supernatant is removed or concentrated. Or a culture supernatant comprising an extracellular vesicle derived from a leukonostock strain.
  • the composition of the culture solution may additionally include components necessary for culturing the leuconosstock strain, as well as components that synergistically act on the growth of the leuconosstock strain, the composition according to those having ordinary skill in the art Can be easily selected.
  • the extracellular vesicle refers to a structure consisting of nano-sized membranes secreted from various bacteria, in the present invention can be isolated from the culture medium of the leuconosstock strain or food containing the leuconosstock strain, and naturally Or may be secreted artificially, but is not limited thereto.
  • the method for separating extracellular vesicles from culture or food is not particularly limited as long as the extracellular vesicles can be separated.
  • Extracellular vesicles can be separated by methods such as centrifugation, ultrafast centrifugation, filtration by filters, gel filtration chromatography, pre-flow electrophoresis, or capillary electrophoresis, and combinations thereof, and also impurities It may further include the process of washing for the removal of, concentration of the obtained extracellular vesicles and the like.
  • composition may be a medicine, food, animal feed, pharmaceutical, beverages, lactic acid bacteria formulations, etc., including the leukonostock holzophelli as an active ingredient, but the leuconostock holzaphelli of the present invention
  • the composition including the strain is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may be a quasi-drug or a pharmaceutical preparation, and the food composition may be a food, a health food, a health supplement food, or a health functional food, but is not limited thereto.
  • the strain may be in a liquid state or a dry state
  • the drying method may be, but not limited to, ventilation drying, natural drying, spray drying, freeze drying, and the like.
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of a disease, such as a liver related disease, by administration of a composition according to the invention.
  • treatment means any action that improves or advantageously changes the symptoms such as liver-related diseases by administration of the composition according to the present invention.
  • improvement means any action that at least reduces the parameters associated with the condition being treated, such as the extent of symptoms.
  • “individual” refers to a subject in need of prevention or treatment of a disease, and specifically, primates, mice, rats, dogs, and cats that are human or non-human. Means mammals such as horses and cows.
  • the food composition may be used in various foods, for example, beverages, gums, teas, vitamin complexes, lactobacillus complexes, health supplements, functional foods, and the like, pills, powders, granules, tablets, capsules, and the like. Or in the form of a beverage.
  • the amount of the leuconosstock holzafelii strain, its culture solution, its concentrate, or its dry matter in the food or beverage can generally be added to 0.01 to 15% by weight of the total food weight in the case of the food composition of the present invention,
  • the food composition of the present invention may include food additives conventional in the art, such as flavoring agents, flavoring agents, coloring agents, fillers, stabilizers, and the like.
  • the food composition according to the present invention is an essential ingredient, and there are no particular limitations on the components added to the leukonostock holzafeli strain, its culture solution, its concentrate, or its dried product, and various flavors or natural carbohydrates as in conventional foods. Etc. can be contained as an additional component.
  • the natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; Polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin; Conventional sugars such as and the like and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents tacumatin, stevia extract (e.g., Rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the proportion of said natural carbohydrates is generally about 1-20 g, preferably about 5-12 g per 100 mL of the composition of the present invention.
  • the food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese, chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid and Salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like.
  • These components can be used independently or in combination.
  • the proportion of such additives is not so critical but is generally selected from the range of 0 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the "pharmaceutical composition” may be characterized in the form of capsules, tablets, granules, injections, ointments, powders or beverages, wherein the pharmaceutical composition may be characterized as targeting humans.
  • the pharmaceutical composition is not limited to these, but can be used in the form of oral dosage forms, such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers can be used as oral administration binders, suspending agents, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, fragrances, etc.
  • buffers, preservatives, analgesic Topical agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers and the like can be mixed and used, and for topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives and the like can be used.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with the pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • oral administration may be in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, and the like, in the case of injections, in unit dosage ampoules or multiple dosage forms.
  • solutions, suspensions, tablets, capsules, sustained release preparations and the like may be used.
  • suitable carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like may be further included.
  • Routes of administration of the pharmaceutical compositions according to the invention are not limited to these, but are oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical , Sublingual or rectal. Oral or parenteral release is preferred.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intramuscular, intrasternal, intradural, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical compositions of the invention may also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is dependent on a number of factors, including the activity, age, weight, general health, sex, formulation, time of administration, route of administration, rate of release, drug combination and severity of the particular disease to be prevented or treated, of the specific compound employed.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's condition, weight, extent of disease, drug form, route of administration, and duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art, and may be 0.0001 to 50 mg per day. / kg or 0.001-50 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated as pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions.
  • the dosage or intake of the leukonostock holzafeli of the present invention is, for example, 5 x 10 4 to 5 x 10 8 CFU / mL of the leukonostock holzafeli Ceb-kc-003 (KCCM11830P) strain, preferably 1 30 to 100 mL can be administered once to four times per day in an amount of xlO 6 to 1 x 10 8 CFU / ml of Leukonostok Holzeppely Ceb-kc-003 (KCCM11830P).
