WO2023096232A1 - 신규 펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

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WO2023096232A1
WO2023096232A1 PCT/KR2022/017769 KR2022017769W WO2023096232A1 WO 2023096232 A1 WO2023096232 A1 WO 2023096232A1 KR 2022017769 W KR2022017769 W KR 2022017769W WO 2023096232 A1 WO2023096232 A1 WO 2023096232A1
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WO
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peptide
cells
muscle
differentiation
proliferation
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PCT/KR2022/017769
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최인호
이은주
박소영
베이그모하메드하산
아마드쿠르시드
샤이크시브하툴라
아마드세이야드사이드
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(주)네오크레마
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to novel peptides and uses thereof, and more specifically, provides novel peptides and uses thereof that promote proliferation of myoblasts and differentiation into muscle cells or inhibit proliferation of preadipocytes and differentiation into adipocytes.
  • Muscle is an important element constituting the human body, a tissue expressed in the stem cells of the mesoderm. Muscles are responsible for about 40% of our body, are located supported by bones and tendons, and are composed of muscle fiber bundles that move each other and change the size of cells to cause contraction. Muscles are divided into skeletal muscles, cardiac muscles, and visceral muscles, which generate force and induce movement in each position, and also play a role in protecting body organs such as bones, joints, and internal organs. In addition, the muscle has a regenerative ability, and when the muscle is damaged, it can be regenerated as a muscle having an original contraction and relaxation ability after being denatured by satellite cells and its surrounding environment.
  • Muscular diseases are caused by innate genetic or environmental causes, and diseases related to muscle loss are increasing in accordance with the recent trend of aging society and life extension. A person's muscles decrease by 1% or more every year from the age of 40, and by the age of 80, 50% of the maximum muscle mass decreases, so muscle loss in old age is recognized as the most important cause of deteriorating overall physical function. These muscle diseases are on the rise worldwide compared to the past.
  • muscle diseases have more diverse causes than other diseases, it is not easy to accurately diagnose them, and the symptoms and severity of the disease vary depending on the type, and in many cases, the exact mechanism has not been identified in the form of a rare disease.
  • the symptoms of muscle disease rapidly progress, and as the disease progresses, patients suffering from muscle disease suffer so much that it is difficult to live a daily life alone, but there are few treatments for fundamentally related diseases.
  • obesity can be defined as a kind of disease that poses a threat to an individual's health due to abnormally excessive accumulation of fat in the body.
  • Obesity is divided into simple obesity, which is mainly caused by overeating and lack of exercise, and symptomatic obesity, which is caused by endocrine diseases.
  • causes of simple obesity include wrong eating habits such as overeating, binge eating, snacking, late-night snacking, irregular eating, lack of exercise, and side effects of medications.
  • Overweight and obesity can cause or exacerbate various chronic comorbidities such as heart disease, diabetes, arthritis, fatty liver, hyperlipidemia, and cancer by increasing blood pressure and cholesterol levels.
  • overweight and obesity are known as major factors that increase the incidence of arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, or heart disease not only in adults but also in children and adolescents. Therefore, there is an increasing need to recognize obesity as a disease and actively treat it.
  • An object of the present invention is to provide a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating or preventing muscle disorders comprising the peptide as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity diseases comprising the peptide as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a health functional food composition for improving or preventing muscle disorders comprising the peptide as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a health functional food composition for preventing or improving obesity diseases comprising the peptide as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a reagent composition having myoblast proliferation or muscle cell differentiation promoting activity comprising the peptide as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a reagent composition containing the above peptide as an active ingredient and having activity for inhibiting proliferation of preadipocytes or differentiation of adipocytes.
  • Another object of the present invention is to provide a medium additive composition for culturing myoblasts containing the peptide as an active ingredient.
  • the present invention provides a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing muscle disorders comprising the peptide as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity diseases comprising the peptide as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food composition for improving or preventing muscle disorders comprising the peptide as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving obesity diseases comprising the peptide as an active ingredient.
  • the present invention provides a reagent composition having myoblast proliferation or muscle cell differentiation promoting activity comprising the above peptide as an active ingredient.
  • the present invention provides a reagent composition containing the peptide as an active ingredient and having an inhibitory activity on preadipocyte proliferation or adipocyte differentiation.
  • the present invention provides a medium additive composition for culturing myoblasts containing the peptide as an active ingredient.
  • the present invention is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; And it relates to a pharmaceutical composition and a reagent composition containing the peptide as an active ingredient, and it was confirmed that the proliferation and differentiation of myoblasts and the regeneration of muscle increased after treatment with the peptide, and the proliferation and differentiation of fat of preadipocytes decreased. Bar, 1) promoting the proliferation of myoblasts, 2) promoting the differentiation of myoblasts, 3) regenerating damaged muscles, 3) inhibiting the proliferation of pre-adipocytes, 4) inhibiting the differentiation of pre-adipocytes into adipocytes, etc. can be used as a material for
  • Figure 1 shows the results of myostatin (hereinafter referred to as MSTN) and the extracellular domain of ACVRIIB (activin IIb receptor) according to the presence or absence of a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as MIF1). represents an interaction.
  • MSTN myostatin
  • ACVRIIB activin IIb receptor
  • Figure 2 shows the binding amino acids of MSTN and ACVRIIB proteins according to the presence or absence of MIF1.
  • Figure 3 shows the proliferation and differentiation of myoblasts according to MSTN protein treatment.
  • Figure 4 shows the proliferation of myoblasts according to various modified MIF1 treatments.
  • FIG 5 shows the proliferation and differentiation of myoblasts according to MIF1 treatment.
  • Figure 6 shows the expression of Atrogin1, MuRF1 and ACVRIIB according to MIF1 treatment during muscle differentiation.
  • Figure 7 shows the proliferation and differentiation of myoblasts according to Ac -MIF1 treatment.
  • Figure 8 shows the expression of Atrogin1, MuRF1 and ACVRIIB according to Ac -MIF1 treatment during muscle differentiation.
  • Figure 9 shows Ac -MIF1 peptide and MSTN protein processing during myogenic differentiation.
  • Figure 10 shows the muscle regeneration effect according to Ac -MIF1 peptide treatment.
  • FIG. 11 shows the expression of fibromodulin (hereinafter referred to as FMOD) and myostatin (hereinafter referred to as MSTN) according to differentiation of adipose tissue and 3T3L1 cells.
  • FMOD fibromodulin
  • MSTN myostatin
  • Figure 12 shows adipose differentiation according to inhibition of FMOD and MSTN expression; and related gene expression in adipose tissue following MSTN knock-out.
  • Figure 13 shows the effect of Ac -MIF1 peptide treatment on 3T3L1 cell proliferation and differentiation.
  • the present invention provides a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the C-terminus of the peptide may be amidated or the N-terminus may be acetylated.
  • the peptide may have myoblast proliferation or muscle cell differentiation promoting activity, preferably by inhibiting myostatin (MSTN) protein to promote myoblast proliferation or muscle cell differentiation promoting activity and inhibiting the proliferation of preadipocytes or into adipocytes. differentiation can be inhibited.
  • MSTN myostatin
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing muscle disorders comprising the peptide as an active ingredient.
  • the muscle disorder may be at least one selected from muscular atrophy, muscle disease, muscle damage, muscular dystrophy, sarcopenia, neuromuscular conduction disease, or nerve damage, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity diseases comprising the peptide as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in one or more formulations selected from the group consisting of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, eye drops, and injection solutions.
  • the pharmaceutical composition is a suitable carrier, excipient, disintegrant, sweetener, coating agent, swelling agent, lubricant, lubricant, flavoring agent, antioxidant, buffer, bacteriostatic agent, One or more additives selected from the group consisting of diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be further included.
  • carriers, excipients and diluents are lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil may be used, and solid dosage forms for oral administration include tablets, pills, powders, granules, and capsules.
  • solid preparations may be prepared by mixing at least one or more excipients, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc., with the composition.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral use, emulsions, syrups, and the like, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, and preservatives may be included in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, suppositories, and the like.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspensions.
  • As the base material of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogeratin and the like may be used.
  • the pharmaceutical composition is intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrasternal, transdermal, intranasal, inhalational, topical, rectal, oral, intraocular or It can be administered to a subject in a conventional manner via the intradermal route.
