WO2020076136A2 - 아커만시아 뮤시니필라 균주 및 이의 용도 - Google Patents

아커만시아 뮤시니필라 균주 및 이의 용도 Download PDF

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WO2020076136A2
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strain
metabolic disease
akkermansia
improving
appetite suppression
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고광표
윤효신
조정환
유현주
남태욱
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서울대학교산학협력단
주식회사 고바이오랩
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to an strain of Akkermansia muciniphila SNUG-61027 (Accession No. KCTC 13530BP) and its use, which has appetite suppression and metabolic disease prevention, improvement, alleviation and treatment efficacy.
  • Obesity is a condition of excessive body fat accumulation due to changes in eating habits such as high-calorie diet and lack of exercise, and is associated with the development of type 2 diabetes, cardiovascular disease, liver disease, and various cancers, and thus has a great clinical significance.
  • intestinal microorganisms are known to have a deep correlation with metabolic diseases such as obesity and diabetes.
  • the strain of Akermansia mucinifila increases in the intestines of mice treated with mepomin, a diabetes treatment agent, and this strain is a high-fat diet mouse.
  • glucose homeostasis was improved when it was administered, it has attracted attention as a therapeutic agent for obesity, and presented a new paradigm for anti-obesity drug research.
  • the anti-obesity effect has various mechanisms in addition to the above-mentioned indicators, and in particular, it has recently been reported that induction of brown fat interacts with intestinal microbes in association with the body temperature maintenance homeostasis mechanism.
  • Adipose tissue is divided into white fat, which stores energy in the form of triglycerides, and brown fat, which releases energy as heat.
  • Brown fat regulates glucose homeostasis by inducing energy consumption through tissue-specific UCP-1 factors and regulates insulin sensitivity. It has a function to boost.
  • GLP-1 glucagon-like peptide
  • GLP-1 is secreted from L-cells, a type of intestinal endocrine cells present in the small intestine (ileum) and large intestine (colon).
  • the GLP-1 is a diabetes treatment effect, obesity treatment effect, heart disease treatment effect, cerebrovascular disease and nerve cell inflammation treatment effect (Salcedo I et al., Neuroprotective and neurotrophic actions of glucagon-like peptide-1 (GLP-1)): an emerging opportunity to treat neurodegenerative and cerebrovascular disorders.British Journal of Pharmacology (2012) 166, 1586-1599), the effect of treating arteriosclerosis (Burgmaier M et al., Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and its split products GLP-1 (9-37) and GLP-1 (28-37) stabilize atherosclerotic lesions in apoe-/-mice.Atherosclerosis (2013) 231, 427-435) and the like.
  • GLP-1 is involved in showing diabetes treatment effects through stimulation of glucose-dependent insulin secretion in the pancreas, insulin gene expression enhancement, pancreatic beta cell proliferation effect, pancreatic beta cell survival enhancement effect, glucagon secretion inhibitory effect, and lowering blood sugar, It is involved in slowing the rate of emptying of the stomach, suppressing appetite, improving satiety, and suppressing food intake, thereby showing the effect of treating obesity.
  • it shows the effect of treating heart disease through the effect of protecting cardiomyocytes from ischemia and improving the cardiac function of patients with heart attacks (Sokos, GG etal., Glucagon-like peptide-1 infusion improves left ventricular Ejection fraction and functional status in patients with chronic heart failure.J. Card.Fail.
  • the GLP-1 is a type of G protein-coupled receptors (GPCRs) that activates TGR5 and GPR119 (Reimann, F., etal., Glucose sensing in L cells: a primary cell study.Cell Metab. (2008) 8: 532 -539; Lauffer, LM, etal., GPR119 is essential for oleoylethanolamide-induced glucagon-like peptide-1 secretion from the intestinal enteroendocrine L-cell.Diabetes (2009) 58: 1058-1066) or activation of ⁇ -gustducin (Jang , HJ, etal., 2007.
  • GPCRs G protein-coupled receptors
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • Rats induced to contain a large amount of brown adipocytes were effective against obesity and metabolic diseases by inducing a decrease in body weight and an increase in calorie consumption relative to obesity caused by high-fat diet.
  • UCP-1 uncoupling protein-1
  • brown fat which is known to play a critical role in heat generation by consuming heat rather than storing heat in fat cells.
  • beige adipocytes are also recognized as important adipocytes.
  • Beige adipocytes are induced by stimulation such as exercise or cold in white adipocytes that are harmful to health, and the traits of white adipocytes are reduced, but they have the characteristics of brown adipocytes, thereby increasing the expression of UCP-1.
  • Their beige adipocytes are also known to be beneficial for obesity and metabolic diseases, similar to brown adipocytes found in mice.
  • the present inventors have revealed that this process is dependent on the host's IL-6 cytokine, and finally, the Akkermansia mucinophila strain culture, cell, supernatant, which promotes the induction of GLP-1 secretion in anti-obesity mechanisms,
  • the present invention was completed by identifying the target protein derived from its extract or fraction, or strain.
  • the present invention provides a strain Akkermansia muciniphila ( AKK ) SNUG-61027 of accession number KCTC 13530BP. Specific information about the strain is as follows.
  • the strain of the present invention includes a 16S rDNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing, improving or treating an appetite suppression or metabolic disease as an active ingredient of the Akkermansia musciniphila SNUG-61027 (Accession No. KCTC 13530BP) strain or a culture medium thereof.
  • culture medium of the present invention is obtained by culturing the strain for a period of time in a medium capable of supplying nutrients so that the strain of Akkermansia mucinifil SNUG-61027 (Accession No. KCTC 13530BP) can grow and survive in vitro. It means a whole medium containing a strain, its metabolites, extra nutrients, etc., but it is a concept that includes all of the supernatant, their extracts and fractions from which the strain was removed after culturing the strain.
  • the liquid from which the cells are removed from the culture medium is also referred to as a "supernatant", and the culture medium is allowed to stand for a certain period of time to take only the liquid from the upper layer excluding the portion that has settled in the lower layer, remove the cells through filtration, or centrifuge the culture medium to settle the bottom. It can be obtained by removing and taking only the liquid at the top.
  • the "bacteria” means the strain itself of the present invention, and includes the strain itself separated from the fermented food or the strain separated from the culture medium by culturing the strain.
  • the cells can be obtained by centrifuging the culture medium and taking a portion that has settled in the lower layer, or can be obtained by removing the upper liquid after being allowed to stand still for a period of time because it sinks to the lower layer of the culture medium by gravity.
  • the extract of Akermansia muciniphila SNUG-61027 (Accession No. KCTC 13530BP) strain culture, cell or supernatant of the present invention is extracted with ethyl acetate (EtOAc) or ethanol (ethanol, ethyl alcohol; EtOH). It may be, but is not limited to this.
  • the fraction of the Akkermansia mucinifil SNUG-61027 strain culture medium, cell or supernatant of the present invention may be a fraction obtained by fractionating ethyl acetate extract with methanol, but is not limited thereto.
  • the fractions of Akermansia muciniphila (Accession No. KCTC 13530BP) strain culture, supernatant or extract of the present invention can be obtained according to conventional fractionation methods well known in the art, for example, anion exchange columns or size columns, etc. It can be obtained by chromatography using a.
  • metabolic disease of the present invention means that various diseases such as impaired glucose tolerance, diabetes, fatty liver, hypertension, dyslipidemia, obesity, cardiovascular atherosclerosis due to chronic metabolic disorders appear in one or more individuals. And, for example, it may be any one selected from impaired glucose tolerance, diabetes, arteriosclerosis, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, fatty liver, cardiovascular disease and obesity.
  • an increase in IL-6, an increase in GLP-1 expression, and an increase in the activity of brown fat may be induced, thereby exhibiting an advantageous effect on the metabolic disease, and further, the metabolic disease may be prevented, improved or treated.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing, improving or treating an appetite suppression or metabolic disease comprising the B2UM07 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • the B2UM07 protein was identified through NCBI Database matching of the existing strain when performing protein identification in the efficacy fraction of the present invention via LC / MS-MS and the information is as follows.
  • Organism Akkermansia muciniphila
  • the B2UM07 protein may be derived from a strain of Akkermansia musinifila, and specifically, the strain of Akkermansia musinifila may be SNUG-61027 strain (Accession No. KCTC 13530BP).
  • variants of the sequence are also included within the scope of the present invention.
  • a variant is a protein consisting of an amino acid sequence consisting of a nucleotide sequence having functional characteristics similar to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, although the nucleotide sequence or amino acid sequence is changed.
