CN117946949B

CN117946949B - 一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其用途

Info

Publication number: CN117946949B
Application number: CN202410346241.5A
Authority: CN
Inventors: 李璟欣; 张旭朏; 傅芳; 肖源灵; 陈政钦; 曾婉秋
Original assignee: Sichuan Anaerobic Biotechnology Co ltd
Current assignee: Sichuan Anaerobic Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-03-26
Filing date: 2024-03-26
Publication date: 2024-06-07
Anticipated expiration: 2044-03-26
Also published as: CN117946949A

Abstract

本发明属于微生物技术领域，涉及一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其用途，尤其涉及一株具有降低胆固醇、抑制脂肪合成、改善腹泻症状的嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci‑2菌株及其用途。该菌株无毒力因子、无耐药基因，具有良好的安全性，且同时具有调节脂质代谢和改善腹泻症状多重功效，对高胆固醇血症、肥胖和/或腹泻具有潜在益处。

Description

一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其用途

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其用途，尤其涉及一株具有降低胆固醇、抑制脂肪合成、改善腹泻症状的嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-2菌株及其用途。

背景技术

肥胖是世界性的健康问题，国际通常用体重指数(Body Mass Index，BMI)为标准判断肥胖程度，18 .5≤BMI≤24 .9时属正常范围，BMI≥25为超重，BMI≥30为肥胖。根据世界肥胖联盟研究显示，预测到2035年，全球将有超过40亿人属于肥胖或超重，占全球人口的51%。2020~2035年间，儿童肥胖率将翻倍上升，全球男孩的肥胖率将从10%上升到20%，女孩的肥胖率将从8%上升到18%；根据预测数据，到2035年，中国成年人的肥胖率将达到18%，2020-2035年的年增长率达到5.4%，儿童肥胖的年增长率为6.6%。

肥胖症是指由环境、饮食以及遗传等多种因素相互作用引起的体内脂肪堆积过多、脂肪分布异常和体重增加等的一种慢性代谢类疾病，其发病趋势与2型糖尿病类似，主要表现为脂肪细胞数量增多、体脂分布失调以及局部脂肪沉积。肥胖使机体代谢稳态破坏，进而引起代谢疾病，肥胖是2型糖尿病的重要发病危险因素。此外，肥胖患者常伴有自卑、焦虑及抑郁等社会心理因素，高血压、糖尿病、冠心病和血管粥样硬化等疾病的发生发展也与肥胖症及其并发症密切相关，通常表现为：①糖代谢、脂代谢功能障碍；②代谢性内毒素血症(与高血液脂多糖水平相关的低级炎症状态)；③肠道屏障功能受损。

肥胖症根据其病因和临床表现可分为单纯性肥胖、继发性肥胖和药源性肥胖。其中，单纯性肥胖在临床上较为常见，其无明显病因且体重增加相对缓慢；继发性肥胖由疾病、内分泌紊乱或代谢紊乱所引起；药源性肥胖则由于使用药物所引起。当前主要治疗方法为：①生活及行为方式治疗：改善身体活动，合理安排饮食和改变环境因素等方式，该方法简单易实施，但对患者的依从性要求较高，且起效慢、治疗效果不稳定；②药物治疗：当BMI超过30kg/m²且伴随肥胖并发症时需要使用药物进行辅助治疗，目前中国获得国家药品监督管理局批准的肥胖症治疗药物是奥利司他，然而长期用药会产生不良反应及耐药性；③外科治疗：适用于重度肥胖(BMI 在30～35kg/m²之间)且伴有严重并发症患者，能更有效减轻并长久维持减重后的体重，但该方法成本高，且具有较大风险和副作用，对于病人心理健康也存在负面影响；④靶点治疗、基因定向治疗等：存在一定风险和不确定性，尚未有充足的临床试验，安全性有待进一步验证。

因此，目前仍有必要进一步开发可用于预防和/或治疗肥胖症的新物质。而人类的另一个基因组即肠道菌群基因组——编码基因是人类自身基因组编码基因的150倍，这种丰富性决定了其可能在肥胖发生中扮演一定角色。研究表明肥胖病人肠道菌群结构失调，肠道细菌多样性下降，存在拟杆菌门与厚壁菌门的比例失调，这些研究的发现为开发益生菌干预肥胖提供了重要试验依据和技术手段。研究发现，益生菌和益生元可以通过减少肠道细菌脂多糖，改变菌群组成，降低脂肪存储等方式发挥抵抗肥胖的作用。因此，靶向肠道微生物群的产品是肥胖症和相关病症的有前景的治疗工具。

嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）是疣微菌门疣微菌属中一种严格厌氧的革兰氏阴性菌，可以在人类肠道中定殖，并依靠肠粘液层的黏蛋白生存，在健康肠道中的丰度占3%~5％。在过去十年中，越来越多的研究发现，嗜黏蛋白阿克曼氏菌在患有肥胖症、糖尿病、肠道疾病、神经疾病等病症的患者中丰度降低，表明其在肠道中的定殖与宿主的健康息息相关。