  • the dosage of the active ingredient according to the present invention may vary depending on the condition and weight of the subject, the type and severity of the disease, the drug type, the route and duration of administration, and may be appropriately selected by a person skilled in the art, and the daily dosage is 0.01 mg. /kg to 200 mg/kg, preferably 0.1 mg/kg to 200 mg/kg, and more preferably 0.1 mg/kg to 100 mg/kg. Administration may be administered once a day or divided into several times, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • the present invention provides a health functional food composition for improving or preventing muscle disorders comprising the peptide as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving obesity diseases comprising the peptide as an active ingredient.
  • the health functional food includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and enhancers (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, It may contain organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like.
  • the health functional food composition is any one form of meat, sausage, bread, chocolate, candy, snack, confectionery, pizza, ramen, gum, ice cream, soup, beverage, tea, functional water, drink, alcohol and vitamin complex can be
  • the health functional food may additionally contain food additives, and the suitability as a "food additive" is determined according to the general rules of the Food Additive Code and general test methods approved by the Korea Food and Drug Administration unless otherwise specified. It is judged according to the relevant standards and standards.
  • Food Additives Codex examples include, for example, chemical synthetic products such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid, natural additives such as dark pigment, licorice extract, crystalline cellulose, goreng pigment, guar gum, L -Mixed preparations such as sodium glutamate preparations, noodle-added alkali preparations, preservative preparations, tar color preparations, and the like.
  • chemical synthetic products such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid
  • natural additives such as dark pigment, licorice extract, crystalline cellulose, goreng pigment, guar gum
  • L -Mixed preparations such as sodium glutamate preparations, noodle-added alkali preparations, preservative preparations, tar color preparations, and the like.
  • the content of the active ingredient added to the food in the process of manufacturing the health functional food may be appropriately increased or decreased as necessary, and preferably may be added so that 1 part by weight to 90 parts by weight is included in 100 parts by weight of the food. .
  • the present invention provides a reagent composition having myoblast proliferation or muscle cell differentiation promoting activity comprising the above peptide as an active ingredient.
  • the present invention provides a reagent composition containing the peptide as an active ingredient and having an inhibitory activity on preadipocyte proliferation or adipocyte differentiation.
  • the present invention provides a medium additive composition for culturing myoblasts containing the peptide as an active ingredient.
  • MIF1, Ac -MIF1, MIF1- NH2 and Ac -MIF1- NH2 were synthesized by Peptron, diluted with DMSO (dimethyl sulfoxide) and stored at -20 °C.
  • C2C12 cells a mouse myoblast cell line, were cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) + 10% FBS (Fetal bovine serum) + 1% Penicillin / Streptomycin (P/S).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FBS Fetal bovine serum
  • P/S Penicillin / Streptomycin
  • C2C12 cells (2x10 3 cells/ml) were placed in a 12-well cell culture dish and allowed to attach for 24 hours, then treated with MIF peptide (1000 nM) for 1 day, and cell proliferation was monitored. It was confirmed by the MTT method. The medium was changed once every 2 days and the cells were cultured at 37 °C.
  • mice C57BL/6 male mice were purchased from Daehan Biolink and maintained four per cage in a temperature-controlled room with a 12-h light cycle. Animals were fed standard rodent chow containing 4.0% (wt/wt) total fat (Rodent NIH-31 Open Formula Auto; Zeigler Bros., Inc., Gardners, PA, USA) and water. All experiments involving animals complied with the guidelines (YUMC-AEC2015-006) published by the Animal Care Committee of the Animal Research Institute of Yeungnam University. MSTN knockout mice were provided by the laboratory of Seoul National University. Normal, MSTN+/- (heterozygous) and MSTN-/- (homozygous) adipose tissues were harvested from 6-week-old mice, fixed, and stored at -80°C until needed for analysis.
  • Mouse fibroblast 3T3L1 cells were cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) + 10% FBS (Fetal bovine serum) + 1% Penicillin / Streptomycin (P/S).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FBS Fetal bovine serum
  • P/S Penicillin / Streptomycin
  • 3T3L1 cells (2x10 3 cells/ml) were placed in a 12-well cell culture dish, allowed to attach for 24 hours, treated with MIF peptide (1000 nM) for 2 days, and cell proliferation was monitored. It was confirmed by the MTT method. The medium was changed once every 2 days and the cells were cultured at 37 °C.
  • the structures of MSTN (pdb id: 3HH2) and ACVRIIB (pdb id: 1S4Y) were retrieved from the RCSB Protein Databank. All water molecules and heteroatoms were removed from both structures.
  • the structure of FMOD was modeled using a combination of initial folding and threading methods using I-TASSER (Yang Zhang Lab, University of Michigan, Ann Arbor, MI, http://zhanglab.ccmb.med.umich).
  • the low percentage of sequence identity in the protein data bank structures of homologs may not result in a robust model for FMOD, leading to Critical Assessment of Structure Prediction (CASP)-7, a world-class experiment designed to provide an objective assessment of state-of-the-art structures.
  • the cell surface was scratched, treated with 1000 nM MIF1 or Ac -MIF1 peptide, cultured for 1 day, and the degree of cell recovery was observed.
  • DMEM + 2% FBS + 1% P/S differentiation medium
  • the medium of the cells was removed and the cells were washed with PBS. After washing, a 1:1 volume ratio of methanol:PBS reagent was treated and fixed for 2 minutes. Additionally, a 2:1 volume ratio of methanol:PBS reagent was added and further fixed for 2 minutes. After 2 minutes, 0.04% Giemsa reagent was added, left for 30 minutes, washed with PBS after 30 minutes, observed under a microscope, and took 3 pictures of the cells (300x). In the photograph taken, the number of fused nuclei in myotube cells was counted, and the number of nuclei of the total cells was counted, and then the number of fused nuclei was divided by the number of nuclei of the total cells to calculate the % value.
  • RNA pellets After adding 1 ml of TRIzolTM reagent, the cells were disrupted using a sonicator. After the pulverized sample was centrifuged (12,000 rpm, 10 minutes, 4°C), the supernatant was transferred to a new tube, 200 ⁇ l of chloroform was added, and left at room temperature for 10 minutes. After 10 minutes, it was centrifuged (12,000 rpm, 10 minutes, 4 °C) to obtain a transparent supernatant. Next, 500 ⁇ l of isopropanol was added, left for 10 minutes, and centrifuged to obtain RNA pellets.
  • RNA pellet was washed with 70% ethanol (ethanol + diethylpyrocarbonate (hereinafter referred to as DEPC)-treated distilled water), then completely removed and dried.
  • DEPC-treated distilled water was added to the dried transparent RNA and stored at -80 °C.
  • the amount of total RNA was measured with a Nanodrop, and 18s and 28s bands were confirmed on a 1.2% agarose gel.
  • cDNA was synthesized with 2 ⁇ g of total RNA, random hexamer primers and reverse transcriptase (25 °C: 10 min, 37 °C: 120 min, 85 °C: 5 min).
  • RT-PCR Real-time PCR
  • gene expression was analyzed using Power SYBR Green PCR Master Mix containing SYBR green fluorescent material (7500 Real-time PCR system).
  • PCR primers were designed with Primer 3 software (http://frodo.wi.mit.edu) according to the nucleotide sequence obtained from NCBI GenBank.
  • PCR was carried out 40 times for 10 minutes at 95 ° C, 33 seconds at 95 ° C, 33 seconds and 72 ° C for 33 seconds according to the gene primer temperature (tm).
  • Gene expression values were analyzed through analysis of c(t) values obtained through real-time PCR analysis (fold change 2- ⁇ Ct formula).
  • the gene expression value of the treated cells was calculated by setting the gene expression value of the untreated cells to 1.
  • normalization was performed using the GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) gene.
  • the sequences of the PCR primers are shown in Table 2.