  • the protein according to the present invention has an amino acid sequence of 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more sequence homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Sequence.
  • the present invention provides a gene encoding the B2UM07 protein.
  • the gene of the present invention includes both genomic DNA and cDNA, each encoding a B2UM07 protein.
  • the gene may include a nucleotide sequence encoding the protein of SEQ ID NO: 2.
  • the gene has a sequence homology of 60% or more, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, and most preferably 90% or more with the base sequence encoding the protein of SEQ ID NO: 2 It may include a base sequence.
  • recombinant vector comprising a gene encoding the B2UM07 protein according to the invention.
  • the term "recombinant" of the present invention refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a peptide, a heterologous peptide or a protein encoded by a heterologous nucleic acid.
  • Recombinant cells can express genes or gene segments not found in the natural form of the cells, either in sense or antisense form. Recombinant cells can also express genes found in natural cells, but the genes have been modified and re-introduced into cells by artificial means.
  • the "vector” is used to refer to a DNA fragment (s), nucleic acid molecules that are delivered into a cell. Vectors replicate DNA and can be independently reproduced in host cells.
  • the present invention provides a transformant transformed with the recombinant vector.
  • a method of transforming the vector with E. coli a method commonly known in the art, such as the use of a competent cell using a CaCl 2 buffer, electroporation, or thermal shock, can be used. have.
  • the method for culturing the transformed E. coli may use a culture method of E. coli that is commonly used in the art.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered by various routes to mammals, including humans.
  • administration means to introduce a predetermined substance into a subject in an appropriate manner, and the administration method may be any of the commonly used methods, for example, routes of oral, skin, intravenous, intramuscular, subcutaneous, etc. It may be administered, preferably, orally.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is an oral dosage form such as powder, granule, tablet, capsule, suspension, emulsion, syrup, etc. according to a conventional method, or parenteral such as ointment, aerosol, transdermal, suppository and sterile injectable solution. It can be used in the form of a formulation.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be one that further contains a pharmaceutically acceptable and physiologically acceptable carrier, excipient and diluent.
  • Carriers, excipients and diluents that can be included in the pharmaceutical compositions of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium Silicates, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants, which are usually used, can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered alone, but is generally selected in consideration of the administration method and standard pharmaceutical practice. It can be administered in combination with a carrier.
  • the composition containing Akermansia mucinifila strains of the present invention is in the form of a tablet containing starch or lactose, or in the form of a capsule containing alone or excipients, or a chemical agent to flavor or color It may be administered orally, intraorally or sublingually in the form of containing elixirs or suspensions.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the patient's age, weight, sex, dosage form, health status and disease level, and once to several times a day at regular time intervals according to the judgment of the doctor or pharmacist It can also be administered in portions.
  • the daily dosage based on the active ingredient content may be 0.1 to 500 mg / kg, preferably 0.5 to 300 mg / kg.
  • the above-mentioned dosage is an example of an average case, and the dosage may be high or low according to individual differences.
  • Another example of the present invention is akermansia muciniphila strain SNUG-61027 (Accession No. KCTC 13530BP) or its culture, supernatant, extract or fraction containing as an active ingredient suppression of appetite or improvement or alleviation of metabolic disease health Provide functional food.
  • the metabolic disease may be impaired glucose tolerance, diabetes, arteriosclerosis, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, fatty liver, cardiovascular disease or obesity.
  • an increase in IL-6, an increase in GLP-1 expression, and an increase in the activity of brown fat may be induced to exhibit a beneficial effect on the metabolic disease, and further, the metabolic disease may be alleviated or treated.
  • the present invention provides a health functional food for improving or alleviating appetite suppression or metabolic disease comprising the B2UM07 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • the metabolic disease may be impaired glucose tolerance, diabetes, arteriosclerosis, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, fatty liver, cardiovascular disease or obesity.
  • the B2UM07 protein may be derived from a strain of Akkermansia musinifila, specifically, the strain of Akkermansia musinifila may be a SNUG-61027 strain (Accession No. KCTC 13530BP), and details are as described above. same.
  • the health functional food may be various beverages, fermented milk, food additives, and the like.
  • the content of the Akkermansia muciniphila strain as an active ingredient contained in the health functional food is not particularly limited according to the type of food, desired use, etc., for example, it can be added at 0.01 to 15% by weight of the total food weight.
  • the health drink composition may be added at a rate of 0.02 to 10 g, preferably 0.3 to 1 g, based on 100 ml.
  • natural carbohydrates examples include monosaccharides, such as disaccharides such as glucose and fructose, such as maltose, sucrose and the like, and polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, etc.
  • Sugar alcohols such as sugar, xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents tacumatine, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizine, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 1 to 20 g per 100 ml of the composition of the present invention, preferably about 5 to 12 g.
  • the health functional food of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, colorants and enhancers (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alginic acid and It may contain salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonic acid used in carbonated beverages, and the like.
  • flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, colorants and enhancers (cheese, chocolate, etc.
  • pectic acid and salts thereof alginic acid and It may contain salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonic acid used in carbonated beverages, and the like.
  • the health functional food of the present invention may contain natural fruit juice and fruit juice for the production of fruit juice drinks and vegetable drinks. These ingredients can be used independently or in combination. The proportion of these additives is not so important, but is generally selected from 0 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the health functional food of the present invention.
  • Akkermansia muciniphila ( Akkermansia muciniphila ) SNUG-61027 strain (Accession No. KCTC 13530BP), or its culture, supernatant, extract or fraction of appetite suppression or use for the prevention, treatment, improvement or alleviation of metabolic disease Provides
  • the Akkermansia muciniphila SNUG-61027 strain used in the use of the present invention may include 16S rDNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the metabolic disease to which the use of the present invention is applied may be impaired glucose tolerance, diabetes, arteriosclerosis, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, fatty liver, cardiovascular disease or obesity.
  • the present invention provides a use for preventing, treating, improving or alleviating appetite suppression or metabolic disease of the B2UM07 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the B2UM07 protein used in the use of the present invention may be derived from the strain of Akkermansia mucinifila.
  • the Akkermansia mucinifila strain used in the use of the present invention may be a SNUG-61027 strain (Accession No. KCTC 13530BP).
  • the present invention is the Akkermansia muciniphila ( Akkermansia muciniphila ) SNUG-61027 strain (Accession No. KCTC 13530BP), or a culture, supernatant, extract or fraction thereof comprising the step of treating appetite suppression or prevention of metabolic disease, treatment, Provide methods for improvement or mitigation.
  • the Akkermansia muciniphila SNUG-61027 strain (Accession No. KCTC 13530BP) used in the method for preventing, treating, improving or alleviating appetite suppression or metabolic disease of the present invention consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 It may be one containing 16S rDNA.
  • the metabolic disease to which the method of the present invention is applied may be impaired glucose tolerance, diabetes, arteriosclerosis, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, fatty liver, cardiovascular disease or obesity.
  • the present invention provides a method for preventing, treating, improving or alleviating an appetite suppression or metabolic disease comprising the step of treating a B2UM07 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the B2UM07 protein used in the method of the present invention may be derived from the strain of Akkermansia musinifila.
  • the Akkermansia mucinifila strain used in the method of the present invention may be a SNUG-61027 strain (Accession No. KCTC 13530BP).
  • the present invention confirms the activation effect of brown fat and the appetite-regulating hormone GLP-1 secretion ability, in addition to weight loss and glucose homeostasis, among the anti-obesity effects of Akkermansia mucinifila, and these effects are directed to specific cytokines, IL-6 of the host. It was confirmed to be dependent.
  • a novel strain of Akermansia muciniphila SNUG-61027 accesion No.
  • KCTC 13530BP KCTC 13530BP
  • B2UM07 P9 isolated from a culture of Akkermansia muciniphila strain It was confirmed that the protein exhibited a remarkably excellent GLP-1 inducing ability, the ability to maintain glucose homeostasis in the body, and a weight loss effect. Therefore, the novel Akkermansia mucinifila strain and the B2UM07 protein can be usefully used to suppress appetite or to treat or prevent metabolic diseases.
  • Figure 2 is an experimental result confirming the increase in UCP-1 expression and brown fat-related markers by Akkermansia mucinifila strains using qPCR.
  • Figure 3 is an experimental result confirming the increase in IL-6 cytokines and GLP-1 in the small intestine by the Akkermansia musciniphila strain using qPCR.