专利申请CN104918626 A公开了嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株MucT(ATTC BAA-835)用于治疗代谢病症的用途，其研究发现，施用嗜黏蛋白阿克曼氏菌能影响肥胖症及其相关病症的三种潜在功能障碍，即代谢功能障碍、与较高的血液脂多糖(LPS)水平相关的低级炎症状态和受损的肠道屏障功能障碍。专利申请CN 108289918 A的研究发现，嗜黏蛋白艾克曼氏菌标准菌株MucT(ATTC BAA-835)经巴氏灭菌比非经巴氏灭菌能更有效增加屏障功能和治疗与肥胖症和相关病症有关的代谢功能障碍。专利申请CN117050914A则证明特定的嗜黏蛋白阿克曼氏菌株能改善GLP-1分泌量和提高基础代谢率。专利CN116200312A则公开一种同时具有抗氧化、肿瘤抑制和减脂潜力的阿克曼氏新种属菌株。专利CN114250179A则表明联用格氏乳杆菌和嗜黏蛋白阿克曼氏菌的减重效果优于单用任一种菌。专利CN113330109A提供一种可能通过B2UM07蛋白增加GLP-1分泌进而抑制体重增加的特定嗜黏蛋白阿克曼氏菌株。CN110964650B公开了一种主要在体重控制和糖代谢方面具有预防和治疗前景的阿克曼氏菌株。

化疗相关性腹泻是化疗药物最常见的副作用之一。以5-FU为例，5-FU被磷酸化为5-FdUMP或者5-FUMP后，对增殖的小肠细胞较敏感，能导致小肠黏膜损伤并干扰肠细胞的分裂引起肠壁细胞坏死及肠壁的广泛炎症，造成吸收和分泌细胞数量失衡，进而导致腹泻。另外，化疗药物还会造成细胞DNA损伤和线粒体功能障碍，导致ROS产生和细胞凋亡。ROS可以诱导NF-κB激活，进一步上调促炎因子的表达，导致上皮、内皮和结缔组织的损伤。在肠上皮发生损伤的情况下，有害细菌极易定植，肠道微生态遭到破坏，进而造成致病菌感染，促进腹泻发生发展。

Su Z等人（Gut microbiota and sunitinib-induced diarrhea in metastatic renal cell carcinoma: A pilot study）的研究发现强化嗜粘蛋白阿克曼氏菌的益生菌可能治疗舒尼替尼引起的腹泻。

尽管各具特色的嗜黏蛋白阿克曼氏菌已经被报道，但是正如《世界胃肠组织临床指南》所述，在微生物领域，菌株的功效具有特异性，已被测试菌株的功效不能作为支持同种属的未经测试的菌株的功效证据。同时也说明，本领域有可能也有必要发掘出功能更多、功效更佳的新菌株。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种安全性良好、同时具有多种功效，具体而言，是同时具有降低胆固醇、抑制脂肪合成和改善腹泻症状功能的嗜黏蛋白阿克曼氏菌株，这在现有研究中从未有过报道。

作为本发明的第一方面，首先提供了一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株，所述菌株如保藏编号为CCTCC NO：M 2024047的Amuci-2菌株所示。所述菌株可以为活菌或灭活形式。

作为本发明的第二方面，本发明提供了前述嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株的纯培养物、活菌或灭活菌体。

作为本发明的第三方面，本发明提供了前述嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株的培养方法，所述方法包括将所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌接种至培养基，进行增殖培养，得到增殖的嗜黏蛋白阿克曼氏菌。

作为本发明的第四方面，本发明提供了一种食品、保健品或药物组合物，其含有前述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株或前述培养方法得到的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株。

在一些具体实施方式中，所述药物组合物中，嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株作为唯一活性成分。

在一些具体实施方式中，所述药物组合物还含有二甲双胍、司美格鲁肽、奥利司他、洛哌丁胺、洛伐他汀、辛伐他汀、阿伐他汀、瑞舒伐他汀、依折麦布、苯扎贝特、非诺贝特和吉非贝齐等中一种或多种。

在一些具体实施方式中，所述组合物的单个制剂中含有10⁶~10¹⁵CFU的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株。

作为本发明的第五方面，本发明提供了前述嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株或前述培养方法得到的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株在制备降低胆固醇、抑制脂肪合成和/或改善腹泻症状的制剂中的用途。所述制剂可制备为保健品或药品。

在一些具体实施方式中，所述制剂施用于高胆固醇血症、肥胖和/或腹泻受试者。

在一些具体实施方式中，所述受试者包括人和其他哺乳动物。

在一些具体实施方式中，所述腹泻为化疗相关性腹泻。

在一些具体实施方式中，所述化疗相关性腹泻是由活性成分选自如下一种或多种的药物引起的腹泻：5-氟尿嘧啶、替加氟、5'-2'-脱氧尿苷、卡培他滨、替吉奥、紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、卡莫司汀、伊立替康。