  • the medium of the cultured C2C12 cells was removed and washed once with PBS. After fixing the cells for 15 minutes by treating the washed cells with 4% formaldehyde (Formaldehyde, Sigma), washing the cells with PBS and adding 0.2% trypton X-100 (Sigma) for 5 minutes left unattended Wash with PBS again, add 1% normal goat serum, leave for 30 minutes, add primary antibody (MYOD, myogenin (MYOG): Myosin light chain (MYL2); 1:50) Reacted at 4 °C for 14 hours. After removing the antibody and washing with PBS three times for 10 minutes, the secondary antibody (Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse & rabbit SFX kit) was left alone for 1 hour. After 1 hour, the antibody was removed, washed with PBS for 10 minutes, and the nucleus was stained with DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindol), and protein expression was observed using a fluorescence microscope.
  • Paraffin-embedded muscle sections were deparaffinized using xylene, rehydrated using a concentration gradient of ethanol, stained with hematoxylin and eosin, observed under an optical microscope, and photographed at 400x magnification. The diameter of muscle fibers was measured using Image J software.
  • IBMX 3-isobutyl-1-methylxanthine
  • Oil-red O dye (3.5 g Oil-red O reagent + 1 ml 100% isopropanol): 4 (distilled water)) was treated and allowed to stand for 1 hour. After 1 hour, it was washed with physiological saline and observed under a microscope. In order to measure Oil-red O stained in intracellularly differentiated cells, 100% isopropanol was added and collected, and then measured at 510 nm.
  • Cells were injected into 3T3L1 cells with FMOD, MSTN shRNA or scrambled vectors (1 ng) using transfection reagents and media according to the manufacturer's instructions. Cells were treated with puromycin (2 ⁇ g/ml), and cells injected with FMOD or MSTN shRNA were selected.
  • MSTN inhibition was applied during the proliferation and differentiation phase of C2C12 cells.
  • variously modified MSTN inhibitory peptides (MIF1, MIF1- NH2 , Ac -MIF1 and Ac -MIF1- NH2 ) were treated during the proliferation period of C2C12 cells, and then the cells proliferated. was observed with untreated cells.
  • MIF1 and Ac -MIF1 peptides were selected for further study.
  • 100% grown cells were scratched and cultured for 1 day in a growth medium treated with the MIF1 peptide.
  • the degree of scratch recovery of the cells treated with the MIF1 peptide (22% increase compared to the cells not treated with the peptide) increased compared to the untreated cells.
  • the cells with the MIF1 peptide in the growth medium when the cells grew to 100% or more, they were treated with the differentiation medium containing the MIF1 peptide and cultured for 3 days, and then myotube formation and fusion index were observed.
  • MIF1 (4% increase compared to cells not treated with the peptide) increased the fusion index of the cells according to the peptide treatment compared to the untreated cells.
  • MYH mRNA expression increased and MSTN mRNA expression decreased in MIF1 peptide-treated cells
  • MYOD, MYOG, MYL2, and MYH protein expressions increased in MIF1 peptide-treated cells.
  • MSTN protein expression was increased in cells treated with the MIF1 peptide.
  • FIG. 6 the expression of Atrogin1 mRNA, which is a factor related to muscle loss, decreased according to the treatment of MIF1 peptide, and the expression of MuRF1 protein decreased.
  • MSTN protein expression was decreased in Ac -MIF1 treated cells.
  • Atrogin1 and ACVRIIB protein expression also decreased in the Ac -MIF1 peptide treatment.
  • C2C12 cells were cultured in growth medium up to 100%, and when grown to 100%, MSTN protein, Ac -MIF1 or MSTN protein + Ac -MIF1 It was cultured for 3 days with muscle differentiation medium containing this.
  • the fusion index was analyzed in cells treated with MSTN protein, Ac -MIF1 or MSTN protein+ Ac -MIF1.
  • myotube formation was reduced in cells treated with MSTN protein compared to cells not treated with Ac -MIF1 peptide.
  • the fusion index of the cells increased compared to untreated cells.
  • Myotube formation in cells treated with MSTN protein + Ac -MIF1 peptide was increased compared to cells treated with only MSTN protein.
  • FMOD and MSTN proteins interact to regulate MSTN expression, and inhibition of FMOD expression increases lipid accumulation in myoblasts. Based on this, the association between FMOD and MSTN was observed in adipose tissue or adipocytes.
  • FIG. 11A FMOD and MSTN gene expressions were analyzed in normal mice and high-fat diet (HFD) mouse adipose tissue, and FMOD was decreased in HFD mouse adipose tissue, and MSTN was increased. Additionally, the expression of FMOD and MSTN genes was analyzed in cells before and after differentiation after treatment of mouse preadipocytes, 3T3L1, for differentiation into adipocytes for 4 days, and according to FIG. 11B, expression of FMOD was differentiated fat Cells were reduced compared to cells before differentiation, and MSTN expression was highly expressed in differentiated adipocytes.
  • FMOD or MSTN shRNA was injected into 3T3L1 cells, followed by adipogenic treatment, and the expression of adipogenic factors was confirmed.
  • CD36, PPAR ⁇ , and MSTN expression increased in FMOD-suppressed cells
  • CD36, PPAR ⁇ , and FMOD expressions decreased in MSTN-suppressed cells (A and B in FIG. 12)
  • MSTN knockout The expression of CD36, PPAR ⁇ and FMOD in knockout) muscle was significantly decreased compared to normal muscle tissue (Fig. 12C). Based on this information, the MIF peptide derived from the FMOD and MSTN binding sites was treated during the proliferation and differentiation of 3T3L1 cells.
  • 3T3L1 cells were cultured in Ac -MIF1-added growth medium for 2 days and proliferation was measured. As a result, as shown in FIG. 13A, Ac -MIF1 peptide-treated cells (peptide-untreated cells) compared to untreated cells. 8% increase compared to cells).
  • 3T3L1 cells When the 3T3L1 cells reached 100% growth, they were treated with adipocyte induction differentiation medium supplemented with Ac -MIF1 peptide and cultured for 4 days. As a result, according to FIG. 13B, adipose differentiation was observed by Oil-red O staining, and Oil-red O intensity was measured in Ac -MIF1 treated and non-treated cells, Ac -MIF1 (peptide-untreated cells). 8% decrease), fat accumulation was reduced in peptide-treated cells.
  • FMOD FMOD
  • MSTN MSTN
  • adipogenesis-related mRNAs and proteins CD36, CD163 and PPAR ⁇

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Abstract

본 발명은 근아세포의 증식과 분화를 촉진 또는 지방전구세포의 증식과 분화를 억제하는 신규 펩티드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 미오스타틴(myostatin; MSTN) 단백질의 일부 중 파이브로모둘린(fibromodulin) 단백질과 결합하는 아미노산 부위를 중심으로 신규 펩티드를 디자인한 후 마우스 근아세포주인 C2C12 세포에 처리하여 세포의 증식, 분화 및 근육의 재생 등을 관찰하고, 디자인한 펩티드를 처리한 후 근아세포의 증식, 분화 및 근육의 재생이 증가함을 확인하였고, 마우스 지방전구세포인 3T3L1 세포에 처리하여 세포의 증식 및 지방분화 등을 관찰하고, 상기 펩티드를 처리한 후 지방전구세포의 증식 및 지방 분화가 감소함을 확인하였다.

Description

신규 펩티드 및 이의 용도
본 발명은 신규 펩티드 및 이의 용도에 관한 것으로, 자세히는 근아세포의 증식과 근육세포로의 분화를 촉진 또는 지방전구세포의 증식과 지방세포로의 분화를 억제하는 신규 펩티드 및 이의 용도를 제공한다.
근육(muscle)은 인체를 구성하는 중요한 요소로, 중배엽의 줄기세포에서 발현되는 조직이다. 근육은 우리 몸의 40% 정도를 담당하며, 뼈와 힘줄에 지지해서 위치하고 근섬유 다발들로 이루어져 서로 움직이고 세포의 크기를 변하도록 하여 수축을 유발한다. 근육은 골격근육, 심장근육, 내장근육으로 구분되는데, 각각의 위치에서 힘을 만들어내고 움직임을 유발하며, 뼈, 관절, 내장 등의 신체기관을 보호하는 역할도 한다. 또한, 근육은 재생 능력을 가지고 있어, 근육이 손상을 받게 되면 위성세포와 그 주변 환경에 의해서 변성된 후 다시 원래의 수축 이완 능력을 가진 근육으로 재생될 수 있다.