  • Figure 7A is an experimental result confirming the ability of GLP-1 expression by the size fraction of Akkermansia mucinophila in vitro
  • Figure 7B is a protease (proteinase K; PK) in the GLP-1 induced fraction (100K, 300K) ), It is the result of the experiment that confirmed the expression of GLP-1.
  • PK proteinase K
  • 11 is an experimental result confirming the glucose homeostatic ability in the body when the target protein is administered intraperitoneally.
  • Example 1 High-fat diet mouse model Akermansia mucinii pillar ( Akkermansia muciniphila , Akk) Analyzing the effect of reducing liver and brown fat weight after administration of strain
  • Example 2 Increased UCP-1 expression and brown fat-related markers by the Akermansia musciniphila strain
  • brown fat activation marker uncoupling protein UCP-1
  • IHC immuno-histochemistry
  • Example 3 Increased IL-6 cytokines and increased GLP-1 in the small and large intestine by the Akermansia musciniphila strain
  • RNA of the small intestine (ileum) and colon (colon) tissues After extracting the RNA of the small intestine (ileum) and colon (colon) tissues, and synthesizing the cDNA, the expression level of the immune cytokine markers (TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-18, IL-6, IL-10) Comparison was made by group (Fig. 3A, B).
  • IL-6 cytokine when treated with three Lactobacillus (KCTC2180, KCTC3112, KCTC1048) and three Bifidobacterium (KCTC3127, KCTC3128, KCTC3352) or Akkermansia mucinibilla (Akk) in mouse intestinal cell line (CT26 cell)
  • the expression capacity of Cain was compared.
  • Lipopolysaccharide (LPS) from E.coli was used as a positive control ( Figure 3C).
  • IL-6 cytokines in mouse small and large intestine cells were significantly increased by administration of Akkermansia mucinifila, and the expression of the appetite regulating hormone, glucagon-like peptide-1 (GLP-1) in serum was significantly increased. It was confirmed that it was significantly increased (Figs. 3A to 3D).
  • Akkermansia mucinifila in mouse intestinal cell lines showed significantly increased IL-6 levels compared to other Lactobacillus and Bifidobacterium strains.
  • the Akk strain (Akermansia mucininipil ATCC BAA-835) or Akermansia mucininipil SNUG-61027 strain was cultured in 0.5% mucin medium, and then 0.1% or 5% Fetal bovine serum ( FBS) incubated in BHI medium for 36 hours.
  • FBS Fetal bovine serum
  • NCI-H716 (ATCC CCL-251) cell line secreting GLP-1 at a concentration of 2 x 10 5 cells / ml in a 96-well plate coated with collagen
  • cell metabolism synchronization for intercellular glucose was performed.
  • BSA bovine serum albumin
  • HBSS Horts Buffered Saline Solution
  • 10% v / of Akk strain (ATCC BAA-835) or Akermansia muciniphile SNUG-61027 (bacterial strain to cell ratio: 1:20) or culture supernatant (CFS) v concentration.
  • the culture supernatant of the SNUG-61027 strain in the same manner as above was used at a concentration of 10-100% v / v or as a control (con) Bifidobacterium bifidum (KBL483; Korean feces Derived isolates) was treated with a concentration of 10-100% v / v, and supernatant was obtained 2 hours later to confirm GLP-1 expression in the supernatant (FIG. 5B).
  • Example 7 Fractionation of GLP-1 derived fraction (100K) using a size filter, anion exchange column and size column and confirmation of GLP-1 derived fraction
  • each fraction was secured using a filter according to size. Thereafter, after concentrating it, it was confirmed that high levels of GLP-1 are expressed in fractions between 100 kDa and 300 kDa when GLP-1 inducing ability is confirmed.
  • protease Protease K; PK
  • PK protease
  • the m2-m4 fraction was concentrated with a 30K filter, and then the concentrated sample was again subjected to FPLC using a GPC size column (GPC / SEC).
  • the fraction was fractionated at a rate of 3 ml / min using a hiload 16/600 Superdex pg (GE Healthcare) AKTAexplorer system.
  • each fraction was treated to L cells, and the ability to express GLP-1 was confirmed.
  • GLP-1 was expressed at a high level in the G17-G20 fraction (FIG. 8B).
  • Amuc1100 is a protein known for its anti-obesity function derived from Akkermansia muciniphila (Plovier H. et al ., A purified membrane protein from Akkermansia muciniphila or the pasteurized bacterium improves metabolism in obese and diabetic mice.Nat Med. (2017) 23 : 107-113) It was used as a positive control. Each isolated protein was treated in L cells to confirm GLP-1 expression.
  • the synthesized target protein was inserted into a pET-21b plasmid (Novagen) with an IPTG-inducing promoter, and purified through his-tag. This was confirmed by SDS-PAGE gel.
  • the synthesized plasmid was mass-produced and separated. After measuring the protein concentration, it was treated in the NCI-H716 cell line .
  • GLP-1 is induced by the B2UKW8 (P1), B2URM2 (P5), and B2UM07 (P9) proteins.
  • B2UM07 the Amuc1100 protein in both 10 ⁇ g / ml and 100 ⁇ g / ml It was confirmed that GLP-1 was induced at a significantly higher level (FIG. 10C).
  • the P1 (B2UKW8), P5 (B2UKW8), and P9 (B2UM07) proteins were administered to the normal diet mice intraperitoneally for 100 weeks at a concentration of 100 ⁇ g / mouse, The glucose tolerance test was conducted.
  • the P9 (B2UM07) protein was administered orally to a high-fat diet mouse at a concentration of 100 ⁇ g / mouse for 8 weeks, and then a glucose tolerance test was performed. Blood glucose was measured for 15 minutes to 120 minutes after oral administration of glucose (2 g / kg).
  • the P9 (B2UM07) administration group showed a significant weight gain suppression effect compared to the high fat diet mouse group, and the effect was greater than that of the Amuc1100 administration group (FIG. 12A).
  • the glucose homeostatic ability was significantly controlled compared to the high-fat diet mouse group (FIGS. 12B and 12C).

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Abstract

본 발명은 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) SNUG-61027 균주 (수탁번호 KCTC 13530BP) 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 상기 균주, 그 배양액 등 또는 그로부터 분리한 B2UM07 단백질을 유효성분으로 포함하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 조성물, 및 이의 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 개선, 완화 및 치료 용도, 및 이를 이용한 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 개선, 완화 및 치료 방법을 제공하고, 이를 통해 항비만 효과 중 체중 감소 및 글루코스 항상성 조절은 물론 갈색지방에 미치는 영향 및 식욕조절 호르몬을 분비하는 효과를 발휘한다.

Description

아커만시아 뮤시니필라 균주 및 이의 용도
관련 출원(들)과의 상호 인용
본 출원은 2018년 10월 11일자 한국특허출원 제10-2018-0121137호 및 2019년 10월 10일자 한국특허출원 제10-2019-0125670호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며， 해당 한국 특허 출원의 문헌들에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 발명은 식욕 억제 및 대사성 질환 예방, 개선, 완화 및 치료 효능을 가진 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) SNUG-61027 균주 (수탁번호 KCTC 13530BP) 및 이의 용도에 대한 것이다.
비만은 고열량 식이와 같은 식습관의 변화, 운동부족 등에 의해 인체내 과도한 체지방이 축적된 상태로 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 간질환, 각종 암의 발병과 연관되어 있어 임상적 중요성이 매우 크다. 한편, 장내 미생물은 비만과 당뇨 등 대사성 질환과 깊은 상관관계가 있다고 알려져 있는데, 특히 당뇨병 치료제인 메포민을 처리한 마우스의 장내에 아커만시아 뮤시니필라 균주가 증가하고, 이 균주를 고지방 식이 마우스에 투여 시 글루코스 항상성이 개선됨이 밝혀지면서 비만 치료제로써의 가능성을 주목받고 있으며, 항비만 제제 연구의 새로운 패러다임을 제시한 바 있다.
사람의 총 세포수의 10배에 가까운 장내 미생물들 중 항비만 효능이 검증된 아커만시아 뮤시니필라 균주의 항비만 효과 기전을 이해하기 위한 다양한 연구가 진행되었는데, 종래의 연구들은 항비만 지표로 체중 감소, 만성 대사성염증 개선, 손상된 장벽의 복원 또는 혈중 지질 지표 개선 등에 초점이 맞추어져 있다.