本发明的嗜黏蛋白阿克曼氏菌无毒力因子和耐药基因，安全性良好，且同时具有降低胆固醇、抑制脂肪形成和抗腹泻多重功效，是有潜力的益生菌株。

微生物保藏信息

菌株名称：嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）Amuci-2

保藏时间：2024年1月9日

保藏单位：中国典型培养物保藏中心（China Center for Type CultureCollection，CCTCC），湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052

保藏编号：CCTCC NO：M 2024047。

附图说明

图1是本发明的嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-2菌落形态正面照片。

图2是嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-2的胆固醇降解能力试验结果。

图3是油红O（oil red-O）染色检测菌株Amuci-2对3T3-L1细胞成脂的影响。A是各组油红O染色图片；B是以模型组为基准的各组细胞的脂质堆积的相对量。

图 4 是qPCR检测3T3-L1细胞成脂诱导过程中各组别c/ebp-α（A）和cpt1b（B）基因的相对表达水平。

图 5 是灭活嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-2对斑马鱼脂肪合成抑制效果图。A肠道和尾部血管脂肪染色强度柱状结果图；B染色结果图。

图6是嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-2活菌对5-氟尿嘧啶致腹泻小鼠的治疗效果图。A是第1-9天各组腹泻评分曲线；B是D9腹泻评分图；C是各组腹泻总分图。

图7是嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-2活菌对血细胞、结直肠长度改善效果图。A是血红蛋白含量；B是红细胞数量；C是结直肠长度。

图8是嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-2活菌和灭活菌的 21天亚急性毒性试验体重图。A是雄性小鼠体重；B是雌性小鼠体重。

具体实施方式

本发明首先提供了一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株，所述菌株如保藏编号为CCTCC NO：M 2024047的Amuci-2菌株所示。

本发明所请求保护的特定保藏编号的菌株，其涵义包括但不限于：

（1）存放于所述保藏中心的特定保藏号的菌株；

（2）与（1）所述菌株具有相同基因组的菌株；

（3）基于前述（1）或（2）的没有突变的传代菌株；

（4）基于前述（1）、（2）或（3）的在传代中积累微小突变的，但毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化的传代菌株；

（5）基于前述（1）-（4）任一所述菌株的活菌、灭活形式、裂解物或发酵产物等。

如本领域所知，菌株经传代应用不可避免会引入微小突变，当突变发生在非编码序列区或者编码区的同义突变或者不影响菌株毒性、免疫原性与生物活性的突变（比如，可能是两个结构域之间的连接氨基酸残基，或者位于蛋白质高级结构内部因不与免疫细胞接触而不影响毒性、免疫原性与生物活性的微小突变的残基），可以合理预期，当这些微小变化没有明显影响后代毒株的毒性、免疫原性与生物活性的情况下，仍然能实现本发明的目的，且其源于本发明贡献的菌株，因此仍在本发明的实质技术贡献范围内。这些微小的突变仍属于非实质性突变，应当视为毒性、免疫原性与生物活性没有变化的突变菌株。

毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化，包括担不限于，在检测灵敏度、检测限等检测技术的局限性和可接受或不可避免误差的范围内视为毒性、免疫原性与生物活性是相同的。用细胞、动物等测定菌株后代的毒性、免疫原性与生物活性，由于细胞品系、动物品种、年龄、性别、健康状况、培养条件等体现的差别以及可预期或不可避免的系统误差属于没有实质性变化。

本发明还提供了嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株的纯培养物、活菌或灭活菌体。

纯培养物是指由单一种类的微生物组成的培养物。纯培养物意味着在培养基上生长的所有微生物都是来自同一个微生物的后代，它们具有相同的遗传特征。

活菌是指具有生命活动能力、能够进行新陈代谢、生长和繁殖，在适宜的环境条件下可以形成菌落，这些菌落可以通过培养基上的可见生长来证实的微生物。

灭活菌体是指由于热处理、化学消毒剂、辐射或其他物理或化学方法处理后，已经失去生命活动能力，不能进行新陈代谢、生长或繁殖的微生物。

本发明还提供了一种食品、保健品或药物组合物，其含有前述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株或前述培养方法得到的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株。

在一些具体实施方案中，单次施用给受试者的食品、保健品或药物组合物中含有10²~10¹⁵CFU、10³~10¹⁴CFU、10⁴~10¹³CFU、10⁵~10¹²CFU、10⁶~10¹²CFU、10⁷~10¹¹CFU、10⁸~10¹⁰CFU、或10⁸~10¹⁰CFU的嗜黏蛋白阿克曼氏菌。