근육질환은 선천적인 유전이나 환경적인 원인에 의해서 발생되며, 최근 고령화 사회 및 수명 연장의 흐름에 따라 근 감소와 관련된 질환이 증가하고 있다. 사람의 근육은 40세 이후부터 매년 1% 이상씩 감소하고, 80세가 되면 최대 근육량의 50% 수준이 감소됨으로써, 노년의 근육 감소는 전반적인 신체기능을 떨어뜨리는 가장 중요한 원인으로 인식되고 있다. 이러한 근육질환은 과거에 비해 전 세계적으로 증가 추세에 있다.
하지만, 근육질환은 그 원인이 다른 질환에 비해 다양하기 때문에 정확한 진단이 쉽지 않고, 그 종류에 따라 증상 및 질환의 강도도 다양하며, 희귀 질환의 형태로 정확한 메커니즘이 밝혀지지 못한 경우가 많다. 근육질환은 그 증상이 급격하게 진행되고, 근육질환 환자들은 상기 질환이 진행됨에 따라 혼자서는 일상적인 생활이 어려울 정도로 고통 받고 있으나, 근본적인 관련 질환에 대한 치료제들은 거의 없는 실정이다.
한편, 비만은 비정상적으로 과다하게 지방이 체내에 축적되어 개인의 건강에 위협을 주는 일종의 질병으로 정의될 수 있다. 비만은 과식, 운동부족이 주된 원인이 되는 단순성 비만과 내분비계 질환이 원인이 되는 증후성 비만으로 구별된다. 단순성 비만의 원인으로는 과식, 폭식, 간식, 야식, 불규칙적인 식사 등 잘못된 식생활 습관과 운동 부족, 약물의 부작용 등이 있다.
경제 성장과 생활 방식의 변화에 따라 식습관에도 최근 많은 변화가 있어 왔다. 특히, 바쁜 현대인들은 패스트푸드 등의 고열량 식이와 적은 운동량으로 인하여 과체중 및 비만이 증가하고 있는 실정이다. 세계보건기구(WHO)에 따르면, 전 세계적으로 10억 명 이상의 성인이 과체중이고, 그 중 적어도 300만 명 이상이 임상적으로 비만이며, 특히, 유럽에서는 매년 25만 명, 전 세계에서 250만 명 이상이 과체중과 관련되어 사망한 것으로 보고된 바 있다.
과체중 및 비만은 혈압과 콜레스테롤 수치를 증가시켜 심장 질환, 당뇨병, 관절염, 지방간, 고지혈증, 암 등 다양한 만성 합병증 질환을 유발시키거나 악화시킬 수 있다. 또한, 과체중 및 비만은 성인뿐만 아니라, 어린이나 청소년에서도 동맥경화, 고혈압, 고지혈증 또는 심장질환 등의 발병률을 증가시키는 주요한 요인으로 알려져 있다. 따라서, 비만을 하나의 질환으로 인식하고 적극적으로 치료하고자 하는 필요성이 증대되고 있다.
현재까지 비만 치료제에 사용되는 물질은 위장에서 지방 흡수를 감소시키거나 식욕을 억제시키는 약제들이다. 그러나, 소장 및 췌장의 리파아제를 억제하여 지방 흡수를 방지하는 작용을 하는 제니칼(Roche) 및 알리(GlaxoSmithKline)는 위장 관련 부작용 및 지용성 비타민 흡수 감소 등의 부작용을 유발하는 것으로 보고된 바 있다. 또한, 식욕 억제를 통하여 비만 억제 효과를 나타내는 로카세린(5-HT2c receptor agonist) 및 큐넥사(Phentermine/Topiramate)는 주의력 결핍이나 기억력 저하 등 부작용을 일으킬 수 있으며, 항우울제나 편두통제와 함께 복용 시, 심장 판막질환 등 심각한 부작용을 유발할 가능성이 있는 것으로 보고된 바 있고, 시부트라민(serotin noradrenalin reuptake inhibitor)은 2010년 심혈관 질환 및 뇌경색 발생 증가로 퇴출된 바 있다. 이렇듯 현재 사용되고 있는 비만 치료제는 상기와 같은 심각한 문제점을 가지고 있어 새로운 비만 치료제의 개발이 절실한 실정이다.
본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근육장애 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 비만질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근육장애 개선 또는 예방용 건강기능식품 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 비만질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근아세포 증식 또는 근육세포 분화 촉진 활성을 갖는 시약 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 지방전구세포 증식 또는 지방세포 분화 억제 활성을 갖는 시약 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근아세포 배양을 위한 배지 첨가제 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근육장애 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 비만질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근육장애 개선 또는 예방용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 비만질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근아세포 증식 또는 근육세포 분화 촉진 활성을 갖는 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 지방전구세포 증식 또는 지방세포 분화 억제 활성을 갖는 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근아세포 배양을 위한 배지 첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드; 및 상기 펩티드를 유효성분으로하는 약학 조성물 및 시약 조성물에 관한 것으로, 펩티드를 처리한 후 근아세포의 증식, 분화 및 근육의 재생이 증가하는 것과 지방전구세포의 증식 및 지방 분화가 감소하는 것을 확인하였는바, 1) 근아세포의 증식 촉진, 2) 근아세포의 분화 촉진 및 3) 손상된 근육의 재생 등을 위한 물질 및 3) 지방전구세포의 증식 억제, 4) 지방전구세포의 지방세포로의 분화 억제 등을 위한 물질로 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 (이하, MIF1이라함)의 존재 및 부재에 따른 미오스타틴 (myostatin; 이하, MSTN이라함)과 ACVRIIB (activin IIb receptor)의 세포외 도메인의 상호 작용을 나타낸다.
도 2는 MIF1 여부에 따른 MSTN 및 ACVRIIB 단백질의 결합 아미노산을 나타낸다.
도 3은 MSTN 단백질 처리에 따른 근아세포의 증식 및 분화를 나타낸다.
도 4는 다양한 변형 MIF1 처리에 따른 근아세포의 증식을 나타낸다.
도 5는 MIF1 처리에 따른 근모세포의 증식 및 분화를 나타낸다.
도 6은 근육분화 중 MIF1 처리에 따른 Atrogin1, MuRF1 및 ACVRIIB 발현을 나타낸다.
도 7은 Ac-MIF1 처리에 따른 근모세포의 증식 및 분화를 나타낸다.
도 8은 근육분화 중 Ac-MIF1 처리에 따른 Atrogin1, MuRF1 및 ACVRIIB 발현을 나타낸다.
도 9는 근육분화 동안 Ac-MIF1 펩티드 및 MSTN 단백질 처리를 나타낸다.
도 10은 Ac-MIF1 펩티드 처리에 따른 근육재생 효과를 나타낸다.
도 11은 지방조직과 3T3L1 세포의 분화에 따른 파이브로모둘린 (fibromodulin; 이하, FMOD라함) 및 미오스타틴 (myostatin; 이하, MSTN이라함) 발현을 나타낸다.
도 12는 FMOD 및 MSTN 발현 억제에 따른 지방 분화; 및 MSTN 녹아웃 (knock-out)에 따른 지방조직 내 관련 유전자 발현;을 나타낸다.
도 13은 3T3L1 세포 증식 및 분화에서 Ac-MIF1 펩티드 처리 효과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 제공한다.
상기 펩티드의 C-말단이 아마이드화 (amidation) 또는 N-말단이 아세틸화 (acetylation)될 수 있다.
상기 펩티드는 근아세포 증식 또는 근육세포 분화 촉진 활성을 가질 수 있으며, 바람직하게 미오스타틴 (myostatin; MSTN) 단백질을 억제시켜 근아세포 증식 또는 근육세포 분화 촉진 활성 및 지방전구세포의 증식 억제 또는 지방세포로의 분화 억제 시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근육장애 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
상기 근육장애는 근육위축증, 근질환, 근육 손상, 근이영양증, 근육감소증, 근신경 전도성 질병 또는 신경 손상 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 비만질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 점안제 및 주사용액으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 투여량이 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg, 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근육장애 개선 또는 예방용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 비만질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
이때, 건강기능식품을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 유효성분은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 바람직하게는 식품 100 중량부에 1 중량부 내지 90 중량부 포함되도록 첨가될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근아세포 증식 또는 근육세포 분화 촉진 활성을 갖는 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 지방전구세포 증식 또는 지방세포 분화 억제 활성을 갖는 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근아세포 배양을 위한 배지 첨가제 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[준비예 1] 펩티드 확보
MIF1, Ac-MIF1, MIF1-NH2 및 Ac-MIF1-NH2 (이하, MIF 펩티드라함)는 펩트론 (Peptron)사에서 합성되었으며, DMSO (dimethyl sulfoxide)로 희석하고 -20 ℃에서 보관하였다.