그러나, 항비만 효과는 상기 언급한 지표 외에 다양한 기전이 존재하며, 특히 갈색지방의 유도는 체온 유지 항상성 메커니즘과 연계하여 장내미생물과 상호작용함이 최근 보고되었다. 지방조직은 에너지를 중성지방의 형태로 저장하는 백색지방과 에너지를 열로 방출하는 갈색지방으로 나누어지는데, 갈색지방은 조직 특이적인 UCP-1 인자를 통해 에너지 소비를 유도함으로써 글루코스 항상성을 조절하고 인슐린 민감도를 높여주는 기능을 갖고 있다.
한편 식욕조절 호르몬인 글루카곤-유사 펩티드(glucagon-like peptide, GLP-1) 는 음식섭취에 의해 소장에서 분비되는 호르몬으로 포만감을 증가시켜, 식욕을 조절하며, 췌장에서 인슐린 분비를 유도함으로써 혈당을 조절한다.
GLP-1은 소장(ileum) 및 대장(colon)에 존재하는 장 내분비세포의 일종인 L-cells에서 분비된다.
상기 GLP-1은 당뇨병 치료 효과, 비만 치료 효과, 심장병 치료 효과, 뇌혈관 질환 및 신경세포 염증 치료 효과(Salcedo I et al., Neuroprotective and neurotrophic actions of glucagon-like peptide-1 (GLP-1): an emerging opportunity to treat neurodegenerative and cerebrovascular disorders. British Journal of Pharmacology (2012) 166, 1586-1599), 동맥경화증 치료 효과 (Burgmaier M et al., Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and its split products GLP-1(9-37) and GLP-1(28-37) stabilize atherosclerotic lesions in apoe-/- mice. Atherosclerosis (2013) 231, 427-435) 등과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
또한 GLP-1은 췌장에서 포도당 의존적 인슐린 분비 자극, 인슐린 유전자 발현 증진, 췌장 베타세포 증식 증진 효과, 췌장 베타세포 생존 증진 효과, 글루카곤 분비 저해 효과, 혈당 강하 등을 통해 당뇨병 치료 효과를 나타내는데 관여하며, 위장이 비워지는 속도를 늦추고, 식욕을 억제하고, 포만감을 증진시키며 음식 섭취를 억제하는데 관여하여 비만 치료 효과를 나타내는데 관여한다. 그리고 국소 빈혈(ischemia)로부터 심장세포(cardiomyocytes) 보호 효과 및 심장마비 우려가 있는 환자의 심장기능 향상 효과를 통해 심장병 치료 효과를 나타낸다(Sokos, G.G. etal., Glucagon-like peptide-1 infusion improves left ventricular ejection fraction and functional status in patients with chronic heart failure. J. Card. Fail. (2006) 12: 694-699., Ban, K., etal., Cardioprotective and vasodilatory actions of glucagon-like peptide-1 receptor are mediated through both glucagon-like peptide-1 receptor-dependent and -independent pathways. Circulation (2008) 117: 2340-2350.).
상기 GLP-1은 G protein-coupled receptors(GPCRs)의 일종인 TGR5 및 GPR119의 활성화(Reimann, F., etal., Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metab. (2008) 8: 532-539; Lauffer, L.M., etal., GPR119 is essential for oleoylethanolamide-induced glucagon-like peptide-1 secretion from the intestinal enteroendocrine L-cell. Diabetes (2009) 58:1058-1066) 또는 α-gustducin의 활성화(Jang, H.J., etal., 2007. Gut expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1. Proceeding of the National Academy of Science 104, 1506915074.)에 의해 분비가 촉진되는 것으로 알려져 있다. 특히, 갈색지방조직(brown adipose tissue) 및 근육(muscle)에 발현된 G protein-coupled receptor(GPCR) TGR5(GPR131)의 활성화는 에너지 소비를 증가시켜서 비만 치료 효과를 보이며, 간질환 개선에 관련이 있는 것으로 알려져 있으며(Lieu T et al., GPBA: A G protein-coupled receptor for bile acids and an emerging therapeutic target for disorders of digestion and sensation. British Journal of Pharmacology (2013) in press), 동맥경화증을 억제하는 것으로 보고되었다(Pols TWH et al., TGR5 activation inhibits atherosclerosis by reducing macrophage inflammation. Cell Metabolism (2011) 14, 747).
또한, 비만환자에게 과도하게 축적된 중성지방은 지방조직뿐 아니라, 간이나 근육에 저장되어 인슐린 저항성을 유도한다. 따라서, 과도하게 저장된 중성지방의 소모가 근본적인 비만과 이에 따른 대사성 질환의 예방 및 치료가 될 수 있다. 지방세포는 크게 백색지방, 갈색지방세포 및 베이지 지방세포로 분류된다. 백색지방세포는 중성지방의 큰 지방구에 저장되어 주로 복부에서 많이 발견되며, 건강에 부정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 갈색지방은 백색 지방세포에 비해 많은 미토콘드리아와 작은 크기의 지방구를 함유하고 있으며 열 발생을 통한 체온 유지와 적절한 운동에 의해 유도될 수 있다고 보고되고 있다. 갈색지방세포가 많이 함유되도록 유도한 쥐는 고지방식이에 의한 비만에 대해 상대적으로 몸무게 감소와 열량 소모의 증가를 유도하여 비만과 대사성 질환에 효과적이었다. 또한, 갈색지방에서는 UCP-1(uncoupling protein-1) 단백질이 많이 발현되며, 이는 지방세포에서 열량의 저장이 아닌 열량 소모로 열 발생에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 갈색지방과 더불어 베이지 지방세포 또한 중요한 지방세포로 인식되고 있다. 베이지 지방세포는 건강에 유해한 백색지방세포에서 운동이나 추위 등의 자극에 의해 유도되며 백색지방세포의 형질은 감소되나 갈색지방세포의 특징을 갖게 되어 UCP-1의 발현을 증가를 나타나게 된다. 이들의 베이지 지방세포 또한 쥐에게서 발견되는 갈색지방세포와 유사하게 비만 및 대사 질환에 유익한 것으로 알려져 있다.
[선행기술문헌]
1. 한국등록특허 제10-1809172호
2. 한국공개특허 제10-2015-0133646호
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 대사성 질환을 효과적으로 예방 및 치료하기 위한 목적으로 현재 항비만 연구에 이용되고 있는 표준균주, 아커만시아 뮤시니필라 균주(Akkermansia muciniphila, Akk; 미국균주은행, 기탁번호 : ATCC BAA-835) 와 건강한 한국인 분변에서 분리한 분리 균주 아커만시아 뮤시니필라 SNUG-61027 균주 (수탁번호 : KCTC13530)를 이용하여 아커만시아 뮤시니필라가 갈색지방 활성에 영향을 주는 UCP-1 인자를 높이고, 소장에서 식욕조절 호르몬 GLP-1 발현을 유도함을 확인하였다.
또한 본 발명자는 이 과정이 호스트의 IL-6 사이토카인에 의존적으로 유도됨을 밝혔으며, 최종적으로 항비만 기전에서 GLP-1의 분비 유도를 촉진하는 아커만시아 뮤시니필라 균주 배양액, 균체, 상등액, 이의 추출물 또는 분획물, 또는 균주에서 유래된 타겟 단백질을 규명하여 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 수탁번호 KCTC 13530BP의 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila, Akk) SNUG-61027 균주를 제공한다. 해당 균주에 대한 구체적인 정보는 다음과 같다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC 13530BP
수탁일자 : 20180525
본 발명의 상기 균주는 서열목록 1의 염기서열로 이루어진 16S rDNA를 포함한다.
또한 본 발명은 상기 아커만시아 뮤시니필라 SNUG-61027(수탁번호 KCTC 13530BP) 균주 또는 그의 배양액을 유효성분으로 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "배양액"은 아커만시아 뮤시니필라 SNUG-61027(수탁번호 KCTC 13530BP) 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미하나, 균주 배양 후 균주를 제거한 상등액, 이들의 추출물 및 분획물을 모두 포함하는 개념이다. 상기 배양액 중 균체를 제거한 액체를 "상등액"이라고도 하며, 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나, 배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다.
상기 "균체"는 본 발명의 균주 자체를 의미하는 것으로 발효식품으로부터 분리하여 선별한 균주 자체 또는 상기 균주를 배양하여 배양액으로부터 분리한 균주를 포함한다. 상기 균체는 배양액을 원심분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 중력에 의해 배양액의 하층으로 가라앉으므로 일정 시간동안 가만히 두었다가 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다.