剂量可以根据使用的剂型和使用的给药途径而变化。个体医生可以根据患者的状况选择确切的剂量。可以单独调整剂量和间隔以提供足够量的活性成分以诱导生物效应。根据待治疗病症的严重性和反应性，给药可以是单次或多次给药，治疗过程持续数天至数周或直至达到治愈或实现疾病状态的减轻。主要的，要施用的组合物的量将取决于被治疗的对象、疾病的严重程度、施用的方式、处方医师的判断等。

本发明提供普通食物、饮料、保健品、医疗食品或药品形式的组合物，其包含本发明所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌。这些普通食物、饮料、保健品、医疗食品或药品包含本发明组合物的各种示例性实施方式。这些普通食物、饮料、保健品、医疗食品或药品可以制成或提供为益生菌粉、胶囊、谷物、婴儿食品、健康食品或特定健康用途的食品，也可以为药物胶囊、药片、粉剂等。

本发明的益生菌组合物还可以进一步含有其他有益成分，例如另一种功能益生菌、益生元或药物等。其他有益成分的例子包括但不限于地衣芽孢杆菌、双歧杆菌、丁酸梭菌、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、低聚甘露糖、菊粉、水苏糖、大豆低聚糖、β葡聚糖、低聚乳果糖等。

本发明中的特定温度参数，如无特殊说明，应理解为恒温处理，并允许在一定温度区间内存在变动。如在±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

下面将结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，均应属于本发明保护的范围。

以下实施例中所用到的培养基配制方法如下，未特殊说明的可以通过商业购买获得，或者按本领域常用方法制得：

无氧BHI&黏蛋白液体培养基的配制：称取BHI肉汤粉末（青岛海博生物技术有限公司，HB8297-1）38.5 g，黏蛋白（西格玛奥德里奇贸易有限公司，M2378-100G）2 g，溶解于1 L的蒸馏水中，N₂置换除氧并分装，121℃高温湿热灭菌15 min，阴凉、干燥处存放。若配制固体培养基，则另加入琼脂粉15 g。

含胆固醇的无氧BHI&黏蛋白液体培养基的配制：称取胆固醇（西格玛奥德里奇贸易有限公司，C8667）0.5 g，加入至25 mL吐温80（上海麦克林生化科技股份有限公司，T6336）中，用90℃水浴加热至胆固醇溶解（约40~60 min），再按2.5%（v/v）的比例将此混合物加至分装好的无氧BHI&黏蛋白液体培养基中，121℃高温湿热灭菌15 min，阴凉、干燥处存放。

菌粉制备培养基配制：称取无水葡萄糖10 g，N-乙酰氨基葡萄糖2g，胰蛋白胨20g，酪蛋白胨10g，酵母提取物5 g，大豆蛋白胨5 g，苏氨酸2g，丝氨酸1g，磷酸二氢钾2 g，磷酸氢二钾2 g，碳酸氢钠0.5g，硫酸锰0.1 g，氯化钙0.05 g，吐温80 0.5 mL，一水合半胱氨酸盐酸盐0.5 g，溶解于1 L的蒸馏水中，N₂置换除氧，分装，121 ℃灭菌20 min。阴凉、干燥处存放。

实施例1 菌株的分离与鉴定

（1）采集健康志愿者的新鲜粪便样本，加入适量无氧PBS重悬，震荡，并过滤。在N₂保护下，将样本进行梯度稀释后厌氧培养5-9天。培养好的菌株经MALDI-TOF质谱检测去重后再进行16S rDNA基因扩增并测序（北京擎科生物科技有限公司成都分公司）鉴定。对测序结果进行BLAST对比，最终分离出3株嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila），分别命名为Amuci-2、 Amuci-7和Amuci-8。

（2）取嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-2划线至BHI&黏蛋白固体培养基培养后，其菌落形态呈较小的白色不透明状圆形菌落，中间凸起、表面光滑湿润，正面照片见图1。该菌株已于2024年1月9日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC，武汉大学保藏中心），该菌株保藏号为：CCTCC M 2024047。

实施例2 全基因组分析

将Amuci-2接种至5 mL无氧BHI&黏蛋白液体培养基中，培养至对数生长后期，提取菌株全基因组DNA进行全基因组测序。对下机数据进行质控后用常规方法组装及注释，将所得蛋白序列与VFDB（Virulence Factor Databases）及CARD（The ComprehensiveAntibiotic Resistance Database）数据库进行比对开展毒力因子及耐药基因分析。结果显示，该菌不具有毒力因子，无耐药基因，基因组层面安全。

利用平均核苷酸相似度（Average Nucleotide Identity，ANI）和基于单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）的Variant分析进行菌株的新颖性分析。通过在Genbank中进行搜索，找到了307个已公开的Akkermansia muciniphila相关全基因组，通过fastANI（v1 .33）、snippy （v4.6.0）比较发现，与Amuci-2全基因组最相近的菌株及相关ANI和Variant信息如表1所示，全基因组最相近的菌株ANI为99.98%。