[준비예 2] C2C12 세포배양 및 MIF 펩티드 처리에 따른 증식관찰
마우스 근아세포주인 C2C12 세포는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) + 10 % FBS (Fetal bovine serum) + 1 % Penicillin / Streptomycin(P/S)에서 배양하였다. MIF 펩티드의 효과를 검증하기 위해 C2C12 세포 (2x103 cells/ml)를 12 well 세포배양접시에 넣고 24시간 동안 부착 시킨 후, MIF 펩티드 (1000 nM)를 1일 동안 처리한 하고, 세포의 증식을 MTT 법으로 확인하였다. 배지는 2일에 한번 씩 교체하였으며 세포는 37 ℃에서 배양하였다.
[준비예 3] 마우스
C57BL/6 수컷 마우스는 대한바이오링크에서 구입하여 12시간 조명 주기로 온도 조절된 방에서 케이지당 4마리를 유지했다. 동물에게 4.0 % (wt/wt) 총 지방 (Rodent NIH-31 Open Formula Auto; Zeigler Bros., Inc., Gardners, PA, USA) 및 물을 함유하는 표준 설치류 먹이를 제공했다. 동물과 관련된 모든 실험은 영남대학교 동물연구소 동물관리위원회에서 발표한 지침 (YUMC-AEC2015-006)을 준수했다. MSTN 녹아웃 마우스는 서울대학교 연구실에서 제공되었다. 정상, MSTN+/- (이형접합체) 및 MSTN-/- (동형접합체) 지방 조직을 6주령 마우스에서 채취하여 고정하고 분석에 필요할 때까지 -80 ℃에서 보관했다.
[준비예 4] 3T3L1 세포 배양
마우스 섬유아세포인 3T3L1 세포는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) + 10 % FBS (Fetal bovine serum) + 1 % Penicillin / Streptomycin(P/S)에서 배양하였다. MIF 펩티드의 효과를 검증하기 위해 3T3L1 세포 (2x103 cells/ml)를 12 well 세포배양접시에 넣고, 24시간 동안 부착 시킨 후 MIF 펩티드 (1000 nM)를 2일 동안 처리한 하고, 세포의 증식을 MTT 법으로 확인하였다. 배지는 2일에 한번 씩 교체하였으며 세포는 37 ℃에서 배양하였다.
[실험예 1] 단백질-단백질 상호작용 분석
MSTN (pdb id: 3HH2) 및 ACVRIIB (pdb id: 1S4Y)의 구조는 RCSB 단백질 데이터뱅크에서 검색되었다. 모든 물 분자와 헤테로 원자는 두 구조에서 모두 제거되었다. FMOD의 구조는 I-TASSER (미국 미시간주 앤아버에 있는 미시간 대학교 Yang Zhang 연구소, http://zhanglab.ccmb.med.umich)를 사용하여 초기 접힘 및 스레딩 방법의 조합을 사용하여 모델링되었다. 상동체의 단백질 데이터 뱅크 구조에서 서열 동일성의 낮은 비율은 FMOD에 대한 강력한 모델을 가져오지 못할 수 있어서, 최첨단 구조에 대한 객관적인 평가를 제공하기 위해 설계된 세계적인 실험인 CASP (Critical Assessment of Structure Prediction) -7 및 -8에 의해 결정된 최상의 단백질 모델을 제공하는 I-TASSER 서버를 사용했다. 이 분석에서 모든 단백질-단백질 연구는 패치독을 사용하여 수행되었다. MSTN과 그 수용체 ACVRIIB 사이의 결합을 조사하기 위해 단백질-단백질 상호작용 연구가 수행되었다. ACVRIIB와 MSTN (FMOD가 있거나 없는 복합) 간의 단백질-단백질 상호 작용은 PatchDock 서버(Institute of Molecular Medicine, Tel Aviv University, Tel Aviv, Israel; http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/)를 사용하여 수행되었다.
[실험예 2] 패턴분석
몇 가지 공통된 결합 패턴을 찾기 위해 일련의 평가가 수행되었다. FMOD 및 ACVRIIB에 대한 MSTN의 결합을 심층 분석하고, 상호작용에 최대 참여하는 MSTN의 잔기 세그먼트를 선택했다. 접근 가능한 표면적의 변화 및 가상 알라닌 스캐닝 (http://robetta.bakerlab.org/alaninescan에서 사용 가능)과 같은 다양한 접근 방식을 사용하여 패턴 연구를 수행하여 복합체에 기여하는 최대 잔류물을 예측하였다.
[실험예 3] 펩티드 스크리닝
MSTN에 대한 설계된 펩티드의 효능은 in silico 결합 접근법을 사용하여 예측되었다. 여기에서 설계된 모든 펩티드는 MSTN에 대해 도킹되었다. 결합 연구는 Patchdock을 사용하여 수행되었다. Patchdock에서 얻은 결과는 각각 1000단계에 대해 Firedock을 사용하여 추가 개선을 거쳤으며 최상위 스코어링 펩티드는 MSTN에 대한 전체적인 결합 에너지를 기반으로 선택되었다. 펩티드 정보는 표 1과 같다.
펩티드 서열정보 크기 (mer) 분자식 분자량
MIF1 VDFEAFWDWG 10 C63H74N12O17 1270.53
Ac-MIF1 Ac-VDFEAFWDWG 10 C65H76N12O18 1312.54
[실험예 4] 스크래치 (Scratch) 실험
C2C12 세포가 100 % 성장하였을 때 세포 표면에 스크래치를 가하고 1000 nM MIF1 또는 Ac-MIF1 펩티드를 처리하고, 1일 동안 배양한 후 세포의 회복 정도를 관찰하였다.
[실험예 5] 세포증식 검증 (MTT 법)
세포의 증식을 검증하기 위해 세포의 배양 배지를 제거하고 DMEM으로 세포를 세척한 후 인산완충생리식염수 (phosphate buffered saline, PBS)에 용해된 MTT 시약 (0.5 mg/ml) 500 ㎕를 각 well에 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 방치하였다. 반응액을 제거하고 1000 ㎕의 DMSO를 각 well에 첨가하였다. 보라색의 포마잔 크리스탈 (formazan crystals)을 DMSO에 완전히 용해시키고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
[실험예 6] MSTN 단백질 처리
C2C12 세포가 70 % 성장 하였을 때, 증식배지에서 MSTN 단백질 (1 ng), Ac-MIF1 (1000 nM) 및 Ac-MIF1 (1000 nM) + MSTN 단백질 (1 ng)가 첨가된 근육분화 배지로 교체한 후 3일 동안 배양하였다.
[실험예 7] 근육분화
근아세포의 근육세포로의 분화를 위해 세포가 약 70 % 이상 성장하였을 때, 분화배지 (DMEM + 2 % FBS + 1 % P/S)로 교체하여 3일 동안 배양하였다. 배지는 매일 한번 씩 교체하였으며 세포는 37 ℃에서 배양하였다.
[실험예 8] Giemsa 염색 및 융합지수 계산
세포의 배지를 제거하고 PBS로 세포를 세척하였다. 세척 후 1:1 부피비율의 메탄올 (Methanol): PBS 시약을 처리한 후 2분 동안 고정하였다. 추가적으로 2:1 부피비율의 메탄올 : PBS 시약을 첨가한 후 2분 동안 추가로 고정하였다. 2분 후 0.04 % Giemsa 시약을 첨가한 후 30분 동안 방치하고 30분 후 PBS로 세척을 하고 세포의 모습을 현미경으로 관찰하고 세포의 사진을 3장씩 찍었다 (300x). 찍은 사진에서 근관세포 내에서 융합 (fusion)된 핵의 수를 세고, 총 세포의 핵 수를 센 후 융해된 핵 수를 총 세포의 핵 수로 나누어 % 값을 산출하였다.