또한, 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 SNUG-61027(수탁번호 KCTC 13530BP) 균주 배양액, 균체 또는 상등액의 추출물은 에틸아세테이트(ethyl acetate; EtOAc) 또는 에탄올(ethanol, ethyl alcohol; EtOH)로 추출한 추출물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 나아가, 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 SNUG-61027 균주 배양액, 균체 또는 상등액의 분획물은 에틸아세테이트 추출물을 메탄올로 분획한 분획물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라(수탁번호 KCTC 13530BP) 균주 배양액, 상등액 또는 추출물의 분획물은 당업계에 널리 알려져 있는 통상의 분획 방법에 따라 수득될 수 있으며, 예컨대, 음이온 교환 컬럼 또는 사이즈 컬럼 등을 이용한 크로마토그래피법에 의하여 수득될 수 있다.
본 발명의 “대사성 질환”은 만성적인 대사 장애로 인하여 내당능 장애, 당뇨, 지방간, 고혈압, 이상지질혈증, 비만, 심혈관계 죽상동맥 경화증 등의 여러 가지 질환이 한 개인에게서 1 또는 2 이상 나타나는 것을 의미하며, 일례로 내당능 장애, 당뇨, 동맥경화, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 지방간, 심혈관질환 및 비만 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 의해 IL-6 증가, GLP-1 발현 증가, 갈색지방의 활성 증가가 유도되어 상기 대사성 질환에 유리한 효과가 나타낼 수 있으며, 더 나아가 상기 대사성 질환이 예방, 개선 또는 치료될 수 있다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 B2UM07 단백질을 유효성분으로 포함하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 B2UM07 단백질은 LC/MS-MS를 통해 본 발명의 효능 분획 내 단백질 identification을 실시할 때, 기존 균주의 NCBI Database matching 을 통해 확인되었고 그 정보는 아래와 같다.
Gene: Amuc_1631
UniProtKB - B2UM07
Protein name - Carboxyl-terminal protease
Organism: Akkermansia muciniphila
상기 B2UM07 단백질은 아커만시아 뮤시니필라 균주에서 유래된 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 아커만시아 뮤시니필라 균주는 SNUG-61027 균주 (수탁번호 KCTC 13530BP)일 수 있다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 외에도 상기 서열의 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 본다. 변이체는 염기서열 또는 아미노산 서열은 변화되지만, 서열번호 2의 아미노산 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 단백질이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 B2UM07 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 B2UM07 단백질을 각각 코딩하는 지놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게, 상기 유전자는 서열번호 2의 단백질을 암호화하는 염기 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 2의 단백질을 암호화하는 염기 서열과 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 염기 서열을 포함할 수 있다.
발명의 다른 양상은 본 발명에 따른 B2UM07 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 "재조합"이라는 용어는 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내에 재도입된 것이다.
상기 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 벡터를 대장균으로 형질전환시키는 방법으로는 CaCl2 버퍼를 이용한 적격 세포(competemt cell) 사용, 전기천공법(electroporation), 열 충격법(hear shock) 등의 당업계에 통상적으로 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다. 상기 형질전환 대장균을 배양하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 대장균의 배양법을 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형, 또는 연고제, 에어로졸, 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액 등의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 인간에게 적용하는 구체예에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행(standard pharmaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 담체와 혼합되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 균주 함유 조성물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강 내 또는 혀 밑 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 0.1 내지 500 ㎎/kg, 바람직하게는 0.5 내지 300 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 아커만시아 뮤시니필라 균주 SNUG-61027(수탁번호 KCTC 13530BP) 또는 그의 배양액, 상등액, 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 개선 또는 완화용 건강기능성 식품을 제공한다.
상기 대사성 질환은 내당능 장애, 당뇨, 동맥경화, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 지방간, 심혈관질환 또는 비만일 수 있다.
본 발명에 의해 IL-6 증가, GLP-1 발현 증가, 갈색지방의 활성 증가가 유도되어 상기 대사성 질환에 유리한 효과를 나타낼 수 있으며, 더 나아가 상기 대사성 질환이 완화 또는 치료될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 B2UM07 단백질을 유효성분으로 포함하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 개선 또는 완화용 건강기능성 식품을 제공한다.
상기 대사성 질환은 내당능 장애, 당뇨, 동맥경화, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 지방간, 심혈관질환 또는 비만일 수 있다.
상기 B2UM07 단백질은 아커만시아 뮤시니필라 균주에서 유래된 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 아커만시아 뮤시니필라 균주는 SNUG-61027 균주 (수탁번호 KCTC 13530BP)일 수 있으며, 구체적인 내용은 상기 상술한 바와 같다.
상기 건강기능성 식품은 각종 음료, 발효유, 식품 첨가제 등일 수 있다.
상기 건강기능성 식품에 함유된 유효성분으로서의 아커만시아 뮤시니필라 균주의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 중 음료에는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 아커만시아 뮤시니필라 균주를 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) SNUG-61027 균주(수탁번호 KCTC 13530BP), 또는 그의 배양액, 상등액, 추출물 또는 분획물의 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화를 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 용도에 사용되는 상기 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) SNUG-61027 균주 (수탁번호 KCTC 13530BP)는 서열목록 1의 염기서열로 이루어진 16S rDNA를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 용도가 적용되는 상기 대사성 질환은 내당능 장애, 당뇨, 동맥경화, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 지방간, 심혈관질환 또는 비만일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 B2UM07 단백질의 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화를 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 용도에 사용되는 상기 B2UM07 단백질은 아커만시아 뮤시니필라 균주에서 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 용도에 사용되는 상기 아커만시아 뮤시니필라 균주는 SNUG-61027 균주 (수탁번호 KCTC 13530BP)일 수 있다.
본 발명은 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) SNUG-61027 균주(수탁번호 KCTC 13530BP), 또는 그의 배양액, 상등액, 추출물 또는 분획물을 처리하는 단계를 포함하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화 방법을 제공한다.
본 발명의 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화 방법에 사용되는 상기 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) SNUG-61027 균주 (수탁번호 KCTC 13530BP)는 서열목록 1의 염기서열로 이루어진 16S rDNA를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 방법이 적용되는 상기 대사성 질환은 내당능 장애, 당뇨, 동맥경화, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 지방간, 심혈관질환 또는 비만일 수 있다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 B2UM07 단백질을 처리하는 단계를 포함하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 사용되는 상기 B2UM07 단백질은 아커만시아 뮤시니필라 균주에서 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 상기 아커만시아 뮤시니필라 균주는 SNUG-61027 균주 (수탁번호 KCTC 13530BP)일 수 있다.
본 발명은 아커만시아 뮤시니필라의 항비만 효과 중 체중 감소 및 글루코스 항상성 조절 외에 갈색지방의 활성화 효과 및 식욕조절 호르몬 GLP-1 분비능을 확인하고 이러한 효능이 호스트의 특정 사이토카인, IL-6 에 의존적임을 확인하였다. 또한, 본 발명에서는 GLP-1 유도 능력이 현저히 증가된 신규 아커만시아 뮤시니필라 SNUG-61027 균주 (수탁번호 KCTC 13530BP)를 발굴하였고, 아커만시아 뮤시니필라 균주 배양액으로부터 분리된 B2UM07(P9) 단백질이 현저히 우수한 GLP-1 유도 능력, 체내 글루코스 항상성 유지 능력 및 체중 감소 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 상기 신규 아커만시아 뮤시니필라 균주 및 B2UM07 단백질은 식욕 억제 또는 대사성 질환의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 고지방식이 마우스 모델에 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila, Akk) 균주 투여 후 간과 갈색지방무게 개선 효과를 실험한 결과이다.
도 2는 qPCR를 이용하여 아커만시아 뮤시니필라 균주에 의한 UCP-1 발현 및 갈색지방 관련 마커 증가를 확인한 실험결과이다.
도 3은 qPCR을 이용하여 아커만시아 뮤시니필라 균주에 의한 소장 내 IL-6 사이토카인 증가 및 GLP-1 증가를 확인한 실험결과이다.
도 4는 아커만시아 뮤시니필라 균주에 의한 갈색지방 발현 및 발열반응이 IL-6 사이토카인에 의존적임을 확인한 실험결과이다.
도 5는 in vitro 상에서 아커만시아 뮤시니필라에 의한 GLP-1 발현은 박테리아 분비 물질에 의한 것임을 확인한 실험결과이다(ELISA).
도 6은 in vitro 상에서 아커만시아 뮤시니필라에 의한 GLP-1 발현은 단쇄지방산(SCFA)이 아닌 다른 요소에 의한 것임을 확인한 실험결과이다(GC-MS).
도 7A는 in vitro 상에서 아커만시아 뮤시니필라의 크기 분획에 의한 GLP-1 발현능을 확인한 실험결과이며, 도 7B는 GLP-1 유도 분획(100K, 300K)에 단백질 분해효소(proteinase K;PK)를 처리한 후, GLP-1 발현을 확인한 실험결과이다.