表1 全基因组ANI和Variant 分析结果

基因组组装名称	ANI(%)	Variant 总数
			ASM288501v1	99.98	27
ASM288555v1	99.91	483
			ASM1877971v1	99.90	87

实施例3 胆固醇降解实验

将保藏的Amuci-2接种至5 mL无氧BHI&黏蛋白液体培养基中，以嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株（CICC24917，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，同ATCC BAA-835）作为参比菌株。所有菌株均在37℃厌氧培养至对数生长后期，得到活化菌株。将各活化菌株接种至1 mL含胆固醇的无氧BHI&黏蛋白液体培养基中，每组设置3个平行，于37℃厌氧培养72 h后进行胆固醇含量检测。

取1 mL培养菌液5000 rpm离心10 min，取上清得到检测样本。采用总胆固醇（TC）含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，BC1985），按照试剂盒的说明书操作绘制标准曲线并检测总胆固醇含量。胆固醇降解率计算方式为：胆固醇降解率%=（空白培养基中胆固醇的含量-实验组中胆固醇的含量）/空白培养基中胆固醇的含量×100%。结果以Mean±SD表示，采用T-test进行比较分析。**代表 p<0.01。

胆固醇降解能力结果如图2所示，菌株Amuci-2胆固醇降解能力达79.24%，极显著高于标准菌株CICC24917，表明Amuci-2具有较强的胆固醇降解能力。

实施例4 油红O（oil red-O）染色检测菌株Amuci-2对3T3-L1细胞成脂的影响

油红O染色法是一种通过油红O试剂染色分化的3T3-L1细胞来测量在细胞内所生成的脂肪含量的方法。

菌株培养：将Amuci-2、嗜黏蛋白阿克曼氏菌CICC24917接种至15 mL菌粉制备培养基中，37℃电热恒温培养箱厌氧培养48 h，得到活化菌株。将活化菌株转接至360 mL菌粉制备培养基中，厌氧培养48 h。收集菌液，7000 rpm/min，离心15 min，使用无菌PBS洗菌一次。巴氏灭活处理后置于4℃待用。

细胞接种：将生长状态良好，密度适宜的3T3-L1细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司，CL-0006）使用胰酶（北京兰杰柯科技有限公司，BL501A）进行消化，离心收集后，用含10%FBS和1% PS（赛默飞世尔科技有限公司，15140-122）的DMEM完全培养基（赛默飞世尔科技有限公司，C11995500BT）稀释至3×10⁵个/mL并接种于6孔板，每孔体积2 mL。接种当天记为Day 0。

配制成脂诱导剂I：称地塞米松（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，D1756）25mg，用12.74 mL DMSO重悬混匀，使其浓度为5 mM；称罗格列酮（卡曼化学公司，71740）100mg，用139.89 mL DMSO重悬混匀，使其浓度为2 mM；称IBMX（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，I5879）250 mg，用2.25 mL DMSO重悬混匀，使其浓度为0.5 M；称胰岛素（美国MCE生物科技有限公司，HY-P0035）25 mg，用2.5 mL DMSO重悬混匀，使其浓度为10 mg/mL；将上述药品稀释1000倍后加入至100 mL DMEM完全培养基中，使其终浓度分别为5 μM、2 μM、0.5mM和10 μg/mL。

配制成脂诱导剂II：吸取2 mM罗格列酮100 μl，10 mg/mL胰岛素100 μl，加入至100 mL DMEM完全培养基中，使其终浓度分别为2μM和10μg/mL。

细胞成脂诱导与给药：设置模型组、标准菌株CICC24917组和Amuci-2组。不同组别处理方式如下：Day3时模型组加入提前配制的诱导剂I，CICC24917组加入用诱导剂I重悬的嗜黏蛋白阿克曼氏菌CICC24917灭活菌液，Amuci-2组加入用诱导剂I重悬的Amuci-2灭活菌液，使其浓度为5×10⁸ 个/mL。将细胞培养板置于5%二氧化碳培养箱中，37℃静置培养。Day5、7、9、11和13时模型组加入提前配置的诱导剂II，CICC24917组和Amuci-2组分别加入用诱导剂II重悬的灭活菌液，使其浓度为5×10⁸ 个/mL，于5%二氧化碳培养箱中，37℃静置培养。

3T3-L1细胞染色处理：Day15时弃去细胞上清液，加入4%多聚甲醛（北京兰杰柯科技有限公司，BL539A）固定30min，使用无菌PBS（武汉博士德生物工程有限公司，PYG0021）洗涤2次，加入60%异丙醇（生工生物工程（上海）股份有限公司，A507048-0500）溶液静置3min，加入油红O染液（北京索莱宝科技有限公司，G1260）进行染色，染色结束后加入60%异丙醇溶液显微镜下观察细胞间隙，细胞间隙清晰，加入无菌PBS洗涤2次，显微镜下拍照观察，结束后，添加异丙醇来溶解用油红O溶液染色的脂滴，利用酶标仪测量500nm处的吸光度。