[실험예 9] RNA 추출 및 cDNA 합성
TRIzol™ 시약 1 ml을 첨가한 후 초고주파 분쇄기 (sonicator)를 이용하여 세포를 분쇄하였다. 분쇄한 샘플을 원심분리 한 후 (12,000 rpm, 10분, 4℃) 상층액을 새 튜브에 옮기고 클로로포름 200 ㎕를 넣고 실온에 10분 동안 방치하였다. 10분 후 원심 분리하여 (12,000 rpm, 10분, 4 ℃) 투명색의 상층액을 수득하였다. 다음으로 이소프로판올 (isopropanol) 500 ㎕를 넣고 10분 동안 방치하고 원심분리 하여 RNA 펠렛을 얻었다. RNA 펠렛에 70 % 에탄올 (에탄올 + 디에틸피로카르본산(diethylpyrocarbonate, 이하, DEPC라함)가 처리된 증류수)을 첨가하여 세척한 후, 완벽하게 제거하고 건조시켰다. 건조된 투명색의 RNA에 DEPC가 처리된 증류수를 넣고 -80 ℃에 보관하였다. 전체 RNA 양은 나노드롭 (Nanodrop)으로 측정하였으며, 1.2 % 아가로즈 젤 (Agarose gel)에서 18s, 28s 밴드를 확인하였다. cDNA는 2 μg의 전체 RNA (total RNA), 랜덤 헥사머 (random hexamer) 프라이머 및 역전사효소 (Reverse Transcriptase)와 함께 합성하였다 (25 ℃: 10분, 37 ℃: 120분 85 ℃: 5분).
[실험예 10] 유전자 발현 확인 (Real-time PCR)
유전자 발현 확인을 위해 실시간 PCR (Real-time PCR; RT-PCR)을 수행하였다. 실시간 유전자 발현 관찰을 위해 SYBR 그린(green)의 형광물질을 포함한 Power SYBR　Green PCR Master Mix를 이용하여 유전자 발현을 분석하였다 (7500 Real-time PCR system). PCR 프라이머는 NCBI GenBank에서 확보된 염기서열 (nucleotide sequence)에 따라 Primer 3 software (http://frodo.wi.mit.edu)로 디자인하였다. PCR은 95 ℃에서 10분, 다시 95 ℃에서 33초, 유전자 프라이머 온도 (tm)에 따라 33초 및 72 ℃에서 33초 동안 40회 반응을 진행하였다. 실시간 PCR 분석을 통해 나온 c(t) 값의 분석을 통해 유전자 발현 값을 분석하였다 (fold change 2-△△Ct formula). 처리하지 않은 세포의 유전자의 발현 값을 1로 두고 처리한 세포의 유전자 발현 값을 계산하였다. 유전자 c(t) 값 분석 시 평준화 (normalization)는 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 이용하였다. 상기 PCR 프라이머의 서열은 표 2와 같다.
프라이머 크기(bp) 온도 Forward Reverse
GAPDH 155 59 5'-tgctggtgctgagtatgtcg-3' 5'-caagcagttggtggtacagg-3'
MSTN 163 59 5'-acgctaccacggaaacaatc-3' 5'-ggagtcttgacgggtctgag-3'
MYOG 185 59 5'-tccagtacattgagcgccta-3' 5'-caaatgatctcctgggttgg-3'
MYL2 177 59 5'-aaagaggctccaggtccaat-3' 5'-cctctctgcttgtgtggtca-3'
MYH 248 59 5'-gggttccattgacattgacc-3' 5'-agggccagtgtttcacattc-3'
Atrogin1 160 59 5'-ttcagcagcctgaactacga-3' 5'-tgaaagcttcccccaaagta-3'
MuRF1 206 59 5'-tgaggtgcctacttgctcct-3' 5'-tcacctggtggctattctcc-3'
ACVRIIB 197 59 5'-aacttccagagagacgcctt-3' 5'-atcgtgggcctcatcttctt-3'
FMOD 155 59 5'-tgcagaagatccctcctgtc-3' 5'-cttgatctcgttcccatcca-3'
CD36 187 59 5'-tggagctgttattggtgcag-3' 5'-tgggttttgcacatcaaaga-3'
PPARγ 232 59 5'-aagagctgacccaatggttg-3' 5'-acccttgcatccttcacaag-3'
CD163 128 59 5'-ctggtcgtgtggaagtgaaa-3' 5'-cgccactgagcatagtgaaa-3'
[실험예 11] 세포조직면역염색법 (Immunocytochemistry)
배양한 C2C12 세포의 배지를 제거하고 PBS로 1번 세척하였다. 세척한 세포에 4 % 포름알데히드(formaldehyde, Sigma)를 처리하여 15분간 세포를 고정한 후, PBS를 이용하여 세포를 세척하고 0.2 % 트립톤(tipton) X-100 (Sigma)을 넣은 후 5분 간 방치하였다. 다시 PBS를 이용하여 세척하고 1 %의 정상 염소 혈청 (normal goat serum)을 넣고 30분 간 방치한 후 1차 항체 (MYOD, myogenin(MYOG) : Myosin light chain(MYL2); 1:50)를 넣고 4 ℃에서 14시간 동안 반응시켰다. 항체를 제거하고 PBS로 10분 동안 3번 세척한 후, 2차 항체 (Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse & rabbit SFX kit)와 1시간 동안 방치하였다. 1시간 후 항체를 제거하고 PBS로 10분 동안 세척한 후 DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindol)로 핵을 염색하고 형광현미경을 이용하여 단백질의 발현을 관찰하였다.
[실험예 12] 웨스턴 블랏 (Western blot)
(1) 배양한 C2C12 세포의 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. 세척한 세포에 LIPA 버퍼와 단백질분해효소 억제제를 넣은 후 12000 rpm에서 10분 동안 원심분리 후 상층액에 포함된 단백질을 수집하였다. 추출한 단백질 중 40 μg을 8 내지 10 %의 아크릴아마이드 겔 (Acrylamide gel)에서 전기영동 한 후 PVDF 멤브레인 (Polyvinylidene fluoride membrane, Milipore)에 옮겼다. 이를 3 % 탈지유 (skim milk)나 소혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA)으로 1시간 동안 실온에서 블록킹 (blocking)하였다. 그 후, 1 % 탈지유 또는 BSA에 희석한 1차 항체 (Pax7; 1:500, MYOD; 1:500, MYOG; 1:400, MYL2; 1:1000, MYH; 1: 500, MSTN; 1:1000, ß-actin; 1:1000, MuRF1; 1:400 및 Atrogin; 1: 1:400)를 첨가하고 16시간 이상 4 ℃에서 반응시켰다. 16시간 후 TBST (Tween 20이 포함된 Tris-Buffered Saline)로 3번 세척하고, HRP (horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 TBST로 3번 세척하고, Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate를 넣어준 후 현상하였다.
(2) 배양한 3T3L1 세포의 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. 세척한 세포에 LIPA 버퍼와 단백질분해효소 억제제를 넣은 후 12000 rpm에서 10분 동안 원심분리 후 상층액에 포함된 단백질을 수집하였다. 추출한 단백질 중 40 μg을 8 내지 10 %의 아크릴아마이드 겔 (Acrylamide gel)에서 전기영동 한 후 PVDF 멤브레인 (Polyvinylidene fluoride membrane, Milipore)에 옮겼다. 이를 3 % 탈지유 (skim milk)나 소혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA)으로 1시간 동안 실온에서 블록킹 (blocking)하였다. 그 후, 1 % 탈지유 또는 BSA에 희석한 1차 항체 (MSTN; 1:1000, ß-actin; 1:1000, CD36; 1:500, CD163; 1:500, FMOD; 1:400 및 PPARγ; 1:500)를 첨가하고 16시간 이상 4 ℃에서 반응시켰다. 16시간 후 TBST (Tween 20이 포함된 Tris-Buffered Saline)로 3번 세척하고, HRP (horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 TBST로 3번 세척하고, Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate를 넣어준 후 현상하였다.