도 8은 음이온 교환 컬럼과 사이즈 컬럼을 이용한 GLP-1 유도 분획(100K)의 분획화 및 GLP-1 유도 분획 실험결과이다.
도 9는 LC/MS-MS를 이용한 아커만시아 뮤시니필라의 GLP-1 유도 분획(100K, m2-m4, G17-G20) 단백질 정성 분석 실험결과이다.
도 10은 순수 정제한 후보 단백질에 의한 GLP-1 유도능을 확인한 실험결과이다(SDS-PAGE gel).
도 11은 타겟 단백질의 복강 투여시 체내 글루코스 항상성 능력을 확인한 실험결과이다.
도 12는 타겟 단백질의 구강 투여시 체내 글루코스 항상성 능력을 확인한 실험결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 또는 실험예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 고지방식이 마우스 모델에 아커만시아 뮤시니필라( Akkermansia muciniphila , Akk) 균주 투여 후 간과 갈색지방무게 감소 효과 분석
아커만시아 뮤시니필라(ATCC BAA-835, Akk) 균주를 0.5% 뮤신(mucin) 첨가 brain heart infusion(BHI) 고체 배지에서 72 시간 혐기 배양한 후, 스탁을 확보하였다. 6주령 수컷 C57BL/6 마우스에 고지방식이(60% 지방) 사료 섭취와 동시에 균주를 4 x 108 CFU/200 ㎕/mouse 농도로 매일 경구 투여하였다(HF+Akk, n=8/그룹). 저지방 식이(10% 지방) 사료(LF)와 고지방 식이 사료(HF)만 섭취한 그룹을 대조군으로 사용하였다. 14 주 뒤, 대조군과 균주 투여 그룹을 비교하였다. 16 시간 절식 후, 지방 조직과 간 조직을 채취, 조직 무게를 측정하였다(도 1A).
그 결과, HF군 대비 HF+Akk 군의 서혜지방조직(inguinal white adipose tissue, igWAT) 및 부고환지방조직(epididymal white adipose tissue, EpiWAT) 무게는 유의적 변화가 없었으나, 갈색지방조직(interscapular brown adipose tissue, iBAT) 무게는 유의적으로 감소함을 확인하였다. 또한 갈색지방(iBAT) 및 간 조직 무게를 체중과 상관관계 분석을 하였을 시(도 1B), 갈색지방 및 간 조직 무게가 체중과 유의적으로 비례함을 확인함으로써, 갈색지방과 간 무게의 감소 현상은 아커만시아 뮤시니필라의 표적 조직일 가능성을 제시하였다.
또한 헤마톡실린 에오신 염색(H&E 염색)을 통해 갈색지방조직 및 간 조직의 지방 크기를 그룹별로 비교한 결과, 아커만시아 뮤시니필라 투여군에서 대조군에 비해 갈색지방조직 및 간 조직의 지방 크기가 현저히 감소한 것으로 관찰되었다(도 1C 및 D).
따라서, 실험 결과, 아커만시아 뮤시니필라가 갈색지방조직의 무게 및 지방 크기 감소 및 간 조직 무게 감소에 기여함을 확인하였다(도 1A~D).
실시예 2. 아커만시아 뮤시니필라 균주에 의한 UCP-1 발현 및 갈색지방 관련 마커 증가
갈색지방조직(iBAT)에서, 갈색지방 활성화 마커인 uncoupling protein(UCP-1)을 immuno-histochemistry(IHC) 염색을 하여 그룹별로 비교하였다(도 2A). 조직의 RNA를 추출, cDNA 합성 후, UCP-1 의 유전자 발현을 qPCR로 확인하였으며, 갈색지방 분화 관련 마커(CIDEA, PRDM16, PPARGC1α, Apelin) 또한 확인하였다(도 2B).
실험 결과, 아커만시아 뮤시니필라를 투여한 고지방 유도 마우스에서 갈색지방조직의 갈색지방 관련 마커가 비투여군보다 유의적으로 증가하였음을 확인하고, 갈색지방 활성에 관여하는 UCP-1 인자를 조직염색한 결과에서도 증가가 확인되어 아커만시아 뮤시니필라의 갈색지방 유도 기작을 확인하였다.
실시예 3. 아커만시아 뮤시니필라 균주에 의한 소장 및 대장 내 IL-6 사이토카인 증가 및 GLP-1 증가
소장(ileum) 조직과 대장(colon) 조직의 RNA를 추출, cDNA를 합성 후, 면역 사이토카인 마커(TNF-α, IL-1β, IL-18, IL-6, IL-10)의 발현 정도를 그룹 별로 비교하였다(도 3A,B).
마우스 장 세포주(CT26 cell)에 락토바실러스 3종(KCTC2180, KCTC3112, KCTC1048)과 비피도박테리움 3종(KCTC3127, KCTC3128, KCTC3352) 또는 아커만시아 뮤시니필라(Akk)를 처리 시 IL-6 사이토카인의 발현능을 비교하였다. E.coli 으로부터의 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS)를 양성대조군으로 사용하였다(도 3C).
소장 조직에서 장 분비 식욕조절 호르몬, 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1)의 발현을 유도하는 관련 유전자(gcg, pcsk1, pcsk2) 를 qPCR 로 확인하였다(도 3D).
실험 결과, 아커만시아 뮤시니필라 투여에 의해 마우스 소장 및 대장 세포 내 IL-6 사이토카인이 유의적으로 증가되었으며, 혈청 내 식욕조절 호르몬, 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1)의 발현이 유의적으로 증가하였음을 확인하였다(도 3A~3D). 특히, 마우스 장세포주에서 아커만시아 뮤시니필라는 다른 락토바실러스 및 비피도박테리움 균주들에 비해 현저히 증가된 IL-6 수준을 나타내었다.
실시예 4. 아커만시아 뮤시니필라 균주에 의한 갈색지방 발현 및 발열반응이 IL-6 사이토카인에 의존적인지 여부
아커만시아 뮤시니필라의 갈색지방 활성화 효능이 IL-6 사이토카인 의존적인지 여부를 확인하였다.
이를 위해, 6주령 수컷 C57BL/6 Wild type(WT) 마우스와 IL-6 유전자 결핍 마우스(IL-6KO) 마우스에 각각 고지방식이(60% high fat; HF) 사료 섭취와 동시에 균주를 4 x 108 CFU/200 ㎕/mouse 농도로 매일 경구 투여하였다(IL-6KO 군은 n=6, 그 이외 군은 n=8/그룹). 저지방 식이(10% low fat; LF) 사료와 고지방 식이 사료만 섭취한 그룹을 대조군으로 사용하였다. 14 주 뒤, WT 마우스와 IL-6KO 마우스에서 고지방식이만 한 그룹과 균주 투여 그룹을 비교하였다.
16 시간 절식 후, 갈색지방조직을 분리하여 RNA를 추출, cDNA를 합성한 뒤, UCP-1 발현을 qPCR로 확인하였다(도 4A). 디지털 온도계(TESTO925)를 사용하여 직장 온도를 측정하였다(도 4B). 갈색지방의 피부 온도를 열화상카메라(FLIR)를 이용하여 측정하였다(도 4C 및 D).
혈청 내 GLP-1 농도를 측정하기 위해 5시간 동안 아침에 공복을 유도한 뒤, 2g/kg 농도로 글루코스를 구강투여 하였다. 10분 뒤, 안와채혈을 통해 plasma를 채혈하여 GLP-1 의 반감기를 억제하는 1 ㎍/㎖ diprotin A(6019; Tocris)가 첨가된 차갑게 유지된 튜브에 담았다. 원심분리(4,000 X g, 10 min) 후 상층액을 -80℃ 에 동결하였다. 이 후 마우스 GLP-1 ELISA kit를 통해 GLP-1 발현을 측정하였다(도 4E).
소장(ileum) 조직과 대장(colon）조직 내 GLP-1 발현을 유도하는 관련 유전자(gcg, pcsk1, pcsk2) 를 WT 마우스와 IL-6KO 마우스에서 qPCR 로 확인하였다(도 4F~H).