实验结果：如图3所示，通过显微镜观察，与模型组相比，Amuci-2组细胞内脂滴及脂肪堆积显著降低（p<0.01）；Amuci-2降低细胞内脂滴及脂肪堆积效果与标准菌株嗜黏蛋白阿克曼氏菌CICC24917相当。结果以Mean±SD表示，采用One-way ANOVA进行多重比较分析。**，表示与模型组比较，p<0.01。

实施例5 qPCR检测3T3-L1细胞成脂诱导过程中c/ebp-α和cpt1b基因的相对表达水平

C/ebp-α作为诱导脂肪细胞形成的转录因子，在机体脂肪合成过程中至关重要。Cpt1b作为脂肪酸β氧化过程的关键蛋白，在氧化降解脂肪酸的过程中也起关键作用。因而检测c/ebp-α和cpt1b基因的表达量可以一定程度上反应脂肪合成与脂肪酸降解水平。

菌株培养：同实施例4的方法制备巴氏灭活菌。

细胞接种：将生长状态良好，密度适宜的3T3-L1细胞使用胰酶进行消化，用含10%FBS和1% PS的DMEM完全培养基稀释至3×10⁵个/mL并接种于6孔板中，每孔体积2 mL。接种当天记为Day0。

成脂诱导剂配制：同实施例4。

细胞成脂诱导与给药：分组、成脂诱导与给药方式与实施例4类似。Day13时弃去细胞上清液，进行RNA提取、逆转录与qPCR实验。

qPCR：Day13时弃去细胞上清液，按照RNAsimple总RNA提取试剂盒（TIANGEN，DP419）说明书进行RNA提取。RNA提取完成后，按照cDNA逆转录试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司，K1622）说明书进行逆转录。逆转录完成后，使用SYBR法（伯乐生命医学产品（上海）有限公司，1725124）进行qPCR实验。检测得到的CT值，采用2^-ΔΔCt 算法计算。基因表达量=2^-[ΔCT（目的基因CT-对应内参基因CT）-ΔCT（对照组目的基因CT-对照内参基因CT）]。将诱导脂肪分化后，模型组各基因的表达量设定为100%，其余各组均以模型组为基准计算相对表达水平。

试验结果：如图4A和B所示，相对于模型组，Amuci-2显著增加cpt1b的mRNA相对表达水平，且显著降低c/ebp-α的mRNA相对表达水平，优于标准菌株CICC24917，表明Amuci-2具有增强脂肪酸氧化降解、抑制脂肪合成的作用。结果以Mean±SD表示，采用One-wayANOVA进行多重比较分析。*与模型组比较，p<0.05。

实施例6 嗜黏蛋白阿克曼氏菌培养及灭活菌粉制备

冻干保护剂配制：

A液：蔗糖5g，海藻糖5g，甘露醇5g，脱脂乳粉8g，纯化水62 g；115℃灭菌20 min。

B液：维生素C钠3 g，纯化水12 g。过滤除菌备用。

使用时按质量比A:B=17：3混合。

菌粉制备：将保藏的嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-2、 Amuci-7和Amuci-8接种至菌粉制备培养基，得到一级种子液。随后，再转接一次得到二级种子液。将二级种子液泵入发酵罐中，设置发酵参数（37℃、pH 6.0、100 rpm、0.06 MPa），发酵培养。发酵到达终点后，离心收集菌体。按菌泥和冻干保护剂重量比1:1~1:2添加冻干保护剂，混匀乳化菌泥。乳化后的菌悬液冻干，粉碎后即得菌粉。

实施例7 灭活嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-2抑制斑马鱼脂肪合成

灭活菌悬液制备：取实施例6中的菌粉2×10⁹CFU，以2 mL 0.9%生理盐水充分溶解，制成浓度为1×10⁹CFU/mL的菌悬液。随后80℃水浴30~60 min进行巴氏杀菌，获得灭活菌悬液。

试验分组与给药：选取5 dpf黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼210尾（购自杭州环特生物科技股份有限公司），随机分为7组，分别为正常对照组、模型对照组、奥利司他组、灭活CICC24917组、灭活Amuci-2组、灭活Amuci-7组和灭活Amuci-8组，每组30尾。正常对照组及模型对照组给予PBS溶液，阳性对照奥利司他组给予浓度为15.0 μg/mL的奥利司他（购自山东新时代药业有限公司），灭活CICC24917组给予浓度为1×10⁸CFU/mL灭活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株CICC24917（购自中国工业微生物菌种保藏管理中心），各组灭活嗜黏蛋白阿克曼氏菌取上述灭活菌悬液加入18mL PBS 配制，给予浓度均为1×10⁸CFU/mL，各组斑马鱼溶液终体积均为20 mL。28 ℃孵育1 h后，除正常对照组外，其余各组均饲喂高脂食物（蛋黄粉，38%甘油酯、19%卵磷脂、30%蛋白质，少量胆固醇、糖类、矿物质等），随后，28 ℃继续孵育24 h。试验结束后进行油红O脂肪染色（油红O是一种强脂溶剂和染脂剂，可与甘油三酯等中性脂肪滴结合呈橘色，可定量反映斑马鱼肠道和血管中的脂肪含量），每组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，分析肠道和尾部血管脂肪染色强度。