[실험예 13] 조직면역염색법 (Immunohistochemistry)
파라핀이 함유된 근육조직에 각각 자일렌 (xylene)과 에탄올로 디파라핀화 (deparaffinization) 및 수분을 공급하였으며, 내생성 과산화효소 활동 (endogenous peroxidase activity)을 중지 시키기 위해 0.3 % 과산화수소수(H2O2) / 메탄올에서 15분 동안 조직을 담구어 두었다. 그 다음, 형태학 관찰을 위해 헤마톡실린(hematoxylin) / 에오신(eosin)으로 염색하거나, 1 %의 정상 염소 혈청 (Normal goat serum)으로 비특이적 항체와의 반응을 차단하기 위해 조직과 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 1차 항체 (1:50)와 16시간 이상 4 ℃ 반응시켰다. 16시간 후 PBS에 3번 세척하고 HRP가 부착된 2차 항체 (1:100)를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. Horse radish peroxidase-conjugated streptavidin를 첨가하여 단백질의 발현을 검출한 후 현미경을 통해 관찰하였다.
[실험예 14] Ac-MIF1 펩티드 주입에 따른 근육재생효과 관찰
MIF 펩티드 주입에 따른 근육재생효과를 관찰하기 위해 마우스에 Ac-MIF1 펩티드 주입 및 카디오톡신 (Cardiotoxin; 이하, CTX라함)을 근육에 주입 / 비주입을 한 후 근육의 형태 및 재생을 관찰하였다. C57BL/6 마우스에 Ac-MIF1 펩티드 (1.125 mM)를 주입 시킨 1일 후 100 mM의 카디오톡신을 비복근 (gastrocnemius) 근육에 주입하였다. CTX 주입 7일 후 근육조직을 샘플링 하였다.
[실험예 15] 근육직경 측정
파라핀이 포매된 근육 절편을 자일렌을 사용하여 탈파라핀화하고 에탄올의 농도 구배를 사용하여 재수화한 다음 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한 후 광학 현미경으로 관찰하고 400x 비율로 확대하여 사진을 찍은 후 근섬유의 직경을 Image J 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.
[실험예 16] MIF 펩티드 처리에 따른 지방분화 관찰
3T3L1 세포의 지방세포로의 분화를 위해 세포가 약 100 % 이상 성장하였을 때 분화배지 (DMEM + 10 % FBS + 1 % P/S + 10 ug/ml 인슐린(insulin) + 1 μM 덱사메타손 (dexametazone)+ 0.5 μM IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine))로 교체하여 2일 동안 배양하였다. 2일 후 10 ug/ml 인슐린을 포함하는 배지에 MIF를 처리한 후 세포의 분화를 유도하였다.
[실험예 17] Oil red O 염색
3T3L1 세포에 4일 동안 펩티드 및 분화 처리 후 배지를 제거하고, 생리식염수로 세포를 세척하고 10 % 포름알데히드 (formaldehyde)를 처리하고 10분 동안 방치하였다. 10분 후, Oil-red O 염색약 (6 (3.5 g Oil-red O 시약 + 1 ml 100% 이소프로판올): 4 (증류수))를 처리하고 1시간 동안 방치하였다. 1시간 후 생리식염수로 세척한 후 현미경으로 관찰하였다. 세포 내 분화된 세포에 염색되어 있는 Oil-red O를 측정하기 위해 100 % 이소프로판올 (isopropanol)을 넣어주고 모은 후, 510 nm에서 측정하였다.
[실험예 18] 유전자 녹다운 (knock-down)
세포는 제조업체의 지침에 따라 형질감염 시약 및 배지를 사용하여 FMOD, MSTN shRNA 또는 스크램블된 벡터 (1 ng)를 3T3L1 세포에 주입하였다. 퓨로마이신 (2 μg/ml)을 세포에 처리하여 FMOD 또는 MSTN shRNA가 주입된 세포를 선별하였다.
[실험예 19] 통계분석
정규화된 유전자 발현의 평균 간의 차이의 유의성은 Tukey의 스튜던트화 범위 (HSD) 및 T 테스트를 사용하여 결정되었다. 내부대조군에서는 GAPDH를 사용하였으며, 통계분석은 SAS ver. 9.0 프로그램으로 분석하였다. p≤0.05의 값은 통계적 유의성을 나타냈다.
[실시예 1] MIF1 펩티드 설계 및 in silico 분석
펩티드는 MSTN과 FMOD의 결합 부분에서 디자인 되었다. in silico 분석을 통해서 MIF1 펩티드의 여부에 따라 ACVRIIB에 대한 MSTN 결합 에너지를 분석한 결과, 도 1 및 2에 따를 때, MSTN은 MIF1 펩티드가 존재할 때 결합 에너지가 -59.69로 감소하였다.
[실시예 2] MIF1 처리에 따른 근아세포의 증식 및 분화
C2C12 세포에서 MSTN 단백질의 처리에 따른 세포의 증식을 관찰하기 위해 증식 또는 분화 배지를 처리한 후 세포의 증식과 분화를 관찰한 결과, 도 3에 따를 때, 처리하지 않은 세포에 비해 세포의 증식과 분화가 감소하였다.
근아세포의 증식과 분화를 억제하는 MSTN 단백질의 효과를 차단하고 세포의 증식 및 분화를 촉진하기 위해 MSTN 억제를 C2C12 세포의 증식 및 분화시기에 처리하였다. 펩티드의 화학적인 변형에 따른 효과를 먼저 검증하기 위해 다양한 변형을 한 MSTN 억제 펩티드 (MIF1, MIF1-NH2, Ac-MIF1 및 Ac-MIF1-NH2)를 C2C12 세포의 증식 기간 동안 처리한 후 세포의 증식을 처리하지 않은 세포와 관찰하였다. 그 결과, 도 4에 따를 때, 세포의 증식은 처리하지 않은 세포(대조군)와 비교하여 MIF1 (펩티드를 처리하지 않은 세포에 비해 11 % 증가) 및 Ac-MIF1 (펩티드를 처리하지 않은 세포에 비해 24 % 증가)를 처리한 세포에서 증가했다.
MIF1 및 Ac-MIF1 펩티드가 추가 연구를 위해서 선택되었다. MIF1 펩티드의 근아세포의 증식에 미치는 영향을 관찰하기 위해 100 % 성장한 세포에서 스크래치를 수행하고 MIF1 펩티드가 처리된 증식 배지에서 1일 동안 배양하였다. 그 결과, 도 5A에 따를 때, 처리하지 않은 세포에 비해 MIF1 (펩티드를 처리하지 않은 세포에 비해 22 % 증가) 펩티드를 처리한 세포의 스크래치 회복정도가 증가하였다. 세포를 MIF1 펩티드를 성장배지에서 부터 처리 한 후 세포가 100 % 이상 성장하였을 때 MIF1 펩티드를 포함하는 분화배지를 처리하고 3일 동안 배양하한 후 근관 형성 및 융합지수를 관찰하였다. 그 결과, 도 5B에 따를 때, MIF1 (펩티드를 처리하지 않은 세포에 비해 4 % 증가) 펩티드의 처리에 따라 세포의 융합지수가 처리하지 않은 세포에 비해 증가하였다.
관련 근육세포 분화 관련 인자들의 발현을 실시간 PCR, 웨스턴 블랏 및 세포조직면역염색법 법으로 관찰하였다. 그 결과, 도 5의 C 및 D에 따를 때, MIF1 펩티드 처리 세포에서 MYH mRNA 발현이 증가하였고 MSTN mRNA 발현이 감소하였고, MYOD, MYOG, MYL2 및 MYH 단백질의 발현은 MIF1 펩티드가 처리된 세포에서 증가하였다. 그러나, MIF1 펩티드가 처리된 세포에서 MSTN 단백질 발현이 증가하였다. 또한, 도 6에 따를 때, 근감소 관련 인자인 Atrogin1 mRNA의 발현이 MIF1 펩티드의 처리에 따라 감소하였으며, MuRF1 단백질의 발현이 감소하였다.
[실시예 3] Ac-MIF1 펩티드 처리에 따른 근아세포의 증식 및 분화
C2C12 세포에서 Ac-MIF1 펩티드의 효과를 관찰하기 위해 스크래치를 수행하고, Ac-MIF1 첨가된 증식 배지와 함께 1일 동안 배양하고 세포 회복을 측정하였다. 그 결과, 도 7A에 따를 때, Ac-MIF1 (처리하지 않은 세포에 비해 28 % 증가) 펩티드가 처리된 세포의 회복력이 처리하지 않은 세포보다 우수했다.