실험 결과, 아커만시아 뮤시니필라 투여에 의해 발현이 증가되는 갈색지방 관련 유전자 UCP-1은 IL-6 유전자 결핍 마우스에서 발현이 증가되지 않았다(도 4A). 또한 갈색지방 부위의 피부 표면 온도를 적외선 카메라도 측정 또는 항문 체온계로 측정시에도 IL-6KO 마우스에서는 갈색지방 활성화에 의한 열 발생이 나타나지 않음을 확인하였다(도 4B~4D). 또한, WT 마우스와 달리, IL-6KO 마우스에서는 혈청 내 GLP-1 농도가 오히려 감소하였으며 GLP-1의 발현을 유도하는 유전자(gcg, pcsk1, pcsk2) 수준에도 변화가 없어서, 소장 내 식욕조절 호르몬 GLP-1의 증가 또한 IL-6에 의존적임을 확인하였다(도 4E~H).
실시예 5. 아커만시아 뮤시니필라에 의한 GLP-1 발현은 박테리아 분비 물질에 의한 것임을 확인( in vitro )
Akk 균주(아커만시아 뮤시니필라 ATCC BAA-835) 또는 아커만시아 뮤시니필라 SNUG-61027 균주를 0.5% 뮤신(mucin) 배지에 배양 후, 액체배양을 위해 0.1% 또는 5% Fetal bovine serum(FBS) 첨가 BHI 배지에 36시간 동안 배양하였다.
GLP-1을 분비하는 NCI-H716(ATCC CCL-251) 세포주를 콜라겐이 코팅된 96-well 플레이트에 2 x 105 cells/㎖ 농도로 seeding 후, 세포 간 글루코스에 대한 세포 대사 동기화(synchronization)을 하기 위해 0.2% 소혈청 알부민(BSA) 첨가된 HBSS(Hanks Buffered Saline Solution) 으로 2 시간 동안 배양하였다. 이 후, Akk 균주(ATCC BAA-835) 또는 아커만시아 뮤시니필라 SNUG-61027의 균 펠렛(균주 대 세포 비율: 1:20) 또는 배양상층액(cell free supernatant; CFS)를 10% v/v 농도로 처리하였다. 2시간 후 상층액을 획득하여 상층액 내 GLP-1 발현 정도를 ELISA kit를 통해 측정하였다(도 5A). GLP-1 발현 효능을 농도별로 확인하기 위해 위와 같은 방법으로 SNUG-61027 균주의 배양상층액을 10~100% v/v 농도로 또는 대조군(con)으로 비피도박테리움 비피덤(KBL483; 한국인 분변 유래 분리 균주)를 10~100% v/v 농도로 처리 후 2 시간 뒤 상층액을 획득하여 상층액 내 GLP-1 발현을 확인하였다(도 5B).
실험 결과, 아커만시아 뮤시니필라의 생균과 상층액을 GLP-1 유도 세포주(L세포)에 처리하였을 때, 생균 처리시에는 GLP-1이 측정되지 않은 반면에, 상층액처리 시에는 GLP-1이 높게 발현됨을 확인하였고, 그 발현 수준은 ATCC BAA-835보다 SNUG-61027 균주에서 유의적으로 현저한 증가를 나타내었다(도 5A). 또한, SNUG-61027 균주의 배양 상층액 처리시 GLP-1의 발현 수준은 농도 의존적으로 증가되었다(도 5B).
실시예 6. 아커만시아 뮤시니필라에 의한 GLP-1 발현은 단쇄지방산이 아닌 다른 요소에 의한 것임을 확인( in vitro )
아커만시아 뮤시니필라 분비 단쇄지방산(short chain fatty acid, SCFA) 분석을 위해 GC-MS를 이용하여 대표적인 단쇄 지방산, 아세테이트(acetate), 프로피오네이트(propionate), 부티레이트(butyrate)의 발현을 확인하였다(도 6A). 아세테이트와 프로피오네이트(1 mM, 10 mM) 와 균주 배양상층액(100% v/v) 을 처리 후 2시간 뒤, GLP-1 발현 정도를 확인하였다(도 6B).
실험 결과, 아커만시아 뮤시니필라는 아세테이트와 프로피오네이트를 분비함을 확인하였다(도 6A). 하지만, 아세테이트와 프로피오네이트에 의해 유도되는 GLP-1 은 아커만시아 뮤시니필라의 배양상층액에 의해 발현되는 GLP-1 보다 현저하게 적었다(도 6B). 따라서, 아커만시아 뮤시니필라에 의해 유도되는 GLP-1은 아세테이트와 프로피오네이트 이외의 요소가 관여함을 알 수 있었다.
실시예 7. 사이즈 필터, 음이온 교환 컬럼과 사이즈 컬럼을 이용한 GLP-1 유도 분획(100K)의 분획화 및 GLP-1 유도 분획 확인
배양액 내 활성물질을 분리하기 위해 크기별 필터를 이용하여 각 분획을 확보하였다. 이 후, 이를 농축 한 뒤, GLP-1 유도능을 확인하였을 때 100kDa~300kDa 사이의 분획에서 높은 수준의 GLP-1이 발현됨을 확인하였다. 또한 효능 분획(100K~300K, 30K~100K) 내 단백질을 제거하기 위해, 단백질 분해 효소(proteinase K; PK)를 100 ㎍/㎖ 농도로 55℃ 1 시간 동안 처리 후, 90℃에서 10 분 간 비활성화 후 GLP-1 발현을 측정하였다. 그 결과, 단백질이 제거된 분획에서는 GLP-1 발현이 유도되지 않음을 확인하였고, 이를 통해 분획 내 단백질에 의해 GLP-1 이 유도됨을 확인하였다. 아커만시아 뮤시니필라 상층액의 100kDa~300kDa(100K)를 다시 분획화하기 위해 MonoQ 음이온 교환 컬럼(MomoQ 5/50, GE Healthcare)및 AKTAexplorer system(GE Healthcare)을 이용하여 FPLC(fast protein liquid chromatography)를 진행하였다. 80 ㎍/㎖ 의 100K 분획이 주입되었으며, 1 ㎖/min 의 속도로 샘플을 분획화 하였다. 이 후 각 분획을 L세포에 처리한 뒤, GLP-1 발현 정도를 측정하였다. 실험 결과 m2-m4 분획에서 높은 함량의 GLP-1이 발현됨을 확인하였다(도 8A).
이 후, m2-m4 분획을 30K 필터로 농축한 뒤 농축된 샘플을 다시 GPC 사이즈 컬럼(GPC/SEC)을 이용하여 FPLC를 진행하였다. 분획에는 hiload 16/600 Superdex pg(GE Healthcare) AKTAexplorer system을 사용하여 3 ㎖/min 의 속도로 샘플을 분획화 하였다. 같은 방법으로 각 분획을 L세포에 처리, GLP-1 발현능을 확인하였다. 실험 결과, G17-G20분획에서 GLP-1이 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다(도 8B).
실시예 8. LC/MS-MS를 이용한 아커만시아 뮤시니필라의 GLP-1 유도 분획(100K, m2-m4, G17-G20) 단백질 정성 분석
아커만시아 뮤시니필라 상층액으로부터 확보된, Sample 1) 100K concentrate, Sample 2) MonoQ concentrate, Sample 3) GPC concentrate을 LC/MS-MS를 통해 정성 분석하였다. 상층액의 기본 배지에서 발견될 수 있는 bovine 관련 단백질은 제외하였으며, 각 분획에서 확인되는 단백질 개수를 확인하였다.
이를 위해, 크기 필터를 통해 확보한 각 샘플에 대한 정성분석을 하고, 마지막으로 농축되었을 것으로 사료되는 GPC concentrate 내 발현하는 단백질 또는 펩타이드 10종을 intensity 별로 나열하였으며, 다른 분획 내 발현 정도와 비교하였다. LC-MS/MS(Nanoflow Easy-nLC 100/Q Exactive mass spectrometer) 분석 기기를 사용하였다. Maxquant 소프트웨어 1.5를 이용하여 processing 되었으며, Universal Protein Resource(Uniprot) protein database를 이용하여 annotation을 함으로써 단백질을 정성 분석하였다. 총 단백질과 펩타이드는 false discovery rate <1% 미만인 것만 선정하였다.
실험 결과, 후보 단백질이 가장 농축되었을 것으로 사료되는 Sample 3) G17-G20 분획에서 10개의 단백질을 확인하였다(도 9A,B).