  • 50 mL per dose may be administered 2 to 4 times per day in an amount of 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 8 CFU / ml of Leuconosestock Holzafel Ceb-kc-003 (KCCM11830P). More specifically, the amount of 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 8 CFU / mL of Leuconosestock Holzafelly Ceb-kc-003 (KCCM11830P) can be administered from 50 mL to 100 mL once or twice a day. have.
  • Serum of 99 patients with cirrhosis and 94 patients with liver cancer was obtained for metagenome analysis of bacteria in serum of patients with liver related diseases. As a control group, 99 normal sera were used.
  • the obtained serum was placed in a 10 mL tube and centrifuged at 3,500 X g for 10 minutes at 4 ° C. to pellet and supernatant ( supernatant), and the separated pellet and supernatant were each added to a new 10 mL tube.
  • the supernatant was removed using a 0.22 ⁇ m filter to remove bacteria and foreign substances, transferred to a Centrifugal filter 50 kD, and centrifuged at 1,500 X g for 15 minutes at 4 ° C to remove substances smaller than 50 kD and concentrated to a total volume of 10 mL. I was. After again removing bacteria and foreign substances by using 0.22 ⁇ m filter, ultra-centrifugation was performed for 3 hours at 150,000 X g at 4 °C using Type 90ti rotor. After super-centrifugation, the supernatant was removed and the pellet was resuspended in phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the amplified DNA was subjected to sequencing using an Illumina MiSeq sequencer, and the results were output in a Standard Flowgram Format (SFF) file.
  • SFF Standard Flowgram Format
  • the output SFF file was converted into a sequential file (fasta) and a nucleotide quality score file using GS FLX software (v2.9) to confirm the credit rating of the read. Only those with lead lengths greater than 300 bps were used, except for parts with a window 20 bps average base call accuracy of less than 99% (Phred quality score ⁇ 20) (Sickle version 1.33 ).
  • KCCM11830P Leukonostock Holzapelli Ceb-kc-003
  • the powder of Leukonostock Holzpellelli was prepared by lyophilization of the cultured strain.
  • 2 kg of dextrose, 1.5 kg of whole milk powder, and 0.05 kg of yeast extract were added to 100 L of purified water. Sterilization at high temperature and high pressure for 30 minutes followed by cooling at room temperature.
  • AST aspartate aminotransferase
  • the level of aspartate aminotransferase was 34.4 ⁇ 22.8 IU / L before ingestion, and was significantly reduced to 21.7 ⁇ 8.2 IU / L after ingestion.
  • the leukonostock Holzafelly Ceb-kc-003 strain culture medium prepared in the same manner as in Example 2 was prepared. And a supernatant from which cells were removed from the culture medium was obtained using a Bottle Top Vacuum Filter (Corning) having a pore size of 0.45 ⁇ m. The obtained supernatant was again passed through a 0.22 ⁇ m Bottle Top Vacuum Filter (Corning) to remove the residues of cells remaining in the supernatant, and to separate the extracellular vesicles derived from the leukonostock Holzafel culture medium.
  • Bottle Top Vacuum Filter Corning
  • the isolated extracellular vesicles were prepared at concentrations of 0.01, 0.1, 1, and 10 ⁇ g / mL using phosphate buffer solution, treated with mouse peritoneal macrophages (Raw264.7), and cultured for 12 hours. cell viability) was measured. Cell viability was measured by using the Neubauer chamber after staining the cultured cells with trypan blue, the cell viability was calculated as a percentage of the number of living cells in the negative control. Phosphate buffer solution was added and cultured as a negative control (NC), and 1 ⁇ g / mL of E. coli EV derived from Escherichia coli was added as a positive control (PC). And incubated. To isolate extracellular vesicles, E.
  • coli was inoculated in LB (Luria-Bertani) medium and incubated at 37 ° C. at 200 rpm for 24 hours.
  • the supernatant from which cells were removed was obtained by using a Bottle Top Vacuum Filter (Corning) having a pore size of 0.45 ⁇ m.
  • the obtained supernatant was again passed through a 0.22 ⁇ m Bottle Top Vacuum Filter (Corning) to remove the residue of cells remaining in the supernatant, and was prepared by separating the extracellular vesicles of E. coli.
  • the results are shown in FIG.
  • the extracellular vesicles derived from the leukonostock holzapeli culture medium prepared in the same manner as in Example 4.1 were prepared using a phosphate buffer solution. After preparation at the concentrations of 1, and 10 ⁇ g / mL, treated with Raw264.7 cell line and incubated for 12 hours, the secretion of inflammatory cytokines IL-6 and TNF-alpha was measured using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Confirmed by. As a negative control, phosphate buffer solution was added and cultured. As a positive control, 1 ⁇ g / mL of E. coli EV (E. coli EV) was added and cultured. The results are shown in FIG.