试验结果：结果如图5所示，奥利司他、灭活嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株CICC24917和灭活嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-2均能显著减少斑马鱼体内脂肪含量（P<0.05），且灭活嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-2改善斑马鱼肥胖的效果优于灭活嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株CICC24917，灭活嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-7和Amuci-8未能有效抑制斑马鱼脂肪合成（P>0.05）。

实施例8 嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-2活菌对5-氟尿嘧啶致腹泻小鼠的治疗效果

试验动物：20只SPF级雄性Balb/c小鼠，体重18~22 g，购自北京维通利华试验动物技术有限公司，饲养于SPF级动物房。

试验设计：采用5-FU（5-氟尿嘧啶，购自天津金耀药业有限公司，规格10 mL/支，0.25 g/10 mL）溶液诱导小鼠化疗相关性腹泻模型，根据小鼠初始体重随机分为4组，分别为正常对照组、模型对照组、阳性对照洛哌丁胺组和Amuci-2组，每组5只。

总体试验周期为9 d，记为D1-D9。D3进行5-FU单次造模处理，除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其他组均进行5-FU单次腹腔注射造模处理，造模剂量按体重给药（350 mg/kg）。

所有组给药方式为灌胃，正常对照组、模型对照组灌胃冻干保护剂，连续灌胃5天（D1-D5）；阳性对照组按体重连续灌胃洛哌丁胺（购自西安杨森制药有限公司）9天（D1-D9，20 mg/kg）；Amuci-2组连续灌胃5天（D1-D5）1×10⁹ CFU Amuci-2。在D5给药结束后，连续观察4天。具体试验分组和给药方案见表2。

表2 试验分组和给药方案

组别

数量

造模剂

造模剂量

受试物

给药体积

给药剂量

给药天数

正常对照组

5

生理盐水

/

冻干保护剂

0.2 mL/只

/

5 d

模型对照组

5

5-FU

350 mg/kg

冻干保护剂

0.2 mL/只

/

5 d

洛哌丁胺

5

5-FU

350 mg/kg

洛哌丁胺

10 mL/kg

20 mg/kg

9 d

Amuci-2

5

5-FU

350 mg/kg

Amuci-2

0.2 mL/只

1×10⁹CFU/只

5 d

注：5-FU:5-氟尿嘧啶；CFU:菌落形成单位；d: 天

腹泻观察与评分：将小鼠置于垫有洁净滤纸的小鼠笼内，每笼1只。粪便硬，正常便视为0分；轻度、轻微湿便或软便视为1分；中度，湿便、粪便不成形且肛周不洁视为2分；重度，稀便且严重肛周不洁视为3分。试验周期内，每天对小鼠粪便进行观察、评分。腹泻总分为每天腹泻评分的总和。

血常规检测：各组动物经腹腔静脉采集全血样本，进行血常规检测（全自动血液细胞分析仪，Mindray）。

试验结果：如图6所示，与模型对照组相比，Amuci-2对5-FU导致的腹泻具有明显改善作用（图6A），与模型对照组相比D9腹泻评分显著降低（P<0.05）（图6B），腹泻总分显著降低（P<0.05）（图6C）。

血红蛋白含量和红细胞数量检测结果如图7A和7B所示：与模型对照组相比，Amuci-2对5-FU导致的血红蛋白含量增加和红细胞数量增加具有明显改善作用，同时结直肠长度检测结果（图7C）表明，Amuci-2对5-FU导致的结直肠长度降低有明显改善作用。

结果表明Amuci-2能改善5-FU诱导的小鼠化疗相关性腹泻模型的腹泻、血细胞变化和结直肠损伤。

实施例9 嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-2菌株21天亚急性毒性试验

菌株样品制备：

将嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-2菌株按体积比5%添加量从甘油管中转接至3 mL无氧BHI&黏蛋白液体培养基中，37℃厌氧恒温培养48 h进行菌株活化。再将活化菌株在360mL无氧BHI&黏蛋白液体培养基中进行扩培，37℃厌氧恒温培养约60 h后，离心收集菌体。用35 mL无氧生理盐水重悬菌体3次后，取重悬后的菌液点样至血球计数板中进行显微计数并记录数据，确保菌液浓度不低于1.25×10⁹CFU/mL。分装上述调浊计数后的菌液至10 mL厌氧管中，每份菌液分装5 mL/支，共6支。相同方法制备菌悬液，经巴氏灭活后即得Amuci-2灭活菌液。