실시예 9. 순수 정제한 후보 단백질에 의한 GLP-1 유도능 확인
아커만시아 뮤시니필라 농축분획으로부터 유래된 단백질 10종을 클로닝 후 E.coli BL21 세포에서 발현하여 단백질을 순수 분리하였다. 단백질 10종 중 1종(Beta-galactosidase)은 클로닝으로 유효한 발현 벡터를 얻지 못해 아래 단계에서 제외하였다. 이후 발현 후 분리한 단백질 9종을 SDS-PAGE를 통해 순수 분리되었음을 확인하였다. Amuc1100은 아커만시아 뮤시니필라 유래 항비만 기능이 알려진 단백질로써(Plovier H. et al., A purified membrane protein from Akkermansia muciniphila or the pasteurized bacterium improves metabolism in obese and diabetic mice. Nat Med. (2017) 23:107-113) 양성대조군으로 사용되었다. 분리된 각 단백질을 L세포에 처리하여 GLP-1 발현을 확인하였다.
이를 위해, 합성된 타겟 단백질을 IPTG 유도 프로모터가 있는 pET-21b 플라스미드(Novagen) 에 삽입 후, his-tag를 통해 순수 정제하였다. 이를 SDS-PAGE gel을 통해 확인하였다. 합성된 플라스미드를 BL21 Escherichia coli 균주에 transformation 하고 배양시킴으로써 단백질을 대량 생산, 분리하였으며, 단백질 농도를 측정 후, NCI-H716 세포주에 처리하였다.
실험 결과, 흥미롭게도 B2UKW8(P1), B2URM2(P5), B2UM07(P9) 단백질에 의해 GLP-1의 발현이 유도됨을 확인하였으며 특히 B2UM07 단백질의 경우 10㎍/㎖ 및 100㎍/㎖ 모두에서 Amuc1100 단백질보다 현저히 높은 수준으로 GLP-1을 유도함을 확인하였다(도 10C).
실시예 10. 타겟 단백질의 체내 글루코스 항상성 능력 확인(정상식이, 복강 투여)
발굴된 타겟 단백질에 의해 체내 글루코스 항상성 능력이 향상되는지 확인하기 위해, P1(B2UKW8), P5(B2UKW8), P9(B2UM07) 단백질을 정상식이 마우스에 복강으로 100 ㎍/mouse 농도로 일주일 동안 투여 후, 내당성 테스트를 진행하였다.
이를 위해, 효능 단백질 3종(P1, P5, P9)을 정상식이 마우스에 100 ㎍/200 ㎕ 농도로 매일 복부 투여 후, 7일 뒤, 투여하지 않은 그룹과 체중을 비교하고(n=8/그룹, 도 11C), 투여 14일 후, 글루코스를 2g/kg 농도로 구강 투여 후, 15분 ~ 120분 동안 혈당을 측정하여 시간별 내당성 테스트를 진행하였다(도 11A 및 11B).
실험 결과, 결과, P9(B2UM07) 투여 그룹이 다른 그룹에 비해 유의적으로 혈당이 낮게 유지됨을 확인하였다. 이는 기존에 내당능이 있다고 알려진 아커만시아 뮤시니필라 유래 Amuc1100 단백질 보다 효과적으로 나타났다. P1(B2UKW8) 과 P5(B2UKW8)는 내당능 경향성만 확인되었으나, P9 그룹의 경우 체중 감소도 유의적으로 확인되었다(도 11C).
실시예 11. 타겟 단백질의 체내 글루코스 항상성 능력 확인(고지방식이, 구강 투여)
발굴된 타겟 단백질에 의해 체내 글루코스 항상성 능력이 향상되는지 확인하기 위해, P9(B2UM07) 단백질을 고지방 식이 마우스에 구강으로 100 ㎍/mouse 농도로 8주 동안 투여 후, 내당성 테스트를 진행하였다. 글루코스를 구강 투여(2g/kg) 후 15분 ~ 120분 동안 혈당을 측정하였다.
실험 결과, P9(B2UM07) 투여 그룹은 고지방 식이 마우스 그룹에 비해 유의적인 체중 증가 억제 효과를 나타내었으며, 그 효과는 Amuc1100 투여 그룹보다 크게 나타났다(도 12A). 또한, 글루코스 투여 30분 후, 고지방 식이 마우스 그룹에 비해 유의적으로 글루코스 항상성 능력이 조절됨을 확인하였다(도 12B 및 12C).
Figure PCTKR2019013402-appb-I000001

Claims (28)

  1. 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) SNUG-61027 균주 (수탁번호 KCTC 13530BP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 서열목록 1의 염기서열로 이루어진 16S rDNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 아커만시아 뮤시니필라 SNUG-61027 균주 (수탁번호 KCTC 13530BP).
  3. 제1항의 아커만시아 뮤시니필라 SNUG-61027 균주, 또는 그의 배양액, 상등액, 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 대사성 질환은 내당능 장애, 당뇨, 동맥경화, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 지방간, 심혈관질환 또는 비만인 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 아커만시아 뮤시니필라 SNUG-61027 균주, 또는 그의 배양액, 상등액, 추출물 또는 분획물은 IL-6 증가, GLP-1 발현 증가, 및 갈색지방의 활성 증가 중 어느 하나 이상을 유도하는 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 B2UM07 단백질을 유효성분으로 포함하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 B2UM07 단백질은 아커만시아 뮤시니필라 균주에서 유래된 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 아커만시아 뮤시니필라 균주는 SNUG-61027 균주 (수탁번호 KCTC 13530BP)인 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제6항에 있어서 상기 대사성 질환은 내당능 장애, 당뇨, 동맥경화, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 지방간, 심혈관질환 또는 비만인 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항의 아커만시아 뮤시니필라 SNUG-61027 균주, 또는 그의 배양액, 상등액, 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 개선 또는 완화용 건강기능성 식품.
  11. 제10항에 있어서, 상기 대사성 질환은 내당능 장애, 당뇨, 동맥경화, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 지방간, 심혈관질환 또는 비만인 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 개선 또는 완화용 건강기능성 식품.
  12. 제10항에 있어서, 상기 아커만시아 뮤시니필라 SNUG-61027 균주, 또는 그의 배양액, 상등액, 추출물 또는 분획물은 IL-6 증가, GLP-1 발현 증가, 및 갈색지방의 활성 증가 중 어느 하나 이상을 유도하는 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 개선 또는 완화용 건강기능성 식품.
  13. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 B2UM07 단백질을 유효성분으로 포함하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 개선 또는 완화용 건강기능성 식품.
  14. 제13항에 있어서, 상기 B2UM07 단백질은 아커만시아 뮤시니필라 균주에서 유래된 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 개선 또는 완화용 건강기능성 식품.
  15. 제14항에 있어서, 상기 아커만시아 뮤시니필라 균주는 SNUG-61027 균주 (수탁번호 KCTC 13530BP)인 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 개선 또는 완화용 건강기능성 식품.
  16. 제13항에 있어서 상기 대사성 질환은 내당능 장애, 당뇨, 동맥경화, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 지방간, 심혈관질환 또는 비만인 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 개선 또는 완화용 건강기능성 식품.
  17. 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) SNUG-61027 균주(수탁번호 KCTC 13530BP), 또는 그의 배양액, 상등액, 추출물 또는 분획물의 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화를 위한 용도.
  18. 제17항에 있어서, 상기 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) SNUG-61027 균주 (수탁번호 KCTC 13530BP)는 서열목록 1의 염기서열로 이루어진 16S rDNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화를 위한 용도.
  19. 제17항에 있어서, 상기 대사성 질환은 내당능 장애, 당뇨, 동맥경화, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 지방간, 심혈관질환 또는 비만인 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화를 위한 용도.
  20. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 B2UM07 단백질의 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화를 위한 용도.
  21. 제20항에 있어서, 상기 B2UM07 단백질은 아커만시아 뮤시니필라 균주에서 유래된 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화를 위한 용도.
  22. 제21항에 있어서, 상기 아커만시아 뮤시니필라 균주는 SNUG-61027 균주 (수탁번호 KCTC 13530BP)인 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화를 위한 용도.
  23. 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) SNUG-61027 균주(수탁번호 KCTC 13530BP), 또는 그의 배양액, 상등액, 추출물 또는 분획물을 처리하는 단계를 포함하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) SNUG-61027 균주 (수탁번호 KCTC 13530BP)는 서열목록 1의 염기서열로 이루어진 16S rDNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 대사성 질환은 내당능 장애, 당뇨, 동맥경화, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 지방간, 심혈관질환 또는 비만인 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화 방법.
  26. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 B2UM07 단백질을 처리하는 단계를 포함하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 B2UM07 단백질은 아커만시아 뮤시니필라 균주에서 유래된 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 아커만시아 뮤시니필라 균주는 SNUG-61027 균주 (수탁번호 KCTC 13530BP)인 것을 특징으로 하는 식욕 억제 또는 대사성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화 방법.
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