  • E. coli EV E. coli EV
  • the E. coli-derived extracellular vesicles as a positive control significantly increased the secretion of inflammatory cytokines in the Raw264.7 cell line, but in the case of the extracellular vesicles derived from the leukonostock Holzapeli culture medium, a high concentration of 10 ⁇ g / mL Only slightly increased when treated with.
  • the extracellular vesicles derived from the leukonostock Holzafelly culture medium prepared in the same manner as in Example 4.1 were prepared using phosphate buffer solution, 0.01, 0.1, 1, And prepared at a concentration of 10 ⁇ g / mL, treated with Raw264.7 cell line and incubated for 12 hours, followed by further treatment of E. coli-derived extracellular vesicles at a concentration of 1 ⁇ g / mL, incubated for 6 hours, IL-6 and The secretion amount of TNF- ⁇ was confirmed by ELISA. Lactococcus, known as an anti-inflammatory effect, as a control (Cont) Experiments were conducted in the same manner using plantarum- derived extracellular vesicles 1 ⁇ g / mL. The results are shown in FIG.
  • the leuconosstock holzafeli strain of the present invention does not exhibit cytotoxicity and thus can be stably used, and can effectively prevent or inhibit the induction of related diseases through the effect of improving liver function.
  • ingestion of the leukonostock Holzafelly strain, culture medium, or extracellular vesicles derived from the culture medium can effectively prevent the induction of inflammation of the liver, and thus, it was confirmed that the incidence of inflammatory liver disease such as hepatitis, cirrhosis and liver cancer can be significantly lowered.
  • a more improved effect can be obtained by mixing a substance, a compound, a strain, etc., which have other known effects in addition to the leuconosstock holzaveli strain.
  • the present invention is a leukonostoc leukonstock for improving liver function ( Leuconostoc holzapfelii ) strain and its use, the leukonostock holzapelli strain of the present invention can effectively improve the function of the liver without side effects, and can effectively reduce inflammation through ingestion, so that various liver including liver inflammation-related diseases It can be widely used for the prevention, amelioration and / or treatment of a disease.

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Abstract

본 발명은 간 기능 개선용 류코노스톡 홀잡펠리(Leuconostoc holzapfelii) 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 류코노스톡 홀잡펠리 균주는 간의 기능을 효과적으로 개선할 수 있으므로, 기능성 식품 조성물을 포함하는 다양한 식품 조성물, 약학 조성물, 동물 사료용 조성물 등 다양한 분야에 적용이 가능할 것으로 기대된다.

Description

류코노스톡속 균주를 포함하는 간 기능 개선용 조성물
본 발명은 류코노스톡속 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 또는 이의 건조물을 포함하는 간 기능 개선용 조성물 등에 관한 것이다.
간(liver)은 체내의 해독, 담즙 배설, 지질 등의 대사 작용, 각종 영양소의 저장, 조혈 또는 혈액 응고, 순환 혈액량의 조절 등 많은 기능에서 중요한 역할을 담당하고 있는 기관 중의 하나로, 간의 기능이 저하되면 다양한 질병이 야기된다. 최근 발표된 바에 따르면, 한국인의 간암에 의한 사망률은 10만 명당 23.4 명으로 세계 1 위이고, 만성 간질환의 경우에도 10만 명당 28.8 명으로 세계 3 위로 확인되었다. 또한 국내 통계청에서 발표된 바에 따르면, 우리나라 40대의 경우 10만 명당 56.1 명이 간 관련 질병을 가지고 있으며, 이는 국내 사망 원인의 주요 원인으로 발표되었다. 대표적인 간 관련 질병으로는 지방간, 알코올성 간염, 알코올성 간경변증, 간암 등이 있으며, 최근 증가되고 있는 정신적 스트레스와 흡연은 간 손상을 가중시켜 인체의 해독 작용을 억제하여 다른 질병의 원인이 되기도 한다(한국출원특허 10-2016-0103803).