试验设计：

参考国家市场监督管理总局颁发的《保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则（2020年版）》中“保健食品原料用细菌致病性检验方法”评价灭活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-2菌株的致病性。4~5周龄，ICR小鼠40只，雌雄各半，雄性14~16 g，雌性15~17g，购自四川维通利华实验动物技术有限公司。适应期饲养3天后，挑选体重在18~22 g范围内的小鼠入组，分为3组，即对照组、Amuci-2组（活菌）和灭活Amuci-2组，每组10只，雌雄各半。试验周期为21天，分组当天为D0，分组后各组小鼠均过夜禁食（16h），给药当天为D1，D1~D3连续3天按照20 mL/kg的给药体积灌胃受试物，对照组灌胃生理盐水，Amuci-2组灌胃浓度为3.32×10¹⁰ CFU/mL，灭活Amuci-2组灌胃浓度为1.40×10¹⁰ CFU/mL（指导原则中要求受试物浓度不低于1.25×10⁹ CFU/mL），第一次灌胃给药后3~4 h喂食，从第一天给药开始，连续观察21天。

临床观察：观察并记录小鼠皮肤和毛、眼睛和粘膜、呼吸情况、肢体活动、行为方式等有无异常。观察是否出现振颤、抽搐、腹泻、嗜睡、流涎和昏迷等现象。

结果显示，在对各组雌性和雄性小鼠连续21天的观察中发现，每只小鼠均皮肤整洁、被毛顺滑有光泽、眼睛粘膜正常、呼吸平稳正常、肢体活动正常、行为方式正常。未出现振颤、抽搐、腹泻、嗜睡、流涎和昏迷等毒性反应。

体重检测：试验前称量并记录所有小鼠的体重，试验结束后称量并记录所有小鼠的体重。

结果如图8所示，试验期间，对照组、Amuci-2组、灭活Amuci-2组的雄性或雌性小鼠的体重均稳定增长。21天时，与对照组相比，Amuci-2组、灭活Amuci-2组雄性或雌性小鼠的体重无显著差异。

结果判定标准：若受试物组动物在试验期间未出现中毒症状或死亡，且体重等指标与对照组相比差异无统计学意义，即可判定该菌株无致病性；若受试物组动物在试验期间出现中毒症状或死亡，或试验期间体重等指标与对照组相比有显著性差异，即可判定该菌株具有致病性。

结论：Amuci-2组、灭活Amuci-2组和对照组的每只雄性或雌性小鼠在试验期间一切生命体征均正常、体重增长稳定、未出现任何毒性反应及死亡情况。21天时，雄性和雌性体重在两组间无统计学差异。综上所述，活菌和灭活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-2菌株均无致病性。

Claims

1. 一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株，其特征在于，所述菌株为保藏编号为CCTCC NO：M 2024047 的Amuci-2 菌株。

2. 权利要求1 所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株的纯培养物、活菌或灭活菌体。

3. 权利要求1 所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株的培养方法，其特征在于，所述方法包括将所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌接种至培养基，进行增殖培养，得到增殖的嗜黏蛋白阿克曼氏菌。

4. 一种食品组合物、保健品组合物或药物组合物，其特征在于，含有权利要求1 所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株，或权利要求2 所述的纯培养物、活菌或灭活菌体。

5. 一种药物组合物，含有权利要求1 所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株，或权利要求2 所述的纯培养物、活菌或灭活菌体，其特征在于，嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株作为唯一活性成分。

6. 一种药物组合物，含有权利要求1 所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株，或权利要求2 所述的纯培养物、活菌或灭活菌体，其特征在于，还含有二甲双胍、司美格鲁肽、奥利司他、洛哌丁胺、洛伐他汀、辛伐他汀、阿伐他汀、瑞舒伐他汀、依折麦布、苯扎贝特、非诺贝特和吉非贝齐中一种或多种。

7. 权利要求1 所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）Amuci-2 菌株，或权利要求2 所述的纯培养物或灭活菌体，在制备降低胆固醇、抑制脂肪合成的药品中的用途。

8. 权利要求1 所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）Amuci-2 菌株，或权利要求2 所述的纯培养物、活菌，在制备改善腹泻症状的药品中的用途。

9. 根据权利要求7 所述的用途，其特征在于，所述药品的单个制剂中含有10⁶~10¹⁵CFU的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株。

10.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药品施用于高胆固醇血症或肥胖受试者。

11.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药品施用于化疗相关性腹泻受试者。

12. 根据权利要求11 所述的用途，其特征在于，所述化疗相关性腹泻是由活性成分选自如下一种或多种的药物引起的腹泻：5-氟尿嘧啶、替加氟、5'-2'-脱氧尿苷、卡培他滨、替吉奥、紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、卡莫司汀、伊立替康。