세포를 Ac-MIF1 펩티드를 성장배지에서 부터 처리 한 후 세포가 100 % 이상 성장하였을 때 Ac-MIF1 펩티드를 포함하는 분화배지를 처리하고 3일 동안 배양하한 후 근관형성 및 융합지수를 관찰하였다. 그 결과, 도 7B에 따를 때, Ac-MIF1 (처리하지 않은 세포에 비해 세포의 핵이 융합된 융합지수 11 %증가) 처리는 미처리 세포보다 근관 형성이 증가하였다.
도 7의 C 및 D에 의할 때, MYOD 및 MYL2 mRNA; 및 MYOD, MYOG 및 MYH 단백질; 발현은 Ac-MIF1 처리된 세포에서 증가하였다. 그러나 MSTN 단백질 발현은 Ac-MIF1 처리된 세포에서 감소하였다. 또한, 도 8에 의할 때, Atrogin1 및 ACVRIIB 단백질 발현도 Ac-MIF1 펩티드 처리에서 감소하였다.
[실시예 4] 근육에서의 분화에서 MSTN 단백질과 Ac-MIF1 펩티드 효과
C2C12 세포의 분화과정에서 MSTN 단백질의 MIF 펩티드 처리에 따른 효과를 관찰하기 위해 C2C12 세포를 최대 100 % 까지 성장 배지로 배양하고, 100% 성장하였을 때 MSTN 단백질, Ac-MIF1 또는 MSTN 단백질+ Ac-MIF1이 포함된 근육 분화 배지로 3일 동안 배양하였다. 융합 지수는 MSTN 단백질, Ac-MIF1 또는 MSTN 단백질+ Ac-MIF1가 처리된 세포에서 분석되었다. 그 결과, 도 9에 따를 때, MSTN 단백질이 처리된 세포에서는 처리하지 않은 세포에 비해 근관 형성이 감소하였으며, Ac-MIF1 펩티드를 처리한 세포의 융합지수는 처리하지 않은 세포에 비해 증가하였다. MSTN 단백질 + Ac-MIF1 펩티드가 처리된 세포들의 근관 형성은 MSTN 단백질만 처리된 세포에 비해 증가했다.
[실시예 5] Ac-MIF1 펩티드 주입에 따른 근육 재생 효과
Ac-MIF1 펩티드가 손상된 근육의 재생에 미치는 확인하기 위해, Ac-MIF1를 다리의 비복근에 주사하고 1일 후, CTX를 주사한 후 7일 동안 유지하였다. 표 3에 의할 때, 7일 후 체중 (g)과 근육의 무게 (g)을 측정하였으며, Ac-MIF1 펩티드의 주입에 따라 근육의 무게는 주입하지 않은 근육에 비해 유의적 차이를 보이지 않았다. 도 10에 의할 때, 유전자 발현의 경우 MYOD, MYL2 및 MSTN의 mRNA 발현은 Ac-MIF1 펩티드가 주사된 근육에서 증가하였고 (도 10A), Pax7, MYOD, MYOG 및 MYL2의 단백질 발현은 Ac-MIF1 펩티드를 주입 근육에서 증가하였으며 (도 10B), 근섬유의 직경 (um)은 펩티드를 주입하지 않은 세포에 비해 Ac-MIF1 펩티드를 주입한 근육에서 증가하였다 (도 10C).
펩티드 CTX (g) CTX + Ac-MIF1 (g)
Ac-MIF1 0.140±0.002 0.140±0.003
[실시예 6] 지방 내 FMOD와 MSTN 발현
이전 연구에서는 FMOD 및 MSTN 단백질이 상호작용하여 MSTN 발현을 조절하고, FMOD 발현 억제는 근아세포 내 지질 축적을 증가시킨다는 것을 보여주었는데, 이를 토대로 FMOD 및 MSTN의 연관성을 지방조직 또는 지방세포에서 관찰하였다. 그 결과, 도 11A에 의할 때, FMOD 및 MSTN 유전자 발현은 정상 마우스 및 HFD (high-fat diet) 마우스 지방 조직에서 분석되었으며, FMOD는 HFD의 마우스 지방 조직에서 감소하였으며, MSTN은 증가하였다. 추가적으로 FMOD 및 MSTN 유전자의 발현을 마우스 지방전구세포인 3T3L1에 지방세포로의 분화조건을 4일 동안 처리한 후 분화 전·후 세포에서 분석하였으며, 도 11B에 의할 때, FMOD 의 발현은 분화한 지방세포는 분화 전 세포에 비해 감소하였으며, MSTN의 발현은 분화한 지방세포에서 높은 발현을 나타내었다.
FMOD 또는 MSTN 유전자 발현 억제를 위해 FMOD 또는 MSTN shRNA를 3T3L1 세포에 주입한 후 지방분화처리를 하고 지방분화 관련 인자들의 발현을 확인하였다. 그 결과, 도 12에 의할 때, CD36, PPARγ 및 MSTN 발현은 FMOD 발현억제 세포에서 증가했고 CD36, PPARγ 및 FMOD 발현은 MSTN 발현억제 세포에서 감소했고 (도 12의 A 및 B), MSTN 녹아웃(knockout) 근육에서 CD36, PPARγ 및 FMOD 발현은 정상 근육 조직에 비해 유의성 있게 감소했다 (도 12C). 이러한 내용을 바탕으로 FMOD와 MSTN 결합부위에 파생된 MIF 펩티드를 3T3L1 세포의 증식 및 분화 과정에 처리하였다.
[실시예 7] Ac-MIF1 처리에 따른 3T3L1 세포의 증식 및 분화
3T3L1 세포를 Ac-MIF1가 첨가된 증식 배지에서 2일 동안 배양하고 증식을 측정한 결과, 도 13A에 의할 때, 처리하지 않은 세포에 비해 Ac-MIF1 펩티드가 처리된 세포 (펩티드를 처리하지 않은 세포에 비해 8 % 증가)에서 감소하였다.
3T3L1 세포가 100 % 성장에 도달하였을 때 Ac-MIF1 펩티드가 첨가된 지방세포 유도 분화배지를 처리하고 4일 동안 배양하였다. 그 결과, 도 13B에 의할 때, Oil-red O 염색에 의해 지방 분화가 관찰되었고 Oil-red O 강도는 Ac-MIF1 처리 및 비 처리 세포에서 측정되었고, Ac-MIF1 (펩티드를 처리하지 않은 세포에 비해 8 % 감소) 펩티드가 처리된 세포에서 지방축적이 감소했다.
또한, 도 13C에 의할 때, FMOD; MSTN; 및 지방 생성 관련 mRNA 및 단백질 (CD36, CD163 및 PPARγ);의 발현은 처리되지 않은 세포에 비해 Ac-MIF1 펩티드가 처리된 세포에서 감소했다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드의 C-말단이 아마이드화 (amidation) 또는 N-말단이 아세틸화 (acetylation)된 것을 특징으로 하는 펩티드.
  3. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 근아세포 증식 또는 근육세포 분화 촉진 활성; 또는 미오스타틴 (myostatin; MSTN) 단백질을 억제시켜 지방전구세포의 증식 억제 또는 지방세포로의 분화 억제 시키는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 펩티드는 미오스타틴 (myostatin; MSTN) 단백질을 억제시켜 근아세포 증식 또는 근육세포 분화 촉진 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  5. 제1항 또는 제2항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근육장애 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 근육장애는 근육위축증, 근질환, 근육 손상, 근이영양증, 근육감소증, 근신경 전도성 질병 또는 신경 손상 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 비만질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 약학 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 점안제 및 주사용액으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근육장애 개선 또는 예방용 건강기능식품 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 비만질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근아세포 증식 또는 근육세포 분화 촉진 활성을 갖는 시약 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 지방전구세포 증식 또는 지방세포 분화 억제 활성을 갖는 시약 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 근아세포 배양을 위한 배지 첨가제 조성물.
PCT/KR2022/017769 2021-11-25 2022-11-11 신규 펩티드 및 이의 용도 WO2023096232A1 (ko)

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