이러한 간 관련 질병에 의한 폐해가 커짐에 따라 최근에는 질병 치료제 시장뿐만 아니라, 간의 기능을 개선해줄 수 있는 기능 개선용 제품에 대한 관심과 소비자의 요구도가 높아지고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 류코노스톡속 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 또는 이의 건조물을 포함하는 간 기능 개선용 조성물 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 류코노스톡 홀잡펠리( Leuconostoc holzapfelii) 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 또는 이의 건조물을 포함하는 간 기능 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 류코노스톡 홀잡펠리( Leuconostoc holzapfelii) 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는, 간 관련 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 배양액은 류코노스톡 홀잡펠리 유래 세포밖 소포(extracellular vesicle)를 포함할 수 있으며, 이는 류코노스톡 홀잡펠리에서 자연적으로 분비된 것일 수 있으며, 또는 추가로 첨가할 수 있는 것을 특징으로 한다. 상기 세포밖 소포는 류코노스톡 홀잡펠리의 배양액, 또는 류코노스톡 홀잡펠리를 포함하는 식품, 또는 류코노스톡 홀잡펠리를 가열 또는 초음파 등으로 사멸시킨 후에 획득된 상층액에서 분리될 수 있으며, 자연적으로 또는 인공적으로 분비된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 간 관련 질병의 예방 또는 개선 효과를 가질 수 있으며, 상기 간 관련 질병은 바람직하게는 혈청 내의 연쇄상구균의 감소와 연관되어 있는 질병 및/또는 염증성 간질환과 연관되어 있는 질병이며, 더욱 바람직하게는 간암, 간염, 간경변, 간부전 등이나, 간에서 유발될 수 있는 질병이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 류코노스톡 홀잡펠리는 바람직하게는 1일 투여량이 5 X 10 4 내지 5 X 10 10 CFU(colony forming unit)/mL일 수 있으나, 투여에 의한 부작용을 유도하지 않을 수 있는 투여량이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 바람직하게는 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 브레비바실러스(Brevibacillus) 속, 락토코코스(Lactococcus) 속, 프로피오니박티륨(Propionibacterium) 속, 비피도박테륨(Bifidobacterium) 속 등의 균주를 추가로 포함할 수 있으나, 식품 조성물에 포함될 수 있다고 알려져있는 균주라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 식품학적으로 허용가능한 담체 또는 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 류코노스톡 홀잡펠리(Leuconostoc holzapfelii) 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 관련 질병의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 류코노스톡 홀잡펠리(Leuconostoc holzapfelii) 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 간 관련 질병의 치료 용도를 제공한다.
본 발명은 간 기능 개선용 류코노스톡 홀잡펠리(Leuconostoc holzapfelii) 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 류코노스톡 홀잡펠리 균주는 부작용 없이 간의 기능을 효과적으로 개선할 수 있을 뿐만 아니라 섭취를 통하여 염증을 효과적으로 감소시킬 수 있으므로 간 염증 관련 질병을 포함한 다양한 간질환의 예방, 개선 및/또는 치료 효과를 가지므로 기능성 식품 조성물을 포함하는 다양한 식품 조성물, 약학 조성물, 동물 사료용 조성물 등 다양한 조성물로의 적용이 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 간경변 또는 간암 환자의 혈청 세균 메타게놈 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 류코노스톡 홀잡펠리 균주의 간 기능 개선 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 류코노스톡 홀잡펠리 균주의 간 세포 사멸 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 세포밖 소포의 세포 독성 여부를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 세포밖 소포의 염증반응을 유도하는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 세포밖 소포의 항염증 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명의 류코노스톡 홀잡펠리 균주는 균주의 섭취 또는 투여를 통하여 체내 유익균의 증가 및 간 세포 사멸을 억제하여 부작용 없이 간의 기능을 효과적으로 개선할 뿐만 아니라, 섭취를 통하여 염증 유발을 효과적으로 억제하므로, 간 관련 질병의 예방 또는 치료 효과를 나타내므로, 의약, 식품, 사료 등 다양한 분야에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 명세서에 있어서, “류코노스톡 홀잡펠리(Leuconostoc holzapfelii)”란 형태학적으로 그람 양성균이며, 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003으로서, 2016년 04월 11일 한국미생물보존센터에 KCCM11830P로 기탁되었으며, 16s rDNA 결과 기존의 류코노스톡 홀잡펠리와 99% 상동성을 가진다. 본 발명의 류코노스톡 홀잡펠리는 통상적으로 바실러스 또는 류코노스톡 속 균주의 배양 방법을 통해서 배양할 수 있으며, 배지는 천연 배지 또는 합성 배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오즈, 수크로오즈, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소 함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다. 배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 칼슘, 철, 칼륨 등이 사용될 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다. 본 발명의 균주는 배양온도 조건은 20 ~ 40 ℃의 온도 범위에서 12 시간 내지 4 일간 배양할 수 있다. 또한, 배양 배지에 쥐눈이콩, 숙지황, 감초, 천궁, 두충, 계피, 당귀, 석창포, 하수오, 측백엽, 생강, 백자인, 천초, 승마, 만형자 등의 생약 제제, 이의 추출물, 또는 이의 혼합물을 첨가하여 배양하고, 이 배양물을 사용함으로써 본 균주의 간 또는 장 기능 개선의 효과를 보다 개선할 수 있다.
본 명세서에 있어서, “배양액(culture broth)”이란 균체를 포함한 배양 원액일 수 있으며, 또한 배양 상등액을 제거하거나 농축한 균체(농축물)일 수 있다. 또는 류코노스톡 균주 유래 세포밖 소포를 포함하는 배양 상등액일 수 있다. 상기 배양액의 조성은 통상의 류코노스톡 균주 배양에 필요한 성분뿐만 아니라, 류코노스톡 균주의 생장에 상승적으로 작용하는 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 따른 조성은 당업계의 통상의 기술을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다. 상기 세포밖 소포(extracellular vesicle)는 다양한 세균에서 분비되는 나노 크기의 막으로 된 구조물을 의미하며, 본 발명에서는 류코노스톡 균주의 배양액 또는 류코노스톡 균주를 포함하는 식품에서 분리될 수 있으며, 자연적으로 또는 인공적으로 분비된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양액 또는 식품에서 세포밖 소포를 분리하는 방법은 세포밖 소포를 분리할 수 있다면 특별히 제한되지 않는다. 예컨대 원심분리, 초고속 원심분리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 또는 모세관 전기영동 등의 방법, 및 이들의 조합을 이용하여 세포밖 소포를 분리할 수 있으며, 또한 불순물의 제거를 위한 세척, 수득된 세포밖 소포의 농축 등의 과정을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, “조성물(composition)”이란 류코노스톡 홀잡펠리를 유효성분으로 포함하는 의약, 식품, 동물 사료용, 약학적, 음료용, 유산균 제제 등일 수 있으나, 본 발명의 류코노스톡 홀잡펠리 균주를 포함하는 조성물이라면 이에 제한되지 않는다. 상기 의약용 조성물은 의약외품 또는 의약적 제제일 수 있으며, 상기 식품 조성물은 식품, 건강식품, 건강보조식품, 또는 건강기능성식품일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 균주의 상태는 액상 상태 또는 건조 상태일 수 있으며, 건조 방법은 통풍 건조, 자연 건조, 분무 건조, 동결 건조 등이 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서, “예방(prevention)”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 간 관련 질병 등의 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, "치료(treatment)"란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 간 관련 질병 등의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, “개선(improvement)”이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, “개체(individual)”란 질병의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상을 의미하며, 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에 있어서 상기 식품 조성물은, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 유산균 복합제, 건강보조 식품류, 기능성 식품류 등에 사용할 수 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태로 사용할 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 류코노스톡 홀잡펠리 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 또는 이의 건조물의 양은, 일반적으로 본 발명의 식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100 mL를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 당업계에 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 식품 조성물은 필수 성분으로서, 상기 류코노스톡 홀잡펠리 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 또는 이의 건조물 외에 첨가되는 성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 명세서에 있어서, “약학적 조성물(pharmaceutical composition)”이란 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1 일 0.0001 내지 50 mg/kg 또는 0.001 내지 50 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 류코노스톡 홀잡펠리의 투여량 또는 섭취량은 예를 들어, 5 x 10 4 내지 5 x 10 8 CFU/mL의 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003(KCCM11830P) 균주, 바람직하게는 1 x 10 6 내지 1 x 10 8 CFU/ml의 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003(KCCM11830P)의 양으로 회당 30 mL 내지 100 mL를 1 일 1 회 내지 4 회 투여할 수 있다. 일 예에서, 1 x 10 6 내지 1 x 10 8 CFU/ml의 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003(KCCM11830P)의 양으로 회당 50 mL를 1 일 2 회 내지 4 회 투여할 수 있다. 보다 구체적으로는 1 x 10 6 내지 1 x 10 8 CFU/mL의 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003(KCCM11830P)의 양을 회당 50 mL 내지 100 mL를 1 일 1 회 내지 2 회 투여할 수 있다. 보다 더욱 구체적으로는 1 x 10 6 내지 1 x 10 8 CFU/mL의 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003(KCCM11830P)를 아침 식전 30 분에 50 mL 내지 100 mL 1 회 투여하고, 저녁 식전 30 분 또는 취침 전에 50 mL 내지 100 mL 1 회 투여할 수 있다. 그러나 이러한 투여량 또는 섭취량은 개개인의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 치료, 예방, 또는 개선하고자 하는 주요 증상, 투여 시간, 투여 방법, 중증도 등에 따라 달라질 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 하기 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 간 관련 질병 환자의 혈청 세균 메타게놈 분석
간 관련 질병을 가진 환자의 혈청 내 세균의 메타게놈 분석을 위하여, 간경변 환자 99 명 및 간암 환자 94 명의 혈청을 획득하였다. 대조군으로는 정상인 99 명의 혈청을 이용하였다. 혈청으로부터 세균 유래 세포밖 소포를 분리하고, 세포밖 소포로부터 DNA를 분리하기 위하여, 10 mL 튜브에 획득한 혈청을 담은 후에 4 ℃에서 3,500 X g로 10 분간 원심분리하여 펠렛(pellet)과 상등액(supernatant)을 분리하고, 분리된 펠렛과 상등액은 각각 새로운 10 mL 튜브에 첨가하였다. 상등액은 0.22 μm 필터를 이용하여 세균과 이물질을 제거한 후에 Centrifugal filter 50 kD에 옮겨서 4 ℃에서 1,500 X g로 15 분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 크기의 물질은 제거한 후에 총 용량이 10 mL이 되도록 농축시켰다. 그리고 다시 0.22 μm 필터를 이용하여 세균과 이물질을 깨끗이 제거한 후에 Type 90ti 로터를 이용하여 4 ℃에서 150,000 X g로 3 시간 동안 초고속원심분리를 실시하였다. 초고속원심분리 후에 상등액은 제거하고 펠렛은 인산염완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 재부유시켜 보관하였다. 이후 재부유된 펠렛 100 μL를 새로운 튜브에 첨가한 후에 100 ℃ 가열 블록(heat block)에서 가열시켜 세포밖 소포 내부의 DNA가 지질 외부로 방출되도록 하였다. 그리고 얼음을 이용하여 냉각시킨 후에, 4 ℃에서 10,000 X g로 30 분 동안 원심분리하여 상등액 만을 분리한 후에 나노드롭(Nanodrop)을 이용하여 상등액 내의 DNA 양을 정량하였다. 혈청으로부터 분리된 DNA에 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여, 표 1에 기재된 16s rDNA 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 실시하여 DNA를 증폭하였다.
프라이머 서열 서열번호
16S rDNA 16S_V3_F 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' 1
16S_V4_R 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3 2
증폭된 DNA는 Illumina MiSeq sequencer를 이용하여 염기서열 분석을 실시하였고, 결과는 Standard Flowgram Format(SFF) 파일로 출력하였다. 출력된 SFF 파일은 GS FLX 소프트웨어(v2.9)를 이용하여 염기서열 파일(fasta)과 뉴클레오타이드 품질 점수(nucleotide quality score) 파일로 변환하여 리드의 신용도 평가를 확인하였다. 윈도우(window 20 bps) 평균 base call 정확도(accuracy)가 99 % 미만(프레드 품질 점수(Phred quality score) < 20)인 부분은 제외하고, 리드의 길이가 300 bps 이상인 것만을 이용하였다(Sickle version 1.33). 결과 분석을 위하여 UCLUST 및 USEARCH를 이용하여 염기서열 유사도에 따른 클러스터링을 실시하고, BLASTN 및 GreenGenes의 16s rDNA 염기서열 데이터베이스(108,453 개의 염기서열)를 이용하여 97 % 이상의 염기서열 유사도를 가지고 있는 세균을 분석하여(QIIME), 운영분류단위(operational Taxonomy Unit; OTU)를 분석하였다. 통계 분석을 위하여, t-test를 이용하였으며 각 군의 평균 분포 비율이 2배 이상 다르며, p 값이 0.05 이하인 경우로 하여 대조군과 실험군에서 유의성 있게 다른 비율로 존재하는 세균을 선정하였다. 그 결과는 도 1 및 표 2에 나타내었다.
정상인 간경변 간암
mean SD mean SD p mean SD p
Streptococcus 0.0568 0.0553 0.0177 < 0.05 0.0000 0.0124 0.0124 < 0.0001
도 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 간 관련 질병을 보유하고 있는 환자, 즉, 간경변 및 간암 환자에서 연쇄상구균(Streptococcus) 세균이 유의성 있게 감소된 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 혈청 내의 연쇄상구균 세균의 감소를 통하여 간 관련 질병 여부를 진단할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 류코노스톡 홀잡펠리 균주의 분말 및 배양액 제조
류코노스톡 홀잡펠리(Leuconostoc holzapfelii) 균주의 장 또는 간 기능의 개선능을 확인하기 위하여, 한국 미생물 보존센터에 기탁되어 있는 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003(KCCM11830P) 균주를 분양받아 3 % 염화나트륨이 첨가된 BHI 고체 배지에서 배양하였다. 류코노스톡 홀잡펠리의 분말은 배양된 균주를 동결건조하여 제조하였으며, 배양액 제조를 위해서는 정제수 100 L에 덱스트로즈 2 kg, 전지분유 1.5 kg, 및 효모 추출액 0.05 kg을 첨가한 후에 121 ℃에서 15 내지 30 분 동안 고온 및 고압으로 멸균한 후에 실온에서 냉각시켰다. 그리고 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003 균주를 무균 상태에서 0.2 내지 0.4 L 접종한 후에 35 ℃ 내외에서 2 내지 3 일간 배양하여 류코노스톡 홀잡펠리 배양액을 제조하였다.
실시예 3: 류코노스톡 홀잡펠리 균주의 간 기능 개선 효과 확인
류코노스톡 홀잡펠리 균주의 간 기능 개선 효과를 확인하기 위하여, 총 20 명(남성 8 명 및 여성 12 명)의 지원자를 모집하였으며, 지원자 평균 연령은 32.0 ± 5.4세였으며, 남성의 평균 연령은 31.8 ± 3.6세(26세 내지 37세) 였으며, 여성의 평균 연령은 32.2 ± 6.3세(21세 내지 47세)였다. 대상자들에게는 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003 균주 배양액을 1 X 10 6 내지 1 X 10 8 CFU(colony forming unit)/mL이 되도록 총 4 주간 1일 2회 매일 경구 투여하였다. 그리고 실시예 1과 동일한 방법으로 임상시험 시작 당일(섭취 전)과 4주 후(섭취 후)에 지원자의 혈청을 채취하고, 혈청 내에 포함되어 있는 연쇄상구균의 변화를 확인하였다. 그 결과는 도 2 및 표 3에 나타내었다.
섭취전 섭취후 p value
Streptococcus 0.0302 0.0332 0.0626 0.0396 < 0.05
도 2 및 표 3에 나타난 바와 같이, 류코노스톡 균주 섭취 후에 간경변 및 간암의 바이오 마커인 연쇄상구균의 수가 유의성있게 증가되어 있는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 류코노스톡 균주의 섭취를 통하여 간의 질환인 간경변, 간암 등의 유발을 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 체내 유익균의 증가를 통하여 간 관련 질병의 증상을 예방, 개선 및/또는 억제할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 추가적으로 간 기능 개선 효과를 확인하기 위하여 혈액 내의 간 관련 질병의 지표인 아스파르테이트아미노 전달효소(aspartate aminotransferase; AST)의 수치를 확인하였다. 아스파르테이트아미노 전달효소는 간 세포(hepatocyte)에 존재하며, 세포가 괴사되면 혈중으로 유출되어 혈액 내의 수치가 증가되게 된다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 아스파르테이트아미노 전달효소의 수치가 섭취 전에는 34.4 ± 22.8 IU/L였는데, 섭취 후에는 21.7 ± 8.2 IU/L로 유의성있게 감소된 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 류코노스톡 균주의 섭취를 통하여 간 세포 사멸을 감소시킬 수 있으며, 이를 통하여, 간 관련 질병을 예방할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 류코노스톡 홀잡펠리 균주 이외에 추가로 류코노스톡 메센테로이데스 KCCM11827P, 락토바실러스 사케이 KCCM11841P, 엔테로코커스 페시움 KCCM11909P, 브레비바실러스 레우스제리 KCCM11911P, 및 락토바실러스 퍼멘텀 KCCM11910P를 포함하는 혼합 균주 배양액을 동일하게 지원자 20 명에게 4 주간 1 일 2 회 경구투여하고, 혈청 내에 포함되어 있는 세균의 변화를 확인하였다. 그 결과, 류코노스톡 홀잡펠리 균주의 단독 투여 시와 비교하여 혈청 내의 연쇄상구균의 수가 좀더 증가된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 세포밖 소포의 항염증 효과 확인
4.1. 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 세포밖 소포의 세포 독성 확인
류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 세포밖 소포의 세포 독성을 확인하기 위하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 준비된 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003 균주 배양액을 준비하였다. 그리고 공극 크기가 0.45 μm인 Bottle Top Vacuum Filter(Corning)를 이용하여 배양액으로부터 세포가 제거된 상층액을 획득하였다. 획득된 상층액은 다시 0.22 μm Bottle Top Vacuum Filter(Corning)를 통과시켜 상층액에 남아있는 세포의 잔여물은 제거하고, 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 세포밖 소포를 분리하였다. 분리된 세포밖 소포는 인산염완충용액을 이용하여 0.01, 0.1, 1, 및 10 μg/mL의 농도로 제조한 후에 마우스 복강대식세포(Raw264.7)에 처리하고 12 시간 동안 배양한 후에 세포 생존율(cell viability)을 측정하였다. 세포 생존율은 배양된 세포를 트리판 블루로 염색한 후에 Neubauer chamber를 이용하여 살아있는 세포의 수를 측정하고, 음성 대조군의 살아있는 세포 수에 대한 백분율로서 세포 생존율을 계산하였다. 음성 대조군(negative control; NC)으로는 인산염완충용액을 첨가하고 배양하였으며, 양성 대조군(positive control; PC)으로는 대장균( Escherichia coli) 유래 세포밖 소포(E. coli EV) 1 μg/mL를 첨가하고 배양하였다. 세포밖 소포를 분리하기 위해서는, 대장균을 LB(Luria-Bertani) 배지에 접종하고 37 ℃에서 200 rpm으로 24 시간 동안 배양하였다. 그리고 공극 크기가 0.45 μm인 Bottle Top Vacuum Filter(Corning)를 이용하여 세포가 제거된 상층액을 획득하였다. 획득된 상층액은 다시 0.22 μm Bottle Top Vacuum Filter(Corning)를 통과시켜 상층액에 남아있는 세포의 잔여물은 제거하고, 대장균의 세포밖 소포를 분리하여 준비하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 세포밖 소포는 고농도에서도 세포 독성을 나타내지 않아, 안정적으로 사용할 수 있다는 것을 확인하였다.
4.2. 류코노스톡 홀잡펠리 유래 세포밖 소포의 염증반응 유도 확인
류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 세포밖 소포가 세포의 염증반응을 유도하는지 확인하기 위하여, 실시예 4.1과 동일한 방법으로 준비된 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 세포밖 소포를 인산염완충용액을 이용하여 0.01, 0.1, 1, 및 10 μg/mL의 농도로 제조한 후에 Raw264.7 세포주에 처리하고 12 시간 동안 배양한 후에 염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-알파의 분비량를 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 확인하였다. 음성 대조군으로는 인산염완충용액을 첨가하고 배양하였으며, 양성 대조군으로는 대장균 유래 세포밖 소포(E. coli EV) 1 μg/mL를 첨가하고 배양하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 양성 대조군인 대장균 유래 세포밖 소포는 Raw264.7 세포주의 염증성 사이토카인의 분비량을 현저히 증가시켰으나, 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 세포밖 소포의 경우에는 10 μg/mL의 고농도로 처리한 경우에만 약간 증가되는 것을 확인하였다.
4.3. 류코노스톡 홀잡펠리 유래 세포밖 소포의 항염증 효과 확인
류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 세포밖 소포의 항염증 효과를 확인하기 위하여, 실시예 4.1과 동일한 방법으로 준비된 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 세포밖 소포를 인산염완충용액을 이용하여 0.01, 0.1, 1, 및 10 μg/mL의 농도로 제조하여 Raw264.7 세포주에 처리하고 12 시간 동안 배양한 후에, 대장균 유래 세포밖 소포를 1 μg/mL의 농도로 추가로 처리하고 6시간 동안 배양하고 IL-6 및 TNF-α의 분비량를 ELISA를 이용하여 확인하였다. 대조군(Cont)으로는 기존에 항염증 효과를 나타낸다고 알려져 있는 Lactococcus plantarum 유래 세포밖 소포 1 μg/mL를 이용하여 동일한 방법으로 실험을 진행하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 세포밖 소포의 전처리는 염증성 반응을 효과적으로 예방 및 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 본 발명의 류코노스톡 홀잡펠리 균주는 세포 독성을 나타내지 않으므로 안정적으로 사용가능할 뿐만 아니라, 간 기능 개선 효과를 통하여 관련 질병의 유발을 효과적으로 예방 또는 억제할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 류코노스톡 홀잡펠리 균주, 배양액, 또는 배양액 유래 세포밖 소포의 섭취는 간의 염증 유발을 효과적으로 예방할 수 있으므로, 간염, 간경변, 간암 등의 염증성 간질환의 발병률을 현저히 낮출 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 류코노스톡 홀잡펠리 균주 외에 기존에 알려져 있는 다른 효능을 가진 물질, 화합물, 균주 등의 혼합을 통하여 좀더 개선된 효과를 획득할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 간 기능 개선용 류코노스톡 홀잡펠리( Leuconostoc holzapfelii) 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 류코노스톡 홀잡펠리 균주는 부작용 없이 간의 기능을 효과적으로 개선할 수 있을 뿐만 아니라 섭취를 통하여 염증을 효과적으로 감소시킬 수 있으므로 간 염증 관련 질병을 포함한 다양한 간질환의 예방, 개선 및/또는 치료에 폭넓게 사용할 수 있다.

Claims (12)

  1. 류코노스톡 홀잡펠리( Leuconostoc holzapfelii) 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 또는 이의 건조물을 포함하는, 간 기능 개선용 식품 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 배양액은 류코노스톡 홀잡펠리 유래 세포밖 소포(extracellular vesicle)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 간 관련 질병의 예방 효과를 가지는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 간 관련 질병은 혈청 내의 연쇄상구균(Streptococcus) 세균의 감소 또는 염증성 간질환과 연관된 질병인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 질병은 간염, 간암, 간경변, 또는 간부전인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 브레비바실러스(Brevibacillus) 속, 락토코코스(Lactococcus) 속, 프로피오니박티륨(Propionibacterium) 속, 또는 비피도박테륨(Bifidobacterium) 속의 균주를 추가로 포함하는, 식품 조성물.
  7. 류코노스톡 홀잡펠리( Leuconostoc holzapfelii) 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 또는 이의 건조물을 포함하는, 간 관련 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 배양액은 류코노스톡 홀잡펠리 유래 세포밖 소포(extracellular vesicle)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 간 관련 질병은 혈청 내의 연쇄상구균(Streptococcus) 세균의 감소 또는 염증성 간질환과 연관된 질병인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 질병은 간염, 간암, 간경변, 또는 간부전인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  11. 류코노스톡 홀잡펠리( Leuconostoc holzapfelii) 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 관련 질병의 예방, 개선 또는 치료 방법.
  12. 류코노스톡 홀잡펠리( Leuconostoc holzapfelii) 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 간 관련 질병의 예방, 개선 또는 치료 용도.
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